bước đầu nghiên cứu xác định sự sai khác di truyền trên gen mc1r quy định màu sắc lông trên một số cá thể dê thuộc các giống dê alpine, dê beetal, dê boer, dê jamnapari

Bộ lông mà con vật sở hữu có thể làkết quả tổng hợp của nhiều yếu tố như dinh dưỡng, môi trường chăn nuôi, khả năngthích ứng với môi trường sống và một yếu tố được coi là nguồn gốc làm n

I Mở đầu

1.1 Đặt vấn đề.

Khoa học di truyền đạt được những đỉnh cao ngay từ đầu thế kỷ 21, thế kỷ củasinh học với những thành tựu nổi bật của sinh học phân tử đặc biệt là công nghệgen Nhờ các kỹ thuật di truyền phân tử: kỹ thuật tách ADN, kỹ thuật nhân genPCR (Polymeraza Chain Reaction), kỹ thuật cắt gen RFLP (Restriction FragmentLength Polymorphisms) và giải trình tự gen cho phép chúng ta tiến hành xác địnhmột kiểu gen nào đó và gọi tên chính xác kiểu gen có liên quan đến tính trạng mà

ta cần nghiên cứu ở mức phân tử Các nhà khoa học đã chứng minh sự biểu hiệncủa các tính trạng là do gen quy định Mỗi tính trạng có thể do một hoặc nhiều gentác động và từ đó tạo nên tính đa dạng cho quần thể Sự đa hình của các nucleotithay chính là sự sai khác về trình tự các nucleotit làm nên sự đa dạng di truyền củamỗi gen

Melanocortin receptor 1 (MC1R) là một gen được biết đến với vai trò điềukhiển màu lông ở động vật có vú Trên thế giới đã có những công trình nghiên cứu

về gen quy định màu lông ở động vật có vú bao gồm nghiên cứu trên trâu bò(Klungland và cs, 1995), trên ngựa (Marklund và cs, 1996), cáo (Vage và cs, 1997),

gà (Takeuchi và cs, 1997) cũng đã có nghiên cứu về MC1R trên dê (Li và cs,2002) Tại Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng các kỹ thuật di truyền phân tửvào trong chăn nuôi đã và đang được triển khai rộng rãi Tuy nhiên công việc nàychủ yếu thực hiện trên lợn, bò và gia cầm Chăn nuôi dê ở Việt Nam ngày càngphát triển với cả các giống dê nội và ngoại nhập Các giống dê nhập ngoại hiệnđang nuôi ở nước ta có đặc điểm ưu việt về tính trạng sản xuất sữa, thịt hoặc cả hai.Màu lông của chúng thường đồng nhất Bộ lông là biểu hiện bên ngoài của một con

vật Bộ lông óng mượt và có màu sắc đặc trưng của giống chứng tỏ con vật đó sinhtrưởng phát triển tốt Thậm chí màu sắc lông còn tham gia trong quá trình chọn lọcgiống và định hướng sử dụng giống vật nuôi Bộ lông mà con vật sở hữu có thể làkết quả tổng hợp của nhiều yếu tố như dinh dưỡng, môi trường chăn nuôi, khả năngthích ứng với môi trường sống và một yếu tố được coi là nguồn gốc làm nên màusắc bộ lông giúp chúng ta phân biệt giống này với giống khác chính là gen MC1R.Nhằm hướng tới đánh giá sự đa dạng di truyền trong quần thể vật nuôi nói chung,loài dê nói riêng đồng thời để có định hướng trong chọn lọc và sử dụng một sốgiống dê ngoại nhập có năng suất cao cũng như góp phần làm phong phú đa dạngquỹ gen vật nuôi trên ngân hàng gen thế giới, việc tìm hiểu về MC1R, xem xét mốitương quan của MC1R với màu lông của dê là cần thiết Sử dụng các kỹ thuật di

truyền phân tử chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Bước đầu nghiên cứu xác

định sự sai khác di truyền trên gen MC1R quy định màu sắc lông trên một số cá thể dê thuộc các giống dê Alpine, dê Beetal, dê Boer, dê Jamnapari nuôi ở Trung tâm nghiên cứu dê và thỏ Sơn Tây- Hà Nội”.

1.2 Mục tiêu của đề tài

 Tìm hiểu vể gen MC1R

 Hiểu và thao tác các kỹ thuật di truyền phân tử: phương pháp tách chiết ADN,phương pháp nhân gen PCR, phương pháp giải trình tự

 Xác định vị trí sai khác trên gen MC1R quy định màu sắc lông ở một số cá thể

dê nhập ngoại nuôi ở Trung tâm nghiên cứu dê và thỏ Sơn Tây- Hà Nội

II Tổng quan tài liệu

2.1 Khái niệm về gen

Tính trạng nếu được truyền từ thế hệ này sang thế hệ kế tiếp theo một phươngthức nhất định được gọi là tính trạng di truyền Toàn bộ tính trạng biểu hiện bênngoài mà ta có thể quan sát hoặc đo đếm được gọi là kiểu hình, còn toàn bộ yếu tố

di truyền tạo nên kiểu hình được tiềm ẩn bên trong được gọi là kiểu gen Tác độngkiểu gen lên kiểu hình thường rất khác nhau có những tính trạng được kiểm soátđơn giản, nhưng cũng có tính trạng lại chịu tác động phức tạp

Khái niệm về gen như một đơn vị di truyền tách biệt được phát hiện nhờ phépphân tích lai của Mendel được W.Johansen đưa ra vào năm 1900 Theo Johannsentính trạng của cơ thể được xác định bởi mầm mống đặc biệt, tách biệt và độc lập,nói ngắn gọn hơn bởi cái chúng ta gọi là “gen” Quan niệm đó về gen tồn tại suốt

cả giai đoạn phát triển của di truyền học kinh điển Từ đó đến nay bản chất của gen

là vấn đề trung tâm của di truyền học, luôn luôn phản ánh ở dạng cô đọng nhấtmức độ phát triển, thành tựu và những vấn đề chưa được giải quyết của di truyềnhọc

Trong khoảng thời gian đó không những người ta tìm ra cơ sở vật chất của gen

mà chính bản thân gen là một đoạn của phân tử ADN đã trở thành đối tượng vàphương tiện kỹ thuật di truyền và công nghệ sinh học Người ta giải mã được cấutrúc sơ cấp của hàng ngàn gen, làm sáng tỏ những đặc điểm cơ bản và tính đa dạngtrong cấu tạo của chúng ở các đối tượng khác nhau Ngày nay chúng ta biết rằng

“gen không phải là đơn vị tái tổ hợp mà là đơn vị cấu trúc của thông tin di truyềnkhông thể phân nhỏ hơn nữa về phương diện chức năng”

Gen hiện nay được hiểu theo nghĩa đơn giản là một đoạn của phân tử ADN mãhoá cho phân tử ARN chức năng.

