đánh giá hiệu quả sử dụng vaccin cúm gia cầm h5n2ở gà h5n1 ở vịt tại đông anh, hà nội

Định nghĩa bệnh cúm gia cầm thể độc lực cao Theo Liên Minh Châu Âu EU - European Union - và Hiệp hội Nông LơngLiên hiệp Quốc FAO – Food Agriculture Organization "Bệnh truyền nhiễm ởgia c

Lời cảm ơn

Trong thời gian học tập và rèn luyện tại Trờng Đại học Nông nghiệp

I, em đợc sự dạy dỗ tận tình của các thầy cô giáo trong trờng, đặc biệt là các thầy cô giáo trong Khoa Chăn nuôi thú y đã dìu dắt, trang bị những hành trang kiến thức giúp em trởng thành.

Hoàn thành báo cáo thực tập tốt nghiệp này ngoài sự nỗ lực của bản thân, em đã nhận đợc sự hớng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, nhân dịp này cho phép em đợc bầy tỏ lòng biết ơn, kính trọng sâu sắc đến:

Thầy giáo Lê Văn Lãnh – Giảng viên bộ môn Vi sinh vật –Truyền nhiễm - Bệnh lý Khoa Chăn nuôi Thú Y – Trờng Đại học Nông nghịêp I Hà Nội.

TS Nguyễn Tiến Dũng – Trởng phòng Siêu vi trùng – Viện Thú Y Quốc Gia- Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn.

BS Nguyễn Thế Vinh – Cán bộ phòng Siêu vi trùng – Viện

Thú y Quốc Gia – Bộ Nông nghịêp và Phát triển Nông thôn,

Đồng thời, em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của Ban chủ nhiệm Khoa Chăn nuôi Thú Y, Ban lãnh đạo Viện Thú Y Quốc Gia và tập thể cán

bộ công nhân viên bộ môn Siêu vi trùng.

Cuối cùng cho phép em đợc gửi lời cảm ơn tới tất cả ngời thân trong gia đình, bạn bè, những ngời đã động viên, tạo điều kiện giúp đỡ em hoàn thành công việc trong quá trình học tập.

Hà Nội, ngày 15 tháng 2 năm 2006

Sinh viên Nguyễn Thi Thu Hơng

Phần I

Đặt vấn Đề

Bệnh cúm gia cầm thể độc lực cao H5N1 nổ ra tại Việt Nam cuối năm 2003

đã gây ra những hậu quả nghiêm trọng đến đời sống xã hội, làm giảm tăng trởngkinh tế quốc dân và ảnh hởng đến sức khoẻ con ngời Hàng triệu con gia cầm đã

bị tiêu huỷ, các vụ dịch cúm gia cầm đã gây ra những đình trệ và thiệt hại lớn vềkinh tế Đầu năm 2004, những ca cúm gia cầm ở ngời đầu tiên đã đợc phát hiệntại Việt Nam và Thái Lan Đến năm 2005, những ca bệnh cúm này còn đợc pháthiện tại Camphuchia, Trung Quốc, Indonexia và Thổ Nhĩ Kỳ Virus cúm gia cầmhiện nay đã lan truyền rộng khắp các quốc gia và ít có khả năng virus này sẽ bịloại trừ trong vài năm tới Chừng nào virus cúm gia cầm còn tồn tại dai dẳngtrong quần thể gia cầm thì vẫn còn những hiểm hoạ cho con ngời Điều đó đòihỏi phải có biện pháp khống chế bệnh nhanh chóng và có hiệu quả

Các biện pháp khống chế, kiểm soát dịch bệnh truyền thống tập trung vàotiêu huỷ, khử trùng tiêu độc đòi hỏi loại bỏ trên quy mô lớn những đàn nhiễmbệnh và những đàn tiếp xúc với virus cúm Những chính sách này đã cho kết quảtốt nhng đặc biệt tốn kém, không triệt để trong tình trạng hiện nay Mật độ chănnuôi nông hộ vẫn rải rác trong các thôn xóm khó kiểm soát dẫn đến phải tiêu diệthàng triệu gia cầm, ảnh hởng lớn đến vấn đề môi trờng và thiệt hại kinh tế củangời dân

Tiêm phòng bệnh cúm gia cầm đã đợc chứng minh là biện pháp hỗ trợ hiệuquả kết hợp với các biện pháp an toàn sinh học, biện pháp loại thải có kiểm soáttại một số quốc gia: Italy, Mexico, Pakistan, Hồng Kông, Trung Quốc Biện pháptiêm phòng vacxin có 2 lợi thế cơ bản: Thứ nhất vacxin làm giảm sự cảm nhiễmbệnh đối với gia cầm đã đợc tiêm phòng, thứ hai giảm đáng kể lợng virus bài thải

ra môi trờng bên ngoài ở gia cầm đã đợc tiêm phòng Nh vậy làm giảm nguy cơlây lan của virus sang các đàn gia cầm khác, giảm nguy cơ lây nhiễm cho con ng-

ời và giảm cơ hội cho virus biến chủng tạo thành chủng virus mới ở ngời

Xuất phát từ tình hình diễn biến dịch cúm gia cầm qua các năm 2003 –

2004 và nửa đầu năm 2005, Ban chỉ đạo Quốc gia về phòng chống cúm gia cầmquyết định sử dụng vacxin nh là một vũ khí quan trọng hỗ trợ tích cực cho chiếnlợc này Việc lựa chọn loại vacxin phù hợp là rất quan trọng, chính vì vậy mà

chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: –Đánh giá hiệu quả sử dụng vacxin cúm

gia cầm H5N2 ở gà và H5N1 ở vịt tại huyện Đông Anh – Hà Nội–.

1.1 Xác định đợc tính an toàn, hiệu lực của vacxin và hiệu quả khi dùngvacxin cúm gia cầm.

1.2 Xác định khả năng đáp ứng miễn dịch của đàn gia cầm đợc tiêm vacxin 1.3 Xác định đợc loại vacxin sử dụng có phù hợp về kỹ thuật và kinh tế haykhông

Phần II tổng quan tài liệu

-2.2 Định nghĩa bệnh cúm gia cầm thể độc lực cao

Theo Liên Minh Châu Âu (EU - European Union) - và Hiệp hội Nông LơngLiên hiệp Quốc (FAO – Food Agriculture Organization) "Bệnh truyền nhiễm ởgia cầm đợc gây ra do bất cứ một virus cúm A nào, có chỉ số gây bệnh khi tiêmtruyền tĩnh mạch cho gà 6 tuần tuổi lớn hơn 1,2 hoặc một bệnh gây ra do cácphân type H5 hoặc H7 mà khi phân tích trình tự nucleotide thấy có nhiềuaminoaxit cơ bản tại các vị trí phân chia của ngng kết tố hồng cầu” [30], [32].Tuy nhiên, các virus cúm độc lực mạnh gây bệnh truyền nhiễm cao ở gia cầm(HPAI) đã đợc phân lập từ đàn gia cầm nhiễm virus có tính gây bệnh thấp (LPAI –Lowly pathogenic avian influenza) thuộc thế hệ sau của phân type H5 và H7

Do đó, để có thể kiểm soát đợc cả virus gây bệnh HPAI và LPAI khi pháthiện có ở đàn gia cầm, Tổ chức thú y thế giới (OIE – Office Internationale des

Epizooties) và EU định nghĩa mới về bệnh cúm gia cầm nh sau: –Bệnh truyền

nhiễm ở gia cầm đợc gây ra do bất cứ một virus cúm A nào có chỉ số gây bệnh khi tiêm truyền tĩnh mạch cho gà 6 tuần tuổi lớn hơn 1,2 hoặc do bất cứ phân type H5 và H7 của virus cúm A– [31].

2.3 Danh pháp

Năm 1980, Tổ chức y tế Thế giới (WHO – World Health Organization) đã

đa ra một hệ thống phân loại mới cho các virus cúm type A và xắp xếp lại một sốphân type mà trớc đó đợc xem là khác nhau nhng sau thấy có quan hệ với nhauvào một nhóm Đồng thời, việc đặt tên cho một virus cúm mới đợc phân lập cũng

đợc quy định chặt chẽ là phải thể hiện theo trình tự: Loại kháng nguyên, nguồngốc vật chủ, địa điểm phát hiện, số chủng phân lập của phòng thí nghiệm, nămphân lập đợc virus và riêng virus cúm A phải quy định rõ các phân type H, N

Ví dụ (A/gà tây/Anh/79/H7N7) [47]

2.4 Lịch sử bệnh

Bệnh cúm gia cầm lần đầu tiên đợc phát hiện ở ý vào năm 1878 và virusbệnh nguyên đợc xác nhận vào năm 1955, trong lịch sử, bệnh giống nh cúm lần

đầu tiên đợc Hippocrates mô tả rất kỹ vào năm 412 trớc công lịch và các ổ dịchgiống nh dịch cúm từ năm 1173 đã đợc tác giả Hirsch tổng hợp một cách chi tiếtnăm 1580 và giai đoạn đó trở đi ngời ta đã ghi nhận đợc 31 đại dịch giống nhcúm (Noble, 1982) Trong hơn 100 năm đã xảy ra 4 đại dịch cúm vào năm 1889,

1918, 1957 và 1968 [33], [5]

Năm 1878, ở Italy đã xảy ra một bệnh gây tử vong cao ở đàn gia cầm, đã

đ-ợc Porroncito mô tả gọi là bệnh dịch hạch gia cầm và đđ-ợc coi là một bệnh nguyhiểm Đến năm 1901, Centanni và Savunozzi đã đề cập đến ổ dịch mà căn nguyên

là một virus siêu nhỏ qua lọc Nhng phải đến năm 1995 Schafet xác định đợcvirus thuộc type A thông qua kháng nguyên bề mặt H7N1 và H7N7 gây chếtnhiều gà, gà tây và các loài khác [5]

Năm 1971 ở Mỹ xảy ra một đợt dịch cúm khá lớn trên gà tây Những nămtiếp theo dịch cúm gia cầm xảy ra ở nhiều quốc gia, vùng trên Thế Giới trongcuối thế kỷ 19 và 20 nh: Bắc Mỹ, Nam Mỹ, Viễn Đông, Trung Đông, Châu Âu,Liên hiệp Anh và Liên Xô cũ

