Đề tài kỹ thuật di truyền sự can thiệp RNA

Con đường hình thành miRNA Quá trình hình thành miRNA diễn ra ở nhân tế bào nuclear và trong tế bào chất cytoplasma Ở trong nhân, các phân tử miRNA được tạo ra thông qua quá trình phiên

Trường ĐH Tôn Đức ThắngKhoa Khoa Học Ứng Dụng

• 1 Dòng thông tin di truyền

o 1.1 Khái niệm về RNAi trong tế bào

o 1.2 Vai trò RNAi

• 2 Lịch sử nghiên cứu

• 3 Bộ máy can thiệp RNAi

o 3.1 Con đường hình thành siRNA

o 3.2 Con đường hình thành miRNA

o 3.3 Sự khác nhau giữa siRNA và miRNA

• 4 Cơ chế can thiệp RNA

o 4.1 Cơ chế chung

o 4.2 Cơ chế làm tắt gene bởi siRNA

o 4.3 Cơ chế làm tắt gene bởi miRNA

• 5 Những thành tựu và triển vọng của việc

nghiên cứu ứng dụng RNAi

o 5.1 Tạo Hoa Hồng Xanh

o 5.2 Ứng dụng cơ chế can thiệp RNA trong nghiên cứu ung thư

o 5.3 Ứng dụng cơ chế can thiệp RNAi trừ sâu bệnh

o 5.4 Triển vọng của việc nghiên cứu ứng dụng RNAi

Dòng thông tin di truyền

Mã di truyền trên DNA quy định protein được hình thành Thông tin di truyền lưu trữ trong DNA được sao chép sang RNA và sau đó được dùng để tổng hợp protein Dòng thông tin được truyền từ DNA quamRNA đến protein được gọi là "Học thuyết trung tâm" của lĩnh vực sinh học phân tử Bộ gene của chúng ta có khoảng 30.000 gene Tuy nhiên không phải mọi thông tin di truyền đều được sử dụng mà chỉ có một phần thông tin di truyền trong hệ gene được sử dụng trong mỗi loại tế bào

Việc gene nào được biểu hiện là do cơ chế kiểm soát của bộ máy sao chép DNA sang mRNA trong quá trình phiên mã Quá trình phiên mã cũng bị điềukhiển bởi nhiều nhân tố khác và được con người nghiên cứu, tìm hiểu ngày càng rõ

Khái niệm về RNAi trong tế bào

"RNA can thiệp" (RNAi) là một hệ thống bên trong

các tế bào sống, giúp kiểm soát được các gene

đang hoạt động "RNA can thiệp" là một cơ chế để bất hoạt gene gây nên bởi RNA mạch kép (dsRNA)

Đó là trình tự đặc biệt và liên quan đến sự suy thoái của cả hai loại phân tử RNA: RNA sợi kép (dsRNA)

và RNA sợi đơn thường mRNA là những sợi tương đồng trong trình tự dsRNA làm kích hoạt phản ứng trả lời Các phân tử RNAi này có thể gây nên các hiệu ứng:

• Ức chế dịch mã đơn vị mRNA

• Ức chế sự phiên mã của gene ở trong nhân

• Phân giải mRNA

Vai trò RNAi

RNAi có rất nhiều chức năng quan trọng trong tế bào Chúng bảo vệ tế bào chống lại gene ký sinh trùng, virut và các yếu tố di truyền vận động

(Transposon) Điều hoà biểu hiện gene Điều khiển

sự phát triển của tổ chức Giữ gìn NST và tăng

cường phiên mã Có thể RNAi còn có nhiều chức năng khác mà con người chưa khám phá hết, và sẽ được khám phá dần trong tương lai

1992, phát hiện “quelling” ở Neurospora (Neurospora crassa - vi khuẩn mốc bánh mì màu đỏ (red bread mold) )

- Năm 1994, Cogoni và cộng sự đã tiến hành thí nghiệm tăng màu cam của nấm Neurospora crassa

- Năm 1995, trên tạp chí Cell số 81, nhóm nghiên cứu củaGuo và Kemphues đã đưa ra bằng chứng đầu tiên trên tuyến trùng Caenorhabditis elegans rằng: Phân tử RNA chiều thuận (sense RNA) cũng gây ra sự ức chế gene

- Năm 1998, nhóm nghiên cứu Fire đã giải thích được điều nghịch lý này bằng những thí nghiệm trên tuyến trùng C elegans.