Một gen là một thực thể hoàn chỉnh và bền vững nhưng cũng có thể bị thay đổitrong trình tự nucleotit, thay đổi đó được gọi là đột biến

Gen sắp xếp theo trình tự nối tiếp nhau trong nhiễm sắc thể Năm 1910 Morgan

đã phát hiện ra gen nằm trong nhiễm sắc thể Trong thực tế số lượng gen của một

cơ thể lớn hơn rất nhiều số lượng nhiễm sắc thể có trong tế bào Nhiễm sắc thểchứa một phân tử ADN dài liên tục bao gồm những vị trí đột biến trên phân tửADN làm cho trình tự nucleotit thay đổi

Vậy một nhiễm sắc thể phải chứa nhiều gen Các gen được xắp xếp và tươngtác với nhau

2.2 Cấu trúc ADN

Ở phần lớn sinh vật, vật chất di truyền là chuỗi xoắn kép ADN ADN có nhữngđặc điểm sau: Một là bền vững, vì thông tin di truyền cần hoạt động chức năngtrong khoảng thời gian 100 năm hoặc hơn nữa Hai là ADN có khả năng sao chép,đảm bảo thông tin di truyền trong các tế bào mới sinh ra được duy trì trong các quátrình sinh trưởng và phát triển Ba là, vật chất di truyền có khả năng bị biến đổichút ít (đột biến) điều này tạo điều kiện cho quá trình tiến hoá

Axit nucleic là các heteropolymer cấu thành từ các monomer là các nucleotit.Các monomer lại được cấu thành từ 3 thành phần: đường, nhóm photphat và bazơnitơ Hai loại axit nucleic (ADN và ARN) có sự khác nhau trong hai thành phầnđường của nucleotit: một loại có đường deoxyribonucleic nên gọi là axitdeoxyribonucleic (ADN); còn một loại có đường ribonucleic vì vậy gọi là axitribonucleic (ARN) Các thành phần đường - photphat của nucleotit có tầm quan

trọng đối với việc xác định đặc điểm cấu trúc của polynucleotit, còn các bazơ nitơthì quy định thông tin chứa trong chúng

Các nucleotit có thể được nối với nhau bằng mối liên kết photphodieste, làmcho polynucleotit mang tính định hướng Như vậy, đầu 5’ của một phân tử sẽ cónhóm photphat tự do, còn đầu 3’ sẽ có nhóm hydroxyl Trong phân tử mạch képcủa ADN chuỗi đường photphat được sắp xếp theo kiểu đối song song với 2 sợi cóđịnh hướng ngược chiều nhau

Các bazơ nitơ là những thành phần quan trọng của axit nucleic do chức năng

mã hoá của chúng Trong ADN, các bazơ đó là Adenin (A), Guanin(G), Cytosin(C) và Thymin (T) Trong ARN, Thymin (T) được thay thế thành Uracil (U) làbazơ có chức năng tương đồng Về phương diện hoá học, Adenin và Guanin thuộcnhóm purin, chúng có cấu trúc mạch vòng kép, trong khi Cytosin, Thymin vàUracil thuộc nhóm pyrimidin, chúng có cấu trúc mạch vòng đơn, và bởi cấu trúckhông gian của phân tử ADN do vậy sự bố trí duy nhất thoả mãn mọi điều kiện là

sự kết cặp các bazơ theo kiểu purin đi với pyrimidin Các bazơ được duy trì vị trícủa mình bởi các mối liên kết hydro, có 2 mối liên kết như thế trong cặp bazơ A-T

và có 3 mối liên kết như thế trong cặp bazơ G-C

Phân tử ADN trong cơ thể thường tồn tại ở dạng chuỗi xoắn kép phải gọi làdạng B Đó là cấu trúc do Watson và Crick tìm ra vào năm 1953

Hình 1: Sơ đồ chuỗi xoắn kép ADN

2.3 Cấu trúc của gen

Thuật ngữ gen được dùng như một đoạn của thông tin di truyền được phiên mãsang một phân tử ARN đơn lẻ, và tiếp đó thông tin di truyền từ phân tử này đượcdịch mã sang một polypeptit nhất định Các gen nằm trên các nhiễm sắc thể, và vịtrí trên nhiễm sắc thể nơi một gen định vị được gọi là locus của gen đó Ở các sinhvật lưỡng bội, các nhiễm sắc thể sắp xếp thành các cặp tương đồng Trên cặp nhiễmsắc thể tương đồng tại các vị trí tương ứng tồn tại các dạng khác nhau cùa cùng mộtgen gọi là các alen Phân tử ADN mạch kép có thể mang thông tin di truyền ở cả 2

sợi Hiện nay có khá nhiều thuật ngữ dùng để chỉ 2 sợi của ADN mạch kép ví dụnhư sợi có nghĩa/ sợi đối nghĩa, sợi cộng/ sợi trừ, sợi phiên mã/ sợi không phiên

mã, sợi khuôn / sợi không làm khuôn Tuy nhiên theo hướng dẫn của Liên đoàn hoásinh quốc tế (IUB) và Liên đoàn quốc tế về hoá học cơ bản và ứng dụng (IUPAC)thì các thuật ngữ nên dùng là sợi mã hoá/ sợi không mã hoá Các thuật ngữ sợikhuôn/ sợi không làm khuôn được sử dụng để mô tả các sợi ADN khi không cầnnói đến chức năng mã hóa Như vậy thông tin di truyền được biểu hiện phiên mãsợi không mã hoá của ADN tức là sản sinh ra phân tử mARN Có một khởi điểm đểbắt đầu quá trình phiên mã, nằm cạnh vị trí mà ADN-polymeraza bám vào, gọi làkhởi điểm (promoter), đó là điểm đặc hiệu để bắt đầu quá trình phiên mã Đoạn từđiểm bắt đầu TC đến điểm kết thúc tC đôi khi được gọi là đơn vị phiên mã, tức làđoạn ADN dùng để làm khuôn sao chép ARN Bên trong đơn vị phiên mã cónhững điểm điều hoà dùng cho quá trình dịch mã gọi là điểm bắt đầu TL và kí hiệudừng tL Các đoạn khác tham gia vào điều khiển sự biểu hiện của gen có thể nằm ởphía ngược dòng hoặc xuôi dòng của gen

2.4 Khái niệm mã di truyền

Nhóm phân tử nucleotit chịu trách nhiệm mã hoá cho một axit amin gọi là mã

di truyền Xác định số lượng nucleotit của một mã là một vấn đề được nghiên cứu

và nhiều khó khăn Ngay thời gian đầu người ta có thể phán đoán, suy luận được sốlượng nucleotit trong mã căn cứ vào số lượng amino axit tìm thấy trong tự nhiên.Giả thiết nếu cứ hai nucleotit tạo thành một mã để mã cho một axit amin thì cứ hainucleotit tạo thành một mã để mã hóa một axit amin thì số mã sẽ bằng tổ hợp 2 của

4 nucleotit (42=16) So với tổng số 20 axit amin khác nhau biết được hiện nay trong

tự nhiên thì số mã thiếu sẽ là 4 Trong trường hợp chúng tổ hợp 3 nucleotit cho một

mã, số lượng mã thu được là 43= 64, nhiều hơn số axit amin trong tự nhiên Dự

đoán này có thể được nhiều người ủng hộ hơn Năm 1981 Sydney và Francis Crick

đã nghiên cứu một số lượng lớn các dạng đột biến của thực khuẩn thể T4 tạo ra quaviệc thêm vào hoặc bớt đi từng cặp bazơ và rút ra kết luận mỗi một mã di truyềnchứa 3 nucleotit