Những công trình nghiên cứu về bệnh cúm gia cầm lần lợt đợc công bố tạicác nớc: ở úc năm 1975, ở Anh năm 1979, ở Mỹ năm 1983 - 1984 Từ sau khiphát hiện ra virus cúm type A, các nhà khoa học đã tăng cờng nghiên cứu và thấyvirus cúm có ở nhiều loài chim hoang dã và gia cầm nuôi trên thế giới và thấybệnh dịch nghiêm trọng nhất xảy ra đối với gia cầm là những chủng gây bệnh caothuộc phân type H5N7, nh ở Scotland năm 1959 là H5N1, ở Mỹ năm 1983 –

1984 là H5N2 [33], [42]

Việc các vụ dịch cúm liên tục bùng nổ khắp các châu lục trên thế giới đãthôi thúc Hiệp hội các nhà chăn nuôi gia cầm tổ chức hội thảo chuyên đề về bệnhcúm gà, hội thảo đã đợc tổ chức lần đầu tiên vào năm 1981 tại Beltsville, Mỹ, lầnthứ 2 tại Ailen 1987 và lần thứ 3 cũng tại Ailen 1992 Từ đó tới nay trong các hộinghị về dịch tễ trên thế giới, bệnh gia cầm luôn luôn là một trong những nội dung

đợc quan tâm hàng đầu, điều đó khẳng định bệnh dịch cúm gia cầm ngày càngtrở nên phổ biến và gây nhiều thiệt hại kinh tế cho ngành chăn nuôi gia cầm thếgiới

Các tác động của dịch cúm gia cầm

Thiệt hại về gia cầm và sản

phẩm gia cầm

Mất việc làm, tăng

tỷ lệ nghèo, xáo trộn sinh hoạt

Ô nhiễm môi ờng nớc, không khí, điều kiện làm việc

Khả năng lây lan bệnhDoanh nghiệp, ngời chăn An ninh chính trị và Kiểm soát vận Bệnh đờng

nuôi bị phá sản, nợ lần đời sống có thay đổi chuyển giống và thức ăn chăn

nuôi cha tốt

ruột, ngoài datăng

- Thu nhập hàng ngày của

- ảnh hởng của giá

cả, xáo trộn bất ổn thị trờng

- Cha có sự cảm thông sâu sắc với ngời bị hại quá

nặng

- Gà nuôi phân tán, khả năng tái phát dịch rất lớn

-Thiếu nguồn

đạm hàng ngày, thiếu thức ăn và dinh dỡng

- ảnh hởng tâm lý căng thẳng trong thời gian dịchbệnh

2.5 Tình hình bệnh cúm gia cầm thể độc lực cao trên thế giới, trong khu vực và tại Việt Nam

2.5.1 Tình hình bệnh cúm gia cầm thể độc lực cao trên thế giới và trong khu vực

Trong khoảng 50 năm trở lại đây dịch cúm gia cầm đã xảy ra ở nhiều nớctrên thế giới nh: Mỹ, Anh, Australia và gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi[39], [47]

Tại Mỹ, trong năm 1983- 1984 ở bang Penasylvani đã tiêu huỷ trên 17

triệu gia cầm thuộc 448 đàn, làm thiệt hại hơn 60 triệu USD, đây là những chiphí dùng trong việc chẩn đoán, chống và dập dịch Ngoài ra, còn có 349 triệuUSD thiệt hại do giảm sản lợng trứng, thịt và tăng chi phí thức ăn cũng nh việctăng giá nhập trứng và thịt

ở úc, năm 1985 dịch cúm gà cũng đã xảy ra và làm thiệt hại 2 triệu USD

vào những việc có liên quan

Tại Pakistan, tháng 10 năm 1994 Newe.C.W và cộng sự đã công bố dịch cúm

gà do virú H7 gây ra ở gà từ 7-66 tuần tuổi làm 63% số gà trong ổ dịch bị chết

Năn 1997, dịch cúm gia cầm xảy ra ở Hồng Kông có thể coi là một đại

dịch trong chăn nuôi gia cầm, đã gây thiệt hại to lớn về mọi mặt cho đặc khu này,

kể cả kinh tế và chính trị với hàng chục ngời tử vong do cúm gà

Năm 2001, ở Italia có gần 400 cơ sở chăn nuôi bị dịch cúm làm chết và bị

huỷ 12 triệu gà

Năm 2003, dịch xuất hiện ở Hà Lan, nhà nớc đã phải tiêu huỷ 6 triệu con

gia cầm của 1049 trại chăn nuôi quốc doanh và 16940 trại chăn nuôi t nhân [6], [35]

Từ cuối năm 2003 đến nay đã có 14 nớc và vùng lãnh thổ xuất hiện dịchcúm gia cầm H5N1 gồm Hàn Quốc, Nhật Bản, Thái Lan, Campuchia, Lào, Indonexia, Trung Quốc, Malaysia, Mông Cổ, Thổ Nhĩ Kỳ, Nga, Kazakhastan, Rumani, Croatia và Việt Nam

2.5.2 Tình hình bệnh cúm gia cầm ở Việt Nam giai đoạn 2003 – 02/2006

2.5.2.1 Diễn biến dịch

Dịch cúm gia cầm ở nớc ta xuất hiện lần đầu tiên vào cuối tháng 12/2003,

đến 27/02/2004 cơ bản đã khống chế đợc dịch Sau gần 2 tháng không có ổ dịchmới, đến giữa tháng 4/2004 dịch lại bắt đầu tái phát rải rác đến tháng 11/2004 rồilại bùng tái phát trở lại vào cuối tháng 12/2004 cho đến 9/1/06 Nh vậy, thời gianqua nớc ta liên tục có dịch cúm gia cầm Để thuận lợi cho việc đánh giá về dịch

tễ học, Cục thú y chia quá trình dịch ra làm 3 đợt nh sau:

Đợt dịch thứ nhất: từ tháng 12/2003 đến 30/3/2004: Lần đầu tiên trong

lịch sử nớc ta dịch cúm gia cầm xuất hiện vào cuối tháng 12 năm 2003 ở tỉnh HàTây, Long An và Tiền Giang Dịch lây lan rất nhanh, chỉ trong vòng 2 tháng, đếnngày 27/2/2004 dịch đã xuất hiện ở 2.574 xã, phờng (chiếm 24,6% số xã, phờng),

381 huyện, quận, thị xã (60%) thuộc 57 tỉnh, thành phố trực thuộc Trung ơng:Các tỉnh xảy ra nặng là Long An, Tiền Giang, Đồng Tháp, Hà Tây, Hải Dơng Tổng số gà và thuỷ cầm mắc bệnh, chết và tiêu huỷ hơn 43,9 triệu con, chiếm16,79% tổng đàn, trong đó gà chiếm 30,4 triệu con, thuỷ cầm chiếm 13,5 triệucon Ngoài ra còn có 14,76 triệu con chim cút và các loài chim khác bị chết vàtiêu huỷ

Đợt dịch thứ hai: từ tháng 4 đến tháng 11/2004.

Trong giai đoạn này dịch phát ra rải rác với quy mô nhỏ ở các hộ gia đìnhchăn nuôi gia cầm; bệnh xuất hiện ở 46 xã, phờng tại 32 huyện, quận, thị xãthuộc 17 tỉnh Thời gian cao điểm nhất là tháng 7 sau đó giảm dần, đến tháng 11

cả nớc chỉ có một điểm phát dịch Tổng số gia cầm tiêu huỷ trong giai đoạn này

là 84.078 con, trong đó 55.999 gà, 8.132 vịt và 19.974 chim cút

Đợt dịch thứ ba:

- Từ ngày 1/1/2005 đến ngày 30/3/2005 dịch cúm gia cầm đã xảy ra ở 669xã, tại 182 huyện thuộc 35 tỉnh, thành phố trong cả nớc gồm 15 tỉnh phía Bắc, 20tỉnh phía Nam Số gia cầm tiêu huỷ là 469.578 gà; 825.689 vịt, ngan và 551.029chim cút;

- Từ ngày 1/4/2005 đến 30/9/2005 dịch cúm gia cầm xảy ra ở 17 xã, 15huyện thuộc 10 tỉnh, thành phố Số gia cầm tiêu huỷ là 14.352 con trong đó gà là7.182 con; vịt, ngan là 7.170 con;

- Từ đầu tháng 10/2005 đến 01/2006 dịch cúm gia cầm đã tái phát và xuấthiện ở 285 xã phờng, thị trấn của 100 quận, huyện, thị xã của 24 tỉnh, thành phố.Tổng số gia cầm ốm chết, bắt buộc tiêu huỷ và tự nguyện tiêu huỷ là 3.972.973con, trong đó: 1.345.832 gà, 2.095.667 vịt, ngan và 531471 chim cút, bồ câu,chim cảnh Tính đến 10/01/2006 cả nớc cơ bản đã khống chế đợc dịch

2.5.2.2 Tình hình bệnh cúm gia cầm tại Đông Anh

Đông Anh là huyện nuôi gia cầm phát triển số đầu gia cầm nhiều nhấttrong các huyện, nhiều xã nông dân chăn nuôi với lợng lớn, nhng chuồng trại chủyếu ở trong khuôn viên gia đình nên khi dịch xảy ra rất khó khống chế Điển hìnhxã Tiên Dơng, ngày 20/1/2004 đàn gà đầu tiên bị dịch đã chết rất nhanh Sau 1tuần có 7 hộ gia đình ở 3 thôn trong xã bị dịch, số đầu con thiệt hại là 52.942 controng đó có 40.672 con gà, 770 con vịt, ngan và 11.500 con chim

2.5.2.3 Nhận xét về đặc tính dịch tế học của dịch cúm gia cầm tại Việt Nam năm 2005

- Năm 2005, dịch cúm gia cầm xảy ra ở nhiều tỉnh, thành phố trong cả nớc,

đặc biệt là đợt dịch thứ 1 đầu năm 2005 xảy ra ở 35 tỉnh, thành phố; một số tỉnh,thành phố xảy ra 2 hoặc 3 lần trong năm;

- Đợt dịch thứ 2 (từ tháng 4 đến tháng 9 năm 2005) chỉ xảy ra lẻ tẻ ở 10tỉnh, thành phố;

- Đợt dịch thứ 3 (từ 1/10/2005 đến 10/1/2006) xảy ra chủ yếu ở các tỉnhphía Bắc Các tỉnh từ Bình Định trở vào không xảy ra dịch;

- Tính đến ngày 10/1/2006 cả nớc cơ bản đã khống chế đợc dịch Cục Thú

Y tuyên bố hết dịch trên phạm vi toàn quốc

Qua theo dõi diễn biến dịch từ khi xuất hiện tới nay có thể rút ra một sốnhận xét sau:

