Nghiên cứu trích ly alkaloid trong lá trà xanh và trái quất

Ngày nay, cùng với sự phát triển của kinh tế thì việc mở rộng ứng dụng công nghệ vào các hoạt động sản xuất nhằm tối ưu hóa năng suất và chi phí là vô cùng quan trọng. Trong những năm gần đây, công nghệ tách chiết các hợp chất từ thực vật đã không ngừng phát triển và bước đầu đạt được những thành quả đáng kể. Trên thế giới từ rất lâu người ta đã ứng dụng những công nghệ này để sản xuất các chất có dược tính, phục vụ lợi ích của con người. Có khoảng hơn 20.000 hợp chất được chiết xuất từ thực vật có dược tính rất có giá trị đối với cuộc sống. Những hợp chất này như các alkaloid, glycosid, carbohydrat, … được biết đến như là các hợp chất thứ cấp. Các hợp chất này thường chỉ được tạo ra ở một số loại tế bào nhất định của thực vật như các tế bào rễ tơ, biểu mô, hoa, lá… Mặc dù, công nghệ tổng hợp hữu cơ vẫn phát triển mạnh mẽ và thu được nhiều thành tựu, tuy nhiên có nhiều chất không thể sản xuất bằng cách tổng hợp, cũng như chi phí đầu tư cho việc tổng hợp là cao. Cho nên chiết tách các hợp chất từ thực vật vẫn là một nguồn nguyên liệu trực tiếp, gián tiếp hoặc cung cấp nguyên liệu cho công nghệ bán tổng hợp nhằm giảm chi phí đầu tư, tối ưu hóa hiệu suất. Xuất phát từ thực tế trên, tôi đã tiến hành tìm hiểu đề tài: “Nghiên cứu trích ly alkaloid trong lá trà xanh và trái quất”. Mục tiêu của đề tài là: Tìm hiểu về alkaloid, cấu tạo hóa học và phân loại của alkaloid, các phương pháp chiết xuất các alkaloid. Xây dựng quy trình tối ưu để trích ly alkaloid trong lá trà xanh và trái quất.

LỜI MỞ ĐẦU i

DANH MỤC BẢNG ii

DANH MỤC HÌNH iii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv

Ngày nay, cùng với sự phát triển của kinh tế thì việc mở rộng ứng dụngcông nghệ vào các hoạt động sản xuất nhằm tối ưu hóa năng suất và chi phí là

vô cùng quan trọng

Trong những năm gần đây, công nghệ tách chiết các hợp chất từ thực vật

đã không ngừng phát triển và bước đầu đạt được những thành quả đáng kể.Trên thế giới từ rất lâu người ta đã ứng dụng những công nghệ này để sảnxuất các chất có dược tính, phục vụ lợi ích của con người Có khoảng hơn20.000 hợp chất được chiết xuất từ thực vật có dược tính rất có giá trị đối vớicuộc sống Những hợp chất này như các alkaloid, glycosid, carbohydrat, …được biết đến như là các hợp chất thứ cấp Các hợp chất này thường chỉ đượctạo ra ở một số loại tế bào nhất định của thực vật như các tế bào rễ tơ, biểu

mô, hoa, lá…

Mặc dù, công nghệ tổng hợp hữu cơ vẫn phát triển mạnh mẽ và thu đượcnhiều thành tựu, tuy nhiên có nhiều chất không thể sản xuất bằng cách tổnghợp, cũng như chi phí đầu tư cho việc tổng hợp là cao Cho nên chiết tách cáchợp chất từ thực vật vẫn là một nguồn nguyên liệu trực tiếp, gián tiếp hoặccung cấp nguyên liệu cho công nghệ bán tổng hợp nhằm giảm chi phí đầu tư,tối ưu hóa hiệu suất

Xuất phát từ thực tế trên, tôi đã tiến hành tìm hiểu đề tài: “Nghiên cứu

trích ly alkaloid trong lá trà xanh và trái quất”.