Như vậy ta biết rằng trình tự các bazơ nitơ trên ADN quyết định trình tự cácaxit amin trên polypeptit tương ứng Tất cả có 20 loại axit amin trong các protein,nhưng chỉ có 4 bazơ nitơ trong ADN như vậy nếu hai bazơ xác định một axit aminthì số axit amin chỉ là 42 =16, còn thiếu 4 axit amin chưa được xác định Vậy tốithiểu phải 3 bazơ nitơ xác định một axit amin như thế số tổ hợp bộ ba có thể có của

4 bazơ nitơ là 43= 64 Vậy nếu mã di truyền là mã bộ 3 sẽ xảy ra trường hợp nhiều

bộ ba xác định một axit amin

Mãi tới năm 1966 mã di truyền mới được khẳng định một cách đầy đủ khiGobind Khorana tìm cách thiết kế các mã qua việc sử dụng sao chép trùng lặp:GUGUGU, AAGAAG và GUUGUU Ông đã có một số kết luận về mã di truyềnsau đây:

 Tất cả các mã chứa ba nucleotit kế tiếp nhau là mã di truyền

 Mỗi amino axit có thể được mã hoá bởi hai hay nhiều mã di truyền

Trong trường hợp này gọi là thoái hoá mã di truyền Trong tất cả 64 tổ hợp của

ba nucleotit có 61 tổ hợp được sử dụng cho các amino axit Có 3 mã không được

mã hoá cho bất kỳ một axit amin nào cả, đó là UAA, UAG, UGA Chúng chịu tráchnhiệm cung cấp tín hiệu ngừng hoặc chấm dứt quá trình tổng hợp protein Mã AUG

mã hoá Methionin và cũng là mã cung cấp tín hiệu khởi đầu cho quá trình tổng hợpprotein

2.5 Phiên mã di truyền

Phiên mã thông tin di truyền từ ADN sang phân tử ARN là nhờ sự xúc tác củamột hệ thống Enzym quan trọng nhất là ARN-polymeraza và Trancriptaza Quátrình phiên mã diễn ra nhiều công đoạn Trước hết là sự gắn ARN-polymeraza vàophân tử ADN Vị trí để ARN-polymeraza tiếp xúc với ADN gọi là Promotor VùngPromotor này chứa khoảng 20 - 30 cặp nucleotit và có một đặc điểm dễ nhận biết là

tỷ lệ bazơ A và T cao (có 16 - 20 nucleotit loại này) Trên một đoạn gen bất kỳthường bắt đầu bằng vùng khởi động rồi tiếp đến vùng điều khiển tiếp theo là vùngexon (vùng chưa mã hoá) và vùng intron (vùng không chứa mã di truyền) xen kẽnhau Sau khi ARN-polymeraza gắn xong, quá trình phiên mã diễn ra ở một tronghai chuỗi polynucleotit của ADN Đồng thời men ADN-polymeraza hoạt động khôiphục tổng hợp lại phân tử ADN sau khi đã làm khuôn mẫu cho việc tổng hợp ARN.Trong quá trình tổng hợp ARN, ngoài sự tham gia của hệ thống enzym kể trên còn

có các phân tử cao năng như ATP, GTP

Sự tổng hợp ARN được polymeraza dẫn dắt theo dọc chuỗi ADN, polymeraza kéo dài đến hai đầu chuỗi ADN tách ra Sau khi ARN được tổng hợp,chúng lại khép lại ARN-polymeraza kéo trên băng ADN từ vị trí 3’ - 5’ và mARNđược hình thành theo hướng ngược lại từ 5’ - 3’

ARN-2.6 Kỹ thuật PCR (Polymeraza Chain Reaction)

2.6.1 Khái niệm về PCR

Công nghệ nhân gen PCR còn gọi là phản ứng PCR (Polymeraza ChainReaction) là phản ứng chuỗi trùng hợp hay còn gọi là quá trình nhân gen, quá trìnhnhân ADN đặc hiệu do Kary Mulis phát minh vào giữa những năm 1980 (James và

cộng sự, 1993) Kỹ thuật này được xem là một trong những kỹ thuật quan trọngnhất trong việc nghiên cứu và phân tích gen.

PCR là kỹ thuật invitro cho phép nhân một vùng ADN đặc biệt nằm giữa haivùng sinh trình tự đã biết tạo ra một số lượng lớn bản sao của đoạn ADN cần lựachọn mà không cần tách dòng và nhân dòng

Kỹ thuật PCR sử dụng các đặc điểm của quá trình sinh tổng hợp ADN Hiệnnay người ta dùng phương pháp PCR để có thể nhân bất kỳ đoạn gen trong cơ thểsinh vật, chỉ cần sử dụng hai đoạn nucleotit ở đầu 5’ - 3’ nếu gen đó đã biết trướcđược trình tự sắp xếp các nucleotit của nó, hoặc có thể dùng một đoạn mồi bất kỳ

để nhân ngẫu nhiên bất kỳ một gen Sau đó phân tách bằng điện di trên gel thạchrồi thanh lọc để sử dụng

Tóm lại PCR là một kỹ nghệ nhằm nhân bản phân tử ADN hoặc đoạn ADNnhất định lặp đi lặp lại qua nhiều chu kỳ trong ống nghiệm đến khi thu được một sốlượng ADN mong muốn

2.6.2 Nguyên lý kỹ thuật nhân gen PCR

Phương pháp PCR cho phép khuếch đại một số lượng bản sao của gen (haymột đoạn ADN) trong thời gian ngắn

Nguyên tắc của phản ứng: Sử dụng enzyme ARN-polymeraza chịu nhiệt để

tổng hợp trong ống nghiệm các đoạn ADN mới từ mạch khuôn trong môi trường cócác deoxyribonucleotit triphotphat (dNTPs) và các cặp mồi đặc hiệu Các đoạnADN mới được hình thành lại được sử dụng làm khuôn Sau nhiều chu kỳ, sốlượng đoạn ADN khuôn được nhân lên gấp bội, nhờ vậy có thể đủ số lượng phục

vụ cho những mục đích nghiên cứu tiếp theo

Quá trình nhân gen gồm 3 giai đoạn lặp đi lặp lại nhiều lần như sau:

Giai đoạn biến tính (denaturation): ở nhiệt độ cao 90oC – 95oC, làm các liênkết hydro của phân tử ADN bị đứt, hai mạch của phân tử tách rời nhau Căn cứ vàoADN khuôn để lựa chọn nhiệt độ biến tính và thời gian biến tính phù hợp

Giai đoạn gắn mồi (annealing): ở nhiệt độ 50oC - 65oC các mồi bắt cặp vớicác mạch đơn ADN khuôn ở đầu 3’ Giai đoạn này khoảng 30 giây - 60 giây

Giai đoạn tổng hợp (elongation): giai đoạn này có nhiệt độ 70oC - 72oC thíchhợp với hoạt động của Enzym taq polymeraza Enzym này xúc tác các hoạt độngtổng hợp gắn thêm các nucleotit vào cuối đoạn mồi, các mồi được kéo dài trên cơ

sở bắt cặp với mạch khuôn theo nguyên tắc bổ sung, tạo nên các mạch đơn mới.Thời gian giai đoạn này phụ thuộc vào kích thước của đoạn ADN có thể từ 30 giâyđến vài chục phút (Khuất Hữu Thanh, 2006)