- Về loài hình và quy mô dịch; Trong năm 2005, dịch chủ yếu xảy ra trên

đàn gia cầm chăn nuôi nhỏ lẻ trong các hộ gia đình;

- Về loài gia cầm mắc bệnh: Dịch tập trung vào đàn vịt, tỷ lệ mắc bệnh vàchết ở vịt cao nhất chiếm 50,80%, gà chiếm 31,14% và chim cút chiếm 18,06%

Đại dịch nguy hiểm nhất trong lịch sử là vào năm 1918 - 1919, ớc tính đã

có 20 - 40 triệu ngời chết trên toàn thế giới (nhiều hơn số ngời chết trong chiếntranh thế giới lần thứ nhất), dịch đã xuất hiện ở Bắc Mỹ, Châu âu, Châu á, ChâuPhi với tỷ lệ tử vong cao vào khoảng 2,5%

+ Năm 1918 – 1919, "Cúm Tây Ban Nha" do biến chủng H1N1 gây nên

có số lợng ngời bị chết lớn nhất, hơn 500.000 ngời bị chết ở Mỹ và từ 20-50 triệungời bị chết trên toàn thế giới

+ Năm 1957 – 1958, "Cúm Châu á" do biến chủng H2N2 đã làm cho

70.000 ngời chết ở Mỹ Bệnh xuất hiện đầu tiên ở Trung Quốc vào cuối tháng 2

và cúm Châu á lan sang Mỹ vào tháng 6 năm 1957

+ Năm 1968 – 1969, "Cúm Hồng Kông" do chủng H3N2 đã làm xấp xỉ

34.000 ngời chết ở Mỹ Virut này lần đầu tiên đợc phát hiện ở Hồng Kông vào

đầu năm 1968 và lan sang Mỹ vào cuối năm đó Virut Type A (H3N2) hiện vẫn

Sự phân bố và lu hành của virus cúm gia cầm rất khó xác định chính xác.

Sự phân bố bị ảnh hởng của cả loài vật nuôi và hoang dã, tập quán chănnuôi gia cầm, đờng di trú của dã cầm, mùa vụ và hệ thống báo cáo dịch bệnh Sự

lu hành cũng bị ảnh hởng của những nguyên nhân tơng tự và sự khác nhau củacác quốc gia về hệ thống, phơng pháp nghiên cứu

Ví dụ: ở gà tây tại Minnesota, Mỹ thì sự lu hành bệnh rất cao trong vài năm

nhng sau đó bệnh gần nh không tồn tại, nguyên nhân không phải do miễn dịch đàn

đợc kéo dài, hoặc không có virus mà thực tế không giải thích đợc

Sự phân bố và lu hành virus cúm gia cầm đã xảy ra trong phạm vi toàn cầu

do sự di trú của các dã cầm, do đó rất khó dự đoán khi nào virus xuất hiện, gâythành dịch cho đàn gia cầm nuôi và việc ngăn chặn sự tiếp xúc giữa các loài giacầm nuôi có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển chăn nuôi gia cầm [13]

2.7.2 Động vật cảm nhiễm

Virus cúm type A gây bệnh chủ yếu cho gia cầm (đặc biệt ở gà), ngời và

động vật có vú khác

Năm 1959, ở Scotland đã phát hiện từ gà phân type virus cúm H5, mà trớc

đó, hầu hết các virus cúm gây bệnh cao đều thuộc phân type H7

Cho đến nay, các virus kể trên đều thuộc phân type H5 hoặc H7 Các virusnày chỉ gây ra các ổ dịch lẻ tẻ, dễ bị khống chế

Trớc năm 1955, gia cầm thờng nhiễm chủng virus cúm có độc lực thấp dù

Vịt nuôi cũng bị nhiễm virus cúm nhng ít phát bệnh do vịt có sức đề khángvới virus bệnh, kể cả những chủng có độc lực cao gây bệnh nặng cho gà, gà tây.Tuy nhiên, năm 1961, ở Nam Phi đã phân lập đợc virus cúm type A (H5N1) gâybệnh cho cả gà và vịt [33].

Phần lớn các loài gia cầm non đều mẫn cảm với virus cúm type A

Hiện nay đã phân lập đợc virus cúm từ vịt bầu, ngỗng, chim cút, gà nhật,

gà ngô, gà lôi

Phân type của virus cúm type A đã gây dịch cho nhiều loài động vật có vú

nh lợn, ngựa, chồn, hải cẩu và thú hoang dã nhiều nơi trên thế giới

Loài chồn cảm nhiễm cao với virus cúm Trong một ổ dịch tại một trại nuôichồn ở Thụy Điển đã phân lập đợc virus cúm type A (H4N10), chồn mắc bệnh 100%nhng chỉ chết 3% Phân type này đang lu hành trong các loài gia cầm

Lợn mắc bệnh cúm thờng do phân type H1N1 và H3N2 với biểu hiện: dãnphế quản, phế nang có dịch tiết và hạch khí quản, phổi bị sng và tụ huyết

2.7.3 Vật mang virus

Trong những năm 70 của thế kỷ XX, chúng ta đã biết một số lớn các viruscúm type A tồn tại trong chim hoang khắp nơi trên thế giới và cũng đợc quan tâmhơn đến sinh thái học của virus cúm gia cầm

Virus cúm đã phân lập đợc ở hầu hết các loài chim hoang dã trên thế giớinh: vịt, thiên nga, hải âu, mòng biển, vẹt, vẹt đuôi dài, vẹt mào, chim thuộc họ sẻ,diều hâu

Tại úc, Israel đã phân lập đợc virus cúm type A (H7N7) từ chim họ sẻ (sáo

đá) tiếp súc với gia cầm nuôi mắc bệnh và kết luận là những virus cúm gây bệnhcao đợc lây truyền giữa các loài gia cầm nuôi và chim họ sẻ [27]

Những loài chim nớc (waterfowl) là nguồn virus có ý nghĩa quan trọng đốivới gà tây đợc chăn thả tự do trục dọc theo đờng chim thờng bay qua ở Minnesota

Vịt từ khi bị nhiễm đến khi bắt đầu thải virus trong vòng 30 ngày Dờng

nh virus đợc duy trì trong số đôngvịt trời cho tới mùa sinh sản tiếp theo lại truyềncho các con non theo đờng tiêu hoá do virus bài thải theo phân, gây nhiễm bẩnnặng ao hồ

Do đặc điểm về cấu tạo gen của các virus cúm gia cầm trong các loài dãcầm khiến cho các loài này mang virus và là nguồn reo rắc virus cho các loàikhác, đặc biệt là gia cầm [29]

2.7.4 Sự truyền lây.

Khi gia cầm bị nhiễm virut cúm, virut đợc nhân lên trong đờng hô hấp và

đờng tiêu hoá Sự truyền lây bệnh đợc thực hiện theo 2 phơng thức là trực tiếp vàchủ yếu là gián tiếp

- Lây trực tiếp do con vật mẫn cảm tiếp xúc với con vật mắc bệnh thôngqua các hạt khí dung đợc bài tiết từ đờng hô hấp hoặc qua phân, thức ăn và nớcuống bị nhiễm

- Lây gián tiếp qua các hạt khí dung trong không khí với khoảng cách gầnhoặc những dụng cụ chứa virut do gia cầm mắc bệnh bài thải qua phân hoặc lây quachim, thú, thức ăn, nớc uống, lồng nhốt, quần áo, xe vận chuyển

Nh vậy virut cúm dễ dàng lây truyền tới những vùng khác do con ngời,

ph-ơng tiện vận chuyển, dụng cụ chăn nuôi Đối với các virut gây bệnh cúm truyềnnhiễm cao ở gia cầm thì sự truyền lây chủ yếu qua phân, đờng miệng

Chu kỳ bệnh cúm gia cầm trong loài chim và từ loài chim sang ngời

Đối với gia cầm nuôi, nguồn dịch bùng phát thờng thấy là:

+Từ các loài gia cầm nuôi khác nhau ở trong cùng một trang trại hoặctrang trại khác liền kề nh vịt lây sang gà hoặc từ gà tây lây sang gà, gà nhật lâysang gà lôi.

+Từ gia cầm nhập khẩu

+Từ chim di trú: đặc biệt là thuỷ cầm Vai trò của thuỷ cầm trong ổ dịch là:

Tỷ lệ lu hành các bệnh cao hơn đối với các đàn gia cầm nuôi nhốt trongcác điều kiện phơi nhiễm nh gà tây đợc nuôi trong các trang trại, vịt đợc nuôi vỗbéo tại các cánh đồng gần trại

Các ổ dịch cúm ở các khu vực có nguy cơ cao thờng xuất hiện theo mùacùng lúc với các hoạt động di trú của thuỷ cầm

Phần lớn các ổ dịch đều ghi nhận có sự tiếp xúc với thuỷ cầm tại điểm phátdịch đầu tiên

+Từ ngời và các động vật có vú khác Phần lớn các ổ dịch cúm gia cầmgần đây đã có sự lây lan thứ cấp thông qua con ngời

2.8 Mầm bệnh

2.8.1 Cấu tạo, hình thái, kích thớc của virus cúm gia cầm

Virus cúm gà có tên khoa học là influenza virus, thuộc họ orthomyxovirus,

là họ virus đa hình thái, có vỏ ngoài, genom là ARN đơn, (-), phân đoạn Trớc

đây, các virus orthomyxo và paramyxo đều đợc xếp chung vào một họ làMyxoviridae do chúng có cấu trúc và khả năng lây bệnh giống nhau, nhng về sau

đợc tách thành 2 họ riêng là orthomyxoviridae và Paramyxoviridae do phát hiệnthấy chúng có nhiều đặc điểm cơ bản không giống nhau Chữ myxo có nghĩa làchất nhầy, nguồn gốc của từ này là do phần ngoài cùng của protein của virus cómang các loại đờng và phần ngọn của các mạch nối đờng chính là một loại acid:acid sialic hay còn gọi là acid neuraminidic ortho có nghĩa là chính thống, nóilên loại myxovirus đợc phát hiện và đặt tên trớc

Virus cúm gia cầm có kích thớc trung bình, đờng kính 80 – 120 nm, trọnglợng phân tử 4,6 – 6,4 dal, trên kính hiển vi điện tử tơng phản âm có dạng gần

nh hình cầu hoặc các hạt mỏng, một số ít virus có dạng hình sợi có thể dài mộtvài nm, có vỏ bọc là Glycoprotein bao gồm protein gây ngng kết hồng cầu(kháng nguyên bề mặt) – Haemagglutinin (viết tắt là H) và protein enzim có thụthể – Neuraminidae (viết tắt N) đây là những kháng nguyên có vai trò quantrọng trong miễn dịch bảo hộ và có tính đa dạng cao [26], [29]

Hình thái vi cấu trúc của căn nguyên bệnh đợc Kawaoka 1988, và Muphymô tả khá chi tiết và nhấn mạnh rằng ARN của virus là một sợi đơn, âm chia 8

đoạn kế tiếp nhau mang 10 mật mã cho 10 loại virion protein khác nhau: HA,

NA, NP, M1, M2, PB1, PB2 và PA, tất cả 8 đoạn của sợi ARN có thể tách và phânbiệt rõ ràng thông qua phơng pháp điện di, các protein có vỏ bọc nhân nối 8 đoạnnày với nhau, đợc bọc bên ngoài bằng các protein và có màng lipip ở ngoài cùng[25], [47].