Mục tiêu của đề tài là:

phương pháp chiết xuất các alkaloid

quất

Bảng 1.1 Các họ thực vật giàu alkaloid 9

Bảng 1.2 Một số loài động vật có chứa alkaloid 15

Bảng 1.3 pKa của một số alkaloid 18

Bảng 1.4 Phản ứng của alkaloid với các thuốc thử tạo tủa vô định hình 19

Bảng 1.5 Phản ứng của alkaloid với các thuốc thử tạo tủa tinh thể 19

Bảng 1.6 Phản ứng của alkaloid với các thuốc thử đặc hiệu 20

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát khối lượng, hiệu suất sản phẩm thu được khi thay đổi lượng dung dịch Na2CO3 10% để kiềm hóa bột trà 36

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát khối lượng, hiệu suất sản phẩm thu được khi thay đổi thời gian đun dung dịch trà – kiềm 38

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát khối lượng, hiệu suất sản phẩm thu được khi thay đổi lượng dung môi dicloromethane sử dụng 39

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát khối lượng, hiệu suất sản phẩm thu được khi thay đổi lượng dung môi cloroform sử dụng chiết hồi lưu cao quất 43

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát khối lượng sản phẩm thu được khi thay đổi thời gian chiết hồi lưu cao quất 45

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát khối lượng, hiệu suất sản phẩm thu được khi thay đổi khoảng nhiệt độ chiết hồi lưu cao quất 46

Hình 1.1 Cây mã tiền 10

Hình 1.2 Cà độc dược 10

Hình 1.3 Cây trà (chè) 10

Hình 1.4 Cây thuốc lá 11

Hình 1.5 Cây ma hoàng 11

Hình 1.6 Canh ki na 11

Hình 1.7 Cây náng 12

Hình 1.8 Cây anh túc 12

Hình 1.9 Cây hồ tiêu 12

Hình 1.10 Cây lựu 13

Hình 1.11 Cây ba gạc 13

Hình 1.12 Cây bách bộ 13

Hình 1.13 Cây bình vôi 14

Hình 1.14 Quy trình chiết alkaloid sử dụng dung môi MeOH 21

Hình 1.15 Quy trình chiết alkaloid sử dụng dung môi cồn acid/ nước acid.21 Hình 1.16 Quy trình chiết alkaloid dưới dạng base 22

Hình 1.17 Cây trà (chè) 24

Hình 1.18 Cây quất (tắc, hạnh) 28

Hình 2.1 Quy trình chiết tách caffein trong lá trà 33

Hình 2.2 Quy trình chiết tách alkaloid trong cao quất 36

Hình 3.1 Biểu đồ khảo sát sự phụ thuộc của khối lượng sản phẩm thu được khi thay đổi lượng dung dịch Na CO 10% sử dụng 39

khi thay đổi thời gian đun dung dịch trà – kiềm 40Hình 3.3 Biểu đồ khảo sát sự phụ thuộc của khối lượng sản phẩm thu được khi thay đổi lượng dung môi dicloromethane sử dụng 42Hình 3.4 Sắc phổ của sản phẩm 43Hình 3.5 Sắc phổ của mẫu caffein chuẩn 44Hình 3.6 Biểu đồ khảo sát sự phụ thuộc của khối lượng sản phẩm thu được khi thay đổi lượng dung môi cloroform sử dụng 46Hình 3.7 Biểu đồ khảo sát sự phụ thuộc của khối lượng sản phẩm thu được khi thay đổi thời gian chiết hồi lưu cao quất 47Hình 3.8 Biểu đồ khảo sát sự phụ thuộc của khối lượng sản phẩm thu được khi thay đổi khoảng nhiệt độ chiết hồi lưu cao quất 49Hình 3.9 Sắc phổ của sản phẩm 51Hình 3.10 Sắc phổ của mẫu codein chuẩn 52

Alk: Alkaloid

DCM: Dicloromethane

HPLC: High performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao)IR: Infra red (Phổ hồng ngoại)

MS: Mass spectrometry (Khối phổ)

NMR: Nuclear magnetic resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân)

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1.1. Khái niệm alkaloid

Alkaloid có nguồn gốc từ chữ: alcali tiếng Ả rập có nghĩa là kiềm, đây

là những hợp chất hữu cơ có chứa dị vòng nitơ, có tính bazơ thường gặp ởtrong nhiều loài thực vật và đôi khi còn tìm thấy trong một vài loài độngvật