2.6.3 Các yếu tố cần thiết cho phản ứng PCR

2.6.3.1 Đoạn ADN mẫu (template)

Có thể là mạch đơn hay mạch đôi của chuỗi ADN hoặc ARN thường dài hơn300bp, được biết trước trình tự ở hai đầu để thiết kế mồi

 PCR có phản ứng khuyếch đại tối ưu xảy ra trên ADN thật tinh sạch, nhưngnhiều kỹ thuật chẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả tốt với ADN thu nhậntrực tiếp từ dịch tế bào

 Lượng ADN mẫu có thể giảm (1µg – 100µg ) khi sử dụng các polymerazahiệu quả cao Giảm lượng mẫu ADN ban đầu còn có tác dụng hạn chế cáckhuyếch đại ký sinh tạo các sản phẩm phụ không mong muốn

 PCR cho phép khuyếch đại cả các mẫu ADN không bảo quản tốt, đã bị phânhuỷ từng phần (vết máu lâu ngày, tinh dịch khô, hoá thạch, tóc, móng taymóng chân người chết).

Mặc dầu kích thước ADN khuôn không phải là yếu tố quan trọng nhưng nếudùng ADN hệ gen có phân tử lượng cao, người ta thường cắt thành từng đoạn nhỏhơn bằng enzym giới hạn như Not I hay Sfi I

Thông thường lượng ADN làm khuôn cho một phản ứng nên:

Mồi gồm một mồi xuôi (forward primer) và một mồi ngược (Reverse primer).Xuôi và ngược là so với chiều sao mã của gen

Trình tự mồi được chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi xuôivới mồi ngược và không có bắt cặp bổ sung giữa các phần khác nhau của một mồi(trình tự của chúng không được bổ trợ cho nhau)

Nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mồi xuôi và mồi ngược không cách xa nhauMồi phải đặc trưng cho trình tự ADN cần khuếch đại, không trùng với cáctrình tự lặp lại trên gen Trình tự nằm giữa mồi xuôi và mồi ngược không quá lớn.PCR sẽ tối ưu trên những trình tự < 1kb

Xét về bản chất hoá sinh học mồi là những đoạn oligonucleotit, mạch đơn dài

6 - 30bp, có trình tự bổ sung với trình tự bazơ của hai đầu đoạn khuôn để khởi đầuquá trình tổng hợp ADN Mồi cần mang tính đặc thù, để tăng tính đặc hiệu củaphản ứng Mồi càng dài, khả năng tổng hợp chính xác đoạn ADN đích càng lớn Sốlượng 4 loại bazơ nitơ trong mồi nên xấp xỉ nhau, tránh những vùng trình tự khôngbình thường, hoặc trình tự lặp đi lặp lại

2.6.3.3 Các nuleotit (dNTP)

Là hỗn hợp 4 loại dATP, dTTP, dGTP, dCTP, làm nguyên liệu cho phản ứngtổng hợp ADN Ngoài ra, có thể sử dụng một số nucleotit đã được thay đổi như gắnthêm biotin hoặc dioxigenin , tuỳ thuộc mục đích sử dụng sản phẩm PCR

Nồng độ dNTP thường dùng khoảng 100μM, tuy nhiên với nồng độ thấp thìM, tuy nhiên với nồng độ thấp thìTaq AND - polymeraza hoạt động chính xác hơn Nồng độ cao dễ xảy ra khuếchđại ký sinh Hơn nữa, nồng độ tối ưu của chúng phụ thuộc rất nhiều yếu tố như phảixác định cho từng phản ứng qua nhiều giai đoạn thử nghiệm:

2.6.3.4 Enzym ADN-polymeraza chịu nhiệt - Taq ADN polymeraza

Trong diễn biến các chu kỳ của phản ứng PCR có giai đoạn cần nhiệt độ caotới hơn 900C nên phải sử dụng loại enzym chịu nhiệt, được tách chiết một loại vi

khuẩn suối nước nóng Thermus aquaticus, nước suối nóng 940C - 1000C TaqADN-polymeraza không bị phá huỷ ở nhiệt độ cao, nhiệt độ biến tính và xúc tác sựtổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng Taq ARN-polymeraza có trọng lượngphân tử 94 kDa, có hoạt tính 5’ - 3’ exonucleaza và hoạt động tốt nhất ở 700C - 800CTrong 1 giây, trung bình nó gắn được 75 nucleotit Ngoài ra, còn có một số enzymđáp ứng yêu cầu trên như VentTM ADN-polymeraza, Pfu ADN, UIT maTM ADN.

2.6.3.5 Dung dịch đệm

Thành phần dung dịch đệm (buffer) có thể thay đổi tuỳ loại enzym được sửdụng, thành phần quan trọng nhất của dung dịch đệm là ion Mg2+ Nó hình thànhmột phức hợp hoà tan với dNTP, rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, xúc táccho enzym ADN-polymeraza, làm tăng nhiệt độ nóng chảy (Tm) của ADN mạchkép

Nồng độ MgCl2 trong hỗn hợp phản ứng cuối cùng biến đổi từ 0,5 - 5 mM,nồng độ tối ưu là 1 - 1,5mM Trong một số trường hợp, nồng độ này có thể thayđổi

Nồng độ MgCl2 có ảnh hưởng tới hiệu quả và tính đặc thù của phản ứng.Ngoài Mg2+ còn một số chất như AMSO, DMSO, fomamide được thêm vào nhằmtạo sản phẩm PCR có kích thước lớn

2.6.4 Số lượng chu kỳ của phản ứng PCR

Phản ứng PCR diễn ra qua hai giai đoạn:

Giai đoạn một: số lượng bản sao tăng lên theo cấp số mũ, tỉ lệ với lượng mẫuban đầu

Giai đoạn hai: hiệu quả khuếch đại giảm hẳn do:

 Phân huỷ và cạn kiệt các thành phần của phản ứng.

 Xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng

 Các bản sao vừa tổng hợp không kết hợp với mồi mà lại bắt cặp nhau

 Số chu kỳ phản ứng tùy thuộc số lượng bản mẫu ban đầu: Số bản mẫu là 105thì cần 25 - 30 chu kỳ Số bản mẫu là 102- 103 thì số chu kỳ phải là 35 - 40

2.7 Kỹ thuật xác định trình tự

Những phương pháp xác định trình tự axit nucleic đang được sử dụng ngày nayđều dựa trên phương pháp của Frederick Sanger (1977), có cải tiến Phương phápnày còn được gọi là phương pháp enzym học hay phương pháp dideoxy

Trong phương pháp này, người ta sử dụng các nhân tố kết thúc đặc hiệu quátrình kéo dài ADN khi tổng hợp Nhân tố kết thúc là các 2,3 dideoxynucleotittriphotphat (ddNTP) Các ddNTP có thể kết hợp vào chuỗi ADN đang tổng hợp quanhóm 5-triphotphat nhưng lại không thể tiếp tục kết hợp được với phân tửdeoxynucleotit triphotphat tiếp theo Do đó khi trộn lẫn lượng nhỏ dideoxynucleotittriphotphat với 4 loại deoxynucleotit triphotphat rồi tiến hành tổng hợp ADN nhờADN-polymeraza thì sẽ thu được một loạt các đoạn ADN được kết thúc đặc hiệubởi gốc dideoxynucleotit Tiến hành 4 thí nghiệm tách rời, mỗi phản ứng bổ sung 1loại dideoxynucleotit khác nhau sẽ thu được các đoạn ADN có kết thúc bằng cácdideoxynucleotit khác nhau và hơn kém nhau 1 nucleotit Chạy điện di các đoạnnày rồi hiện hình chúng, ta có thể xác định trình tự của chuỗi ADN quan tâm(Nguyễn Quang Thạch, 2004)