Cấu tạo virus cúm gia cầm

Do tính chất quan trọng và tính ứng dụng của chúng, chúng tôi chỉ trình

bày chi tiết hơn hai loại protein đó là HA và NA Việc ứng dụng đầu tiên là do sựkhác nhau về tính kháng nguyên nên protein HA đợc chia làm 15 loại ký hiệu từH1 đến H15 NA gồm có 9 loại và đợc ký hiệu từ N1 đến N9 ProteinHemagglutinine hay HA là một glycoprotein dới dạng trimer Mỗi monomer gồm

có 2 phần HA1 và HA2 Hai phần của protein này đợc nối với nhau bằng mộtchuỗi các acid amin trong đó có arginin Tại vị trí này các men cắt protein có sẵntrong cơ thể (trên các màng niêm mạc) của ký chủ sẽ cắt HA ra làm đôi, tạo điềukiện cho virus bám vào thụ thể của tế bào ký chủ Do vậy đoạn này đợc gọi làcleavage site của HA Do các enzym protease chỉ cắt protein tại các acid aminbasic nên nếu vị trí này càng nhiều acid amin basic thì khả năng bị cắt đôi của

HA lại càng cao dẫn đến khả năng để virus bám vào thụ thể tế bào và bắt đầu quá

trình xâm nhập vào tế bào càng lớn Dựa trên cơ sở này ngời ta đã phân loại virus

có độc lực cao là loại virus cúm có nhiều acid amin basic tại vị trí cleavage site

và ngợc lại

Protein NA chính là một loại enzym có tên là neuraminidase Khi virusxâm nhập vào cơ thể các mạch đờng của protein HA và thụ thể của tế bào sẽ liênkết với nhau, gắn virus vào bề mặt tế bào Sau đó nhờ neuraminidase cắt mối liênkết này đi làm cho virus có thể vào bên trong, sau khi HA đợc cắt đôi, hoặc nếukhông nh vậy, virus sẽ bị rời ra khỏi tế bào

Thành phần hoá học của virut

ARN của virut chiếm 0,8 1,1% ; protein: 70 75%; Lipit: 20 24% và 5 8% hidrocacbon Lipit tập trung ở màng virut và chủ yếu là Lipit có gốcphốtphos, số còn lại là Cholesterol, glucolipit và 1 ít hidrocacbon gồm các loạimen galactose, manose, ribose, fructose, glucosamin Thành phần chính Proteincủa virut chủ yếu là glycoprotein

-2.8.2 Cấu tạo acid nhân

Acid nhân của virus cúm gồm 8 đoạn gen có cấu tạo là RNA chuỗi đơn

âm Chính vì bản chất của các đoạn gen của virus cúm là ARN nên không có cơchế tự sửa chữa khi sao chép sai lệch dẫn đến chúng rất dễ bị biến đổi

2.8.3 Quá trình xâm nhập và nhân lên của virus

Khi cơ thể của động vật, hoặc con ngời hít, ăn phải các chất có chứa virus,ngay lập tức virus đời bố, mẹ sẽ bám vào niêm mạc đờng hô hấp, đờng tiêu hoá,nhờ chúng có kháng nguyên H và N Kháng nguyên H giúp cho virus bám vàolớp màng nhầy Sau đó, virus bám vào màng tế bào và sau đó “chui” qua màng đivào trong tế bào chủ Bộ gen của virus đợc “cởi vỏ” và thoát ra khỏi vỏ bọc trởnên tự do để hoạt động Khi virus cúm di chuyển đợc qua các màng tế bào, tại

đây chúng lợi dụng hệ thống tổng hợp protein của tế bào chủ để tổng hợp nên bộgen của chúng

Sự sao chép của virus cúm đã đợc nhiều nhà khoa học nghiên cứu và mô tảkhá chi tiết, Fenner và các đồng sự [43] đã mô tả tóm tắt virus hấp thụ đối với cácthụ cảm quan glycoprotein có chứa axit sialic trên bề mặt tế bào, sau đó virusxâm nhập vào tế bào qua receptor mediate endocytoci, nó bao gồm các exposurevới nồng độ pH thấp trong endosme, dẫn đến sự thay đổi trong HA, là sự kết hợpmàng trung gian Vì vậy nucleocapxit đi vào bên trong nguyên sinh chất và dichuyển vào trong nhân Virus cúm dùng cơ chế đơn nhất để sao chép trong đómột loại mem nội nhân (Viral endonuclease) tách từ đầu 5’ của mARNs tế bào vàdùng nó nh một cái mồi để sao chép nhờ sự vận chuyển virus Sáu monocistronicmARNs đợc tạo ra và dịch chuyển thành: HA, NA, NP và ba men polymerases:PB1, PB2, PA Các mARN đối với các gen NS và M đợc nối với mỗi sản lợng haimARNs, đợc dịch chuyển trong những khung đọc khác nhau và tạo ra cácprotein: NS1, NS2, M1, M2, HA, NA, đợc đờng hoá trong mạng lới võng mạc nộimô và đợc điều chỉnh trong tiểu thể Golgi, rồi chuyển tới bề mặt tế bào và bắt

đầu hình thành virion Một yếu tố quan trọng đối với HA là việc phân ra nhờ menprotease của tế bào chủ thành HA1 và HA2, mà chúng vẫn gắn kết đợc nhờnhững mối liên kết disulfis, việc cắt ra là yêu cầu đối với viếc sản xuất các virus

bị nhiễm sau khi sản xuất và ghép các proein virus và ARN, virrus có thể tồn tạitrong tế bào là nhờ sự nảy chồi từ màng plasma Mặc dù cha rõ virus diệt tế bào

nh thế nào, nhng những nghiên cứu gần đây đã cho thấy mô tế bào nuôi cấy bịnhiễm virus trải qua apotosis (quá trình chết theo sinh lý bình thờng của tế bào cơthể) đã bị đảo lộn, bị phá vỡ lập trình, apotosis trong cúm cũng đã đợc xác định[26], [46]

Nh vậy quá trình nhân lên của virus kết thúc với kết quả từ một hạt virus(bố mẹ) sẽ có hàng trăm, hàng ngàn virus đợc tạo ra Tuy nhiên, ngời ta đã tínhtoán rằng, trong quá trình lắp tạo virus không cần nhiều năng lợng chỉ khoảng30%, nghĩa là chỉ 30% số lợng virus đời con là những hạt virion không hoànchỉnh có khả năng gây nhiễm, còn lại các virus ở dạng khiếm khuyết

2.8.4 Sự thay đổi kháng nguyên của virus cúm gia cầm

Đặc điểm của virus cúm gia cầm là rất dễ thay đổi cấu trúc kháng nguyên

bề mặt và khả năng biến chủng để thích nghi tồn tại Virus cúm gia cầm có tần sốthay đổi kháng nguyên cao và xảy ra theo hai cách:

2.8.4.1 Thay đổi lớn

Hiện tợng hoán vị kháng nguyên (antigenic shift) xảy ra khi có 2 haynhiều chủng virus, với nhiều đoạn ARN khác biệt nhau về mặt di truyền, cùng lúcxâm nhiễm vào 1 tế bào Mỗi loại virus cùng sinh ra 8 đoạn gen có thể lẫn lộn

đoạn ARN của virus khác, miễn là đủ 8 đoạn Trên cơ sở đó hình thành một viruscúm mới Hiện tợng này gọi là shift Ví dụ: thay đoạn mã hoá cho hemaglutinincủa ngời bằng đoạn của động vật, kết quả là tạo ra chủng virus mới với khángnguyên H thay đổi, làm cho virus kháng lại kháng thể đã đợc hình thành trong

đáp ứng miễn dịh lần trớc Vì vậy, do kiểu gen của virus cúm type A gồm 8 đoạnnên về lý thuyết từ 2 virus bố mẹ có thể xuất hiện 28 = 256 kiểu kết hợp khácnhau của thế hệ sau Trong thực tế, sự kết hợp này đã phân lập đợc từ gia cầm 117trờng hợp

Biến chủng virus có thể lây nhiễm vào vật chủ mới mà bố mẹ chúng không

có khả năng gây nhiễm Sự hoán vị kháng nguyên đợc coi là nguyên nhân gây racác vụ đại dịch ở ngời và gia súc Ký chủ mà tại đó hiện tợng shift xảy ra đợc gọi

là bình trộn virus (mixing vessel) Trớc đây, lợn đợc coi là bình trộn virus Nghiêncứu đợt dịch cúm gia cầm tại Hồng Kông vào năm 1997 đã cho phép xác định có

3 lọai virus khác nhau (H5N1: H9N2 và H6N1) cùng nhiễm vào chim cút và tạo

ra chủng H5N1 Nói cách khác, chim cút đã là bình trộn virus và tạo ra loạiH5N1 Có thể mô tả theo sơ đồ sau:

cút

H5N1 mới rất

độc cho ngời H5N1 mới rấtđộc cho gà

H6N1

Một khái niệm khác liên quan đến sự thay đổi kháng nguyên nhng ở mức độthấp gọi là biến thể kháng nguyên (antigenic drift) Do đột biến ngẫu nhiên xảy

ra ở gen mã hoá cho hemaglutinin dẫn đến sự thay đổi mộ số axit amin trongprotein hemaglutinin (mặc dù về cơ bản, hemaglutinin vẫn là protein cũ) Chủngvirus biến thể kháng nguyên trở thành chủng đợc chọn lọc trong quần thể dochúng có khả năng nhiễm vào kí chủ cha miễn dịch Hiện tợng biến thể khángnguyên tăng lên từ mùa này sang mùa khác đã gây khó khăn cho việc sản xuấtvacxin hữu hiệu phòng ngừa dịch cúm