- Năm 2000, trên tạp chí Nature cũng công bố việc phát hiện hiện tượng RNAi trên loài ruồi giấm ProSophila do nhóm nghiên cứu của Richard Cathew tiến hành

Năm 2001, lần đầu tiên RNAi được mô tả trong các tế bào động vật có vú (Tuschl và cộng sự)

-2002, Tạo ra tái tổ hợp dicer để tạo siRNA , công nghệ iRNA trở thành công nghệ của năm

- 2003-2005, khoảng thời gian cải tiến và tìm hiểu rõ hơn

về công nghệ iRNA

- Năm 2006, giải thưởng Nobel sinh lý và y học cho phát hiện cơ chế RNAi của hai nhà bác học Mỹ là Andrew Fire (ĐH Stanford) và Craig C Mello (ĐH Massachusetts)

Bộ máy can thiệp RNAiCác thành phần tham gia vào quá trình can thiệp RNAi gồm siRNA và miRNA

• siRNA

• dsRNA (double strand RNA – RNA sợi đôi) là những đoạn RNA dài mạch kép có trình tự bổ xung với gene đích (target RNA) có 2 đầu thò

là 3’OH

• Dicer: Là một loại enzyme endonuclease

(Ribonuclease III) chịu trách nhiệm hoàn thiệnsợi dsRNA

• Phức hệ RISC (RNA – incluced silencing

complex): Phức hệ gắng gene kích ứng bởi RNA Phức hệ này có chứa enzyme helicase

và một số protein trong đó quan trọng nhất là protein thuộc họ Agronaut (liên kết RNA) hoạt động như một endonuclea và cắt mRNA

• siRNA (small interfeing RNA): là RNA can

thiệp kích thước nhỏ được tạo ra từ dsRNA

• miRNA là những đoạn RNA ngắn khoảng từ 19 –24 nucleotit, không tham gia vào quá trình tổnghợp protein Bộ máy miRNA bao gồm:

• Pri- mRNA (primary- mRNA) là chuỗi mRNA nguyên thuỷ, dài hàng nghìn nucleotit và

mang đầu 5’CAP, đuôi poly A Pri- mRNA

chứa ít nhất một hay nhiều vòng kẹp tóc

(hairpin) mỗi vòng dài khoảng 70 nucleotit

• Phức hệ RISC (RNA – incluced silencing

complex): Phức hệ gắn gene kích ứng bởi RNA Phức hệ này có chứa enzyme helicase

và một số protein trong đó quan trọng nhất là protein thuộc họ Agronaut (liên kết RNA) hoạt động như một endonuclea và cắt mRNA

• Hai enzyme cắt là Drosha ở trong nhân tế bào

và Dicer ở ngoài tế bào chất

Con đường hình thành siRNA

Quá trình hình thành siRNA diễn ra ở tế bào chất (cytoplasma) RNAi được kích hoạt bởi dsRNA có đầy đủ các cặp bazơ và có ít nhất 21 -23 cặp bazơ Còn những phân tử dsRNA dài

sẽ được là cắt thành những mảnh có độ dài khoảng 21-23 bp bởi một enzyme ngoài tế bào chất được gọi là "Dicer"

Những mảnh RNA được gọi tắt là siRNA (short interfering RNA - RNA ngắn can thiệp) và liên kết bởi protein của RNA- phức hệ gây nên sự

im lặng (RISC) Những phức hệ RISC nhận ra

và làm suy biến RNA sợi đơn tương ứng trong trình tự siRNA dsRNA (double strand RNA) là đoạn RNA dài mạch kép mang trình tự bắt cặp

bổ sung được với gene mục tiêu

Khi dsRNA vào tế bào, nó bị Dicer (1 lọai

enzyme cắt RNA mạch kép) cắt thành những đọan ngắn gọi là siRNA (small interfering RNA) Một mạch đơn của siRNA gắn với RISC (RNA - induced silencing complex) tạo phức hợp Phứchợp này tương tác với mRNA của gene mục tiêu và cắt nhỏ mRNA này