2.8 Vai trò của màu lông ở động vật

Màu lông là một trong những biểu hiện kiểu hình có thể quan sát dễ dàng ởcác loài vật Màu lông của các loài khác nhau là khác nhau, thậm chí trong cùngmột giống cũng có sự sai khác nhất định Sự sai khác này làm nên sự phong phútrong màu sắc các loài động vật Màu sắc lông còn có vai trò như dấu hiệu của tiếnhóa Động vật có màu lông như hiện nay một phần là kết quả chiến thắng quá trìnhđào thải của chọn lọc, thích nghi với các yếu tố sinh thái và môi trường sống Sựbiểu hiện của màu sắc lông, da là một phản ứng tự vệ Một con sâu sống trên thâncây sẽ hình thành màu xanh trên thân chúng để tránh kẻ thù phát hiện Ngoài ratrong giao phối tự nhiên màu sắc lông còn được sử dụng để kêu gọi bạn tình màchúng ta gặp điển hình ở loài Công Những con Công đực thường có bộ lông sặc sỡhơn những con công cái Ở loài chim sắc tố màu lông có chức năng sinh lý quantrọng, bao gồm chống oxy hóa, điều chỉnh miễn dịch, và thuộc tính bảo vệ quanghọc Sắc tố cũng được nhiều loài chim sử dụng như chất nhuộm màu, và chịu tráchnhiệm cho màu đỏ, cam và vàng Cụ thể, sắc tố đỏ ở loài chim có tác dụng như tínhiệu thể hiện tình trạng sức khỏe và dinh dưỡng của một cá thể và khả năng tìmkiếm những nguồn thức ăn tốt của nó Những nghiên cứu gần đây cho thấy sự biếnđổi sắc tố diễn ra trực tiếp trong kén khi lông phát triển Hiểu rõ sự biến đổi cơ chếhình thành màu sắc giữa các loài có thể là chìa khóa để hoàn chỉnh quá trình tiếnhóa khác nhau bao gồm tín hiệu màu sắc

Trong chăn nuôi màu sắc lông có vai trò rất lớn Đó là tính trạng rất quantrọng được sử dụng trong chọn giống Ở gà, các giống gà siêu thịt thường có lôngmàu trắng, các giống gà đẻ trứng thương phẩm thường có lông màu nâu Màu lôngcòn dùng để phân biệt gà trống, mái khi mới nở (autosexing), chẳng hạn ở cácgiống gà siêu trứng hiện nay như Hy line, Gold line con trống thương phẩm có màu

trắng, con mái có màu nâu Ở trên bò người ta còn phát hiện một mẫu thịt bò không

rõ nguồn gốc có phải là thịt của bò đen hoặc trắng Hostlein hay thịt bò xámHungary nhờ phản ứng PCR - RFLP sử dụng cặp mồi MCRE1/MCRE2 Theo đócác nhà khoa học khẳng định các phân tích đa hình gen MC1R là công cụ tốt đểphân biệt các sản phẩm thịt bò đen và trắng Hostlein và bò xám Hungary từ đóngăn chặn các nguy cơ gian lận (Radacsi A và cs, 2008) Đối với nhiều loài gia súcnhư cừu, dê…bộ lông của chúng còn có tác dụng với nghành công nghiệp dệt may

Ở nước ta hiện nay chăn nuôi dê đang phát triển đặc biệt là những giống dêcao sản nhập từ các nước khác về Chăn nuôi dê hiện nay không những theo hướnglấy thịt hoặc sữa mà còn để lấy lông Dê có một bộ lông tơ mịn bao phủ khắp thân

Bộ lông có thể chỉ có một màu hoặc nhiều màu, thường là màu đen, xám, trắng,nâu Lông dê dài ngắn tùy theo loài và tùy theo các khu vực địa lý khác nhau màchúng sống, ví dụ như những loài dê sống ở vùng nóng thì lông ngắn và thưa, cònnhững loài dê sống ở vùng lạnh thì lông dài và rậm hơn (như ở các vùng đồi núihoặc những nơi cao hơn mực nước biển Dê được nuôi không chỉ để lấy thịt, lấysữa, để hạn chế cỏ dại hay có ích trong việc trồng mới lại các bãi cỏ mà bộ lông củachúng cũng có giá trị (http://www.khuyennongtphcm.com)

2.9 Một số đặc điểm cấu tạo và chức năng của MC1R

Melanocortin 1 receptor (MC1R), còn có tên gọi khác như stimulating hormone receptor (MSHR), hoặc melanin-activating peptit receptor, làmột thụ thể xuyên màng, bám với một lớp hormone peptit được tiết ra từ tuyến yên,được biết đến như các melanocortin, trong đó gồm có hormone adrenocorticotropic

melanocyte-và các dạng khác nhau của hormone melanocyte-stimulating (MSH) MC1R là mộttrong những protein then chốt tham gia vào quá trình điều chỉnh màu da và lông ởđộng vật có vú Protein này định vị trên màng plasma của tế bào melanocyte,

những tế bào tạo ra sắc tố melanin thông qua quá trình melanogenesis Thông qua

sự điều chỉnh kiểu melanin được tạo ra và sự hoạt hóa của quá trình làm tế bàomelanocyte chuyển đổi việc tạo ra phaeomelanin có màu vàng hoặc đỏ thànheumelanin có mầu đen hoặc nâu (Garcia-Bronron và cs, 2005)

Khi được hoạt hóa bởi một trong nhiều loại MSH, thường là α-MSH, MC1Rkhởi động một phức hệ các nấc truyền tín hiệu, dẫn đến sự hình thành mầu nâuhoặc đen do sắc tố eumelanin Ngược lại, thụ thể này cũng có thể bị trung hòa/ gâytác dụng ngược bởi peptit tín hiệu Agouti (ASIP), kết quả các tế bào trở lại trạngthái sản xuất ra phaeomelanin có mầu vàng hoặc đỏ

Hình 2: Sơ đồ hoạt hóa MC1R

A: MC1R bị bất hoạt bởi Agouti (bị bám vào), phaomelanin (sắc tố màuvàng hoặc đỏ) được tổng hợp

B: Không có Agouti, α-MSH bám vào MC1R, eumelanin (sắc tố màu nâuhoặc đen) được sinh ra