2.8.5 Phân loại virus cúm

Virus cúm đợc chia thành 3 nhóm hay còn gọi là type có tên gọi là A, B và

C Sự phân biệt này dựa trên sự khác nhau về cấu trúc kháng nguyên bề mặt Hiệnnay để phân biệt 3 type virus cúm ngời ta dùng phản ứng Elisa và RT-PCR.Trong khi các type B và C chỉ có một đại diện duy nhất có tính kháng nguyên ítbiến đổi thì type A lại bao gồm 15*9 =135 subtypeee do có 15 loại protein HA và

9 loại NA khác nhau mà thành Để phân biệt các subtypeee này ngời ta dùngphản ứng HI ( hemaglutinin Inhibition test - ức chế ngng kết hồng cầu để phânbiệt các loại HA và NI (neuraminidase inhibition test - ức chế neuraminidase) đểphân biệt các loại NA Ngời ta cũng có thể dùng các phơng pháp khác nhau nhtrung hoà virus, RT-PCR để phân biệt giữa các subtypeee cúm với nhau

2.8.6 Nuôi cấy và lu giữ virus

Virut cúm gà phát triển tốt trong xoang niệu nang của phôi trứng gà ấp 9-11ngày tuổi Tiêm 0,1 - 0,3ml huyễn dịch bệnh phẩm (ruột, não, khí quản ) vàoxoang niệu mô của phôi gà 9 - 11 ngày tuổi, hàn kín và tiếp tục cho ấp ở nhiệt độ

370C trong 2 - 3 ngày Một số ít chủng virus có độc lực cao có thể gây chết phôikhoảng 18-24 giờ, nớc trứng thu hoạch để ở nhiệt độ 40C qua một đêm, virusnhân lên trong nớc trứng có hiện tợng ngng kết hồng cầu gà Nếu không ngây ng-

ng kết thì cần lấy nớc trứng thu đợc tiêm lần sau cho phôi trứng gà 9-11 ngàytuổi

Virut cúm gà cũng phát triển rất tốt trong tế bào xơ phôi gà CEF (ChickenEmbryo Fibrolast) và tế bào dòng có nguồn gốc thận chó MDCK (Madin-Darby-Canine-Kidney cells) với điều kiện môi trờng nuôi cấy tế bào không chứaTrypsin

2.8.7 Sức đề kháng của virus

Virut cúm gia cầm tơng đối nhạy cảm với các chất hoá học nh formalin,ete, Sodium desoxycholat, hydroxylamone…

Virut không bền vững đối với nhiệt độ: ở nhiệt độ 56 – 600C chỉ trong vàiphút là virut mất độc tính, ở 70 0C virus chết ngay.

ở nhiệt độ thấp, virus vẫn có thể tồn tại trong phân ít nhất là 3 tháng.Trong nớc, virus có thể sống tới 4 ngày ở nhiệt độ 300C và trên 30 ngày ở nhiệt

độ 00C, vô hạn định ở nơi nguyên liệu bị đông lạnh

Trong phủ tạng gia cầm virus tồn tại 24 – 39 ngày, ánh sáng chiếu trựctiếp sống đợc 40 giờ còn chiếu bình thờng sống đợc 15 ngày

Do virus cúm gia cầm có vỏ bọc ngoài là lipip nên chúng rất mẫn cảm vớicác chất tẩy rửa nh formaldehylde, β – propiolacton, ethanol, sau khi tẩy vỏ cáchoá chất nh phenolic, NH4+, natri hypochlorit, axit loãng và hyđroxylanine có thểphá huỷ virus cúm gia cầm [24] Ngời ta thờng dùng các chất này nh là các chấtsát trùng hữu hiệu để tổng uế chuồng trại, dụng cụ và các thiết bị chăn nuôi khicơ sở chăn nuôi có nguy cơ bị đe doạ bởi dịch cúm gia cầm

có tính lây nhiễm cho ngời thấp nhng khi ngời đã bị nhiễm thì phát bệnh rất nặng

và có tỷ kệ tử vong cao, tức là nó có độc lực cao đối với con ngời Độc lực của viruscúm đợc xác định bằng hai phơng pháp:

- Invitro

Độc lực của virus cúm thờng đợc xác định thông qua trình tự cácnucleotide của cleavage site nh đã trình bầy ở phần protein HA, có thể hiểu đơngiản ở vị trí cleavage site có nhiều arginin thì virus đó có độc lực cao và ngợc lại

- Invivo

Trên thực tế, đây vẫn là các xét nghiệm trong phòng thí nghiệm nhng đợctiến hành trên động vật Để xác định độc lực của virus cúm trên gia cầm ngời tadùng phơng pháp xác định hệ số độc lực khi tiêm tĩnh mạch (IVPI-Intra VenousPathogenicity Index) Phơng pháp này là tiêm virus cúm vào tĩnh mạch cho gà 6tuần tuổi Quan sát triệu chứng lâm sàng số gà chết vào từng ngày đợc tính điểm( theo phơng pháp tính điểm của Reed và Muench) Sau 10 ngày nếu kết quả tínhtoán cho thấy chỉ số này là 1,2 trở lên (cao nhất là 3) thì virus đợc coi là có độclực cao Ngợc lại nếu kết quả nhỏ hơn 1,2 thì virus đợc coi là có độc lực thấp(LPAI) [37]

2.8.9 Ký chủ

Ký chủ là các sinh vật mà trên hoặc bên trong nó có sinh vật khác (kýsinh) sinh sống gây ảnh hởng tới cuộc sống của bản thân Virus cúm (ký sinhtuyệt đối) có khả năng xâm nhập, gây nhiễm và gây bệnh cho tất cả các loài giasúc và gia cầm thậm chí cả động vật dới nớc nh cá voi, hải cẩu Tuy nhiên, vềsinh thái bệnh, bệnh cúm có tính chất sinh thái vô cùng phức tạp Mỗi loại kýchủ lại có vai trò khác nhau trong việc lu giữ, phát tán và làm lây lan bệnh Dovậy, để tiện cho việc phòng chống bệnh, ngời ta đã chia ký chủ của virus cúm ralàm 3 loại :

Ký chủ lu giữ (reservoir host) hay mang (carier) mầm bệnh: Đây là loại kýchủ thờng nhiễm virus nhng không phát bệnh hoặc chỉ phát bệnh rất nhẹ (sub-clinical) hoặc chỉ những con non mắc bệnh còn các con vật trởng thành khinhiễm virus thì chỉ tạo ra miễn dịch Trong trờng hợp bệnh cúm, các loại thuỷcầm đợc coi là ký chủ lu giữ mầm bệnh Tuy nhiên, điều này còn phụ thuộc độclực của từng loại virus bởi vì đối với H5N1 virus cúm đã gây bệnh với tỷ lệ chếtcao ở thuỷ cầm

Ký chủ hứng chịu (nguyên văn là spillover host nghĩa là bị tràn gập, bị đổlên đầu): đây là loại ký chủ mẫn cảm với virus cúm và thải virus ra xung quanhlàm lây nhiễm các cá thể khác Loại ký chủ này thờng phát bệnh rất nặng khi bịnhiễm nhng lại không thể lu giữ lâu dài mầm bệnh trong cùng một loài vì khi bịnhiễm virus chúng sẽ bị tiêu diệt Nói cách khác, nếu loài động vật này khôngtiếp xúc với ký chủ lu giữ thì bệnh tự nhiên (virus) sẽ tự tiêu vong trong loài kýchủ hứng chịu Các loài chim cạn (gà, gà tây, gà lôi, trĩ, đà điểu ) thờng đợc coi

là ký chủ hứng chịu của virus cúm Bệnh thờng phát ra rất nghiêm trọng ở loài kýchủ hứng chịu Lợng virus sinh ra cũng rất lớn Virus gây bệnh cho phổ ký chủrộng hơn Thông thờng nếu ở vịt (ký chủ lu giữ) virus cúm chỉ gây bệnh ở mộtphạm trù (vịt non chẳng hạn) và tập trung vào đờng ruột, thì ở ký chủ hứng chịu(gà) virus gây bệnh cho gà ở mọi lứa tuổi và nhân lên ở mọi cơ quan nội tạng của

gà Tuy vậy, ở gia cầm nh đã nói ở trên còn có các loại virus gọi là độc lực thấp(LPAI) không gây bệnh lâm sàng Nhng các loại virus này khi nhiễm chuyển tiếpnhiều đời trên gà, sẽ trở thành loài có độc lực cao Trong khi đó, ở ký chủ lu trữmầm bệnh, virus hầu nh ổn định về mặt di truyền Chính vì lý do đó, ngời ta đa rathuyết về sự ngng trệ tiến hoá (evolutionary stasis) của virus cúm ở loài thuỷcầm, nhng trên ký chủ hứng chịu chúng biến hoá (đột biến) rất mạnh Đó cũngchính là lý do tại sao các nhà khoa học thấy rằng cần phải diệt hết gia cầm mắc

bệnh cúm bất kể là subtype nào vì sợ rằng chúng sẽ sinh ra những chủng virusmới, trong khi sự lu hành virus cúm trong đàn vịt không đáng ngại nh đàn gà.