1.1.2. Phân loại alkaloid

Có thể chia alkaloid làm 5 loại dựa vào bậc của nguyên tử Nitơ trongcấu tạo phân tử alkaloid: Nitơ bậc I, Nitơ bậc II, Nitơ bậc III, Nitơ bậc IV;Nitơ – oxyd

ở pH > 8.0 chúng ở dạng không ion hóa

chất rất phân cực, trong mọi điều kiện pH chúng đều tồn tại ở dạng ion,

để tách chiết chúng phải phân lập dưới dạng muối

capsaicin) và hầu hết các lactam (ricinin )

tan trong nước, hay gặp ở các alkaloid pyrrolizidin (N-oxyd-indicin)

Theo đường sinh tổng hợp có thể chia alkaloid thành 3 loại: alkaloid, proto-alkaloid, alkaloid thực

thành từ các acid amin, chúng có chứa dị vòng Nitơ, và có thể đượcchia thành nhiều nhóm nhỏ hơn tùy nhân căn bản như sau:

pyrrol

- Alkaloid khung indolizidin:

Các kiểu proto- alkaloid thường gặp:

Ngoài ra, người ta còn có thể phân loại alkaloid dựa trên:

Alkaloid là một hợp chất hữu cơ có tính dược tính, do vậy nó có nhiều ứngdụng trong việc điều trị bệnh, tùy từng loại alkaloid mà nó có những công dụng khác nhau như:

Alkaloid trong tự nhiên có ở cả động vật và thực vật, tuy nhiên chúng tồntại phần lớn ở trong thực vật Trong thực vật chúng tồn tại chủ yếu ở thực vậtbậc cao, ngành hạt kín (cà phê, mã tiền, họ cà, hành, tỏi ), ít gặp trong cácngành hạt trần, nấm, quyết thực vật, và hầu như không gặp chúng ở các thựcvật bậc thấp

Năm 1995, người ta tìm thấy khoảng 27000 alkaloid, trong đó có hơn

21000 alkaloid được tìm thấy ở các thực vật bậc cao, gồm 27 nhóm, 1872khung cơ bản Và khoảng 6000 alkaloid được tìm thấy ở động vật, thực vậtkhác Hiện nay, vào năm 2013 con số alkaloid được tìm đã tăng lên đến

30000 alkaloid, trong đó có khoảng 21120 alkaloid được tìm thấy trong thựcvật hạt kín và hạt trần, ở thực vật bậc cao, alkaloid có mặt trong 67/83 bộ,186

họ, 1730 chi, 7231 loài, 16 bộ còn lại chưa phát hiện có mặt alkaloid

Bảng 1.1 Các họ thực vật giàu alkaloid Apocynaceae

(họ Trúc đào)

Papaveraceae

Ranunculaceae(họ Hoàng liên)

Rubiaceae

(họ Cà phê)

Liliaceae (họ Loa kèn)

Loganiaceae (họ Mã tiền)Amaryllidaceae

(họ Loa kèn đỏ)

Lauraceae(họ Nguyệt quế)

Berberidaceae(họ Hoàng mộc)Boradinaceae

(họ Vòi voi)

Piperaceae (họ Tiêu)

Menispermaceae (họ Tiết dê)

Ngoài ra alkaloid còn tồn tại trong các loài thực vật bậc thấp như:

psilocybe semilanceata và panaeolus subalteatus

serrata

một số bộ phận nhất định như hoa, lá, thân, hạt, củ, rễ Dưới đây làmột số ví dụ điển hình về các loài cây phổ biến có chứa alkaloid:

Hình 1.1 Cây mã tiền

Hình 1.2 Cà độc dược

- Cây có chứa alkaloid trong lá như: trà, thuốc lá

Hình 1.3 Cây trà (chè)

Hình 1.4 Cây thuốc lá

Hình 1.5 Cây ma hoàng

Hình 1.6 Canh ki na

Hình 1.7 Cây náng

Hình 1.8 Cây anh túc

Hình 1.9 Cây hồ tiêu

Hình 1.10 Cây lựu

Hình 1.11 Cây ba gạc

Hình 1.12 Cây bách bộ

Hình 1.13 Cây bình vôi

Alkaloid trong tự nhiên thường tồn tại ở dạng hỗn hợp của các alkaloidcùng nhóm, chúng thường chứa 1-2 alkaloid chính có hàm lượng cao nhất(trong trà xanh ngoài chứa phần lớn là caffein chúng còn chứa 1 lượng nhỏtheobromin và theophyllin), trong các thực vật cùng họ thường chứa các