Những tín hiệu truyền tới MC1R thông qua ASIP tạo ra các kiểu lông dảimầu vàng hoặc đen, được quan sát thấy trên lông ở phần lớn động vật có vú Ở một

số loài, tín hiệu ASIP không hoạt động tự nhiên mà bị giới hạn trong những vùngchính Sự riêng biệt này có mặt ở ngựa, ví dụ lông ngựa có thể là màu đen ở chân,bờm và đuôi, nhưng có màu đỏ ở thân (http://en.wikipedia.org) Tuy nhiên, các độtbiến của gen MC1R có thể tạo nên một thụ thể “trơ” ngay khi không bị kích thíchhoặc có hoạt động ở mức thấp hơn Các alen MC1R hoạt động chủ yếu được ditruyền trội và tạo ra mầu lông đen, trong khi các alen MC1R có chức năng khôngbình thường thể hiện tính trạng lặn sẽ tạo ra màu lông sáng Các thay đổi ở MC1Rliên quan tới màu đen, đỏ/ vàng và trắng/ kem ở một số loài động vật đã được công

bố, như chuột (Robbins L.S và cs, 1993), bò (Klungland H và cs, 1995), người(Valverde P và cs, 1995), lợn (Kijas J.M và cs, 1998), cáo (Vage D.I và cs, 1999),gấu (Ritland K và cs, 2001), chó (Schmutz S.M và cs, 2002), gà (Kerje và cs,2003), chim (Mundy N.I và cs, 2003), Li và cộng sự đã xác định màu đỏ ở đầu và

cổ của dê Boer được điều khiển bởi một gen lặn di truyền qua các thế hệ (Li long và cs, 2002) Ngoài ra màu lông trắng trên thân con dê Boer được dự đoán là

Xiang-do sự đột biến của nucleotit số 676 (C thay cho A) (Zhao-Long Wu và cs, 2006)

Ở nhiều động vật có vú, việc tăng chức năng do các thay đổi trên gen MC1R

có liên quan đến sự cường hóa quá trình tạo ra eumelanin, trong khi việc giảm chứcnăng do các điểm đa hình có liên quan đến sự tạo ra phaeomelanin có màu đỏ/vàng Sự mất chức năng do điểm đa hình cũng liên quan đến sự xuất hiện mầu lôngtrắng ở gấu (Ritland K và cs, 2001) Thêm nữa, các đa hình trên MC1R tìm thấytrên người với màu tóc đỏ (Valverde P và cs, 1995) Cũng ở trên người các nghiêncứu đã chỉ ra nhiều thay đổi di truyền trong gen MC1R tăng nguy cơ phát triển ungthư da, hình thức nghiêm trọng của bệnh ung thư da mà bắt đầu trong melanocytes

(melanoma) Sửa đổi trong MC1R gene làm gián đoạn khả năng của cácmelanocortin 1 receptor để phá vỡ khả năng sản xuất eumelanin trong melanocytes Bình thường eumelanin thường bảo vệ da khỏi các tác hại của bức xạ UV, thiếueumelanin da dễ bị tổn thương nhiều hơn do bức xạ của ánh nắng mặt trời Da chịuảnh hưởng lớn gây ra bởi bức xạ UV từ ánh sáng mặt trời là một yếu tố nguy cơ lớn

để phát triển melanoma (ung thư da) và các hình thức khác của bệnh ung thư da Ởtrên người các tác giả tìm thấy vị trí mà gen MC1R định vị là 16q24.3 từ cặpnucleotit số 88.512.526 đến 88.514.885 (Harding, R.M và cs, 2000)

Gen MC1R quy định sự hình thành chuỗi protein MC1R gồm 317axitamin Dưới đây là hình ảnh chuỗi protein MC1R ở một số loài động vật

Hình 3: Sơ đồ chuỗi protein MC1R ở một số loài động vật

Tại các vị trí có các màu tô đậm khác nhau là vị trí có sự sai khác nhau trongcấu trúc gen MC1R ở các loài khác nhau.

Tuy nhiên, các đa hình trên MC1R ở dê hiện vẫn chưa được công bố trênngân hàng gen (Genbank) Với mục đích tìm ra mối liên quan giữa gen MC1R vớimàu lông trên dê, việc phân tích đa hình trên MC1R được tiến hành

Sự đa dạng màu sắc đặc biệt phong phú ở động vật nuôi, trong cùng loàicũng như khác loài Đặc điểm này được ứng dụng trong các nghiên cứu cơ bản vềsắc tố và mối liên quan giữa kiểu hình và kiểu gen trên mô hình động vật nuôi.Việc tổng hợp màu sắc có một số chức năng như trong phối giống, trong ngụy trang

kẻ thù và để thích nghi điều kiện môi trường Và hệ quả là, gen MC1R rất bảo thủ

và được coi là công cụ cho các nghiên cứu về tiến hóa

2.10 Nguồn gốc, phân bố và phân loại động vật học chung của dê

Về nguồn gốc và theo phân loại động vật, dê là gia súc nhai lại nhỏ thuộc lớpđộng vật có vú (Mammalia), bộ móng chẵn (Artiodactyla), bộ phụ nhai lại(Ruminantia), họ sừng rỗng (Bovidae), họ phụ dê cừu (Capra rovande), loài dê(Capra hircus), giống dê

Dê rừng (Capra aegagrus) trên thế giới được chia làm ba nhóm: Nhóm 1 làBezoar (C a eagagrus), nhóm 2 là: Ibex (C a Ibex) và nhóm 3 là: Markhor Dêrừng phân bố rộng ở vùng núi và bán sơn địa, phạm vi phân bố tự nhiên của nhómBezoar là vùng Tây Á Nhóm Ibex phân bố ở vùng Tây Tạng, đông Châu Phi vàChâu Á Nhóm Markhor phân bố ở Afghanistan và vùng Kashimir - Karakorum

Với những dẫn liệu đặc biệt tìm thấy được gần đây, người ta cho rằng nơithuần hóa các giống dê đầu tiên bắt nguồn từ Châu Á, vào thiên niên kỷ thứ 7 - 9trước công nguyên tại vùng Tây Á

Theo tài liệu của Herre và Robrs 1973 thì dê là loài vật nuôi sớm nhất củaloài người Giống như các loài vật nuôi khác dê sau khi thuần hóa đầu tiên đượcnuôi với mục đích lấy thịt, lấy sữa cũng là một hướng sử dụng sớm của con người

thậm chí còn sớm hơn cả nuôi bò lấy sữa vì vắt sữa dê còn dễ hơn vắt sữa bò.Trung tâm nuôi dê sớm nhất xuất hiện ở các nước Trung Đông sau đó đến Ấn Độ

và Ai Cập tiếp đến các nước phương Tây, châu Á và châu Phi Trung tâm nuôi dêlớn nhất mới hình thành ở Đông Nam Châu Á (Đinh Văn Bình, 2000)

2.11 Đặc điểm một số giống dê ngoại nuôi ở Việt Nam.