Ký chủ lệch (aberrant host) là loài động vật hiếm khi bị nhiễm virus, khinhiễm sẽ phát bệnh nặng nhng không hoặc bài thải rất ít virus để lây nhiễm cáccá thể xung quanh Hiện tại thuỷ cầm là ký chủ lu giữ, gia cầm cạn là ký chủhứng chịu và ngời (và động vật có vú) là ký chủ lệch của virus H5N1 Sự phânchia này không mang tính tuyệt đối Một khi virus H5N1 có khả năng lây từ ngờisang ngời thì con ngời trở thành ký chủ hứng chịu Mặt khác, với cúm H3N2 hiện

đang lu hành gây ra cúm thông thờng ở ngời thì có thể nói con ngời là ký chủ lutrữ H3N2 hoặc nằm giữa ký chủ lu trữ và ký chủ hứng chịu Tuy vậy, sự phânchia này có tác dụng phân biệt, diễn tả và quản lý bệnh theo từng giai đoạn tiếntriển của dịch Tuy nhiên với dịch cúm gia cầm do H5N1 xảy ra hiện nay vịtkhông chỉ là ký chủ lu trữ bởi vì khi bị nhiễm chúng cũng phát bệnh và chết với

tỷ lệ cao, đây là điều mới đối với bệnh cúm gia cầm

2.8.10 Dịch tễ học

Trong tự nhiên bệnh cúm gia cầm có thể xảy ra đối với bất kỳ loài động vậtnào nh: gà, vịt, ngan, ngỗng, lợn, cá voi, chồn, ngời và các loài chim nuôi vàchim hoang dã trong đó gia cầm mẫn cảm nhất và có tỷ lệ ốm, tỷ lệ chết caodao động từ 15- 100%, đặc biệt ở những nơi bệnh mới xảy ra lần đầu

Gà, ngan, vịt ở mọi lứa tuổi đều có thể mắc bệnh nhng bệnh thờng xảy ra ở

độ tuổi từ 4-66 tuần tuổi Gia cầm trong thời kỳ đẻ, hoặc sắp đẻ có tỷ lệ mắc rấtcao

Gia cầm với khả năng sản xuất càng cao thì càng mẫn cảm với bệnh cúm gà.Gia cầm mái dễ mắc hơn gia cầm trống

Bệnh cúm gia cầm có thể xảy ra ở tất cả các tháng trong năm, nhng thờngxảy ra vào vụ thu đông và vụ xuân, (tập trung nhiều vào các tháng 11, 12, 1, 2, 3)mùa có khí hậu lạnh, ma nhiều, độ ẩm cao, có sự thay đổi đột ngột về thời tiết vàcác yếu tố bất lợi khác Tuy nhiên, với điều kiện thời tiết khô hanh bệnh vẫn cókhả năng xảy ra nên chúng ta vẫn phải đề phòng

2.9 Các biểu hiện đặc trng của bệnh cúm gia cầm

Virus thâm nhập vào đờng tiêu hoá, nhân lên trên các tế bào biểu mô, nhngkhông gây ra bất kỳ triệu chứng nào mà con ngời có thể phát hiện bằng mắt th-ờng Thờng các loại virus có độc lực thấp (LPAI) gây ra thể bệnh này.

2.9.2 Bệnh tích

Tuỳ theo độc lực cao hay thấp mà có thể có các bệnh tích sau:

• Mào và tích thâm tím, phù nề nặng, xuất huyết dới da và rìa của tích, ờng xuyên thấy mí mắt sng mọng và đỏ tấy hoặc thâm tím

th-• Bóp mỏ thấy nhiều dịch không nhầy, không mùi

• Xuất huyết dới da ống chân thành vệt đỏ hoặc kẽ các ngón chân rất rõ

• Viêm xuất huyết đờng ruột

• Tim hơi trong, bao dịch thẩm xuất màu vàng sánh

• Lách bị biến màu lốm đốm vàng, rắn chắc hơn bình thờng

• Tuỵ khô và dai

• Thận hơi sng và có nhiều điểm tụ huyết

2.10 Chẩn đoán bệnh dựa vào đặc điểm dịch tễ học, triệu chứng lâm sàng và bệnh tích

2.10.1 Chẩn đoán lâm sàng

Gà bị bệnh ở mọi lứa tuổi nhng thờng gặp từ 4 tuần đến 66 tuần tuổi Bệnh

nổ ra dồn dập và nhanh chóng trở thành dịch

Lâm sàng học: Các triệu chứng điển hình gồm: thở dốc, thở khó, viêm tịt

mũi, phù nề mặt, sng đầu, thuỳ thũng, xuất huyết và hoại tử ở mào và tích, chảymáu dới da chân thành vệt đỏ, năng suất trứng giảm

Giải phẫu bệnh lý học: Cơ quan nội tạng bị teo, viêm xuất huyết và hoại tử

ở tim, gan, lách, thận, phổi, tụy, thịt gà bệnh thâm xám, viêm dính phúc mạc.Buồng trứng và ống dẫn trứng bị viêm, trứng non bị dập vỡ

Cần chẩn đoán phân biệt với các bệnh khác nh Newcastle, viêm thanh khíquản truyền nhiễm, viêm phế quản truyền nhiễm, bạch lỵ, tụ huyết trùng và một

số bệnh khác

2.10.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm

Chẩn đoán xác định virus cúm gia cầm đợc thực hiện bằng cách: phát hiệntrực tiếp các protein hay gene virus cúm gia cầm trong bệnh phẩm nh mô có bệnhtích, tăm bông ngoáy họng hay ngoáy dịch ổ nhớp, nuôi cấy tế bào hay sử dụngtrứng có phôi, phân lập và định danh virus cúm gia cầm hoặc chẩn đoán gián tiếp

đợc thực hiện bằng phát hiện kháng thể kháng virus cúm

- Phát hiện kháng nguyên: test Directigen đã đợc báo cáo phát hiện khángnguyên virus cúm trong mẫu bệnh phẩm gia cầm và dịch niệu mô của trứng gà cóphôi đã đợc cấy truyền, test này đặc hiệu và nhạy cảm Kỹ thuật sử dụng khángthể huỳnh quang phát hiện nhanh virus cúm gia cầm trong mô Kỹ thuật sử dụngkháng thể đơn dòng phát hiện kháng nguyên virus trong mô bằng nhuộmimmunoxidase Kỹ thuật RT – PCR nhạy cảm hơn kỹ thuật phân lập 100 lần, kỹthuật này hứa hẹn một cuộc cách mạng hoá trong chẩn đoán, điều tra bệnh cúmgia cầm cũng nh các bệnh khác

- Phát hiện kháng thể: phản ứng huyết thanh học đợc dùng để chứng minh

sự hiện diện của kháng thể đặc hiệu với virus cúm gia cầm 7 ngày sau khi nhiễm

Có nhiều kỹ thuật đợc dùng để giám sát và chẩn đoán huyết thanh học nh ELISAdùng phát hiện kháng thể kháng virus cúm gia cầm, HI dùng để xác định subtype

HA Huyết thanh nhiều loài chứa các yếu tố ức chế không đặc hiệu của HI và cáctest khác Huyết thanh phải đợc xử lý để làm giảm hoặc loại bỏ hoạt tính của cácyếu tố này

+ Kỹ thuật ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) phát hiện khángthể kháng virus cúm gia cầm Chỉ thích hợp để kiểm tra trên gà và gà tây Pháthiện kháng thể trong vòng 1 tuần sau khi nhiễm.

+ Kỹ thuật khuếch tán miễn dịch trên thạch (AGID – agar gelimmunodiffusion): không phân biệt đợc các subtypee của cúm gia cầm Phát hiệnkháng thể kháng virus cúm gia cầm trong vòng một tuần sau khi nhiễm

+ Phản ứng ngăn trở ngng kết hồng cầu (HI) đặc hiệu cho serotypee Phảnứng HI dơng tính phát hiện vài ngày sau khi phát hiện bằng ELISA hay AGID,kháng thể vẫn còn tồn tại một thời gian dài sau khi nhiễm, phản ứng này thíchhợp để kiểm tra mẫu huyết thanh cho thuỷ cầm

+ Phản ứng miễn dịch huỳnh quang (IFT – immunofluorescent test) pháthiện kháng thể kháng một subtype N đặc hiệu

2.11 Điều trị

Hiện nay, theo quy định của cơ quan dịch tễ quốc tế (OIE), khi một cơ sở códịch cúm gà thì toàn bộ gà của cơ sở phải huỷ bỏ và tiêu độc, không điều trị, bởihai lý do sau:

Tất cả các kháng sinh và các hoá dợc hiện đang đợc sử dụng đều khôngdiệt đợc virus cúm gà trong cơ thể gà bệnh

Virus lây lan hết sức nhanh, lại rất nguy hiểm, có thể lây nhiễm và gâybệnh cho tất cả các loài gia cầm, nhiều loài chim trời, một số loài thú, đôi khi lâynhiễm sang ngời

2.12 Phòng bệnh cúm gia cầm

Tại Hội thảo về các biện pháp phòng chống dịch cúm gia cầm do WHO,OIE và FAO tổ chức tại thành phố Hồ Chí Minh (tháng 2 năm 2005) đã đề xuấtcác bịên pháp phòng chống dịch cúm gia cầm gồm có:

Giám sát chặt chẽ để phát hiện và báo cáo tình hình dịch bệnh

Tăng cờng an toàn sinh học tại các trại, cơ sở chăn nuôi gia cầm và các trạichăn nuôi có liên quan

Kiểm soát vận chuyển gia cầm và các sản phẩm gia cầm có thể có virus,kiểm soát việc vận chuyển vùng khu vực danh giới vùng bị nhiễm và vùng không

bị nhiễm

Thay đổi phơng thức chăn nuôi để giảm nguy cơ lây lan bệnh

Tiêu huỷ nhanh gia cầm bị bệnh, gia cầm có nguy cơ nhiễm bệnh Huỷ xácgia cầm chết và các vật liệu có khả năng bị nhiễm sao cho đảm bảo an toàn sinhhọc và vệ sinh môi trờng

Trong đó việc tiêm vacxin phòng bệnh cúm gia cầm là một phần của chiếnlợc khống chế và thanh toán bệnh cúm gà.