Đặc biệt rất hiếm khi alkaloid và tinh dầu tồn tại đồng thời

Hàm lượng alkaloid thay đổi theo điều kiện dinh dưỡng, sinh lý củacây, nói chung thường là thấp Hàm lượng alkaloid được cho là nhiều khichiếm trên 1% khối lượng, ít khi chiếm dưới 1% khối lượng, và nếu chỉchiếm dưới 0,01% nó được coi là không tồn tại Tuy vậy, vẫn có nhữngtrường hợp đặc biệt như:

Trong động vật người ta tìm thấy có khoảng 1500 alkaloid

Một số loài động vật có chứa alkaloid:

Bảng 1.2 Một số loài động vật có chứa alkaloid

Ếch phi tiêu độc Kokoe (Phyllobates aurotaenia)

Ếch dâu cực độc (Dendrobates pumilio)

BatrachotoxinPumiliotoxin

Cóc mía (Bufo bufo)

BufoteninBufotenidinSerotonin

Sa giông (Salamanders)

SamandarinSamanin

Giun heo (Ascaris suum)

Morphin

Sâu bi (Glomeris marginata)

GlomerinHomoglomerin

Saxidomus giganteus

Saxitoxin

nhiệt độ thường, trừ: arecolin, pilocarpidin tồn tại dạng lỏng ở nhiệt độthường

lỏng ở nhiệt độ thường

glycosid, và hiếm khi ở dạng base

tan trong dung môi hữu cơ kém phân cực

trong dung môi hữu cơ kém phân cực

1.2.2. Tính chất hóa học

- Một số ít alkaloid có tính kiềm mạnh như: nicotin, các Alkaloid cóchứa Nitơ bậc 4, các alkaloid có chứa Nitơ oxyd, các Alkaloid có chứa

2 nguyên tử Nitơ

colchicin, codein, ricinin, piperin

Các alkaloid có tính kiềm mạnh rất dễ tạo muối bền với acid, còn alkaloid

có tính kiềm rất yếu thì cho muối kém bền, dễ trở về dạng base khi tác dụngvới acid

Bảng 1.3 trình bày giá trị thông số pKa của một số alkaloid:

Bảng 1.3 pKa của một số alkaloid

Alkaloid còn tham gia các phản ứng đặc trưng với :

- các thuốc thử tạo tủa tinh thể (Bảng 1.5) và

Bảng 1.4 Phản ứng của alkaloid với các thuốc thử tạo tủa vô định hình

màu

diamin chromat III

50%

khá đặc trưng

Bảng 1.5 Phản ứng của alkaloid với các thuốc thử tạo tủa tinh thể

loại Alkaloid

Acid picric 2,4,6-trinitrophenol - Có màu vàng -> đỏ

cam

- Có hình dạng đặc trưng

- Có điểm chảy xác định

Acid

picrolonic

Delta’ của p-nitrobenzen

Bảng 1.6 Phản ứng của alkaloid với các thuốc thử đặc hiệu

-> lục

sulfo-molybdic

đỏ

1.3.1. Nguyên tắc chung

Alkaloid là các base yếu, trong cây chúng tồn tại ở dạng:

Để tách chiết Alkaloid, ta có thể:

1.3.2. Các phương pháp trích ly alkaloid ở thực vật

Alk muối/Bột dược liệu

Chiết = cồn/acidLắc với Et2O

Alk base/dm hữu cơ

Cắn alk baseAlk muối mới/dịch acid

Lắc dm hữu cơ

Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2010-2014 Trường ĐH BR - VT

- Sử dụng dung môi cồn acid/ nước acid để chiết

MeOH

Cô quay

Loại nước

Lọc bỏ tủa

+ HCl 2%

Dịch DCM

Kiềm hóaDịch lọc alkaloid muối

Chiết = DCMHình 1.14 Quy trình chiết alkaloid sử dụng dung môi MeOH

Hình 1.15 Quy trình chiết alkaloid sử dụng dung môi cồn acid/ nước acid

c) Chiết dạng Alkaloid base

Hình 1.16 Quy trình chiết alkaloid dưới dạng base

Trong tự nhiên, alkaloid tồn tại ở rất nhiều loài động – thực vật, tuy nhiên trong khuôn khổ của đồ án tốt nghiệp này tôi lựa chọn nghiên cứu trích ly alkaloid ở 2 đối tượng đó là cây trà (chè) và cây quất (tắc, hạnh) Đây là 2 loạicây dễ trồng và được trồng phổ biến, rộng rãi khắp đất nước, dân gian từ lâu

đã sử dụng chúng như một phương thuốc để chữa một vài loại bệnh thông thường, khoa học cũng chứng minh được trong 2 loại cây này có chứa những hợp chất có tác dụng dược lý, điển hình như hợp chất alkloid

1.4.1. Cây trà (chè)

Cây trà hay cây chè có tên khoa học là Camellia sinensis, là loại cây mà lá

và chồi của chúng được sử dụng để sản xuất chè (- trà, không phải cây hoatrà) Tên gọi sinensis có nghĩa là “Trung Quốc” trong tiếng Latinh Các danhpháp khoa học cũ còn có Thea bohea và Thea viridis

Alk base/dm hữu cơ

dmDược liệu

hữu cơ/kiềm

dm

Alk muối/nướcAlk base/dm hữu cơ

hữu cơ/kiềm

Cô giảm áp

Từng alk base riêng

Tinh chếCắn Alk base

Phân lậpacid loãng

Lắc với

Từng alk muối riêng

Kết tinh Alk muối/nước

Phân lập

Camellia sinensis có nguồn gốc Đông Nam Á, nhưng ngày nay nó đượctrồng phổ biến trên thế giới, trong các khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới Đặcbiệt được trồng nhiều ở Trung Quốc, Ấn độ, Srilanca.

Nước ta hầu hết các tỉnh có điều kiện thuận lợi đều trồng trà, song có bavùng trồng trà lớn nhất:

chiếm khoảng 25% sản lượng trà miền Bắc

là vùng trà chủ yếu, chiếm tới 75% sản lượng trà miền Bắc với nhiềunhà máy sản xuất lớn

yếu trồng giống trà Ấn Độ và trà shan, trà Oolong

Là loại cây xanh lưu niên mọc thành bụi hoặc các cây nhỏ, thông thườngđược xén tỉa để thấp hơn 2m khi được trồng để lấy lá, những cây mọc hoang

có thể cao đến 20m Nó có rễ cái dài, hoa trà màu trắng ánh vàng, đường kính

từ 2,5 - 4cm, với 7 - 8 cánh hoa, hạt của nó có thể ép để lấy dầu

Trà xanh, trà mộc, bạch trà, trà đen, trà oolong, trà hương lài đều đượcchế biến từ loại cây này nhưng trong các điều kiện oxy hóa khác nhau

Hình 1.17 Cây trà (chè)

Trong lá trà có chứa các thành phần:

Từ những nghiên cứu, người ta nhận thấy rằng trà xanh có khả năng điềutrị:

- Xơ vữa động mạch: Nghiên cứu lâm sàng chỉ ra rằng các đặc tính chống oxy

hóa của trà xanh có thể giúp ngăn ngừa xơ vữa động mạch, bệnh động mạchvành Nghiên cứu cho thấy trà đen cũng có tác dụng tương tự Trong thực tế,các nhà nghiên cứu ước tính rằng tỷ lệ nhồi máu cơ tim giảm 11% với mứctiêu thụ 3 tách trà mỗi ngày

- Cholesterol cao: Nghiên cứu cho thấy trà xanh làm giảm cholesterol toàn

phần và tăng HDL ("tốt") cholesterol ở cả động vật và con người Một nghiêncứu lâm sàng cho thấy những người đàn ông uống trà xanh có lượngcholesterol thấp hơn những người không uống trà xanh Chất polyphenoltrong trà xanh có thể ngăn chặn cholesterol bị hấp thu ở ruột, giúp cơ thể thoátkhỏi cholesterol