Trong 2 mạch đơn này, chỉ mạch nào có đầu 5’

có hoạt lực với Agronauttrong phức hệ RISC mới gắn được với phức hệ RISC => tạo phức hợp siRNA-RISC Mạch còn lại đầu 5’ không có hoạt lực với Agronaut => không liên kết với

RISC được Sự xuất hiện của mạch đơn siRNA

sẽ hoạt hoá RISC thành trạng thái hoạt động (RISC*)

Con đường hình thành miRNA

Quá trình hình thành miRNA diễn ra ở nhân tế bào (nuclear) và trong tế bào chất (cytoplasma)

Ở trong nhân, các phân tử miRNA được tạo ra thông qua quá trình phiên mã từ các gene gọi làcác phân tử miRNA nguyên thuỷ (pri- miRNA), các phân tử này có chứa các cấu trúc kẹp tóc (hairpin) Các phân tử pri-miRNA được cắt bởi enzyme Drosha để tạo thành những sợi Pre-miRNA (phân tử tiền microRNA)=> gọi là quá trình chế biến pri- miRNA Các phân tử Pre- miRNA sẽ được di chuyển ra ngoài tế bào chất.Ngoài tế bào chất, Pre- miRNA sau khi được di chuyển ra ngoài tế bào chất sẽ được enzyme Dicer cắt thành những đoạn RNA nhỏ (khoảng

19 – 21 nu) Các đoạn miRNA được tách đôi, tạo ra các sợi miRNA đơn Trong đó sợi có đầu 5’ có hoạt lực với Agronaut trong phức hợp

RISC => sẽ kết hợp với phức hợp RISC tạo

thành phức hệ miRNA-RISC

Sự khác nhau giữa siRNA và miRNA

Về mặt nguồn gốc, RNA mạch kép (dsRNA) có cấu trúc là chuỗi xoắn kép Tiền miRNA(Pre-

miRNA) có cấu trúc dạng thân vòng (steen-loop)hay dạng kẹp tóc (hairpin)

Xét về vị trí hình thành, chúng xảy ra ở ngoài tế bào chất Trong nhân và ngoài tế bào chất

Cơ chế can thiệp RNA

Cơ chế chung

• Chia làm 3 bước chủ yếu :

1. dsRNA bị cắt nhỏ ra thành những đoạn

siRNA bởi Dicer

2. siRNAs gắn vào phức hợp RISC

3. Phức hợp trên tìm mRNA thích hợp để gắn vào và phân giải

Khả năng chống lại các virus và gene nhảy

Sự can thiệp RNA đóng vai trò quan trọng trong việc chống lại sự xâm nhiễm của các virus, đặc biệt là các sinh vật bậc thấp hơn vào cơ thể vật chủ Nhiều virus có thông tin di truyền chứa trênRNA sợi đôi Khi các virus này xâm nhiễm vào

tế bào, chúng bơm thông tin di truyền vào tế bào vật chủ Khi đó, RNA lập tức vào Dicer,

phức hợp RISC kích hoạt, RNA virus bị phân hủy, tế bào vật chủ thoát khỏi xâm nhiễm.

Gene nhảy (trasposon) là các trình tự DNA có thể di chuyển trong bộ gen Nhiều transposon hoạt động bằng cách sao chép DNA thành RNA,sau đó, RNA phiên mã ngược thành DNA và gắn vào vị trí khác trên bộ gene Sự can thiêp RNA bảo vệ bộ gene chống lại transposon

Một số quá trình sống của tế bào có liên quan đến quá trình can thiệp RNA

• Khi virus RNA nhiễm vào tế bào, nó tiêm bộ gene có chứa RNA mạch đôi của nó vào bên trong Can thiệp RNA tiêu hủy RNA của virus, ngăn cản sự hình thành virus mới

• Sự tổng hợp của nhiều loại protein do các gene mã hoá cho vi RNA kiểm soát Sau khi

xử lý, vi RNA ngăn cản sự dịch mã từ mRNA thành protein

• Trong phòng thí nghiệm, các phân tử RNA mạch đơn được biến đổi để hoạt hoá phức hợp RISC để phân hủy mRNA của một gene chuyên biệt nào đó

• Quá trình can thiệp RNA được kích hoạt khi phân tử RNA tồn tại trong tế bào với cấu trúc sợi đôi

• RNA sợi đôi kích hoạt một cơ chế hoá sinh đểphân huỷ các phân tử mRNA có mã di truyền giống với nó.