Đây là vấn đề hết sức phức tạp không những ở nớc ta mà cả trên thế giới.Sau nhiều phiên họp các chuyên gia, tháng 9-2004, FAO đã đa ra khuyến cáo vềviệc tiêm phòng cúm cho gia cầm nh sau:

Tiêm phòng chỉ là biện pháp phụ trợ với hàng loạt các biện pháp an toànsinh học khác

Không tiêm đàn nhiễm virus

Loại gia cầm, khu vực sản xuất nơi áp dụng việc tiêm phòng phải đợc xác định.Phải có đủ vacxin

Các nớc có thể sản xuất vacxin, tham gia ngân hàng vacxin và chế phẩmchẩn đoán

Có chiến lợc giám sát và hệ thống theo dõi dịch cúm gia cầm

Có đánh giá hiệu quả (12 tháng)

Có kế hoạch dừng tiêm phòng

Phải có kỹ thuật DIVA (Diffirentiating infected from Vaccinated Animals)theo OIE để phân biệt gia cầm tiêm phòng với gia cầm nhiễm virus cờng độc

Lợi ích của tiêm phòng theo FAO là nh sau:

Giảm khả năng nhiễm virus

Nếu nhiễm, giảm khẳ năng bài thải virus

Nếu thải virus, giảm lợng virus thải ra môi trờng

Lợi ích khác:

Giảm số ổ dịch phát ra cục bộ

Giảm khả năng lây lan của virus cúm nếu tất cả gia cầm đều đợc tiêm phòng.Lợi ích kinh tế, xã hội

Khôi phục nhanh đàn gia cầm

Cũng trong khuyến cáo này, FAO đã xác định các chiến lợc tiêm phòng

nh sau:

Ba chiến lợc tiêm phòng:

 Tiêm bao vây

 Tiêm khi có dấu hiệu nhiễm virus cúm và

 Tiêm cơ sở (toàn bộ đàn gia cầm)

Lo ngại từ phía y tế:

 Gia cầm đợc tiêm phòng vẫn thải virus

 Sức ép miễn dịch do tiêm phòng tạo ra sẽ gây ra biến chủng virus mới

Giải pháp của FAO đa ra để ngăn ngừa hiện tợng trên:

 Có hệ thống giám sát gia cầm tiêm phòng

 Phân tích ngay virus phân lập đợc từ đàn gia cầm tiêm phòng

Một số loại vacxin hiện có:

Vacxin vô hoạt: virus nhân lên trên phôi gà 9 - 11 ngày tuổi, thu lấy nớctrứng, vô hoạt virus bằng β - propiolacton hoặc formaldehyt và cho bổ trợ bằngdầu khoáng hoặc dầu thực vật [40]

Vacxin vô hoạt đồng chủng: những loại vacxin này ban đầu đợc sản xuất

nh vacxin tự phát sinh, có nghĩa là vacxin chứa cùng những virus cúm gà giống

nh chủng gây bệnh trên thực địa Hiệu lực của những vacxin này trong việc ngănngừa bệnh và giảm lợng virus thải ra môi trờng đã đợc chứng minh thông qua cácnghiên cứu trên thực địa và các thử nghiệm [43]

Nhợc điểm của loại vacxin này là không thể phân biệt gia cầm đợc tiêmchủng với gia càm tiếp xúc với mầm bệnh trên thực địa trừ khi có những con cha

đợc tiêm chủng đợc nhốt trong chuồng

Vacxin vô hoạt dị chủng: những vacxin này đợc sản xuất tơng tự nh vacxinvô hoạt đồng chủng Điểm khác biệt là các chủng virus sử dụng trong vacxin cókháng nguyên H giống chủng virus trên thực địa, nhng có neuraminidase (khángnguyên N) dị chủng [44]

Sau khi tiếp xúc với virus trên thực địa, bảo hộ lâm sàng và giảm thải virus

ra ngoài môi trờng đợc đảm bảo bằng phản ứng miễn dịch sản sinh bởi khángnguyên nhóm H đồng chủng, trong khi kháng thể chống lại Neuraminidase sảnsinh bởi virus thực địa có thể sử dụng nh chất đánh dấu sự lây nhiễm trên thực địa[43]

Đối với 2 loại vacxin đồng chủng và dị chủng, mức độ bảo hộ lâm sàng vàviệc giảm thải virus ra môi trờng bên ngoài đợc cải thiện do khối lợng khángnguyên trong vacxin cao hơn Đối với vacxin dị chủng, mức độ bảo hộ không tỷ

lệ chặt chẽ với mức độ đồng chủng giữa gen ngng kết tố hồng cầu trong vacxin

và chủng trên thực địa Nhiều nghiên cứu thực nghiệm đã chứng minh rằngvacxin vô hoạt đơn giá hoặc đa giá có chất hỗ trợ đã tạo ra kháng thể cho gia

cầm, có tác dụng phòng vệ và làm giảm số nhiễm, số chết, không giảm đẻ trứng.Tuy vậy, gia cầm đợc tiêm vacxin này trở nên mắc bệnh mà không có triệu chứnglâm sàng nhng vẫn bài thải virus mà vẫn tiềm tàng khả năng lây lan, gây bệnhnghiêm trọng [44], [45].

Vacxin thế hệ mới: vacxin đợc sản xuất có sử dụng kỹ thuật gen đang đợctriển khai

+ Vacxin dới nhóm chứa protein kháng nguyên HA, NA tái tổ hợp và táchchiết làm vacxin

+ Vacxin tái tổ hợp có véc tơ dẫn truyền sử dụng virus đậu gà làm véc tơtái tổ hợp song gen H5 và N1 phòng chống virus type H5N1 và H7N1

+ Vacxin nhợc độc virus cúm nhân tạo: sử dụng virus cúm đợc làm nhợc

độc bằng kỹ thuật xoá bỏ gen độc

+ Vacxin AND: sử dụng AND tái tổ hợp làm vacxin, vacxin chứa gen HA,

NA, NP đơn lẻ hoặc đa gen

Phần III

Đối tợng, Nội dung, nguyên liệu và

phơng pháp nghiên cứu

3.1 đối tợng nghiên cứu

Tiêm phòng vacxin cúm gia cầm HVRI của Trung Quốc trên gà hậu bị ớng trứng

h-Tiêm phòng vacxin cúm gia cầm HVRI của Trung Quốc trên vịt đẻ trứng

3.2 Nội dung nghiên cứu

3.2.1 Lựa chọn đàn gia cầm để tiêm vacxin theo quy định của FAO

- Lựa chọn 2 trại gà hậu bị thơng phẩm hớng trứng tại Công ty gà PhúcThịnh: quy mô trên 2000 con

Lựa chọn 3 trại vịt đẻ trứng tại Đông Anh qui mô trên 500 con

3.2.2 Tiêm phòng vacxin cho đàn gà, vịt đã lựa chọn

3.2.3 Giám sát huyết thanh và giám sát virus đối với đàn gà và vịt đợc tiêm phòng

3.2.4 Giám sát huyết thanh và giám sát virus đối với đàn gà và vịt chỉ báo 3.2.5 Giám sát lâm sàng và một số chỉ tiêu chăn nuôi ở đàn gà, vịt đợc tiêm phòng và đàn chỉ báo.

3.2.6 Thử nghiệm công cờng độc trên gà và vịt đã đợc gây miễn dịch bằng vacxin (công việc này cha đủ điều kiện để triển khai và sẽ đợc thực hiện sau)

3.3 Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu

3.3.1 Vacxin dùng trong thí nghiệm

3.3.1.1 Vacxin HVRI của Trung Quốc chủng H5N2 do Bộ Công An cung cấp

- Vacxin vô hoạt AI (H5, N - 28) virus giống A/Turkey/England/N - 28/73,

là chủng có độc lực thấp nhập từ phòng thí nghiệm tham chiếu quốc tế Weybidge

- Anh Quốc Khi sử dụng trên gà, hàm lợng kháng thể đạt mức độ cao 8log2,trong vòng tuần thứ 5 sau khi sử dụng vacxin Hiệu giá này đợc duy trì trongvòng 4 tuần Mức độ bảo hộ của kháng thể vẫn có thể đợc đảm bảo đến thứ 23sau khi tiêm phòng Bộ nông nghiệp Trung Quốc đã phê chuẩn vacxin này là mộtsản phẩm mới dùng cho gia cầm từ tháng 12/2003 vacxin này đã đợc sử dụngrộng rãi ở Trung Quốc trong các ổ dịch cúm gia cầm thể độc lực cao vào đầu năm

2004

- Đối tợng sử dụng vacxin: Gà từ 2- 5 tuần tuổi trở lên

- Chỉ định sử dụng: Chỉ dùng cho gà khoẻ mạnh

- Liều sử dụng và đờng tiêm:

+ Gà từ 2-5 tuần tuổi, tiêm trực tiếp vào da cổ gà, mỗi con tiêm 0,3ml.+ Gà 5 tuần tuổi trở lên tiêm ở ức gà, mỗi con tiêm 0,5ml

- Bảo quản vacxin

+ Vacxiin đợc bảo quản trong tối ở nhiệt độ từ 2-8 0C, tránh đông đá

+ Trớc khi sử dụng vacxin, để vacxin ấm lên đạt nhiệt độ phòng từ

15-250C Lắc kỹ trớc khi sử dụng

3.3.1.2 Vacxin của Trung Quốc chủng H5N1 cho vịt do Bộ Nông nghiệp

và Phát triển nông thôn cung cấp.

- Vacxin đợc sử dụng phòng chống dịch cúm gia cầm trên vịt là loại vacxinvô hoạt virus cúm gia cầm tái tổ hợp (sub - tup H5N1, chủng Re - 1) Virusgiống: virus giống thông thờng đã đợc biến đổi một cách nhân tạo Virus cúm đó

là A/Goose/ Guadong/1996 (H5N1) đại diện kháng nguyên của virus của TrungQuốc, đã đợc dùng để tạo nên virus cúm gia cầm H5N1 vô hoạt nhờ việc tái tổhợp với virus cúm của ngời Khi dùng cho vịt hàm lợng kháng thể đạt đợc cao9log2 sau 4 tuần sử dụng vacxin Hàm lợng kháng thể vẫn có thể đảm bảo đếntuần thứ 25 sau khi dùng vacxin Bộ Nông nghiệp Trung Quốc đã phê chuẩnvacxin này là sản phẩm mới dùng cho gia cầm từ tháng 1/2005

- Đối tợng sử dụng vacxin: dùng cho vịt có độ tuổi 2 - 5 tuần tuổi trở lên

- Chỉ định sử dụng: chỉ dùng vacxin cho vịt khỏe

- Liều sử dụng và đờng tiêm:

- Đờng tiêm:

Tiêm bắp thịt vào cơ ngực hay tiêm dới da vào giữa cổ

- Liều sử dụng:

+ Vịt từ 2 - 5 tuần tuổi: 0,5ml/con

+ Vịt trên 5 tuần tuổi: 1ml/con

- Đối với vịt cần tiêm nhắc lại 2 lần sau khi tiêm lần đầu là 3 tuần

- Bảo quản vacxin:

+ Vacxin phải đợc bảo quản chỗ tối ở nhiệt độ 2 -80C và tránh đông đá+ Trớc khi sử dụng vacxin để vacxin ấm lên đạt nhiệt độ phòng 15 - 250C,lắc kỹ trớc khi dùng

3.3.2 Các nguyên vật liệu khác

Các số liệu của Viện Thú Y, Cục Thú y, Chi cục Thú y Hà Nội và các sốliệu trực tiếp điều tra tại các trại giám sát trong thời gian thực hiện đề tài

Các mẫu bệnh phẩm, huyết thanh và que ngoáy dịch ổ nhớp thu thập tạicác trại gà và vịt tiêm vacxin tại Đông Anh.