2.11.1 Dê Alpine

Nguồn gốc, phân bố:

 Tên tiếng anh là dê Alpine

 Đây là giống dê được tạo từ vùng núi Alpine (Pháp) Nhập từ Pháp về nước

ta năm 1998, nhập từ Mỹ năm 2002

 Phân bố: Hiện nay giống dê này được nuôi ở Trung tâm Nghiên Cứu dê vàThỏ Sơn Tây – Hà Nội và Ninh Thuận

Đặc điểm hình thái:

Dê Alpine có màu lông đa dạng nhưng chủ yêú là nâu hoặc đen có loang trắng

và kết hợp các loại màu trên, lông ngắn Con đực thường có lông dài hai xươngsống Tai cuộn tròn và dựng đứng Khối lượng dê sơ sinh 2,7 - 3,0 kg/con Lúctrưởng thành dê cái cao: 0.75 m và nặng 50kg Dê đực cao: 0.85 - 1,0 m, nặng 75kg/con

Hình 4: Dê Alphine

2.11.2 Dê Boer

Nguồn gốc, phân bố:

 Tên tiếng anh là Dê Boer

 Được nhập từ Mỹ vào Việt Nam năm 2002

 Phân bố: Hiện nay đang nuôi ở Trung tâm nghiên cứu dê và thỏ Sơn Tây

-Hà Nội và Thành phố Hồ Chí Minh

Đặc điểm hình thái:

Thân màu trắng, cổ, đầu tai màu nâu đỏ, trán và mặt trắng Tai to và cụp,sừng thường uốn cong về phía sau Đầu to khoẻ, mắt màu nâu Lúc trưởng thànhcon đực nặng khoảng 110 - 135kg và dê cái nặng 90 - 100 kg/con

Hình 5: Dê Boer

2.11.3 Dê Beetal

Nguồn gốc, phân bố:

 Tên tiếng anh là dê Beetal

 Nguồn gốc : từ các vùng Punjab Ấn Độ, Rawalpindi và Lahore Pakistan.Được nhập vào Việt Nam từ năm 1994

 Phân bố : Đầu tiên nuôi ở Trung tâm Nghiên cứu Dê và Thỏ Sơn Tây –HàNội Hiện nay còn nuôi thêm ở cả một số tỉnh miền Trung và miền Nam

Đặc điểm hình thái:

 Màu lông dê Beetal thường hung đỏ, có các điểm trắng và cũng có các màukhác như màu đen Mũi gồ và tai dài, con đực thường có bộ râu cằm đặctrưng mà con cái không có

 Lúc trưởng thành con đực cao khoảng 89cm, con cái cao khoảng 84cm Lúctrưởng thành con đực nặng khoảng 60 kg và con cái nặng khoảng 40 kg

Hình 6: Dê Beetal

2.11.4 Dê Jamnapari

Nguồn gốc, phân bố:

 Tên tiếng anh là dê Jamnapari

 Được nhập từ Ấn Độ vào Việt Nam năm 1994

 Phân bố: Dê Jamnapari hiện đang được nuôi ở Trung tâm nghiên cứu dê vàthỏ Sơn Tây - Hà Nội

2.12 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về gen MC1R

Ở nước ta đã có nhiều công trình nghiên cứu về các đặc điểm sinh học, khảnăng thích nghi, nghiên cứu khả năng sản xuất, chế độ dinh dưỡng thích hợp trongkhẩu phần ăn của các loài vật nuôi trong đó có dê Di truyền phân tử trong chănnuôi cũng đã được nghiên cứu và có những thành tựu đáng ghi nhận Tuy vậy việc

sử dụng các kỹ thuật của di truyền phân tử trên dê chưa được nghiên cứu nhiều đặcbiệt là sử dụng các kỹ thuật di truyền phân tử trong nghiên cứu về gen quy địnhmàu sắc lông (MC1R) trên dê

Trên thế giới: Các nhà khoa học trên thế giới đã và đang tiếp tục nghiên cứu

về MC1R ở động vật có vú Ở trên lợn nghiên cứu về màu sắc lông chỉ ra một

chuỗi 3 alen tại locus E đã được củng cố tốt ở trên lợn nơi E (đối với màu lông đenđồng nhất) là trội đối với Ep(đối với đốm đen) và lặn e (đối với màu lông đỏ đồngnhất) (Olliver và cs, 1982) Các nghiên cứu về sự sai khác di truyền của gen MC1R

ở trên chuột đã chỉ ra ở cả hai alen trội và lặn đều xuất hiện đột biến và thể hiệnchức năng Alen quy định màu lông vàng (e) ở chuột mã hóa cho thụ thể khôngchức năng liên quan đến đột biến dẫn đến việc loại bỏ quá trình tổng hợpeumelanin Ngược lại alen trội (E) gây ra một dãy các kiểu hình lông màu đen do sựđột biến chức năng (Robbins và cs, 1993) Những phân tích trước đây về di truyềnmàu sắc lông trong phạm vi sự giao phối của lợn Large White chỉ định một cách chắcchắn locus E ở NST 6p (Mariani và cs, 1996) Ở người các nghiên cứu về MC1R chỉ

ra có ít nhất 20 dạng alen khác nhau và 1 vài alen trong số đó liên quan đến tóc đỏ và

da trắng (Valverde và cs, 1995; Box và cs, 1997) Một nghiên cứu khác về gen MC1Rtrong vai trò điều khiển sự hình thành những nốt tàn nhang ở người chỉ ra 27 dạngbiến thể của MC1R, trong đó các trường hợp phổ biến nhất là Val60Leu, Asp84Glu,Val92Met, Arg160Trp, Arg163Gln, His260Pro, Asp294His (Valverde và cs, 1995;

Smith và cs, 1998) Ngoài ra các tác giả còn chỉ rõ MC1R có mặt trong những tếbào hắc tố nang lông và da Sự hoạt động của MC1R được điều khiển bởi hormonhướng vỏ thượng thận hay chính là α-melanocyte stimulating hormon (α-MSH) -hormon kích thích tế bào biểu bì (Garcia-Borron và cs, 2005) Những nghiên cứuthực hiện trên người Anh, Hà Lan, và Úc cho thấy MC1R có sự đa dạng di truyềncao ở những người da trắng, với hơn 50% những người da trắng mang trong mình ítnhất một dạng biến thể của MC1R (Marrten Bastiaens và cs, 2001) Một nghiêncứu khác của các nhà khoa học của Bộ môn khoa học động vật, khoa Khoa họcđộng vật và công nghệ, trường Đại học Hebei, Baoding, Trung Quốc cũng tiếnhành trên lợn sử dụng các phương pháp giải trình tự, PCR - RFLP và PCR - SSCPxác định các điểm sai khác di truyền trên ba giống lợn Landrace, Yorkshire, Duroc

đã chỉ ra các điểm đột biến cụ thể là ở vị trí nucleotit 668G→C, 1318C→T,1554G→A, 1197G→A Trong tất cả các mẫu nghiên cứu thuộc giống Landrace vàYorkshire thấy sự hiện diện của các vị trí đồng hợp tử 668 GG, 1197AA, 1318CC,

và 1554GG, và CC ở vị trí nucleotit 894 Trong khi đó ở các cá thể thuộc giốngDuroc thấy sự có mặt của các đồng hợp tử trái ngược đó là 668 CC, 1197GG,

1318TT và 1554AA, không có CC ở vị trí nucleotit 894 (Guiling Dun và cs, 2007).