- Ung thư: Một số nghiên cứu lâm sàng đã chỉ ra rằng các loại trà xanh và cả

trà đen có thể giúp bảo vệ chống lại ung thư Nghiên cứu cho thấy hợp chấtpolyphenol trong trà, trà đặc biệt là màu xanh lá cây, có thể đóng một vai tròquan trọng trong việc phòng chống ung thư Các nhà nghiên cứu cũng tin rằngpolyphenol giúp tiêu diệt tế bào ung thư và ngăn chúng phát triển

- Ung thư bàng quang: Một số theo dõi nghiên cứu lâm sàng bởi một nhóm các

nhà nghiên cứu tiết lộ rằng những người bị ung thư bàng quang - đặc biệt là ởnam giới- người uống trà xanh có tỷ lệ sống tốt hơn so với những ngườikhông uống 5 năm

- Ung thư vú: Nghiên cứu lâm sàng ở động vật và thử nghiệm cho thấy rằng

polyphenol trong trà xanh ức chế sự tăng trưởng của tế bào ung thư vú Trongmột nghiên cứu 472 phụ nữ ở giai đoạn khác nhau của bệnh ung thư vú, người

ta phát hiện ra rằng phụ nữ ở giai đoạn đầu của bệnh uống ít nhất 5 tách tràmỗi ngày có thể điều trị khỏi bệnh

- Ung thư buồng trứng: Trong một nghiên cứu lâm sàng thực hiện với bệnh

nhân ung thư buồng trứng ở Trung Quốc, các nhà nghiên cứu phát hiện ra

rằng những phụ nữ uống ít nhất một tách trà xanh mỗi ngày sống lâu hơnnhững người không uống trà xanh Trong thực tế, những người uống trà nhiều

sẽ sống lâu

- Tuyến tiền liệt ung thư: Nghiên cứu phòng thí nghiệm đã phát hiện ra rằng

chiết xuất trà xanh ngăn chặn sự tăng trưởng của tế bào ung thư tuyến tiềnliệt.Trong một nghiên cứu lâm sàng lớn ở Đông Nam Trung Quốc nghiên cứunhận thấy nguy cơ ung thư tuyến tiền liệt đã giảm dần khi tăng thời gian và sốlượng trà xanh tiêu thụ

- Ung thư da: Các polyphenol chính trong trà xanh là epigallocatechin gallate

(EGCG).Nghiên cứu khoa học cho thấy EGCG và polyphenol trong trà xanh

có đặc tính chống viêm và chống ung thư có thể giúp ngăn chặn sự phát triển

và tăng trưởng của các khối u da

- Ung thư dạ dày: nghiên cứu phòng thí nghiệm đã phát hiện ra rằng

polyphenol trong trà xanh ức chế sự tăng trưởng của tế bào ung thư dạdày Trong hai nghiên cứu so sánh người uống trà xanh với không uống, cácnhà nghiên cứu thấy rằng những người uống trà giảm một nửa khả năng pháttriển ung thư dạ dày và viêm dạ dày như so với người không uống trà xanh

- Bệnh tiểu đường: Trà xanh đã được sử dụng để kiểm soát lượng đường trong

máu Nghiên cứu ở động vật cho thấy rằng trà xanh có thể giúp ngăn ngừa sựphát triển của bệnh tiểu đường loại 1 và làm chậm sự tiến triển khi nó đã pháttriển Ở những người bị bệnh tiểu đường loại 1, các cơ quan của họ làm cho íthoặc không có insulin, giúp chuyển đổi glucose hoặc đường thành nănglượng Trà xanh có thể giúp điều chỉnh lượng đường trong cơ thể

- Bệnh gan: Nghiên cứu lâm sàng chỉ ra rằng những người đàn ông uống nhiều

hơn 10 ly trà xanh mỗi ngày ít có khả năng để phát triển vấn đề về gan Tràxanh cũng có vẻ bảo vệ gan khỏi các tác hại của các chất độc hại nhưrượu Nghiên cứu động vật đã chỉ ra rằng trà xanh giúp bảo vệ chống lại cáckhối u gan ở chuột