Kết quả xét nghiệm của Viện Thú y, Trung tâm chẩn đoán Trung ơng, sốliệu của công ty gà Phúc Thịnh

3.3.3 Dụng cụ máy móc thí nghiệm

Bộ pipetmen loại: 10àl, 20à, 100à, 1000àl và các đầu tuyp tơng ứng

Hộp đựng đầu tuyp, giá đựng effendorf

3.3.4 Môi trờng, hoá chất

Dung dịch bảo quản mẫu:

Dung dịch tách chiết ARN: Trizol, cloroform, propanon, Ethanol 75%

Sinh phẩm cho phản ứng RT-PCR: Primer, Taq polymerase, 2XMix, nớc vôtrùng không có men aza

Hóa chất dùng cho chạy điện di: Dung dịch Agarose 1.5%,Ethidiumbromide, TBE 1X, loading bufer, Marker

Cặp mồi sử dụng trong đề tài này:

3.4 Ph-

ơng pháp nghiên cứu

3.4.1 Phơng pháp phân lô gia cầm trong thí nghiệm

- Đối với gà: mỗi trại chia làm 2 lô, một lô thínghiệm (khoảng 2000 con) và một lô đối chứng (khoảng 200 con)

độ (0C )

Kích thớc(bp)1

219F

H5-GAGTGAAGCGTCTCATTTTG

515R

H5-GATCTTCTTGGTTGGTATTATTGTAGCTCC

2

515F

H5-CATACCCAACAATAAAGAGG

1220R

H5-GTGTTCATTTTGTTAATGAT

- Đối với vịt: mỗi trại chia làm 2 lô: một lô thínghiệm (tiêm vacxin khoảng 500 con), lô đối chứng (không tiêm vacxin khảng

50 con)

3.4.2 Phơng pháp lấy mẫu

Để tiến hành các chẩn đoán phòng thí nghiệm, việc lấy mẫu và vận chuyểnmẫu đúng quy cách đóng vai trò đặc biệt quan trọng, quyết định kết qủa xétnghiệm

Việc lấy mẫu phải đợc tiến hành đúng lúc, đúng vị trí, đúng kỹ thuật Cácmẫu dùng để phân lập virus tốt nhất đợc lấy trong vòng 3 ngày đầu sau khi giacầm có biểu hiện triệu chứng bệnh cúm

Với gà và vịt sống: mẫu bệnh phẩm đợc lấy là: dịch ngoáy mũi, dịch ngoáyhọng, dịch ngoáy khí quản, dịch ngoáy ổ nhớp, mẫu phân, máu

Đối với gà và vịt đã chết: bệnh phẩm lấy là: khí quản Ruột, não, dịch khí quản,phổi Có thể lấy bệnh phẩm ở các phủ tạng khác: lách, thận, tuyến tuỵ

Bệnh phẩm cả con: Gia cầm đã chết đựng vào túi nilon, kèm theo nhãn ghichủ gia cầm, dùng chỉ buộc kín, để vào trong hộp xốp, chèn đá lạnh xung quanh(tuỳ theo gia cầm to hay nhỏ, số lợng nhiều hay ít mà dùng loại hộp thích hợp);

đậy nắp, gắn nhãn ghi ngời gửi, loại gia cầm, địa chỉ, dán băng dính cho kín;phun sát trùng bên ngoài, gửi đến nơi có điều kiện chẩn đoán xét nghiệm

Cách lấy mẫu bệnh phẩm là dịch ổ nhớp (swab): Dùng tăm bông ngoáy lấydịch ở hậu môn gia cầm, cho vào ống có dung dịch bảo quản, đậy kín, bảo quảnlạnh, vận chuyển về nơi có điều kiện chẩn đoán xét nghiệm

Cách lấy huyết thanh: huyết thanh đợc chắt ra từ máu

Cách lấy máu: Thờng lấy máu ở tĩnh mạch cánh hoặc đâm thẳng vào tim.Lấy máu tĩnh mạch cánh: thờng là phơng pháp tốt và đơn giản nhất đối với

gà, gà tây và với hầu hết các loại gia cầm khác nuôi trong điều kiện tự nhiên.Bộc lộ tĩnh mạch cánh bằng cách nhổ một số lông trên bè mặt tĩnh mạch vùngcánh, tĩnh mạch nằm dới vết lõm của cánh giữa khớp nối với cơ cánh tay Nếudùng cồn 700 hoặc chất sát trùng không màu thấm ớt vùng tĩnh mạch sẽ thấytĩnh mạch rõ hơn Ngời lấy máu dùng một tay giữ hai cánh áp vào nhau, cầmchặt hai cánh ở vùng phía trên và chọc kim vào tĩnh mạch cánh, kim đặt đối diệntrực tiếp với máu tĩnh mạch chảy về tim

Lấy máu tim: Gia cầm đợc đặt nằm ngửa, nhổ lông vùng hõm ngực, sáttrùng để khô, đâm kim từ hõm ức song song với cột sống, hơi chếch về phía tráicho đến khi kim chọc vào tim Máu sẽ chảy vào bơm tiêm, dùng tay kéo bơm

tiêm từ từ để hút máu Kích thớc và chiều dài kim phụ thuộc vào kích thớc củagia cầm.

Máu lấy khoảng 2 – 3 ml là đủ Nếu để máu đông chắt huyết thanh trongbơm tiêm thì phải kéo bơm tiêm dài ra, nút đầu kim tránh nguy hiểm, để bơmtiêm nằm ngang cho máu đông và chắt huyết thanh Trờng hợp cho máu vào ốngnghiệm thao tác phải nhanh chóng tránh đông máu trong bơm tiêm Máu đợc đểtrong phòng nhiệt độ môi trờng tránh nơi quá nóng và ánh mặt trời chiếu trựctiếp, nếu có điều kiện tốt nhất là để vào tủ ấm 370C trong 30 phút, sau đó đặtngăn lạnh 40C

3.4.3 Các phơng pháp dùng trong phòng thí nghiệm

3.4.3.1 Phản ứng ức chế ngng kết hồng cầu (HI - Hemagglutination inhibition test)

Dung dịch và dụng cụ:

- Dung dịch chống đông (citrat natri 1%)

1500- Làm tan cặn với 3 thể tích nớc sinh lý (so với thể tích máu ban đầu)

 Ly tâm 1500-2000v/p/5phút, loại bỏ nớc nổi

 Rửa thêm 1 lần nữa nh trên

- Xử lý huyết thanh: 560C/30phút trong nồi đun cách thuỷ

- Chuẩn độ hiệu giá kháng nguyên: (HA)

 Kháng nguyên để tan ở nhiệt độ phòng

 Chuẩn độ hiệu giá kháng nguyên bằng phản ứng ngng kết hồng cầu vi ợng (HA)

l- Cho 50àl NaCl 0.85% vào một hàng 12 giếng.

 Cho 50àl kháng nguyên vào giếng 1, dùng pipet trộn đều hút 50àl sanggiếng thứ 2, trộn đều, làm tơng tự đến giếng thứ 11 Ta có kháng nguyên phaloãng bậc2 Giếng thứ 12 dùng làm đối chứng hồng cầu

 Cho vào tất cả các giếng 50àl hồng cầu gà 0.5%, lắc nhẹ đĩa, để nhiệt độphòng trong 30 phút, đọc kết quả

Hiệu giá kháng nguyên tính đến độ pha loãng cuối cùng còn khả năng làm ngng kết hồng cầu gọi là 1 đơn vị HA

Trong phản ứng ngăn trở ngng kết hồng cầu dùng kháng nguyên 8 đơn vị (8

đơn vị HA) pha trong dung dịch pha loãng kháng nguyên

- Cách tính 8 đơn vị HA:

+ VD: 1 đơn vị HA là 1/256 thì 8 đơn vị HA là 8*1/256= 1/32

+ Nghĩa là pha 1ml virus ban đầu + 31ml NaCl 0.85%

+ Chuẩn lại 8 đơn vị HA bằng phản ứng HA

Cách đánh giá 8 đơn vị HA: Virus ngng kết ở 3 giếng đầu tiên là đạt tiêu chuẩn

- Tiến hành phản ứng ngăn trở ngng kết hồng cầu vi lợng (HI)

 Cho 25àl NaCl 0.85% từ giếng A đến giếng G

 Cho 50àl NaCl 0.85% vào các giếng ở hàng H

 Cho 25àl huyết thanh đã xử lý vào giếng A Dùng pipet trộn đều và hút

25àl từ giếng A đến giếng G (giữ lại 25àl ở hàng G) ta có huyết thanh pha loãngbậc 2 Hàng G dùng làm đối chứng huyết thanh

 Cho 25àl kháng nguyên 8 đơn vị HA vào các giếng trừ các giếng ở hàng

G và H, lắc để nhiệt độ phòng 30 phút

 Cho 50àl hồng cầu 0,5%, lắc đều để nhiệt độ phòng 30 phút

 Đọc kết quả

o Chú ý: phải kiểm tra lại kháng nguyên 8 ĐV và các huyết thanh đối

chứng mẫu (hàng G), đối chứng hồng cầu (hàng H) cùng với phản ứng chính

o Nhận định kết quả:

 Huyết thanh có kháng thể kháng virus cúm khi có hiện tợng ngăn trở

ng-ng kết hồng-ng cầu ( hồng-ng cầu tụ lại dới đáy giếng-ng)

 Hiệu giá kháng thể là độ pha loãng cao nhất của huyết thanh còn có khảnăng ngăn trở ngng kết hồng cầu hoàn toàn

3.4.3.2 Phân lập virus cúm gia cầm

Mẫu bệnh phẩm và mẫu ngoáy dịch ổ nhớp đợc giữ ở 40C và phải tiến hànhphân lập virut trong phạm vi 48 giờ kể từ khi lấy mẫu Nếu cần bảo quản trongthời gian dài hơn thì phải giữ ở nhiệt độ -700C

Môi trờng bảo quản mẫu Glycerol medium đợc pha chế theo công thức:

2 Trộn PBS và Glycerol theo tỷ lệ 1:1 để đợc 1 lít dung dịch

3 Trong 1 lít PBS/Glycerol cho

đó so sánh trình tự ADN đó với trình tự ADN khác của virus cúm đã đợc đăng kýtrong ngân hàng dữ liệu gen

Nguyên lý của phản ứng PCR dựa vào đặc điểm sao chép ADN, ADNpolymerase sử dụng các đoạn ADN mạch đơn để tổng hợp nên sợi bổ sung mới.Tất cả các ADN polymerase khi hoạt động để tổng hợp nên sợi ADN mới từmạch khuôn thì đều cần có sự hiện diện cuả những cặp mồi (Primer) đặc hiệu đểkhởi đầu cho quá trình tổng hợp