Một nhóm các nhà khoa học Trung Quốc tiến hành giải trình tự so sánh nhữngđiểm khác biệt di truyền trên MC1R ở những con bò Tây Tạng sử dụng kỹ thuậtPCR với cặp mồi

F: 5′ - GGACCCTGAGAGCAAGCAC - 3′;

R: 5′ - CTCACCTTCAGGGATGGTCTA - 3′

thu được đoạn gen MC1R có độ dài 954bp, và trình tự thu được giống với trình tựđoạn MC1R thu được trên những con bò hoang dã với hơn 99% những vị trí tương

đồng So sánh trình tự của 44 con bò Tây Tạng thấy có tổng số 5 nucleotit đơn đahình Những vị trí nucleotit đơn đa hình được chỉ ra ở ba locus là EY1, EY2, EY3 Cáctrình tự thu được đã được đăng ký công bố trên ngân hàng gen thế giới với các mã

số là FJ624478, FJ624479, FJ624480 (Shi-Yi Chen và cs, 2009) Trên dê đã có cáckết quả nghiên cứu về màu lông của dê Boer trong mối quan hệ với MC1R, các tácgiả cho rằng màu đỏ ở đầu và ở cổ dê Boer có thể được điều khiển bởi alen lặn củaMC1R (Li và cs, 2002)

III VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng, vật liệu, thời gian và địa điểm nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu:

Gen MC1R của dê

3.1.2 Vật liệu nghiên cứu.

Mẫu máu của các giống dê:

Cặp mồi dùng cho phản ứng PCR:

Phản ứng PCR tiến hành sử dụng cặp mồi đặc hiệu MC1R E1/MC1R E2 được đặttổng hợp tại hãng Invitrogen có trình tự như sau:

 Hoá chất dùng để điện di kiểm tra sản phẩm: thạch agarose; dung dịch đệmTAE1x; chất chỉ thị màu Ethidium Bromid; loading dye.

 Các hoá chất dùng cho kỹ thuật PCR: đệm Buffer; MgCl2; dNTPs; enzymTaq ADN-polymeraza của hãng Fermentas

 Bộ kit dùng cho tinh sạch sản phẩm PCR Wizard SV gel and PCR clean-upsystem của hãng Promega

 Bộ hoá chất Gen JETTMPCR Cloning Kit của Fermentas

 Bộ kít xác định trình tự Bigdye®-terminator 3.1 của hãng AppliedBiosystems (Mỹ)

3.1.3 Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 15/1/ 2009 đến 15/6/2009

3.1.4 Địa điểm nghiên cứu:

Viện Chăn nuôi Quốc gia - Thụy Phương - Từ Liêm - Hà Nội

Viện Công nghệ sinh học Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam - Số 18 - HoàngQuốc Việt - Cầu Giấy - Hà Nội

3.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu.

3.2.1 Nội dung nghiên cứu.

 Tìm hiểu về gen MC1R

 Điều tra thu thập mẫu máu của 4 giống dê Lấy mẫu máu (mỗi giống lấy 20mẫu) và tách chiết ADN

 Dùng kỹ thuật PCR và kỹ thuật giải trình tự phân tích các mẫu máu của cácgiống dê: dê Alpine, dê Beetal, dê Boer, dê Jamnapari nuôi tại Trung tâmnghiên cứu dê và thỏ Sơn Tây

 Giải trình tự và so sánh với trình tự đã công bố trên ngân hàng gen thế giớiNCBI (http://www.ebi.ac.uk/) để tìm ra các điểm sai khác trên gen quy địnhmàu lông của 7 mẫu nghiên cứu

3.2.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.2.1 Phương pháp lấy mẫu máu của dê

Mẫu máu được lấy từ tĩnh mạch cổ dê, đựng trong ống lấy mẫu vô trùng hútchân không có chất chống đông EDTA Mỗi con lấy khoảng 3 - 5ml máu Các dụng

cụ khác như kim tiêm, xilanh vô trùng, găng tay, bông, cồn, thùng đá

Đầu tiên cột chặt phần đầu dê dùng chân và tay kết hợp, tiếp theo xác định vị trítĩnh mạch cổ sát trùng vị trí này bằng cồn, đưa xilanh gắn đầu kim đã sát trùng tríchvào tĩnh mạch ở vị trí đã sát trùng Hút 3 - 5ml máu rồi chuyển vào ống mẫu đãchuẩn bị trước Mẫu máu sau khi lấy xong được đánh dấu cẩn thận và bảo quảntrong bình đá khô, vận chuyển về phòng thí nghiệm, bảo quản ở tủ -200C

Tiếp theo, các mẫu được tiến hành phân tích các bước:

Tách chiết ADN

Nhân gen PCR

Đọc trình tự

So sánh với trình tự trên ngân hàng gen Quốc tế NCBI (http://www.ebi.ac.uk/)

3.2.2.2 Phương pháp tách chiết ADN từ máu

Nguyên tắc chung:

Màng tế bào được phá vỡ bằng các chất tẩy rửa mạnh, ADN trong tế bàođược giải phóng cùng với các protein Sau đó, ADN được tinh sạch nhờ proteinase

K và hỗn hợp phenol: chloroform: isoamyl alcohol Cuối cùng, ADN được tủa bằngEtOH 99,99 % và được thu lại bằng phương pháp ly tâm.

Tiến hành:

Mẫu máu dê lấy về từ trung tâm được bảo quản ở điều kiện -200C do đó phảilàm tan ở 390C trong bể ổn nhiệt khoảng 1 giờ Sau đó lấy 200 μM, tuy nhiên với nồng độ thấp thìl máu vào các ốngeppendof 1.5ml và tiến hành tách chiết ADN tổng số theo phương pháp củaSambrook và Russell có sửa đổi (Sambrook và cs, 2001) bao gồm các bước sau:

 Bước 1: Chia vào các ống Epp 1.5ml, mỗi ống 200μM, tuy nhiên với nồng độ thấp thìl máu

 Bước 2: Bổ sung 300 μM, tuy nhiên với nồng độ thấp thìl PBS1x Votex, ly tâm 6000v/p trong 15 phút ở 40C

bỏ dịch Lặp lại bước này lần nữa

 Bước 3: Bổ sung 500 μM, tuy nhiên với nồng độ thấp thìl Lysis buffer + 5 μM, tuy nhiên với nồng độ thấp thìl Proteinase K Ủ 560C trong 3 giờ

 Bước 4: Bổ sung 500 μM, tuy nhiên với nồng độ thấp thìl dung dịch phenol: cloroform: isoamyl alcohol

(25:24:1) Votex, ly tâm 6000v/p trong 15 phút ở 40C Thu tủa

 Bước 5: Bổ sung 500 μM, tuy nhiên với nồng độ thấp thìl dung dịch cloroform: isoamyl alcohol (24:1) Votex,

ly tâm 12000v/p trong 15 phút ở 40C Thu tủa

 Bước 6: Bổ sung 50 μM, tuy nhiên với nồng độ thấp thìl dung dịch CH3COONa, 1ml Ethanol Ủ -20 0C trong 3giờ

 Bước 7: Ly tâm 12000v/p trong 15 phút ở 40C

 Bước 8: Bổ sung 500 μM, tuy nhiên với nồng độ thấp thìl cồn 70% Ly tâm 12000v/p trong 15 phút ở 40C

 Bước 9: Sấy khô trong máy Speed Vac – Hòa tan tủa trong 30 μM, tuy nhiên với nồng độ thấp thìl H2O khửion vô trùng Điện di với 8 μM, tuy nhiên với nồng độ thấp thìl để kiểm tra sản phẩm tách chiết

3.2.2.3 Phương pháp nhân gen PCR

Sau khi thu được ADN tổng số chúng tôi tiến hành phản ứng nhân gen PCR với cặp mồi đặc hiệu MC1R E1/MC1R E2