• Khi các phân tử mRNA này biến mất => gene tương ứng bị bất hoạt => không có protein nào do gene đó mã hoá được tạo thành

Cơ chế làm tắt gene bởi siRNA

Trong tế bào, sự biểu hiện hoặc cảm ứng của RNA mạch kép dài là kết quả của sự bắt cặp giữa mạch mang mã (sợi có nghĩa) và mạch đối

mã (sợi vô nghĩa) Các đoạn dsRNA sợi kép dàiđược cắt bởi enzyme Dicer tạo ra những đoạn RNA ngắn (siRNA) khoảng 21-28 nucleotit

• Sau đó các siRNA được tháo xoắn dưới tác dụng của enzyme helicase và một mạch đượcnạp vào phức hợp protein một cách chon lọc gọi là phức hợp cảm ứng bất hoạt RISC

• Sự xuất hiện của mạch đơn siRNA sẽ hoạt hoá RISC thành trạng thái hoạt động (ký hiệu

là RISC*)

• Cuối cùng phức hợp siRNA-RISC* này sẽ tìm kiếm các transcriptome (sản phẩm của quá trình phiên mã) một cách đặc hiệu và những RNA mục tiêu tiềm năng

• Sợi đơn siRNA sau khi được nạp vào RISC được gọi là mạch hướng dẫn, nó đóng vai trò chỉ đạo trong việc đưa phức hợp siRNA-

RISC* đến các phân tử mRNA có trình tự bổ sung với nó.Việc chỉ đạo của siRNA thông qua một endonuclease có trong RISC là

Agronaute protein

• RISC* cũng có thể xâm nhập được vào nhân

tế bào và kết cặp với trình tự tương đồng trênphân tử DNA hệ gene

• Lúc này RISC* huy động một số protein làm cải biến chất nhiễm sắc quanh vị trí promoter của gene => sự kìm hãm phiên mã

• Cơ chế tắt gen lúc này phụ thuộc vào mức độtương đồng giữa siRNA và mRNA đích

• Nếu sự tương đồng giữa siRNA và mRNA đích là hoàn toàn thì phân tử mRNA có xu hướng bị cắt và phân giải (do hoạt tính

nuclease của RISC) => không có mRNA mã hoá cho protein đó

• Nếu sự tương đồng giữa siRNA và mRNA chỉ

là một phần thì xu hướng xảy ra là sự ức chế dịch mã do khi chung bám trên mRNA

=> ngăn cản sự dịch chuyển của Ribosome

trong quá trình dịch mã => quá trình dịch mã bi ngưng lại

=> không tạo ra được protein

• Cơ chế tắt gene bởi siRNA có hiệu quả rất cao, chỉ cần một lượng nhỏ siRNA được đưa vào tế bào cố thể đủ để làm tắt hoàn toàn sự biểu hiện của một gene nào đó (vốn có rất nhiều bản sao trong cơ thể đa bào)

Cơ chế làm tắt gene bởi miRNA

• Trong tự nhiên, ngoài cơ chế điều hoà biểu hiện gene bằng sợi siRNA còn có cơ chế điềuhoà biểu hiện của gene bởi một nhóm RNA khác gọi là micro RNA (miRNA)

• Cơ chế hoạt động của miRNA trong quá trình

ức chế sự biểu hiện của gene cũng tương tự như ở siRNA

• Các miRNA có chiều dài khoảng 19-24

nucleotit được tạo từ tác động cắt các đoạn Pre- miRNA có trình tự kẹp tóc (được phiên

mã từ các đoạn DNA không mã hoá protein) bởi 2 enzyme là Drosha và Dicer

• Gần 70% các miRNA được phát sinh liên

quan đến sự điều tiết trong quá trình phiên

mã tạo ra các mRNAvà các RNA không sinh tổng hợp các protein Và 30% còn lại được phát sinh độc lập không liên quan đến quá trình nhân lên (chức năng của 30% miRNA này chưa được làm rõ).

• Tương tự với siRNA: Các miRNA có thể điều tiết sự phân giải mRNA với sự hiện diện của phức hợp RISC trong trường hợp bổ sung hoàn toàn(ở thực vật) (perfect

complementary)

• Trong trường hợp bổ sung không hoàn toàn (inperfect complementary) với vùng 3’ UTR của mRNA => ức chế quá trình dịch mã

• Ước lượng có khoảng 120 gene mã hoá cho miRNA ở giun tròn, ở người có khoảng 250 gene và 50% gene mã hoá protein ở người đang bị kiểm soát bởi miRNA

• Thông thường các gene miRNA được điều hoà theo kiểu chỉ biểu hiện vào những thời điểm nhất định và ở các mô nhất định trong quá trinh phát triển của cá thể

• Đáng chú ý là 30% các phân tử miRNA ở giuntrong có trình tự rất giống ở ruồi giấm và độngvật có vú Điều này cho thấy, dường như cơ chế điều hoà biểu hiện gene bởi miRNA đã có

nguồn gốc từ lâu trong quá trình tiến hoá và vai trò của chúng trong việc " lập trình" biểu hiện của hệ gene là rất quan trọng đối với giớisinh vật.

Những thành tựu và triển vọng của việc nghiên

cứu ứng dụng RNAi

Tạo Hoa Hồng Xanh

Trong cây trồng có một loại phân tử được gọi là anthocyanin được coi là sắc tố chủ đạo trên

hoa, trái và các mô tế bào khác Thông thường các màu chính của hoa bắt nguồn từ

anthocyanin với sự có mặt của một ít các chất carotenoid màu vàng Ngoài ra anthocyanin

dihydrokaempferol (DHK) lại là một enzyme chi phối cho cả 3 chu trình hình thành sắc tố trên cây trồng bao gồm: cyanidin, pelargonidin và delphinidin

Gene cyanidin mã hóa một enzyme làm thay đổienzyme DHK nhằm hình thành chu trình

cyanidin dẫn đến biểu hiện các màu đỏ, hồng hay màu tím hoa cà Trong khi đó gene

delphinidin không hiện diện trong cây hoa hồng

sẽ mã hóa một enzyme khá tương đồng cho việc thay đổi enzyme DHK nhằm hình thành sự tổng hợp màu theo chu trình delphinidin Một

loại enzyme khác có tên gọi là dihydroflavinol reductase (DFR) sẽ hỗ trợ các màu chỉ chị trong

cả ba chu trình trên Enzyme này rất quan trọng

vì không có nó sẽ không thể tạo màu trên các cánh hoa Chính vì vậy mà các đột biến gene DFR đều cho ra những hoa có màu trắng Tronghoa hồng không có gene delphinidin để hình thành màu theo chu trình của nó Chu trình

delphinidin có thể hình thành màu đỏ hoặc xanhtrên hoa dưới sự tác động của DRF và pH

Để tạo ra bông hồng xanh, các nhà khoa học của Suntory đã áp dụng một bộ 3 gene Một gene nhân tạo được dùng cho kỹ thuật RNAi nhằm ức chế gene DFR của hoa hồng làm cho hoa hồng không biểu hiện màu Sau đó chuyển gene delphinidin từ loài hoa păng-xê và gene DFR từ loài hoa iris sẽ tạo ra hoa hồng có hàm lượng delphinidin rất cao trong cánh hoa Tuy nhiên cũng phải lưu ý một yếu tố ảnh hưởng đến màu xanh trên cánh hoa đó chính là độ pH

tế bào và đó là một trong những lý do chính là tại sao các loài hoa có cùng chu trình

anthocyanin nhưng lại có màu khác nhau Khi nồng độ pH tế bào mang tính kiềm thì sắc tố của anthocyanin thường trở nên xanh hơn pH của đất không ảnh hưởng hay ảnh hưởng rất ít đến pH tế bào cánh hoa Nồng độ pH tế bào

cánh hoa thường mang tính di truyền Cánh hoahồng thông thường có nồng độ pH khoảng 4.5 chính vì vậy để tạo ra các cánh hoa hồng có nồng độ pH thấp thì rất hạn chế Vì vậy các nhà khoa học mới nghĩ đến kỹ thuật ức chế gene bằng kỹ thuật RNAi nhằm xác định những gen ảnh hưởng đến tính axít của cánh hoa hay điều chỉnh màu của cánh hoa theo những hướng khác.