ĐỀ TÀI: Nghiên cứu khả năng đối kháng và tiềm năng ứng dụng của một số chủng trichoderma phân lập từ RNM trên một số nấm bệnh thực vật

Trichoderma từ RNM, với mong muốn tìm ra những chủng có khả năng ápdụng trong bảo vệ thực vật, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu khả năng đối kháng và tiềm năng ứng dụn

PHẦN MỞ ĐẦU

Biện pháp sinh học sử dụng các sinh vật, vi sinh vật đối kháng hay sảnphẩm của chúng trong kiểm soát sinh học, nhằm ngăn chặn, diệt trừ các sinhvật, vi sinh vật gây bệnh có nhiều ưu điểm to lớn Nó không những phòng,trị sâu bệnh hại có hiệu quả mà còn khắc phục được những nhược điểm củabiện pháp sử dụng các chất hoá học bảo vệ thực vật Biện pháp sinh họckhông hoặc rất ít gây ô nhiễm môi trường, góp phần vào việc giữ cân bằngsinh thái, không độc hại với người sử dụng, các nông phẩm tạo ra có chấtlượng cao, sạch an toàn với sức khoẻ con người và vật nuôi Vì vậy biệnpháp sinh học được sử dụng khá phổ biến ở nhiều nước phát triển và hiệnđang từng bước được mở rộng, khuyến khích sử dụng ở hầu hết các nướctrên thế giới và có nhiều triển vọng phát triển mạnh trong tương lai

Ở Việt Nam, trong những năm trở lại đây cũng đang có nhiều nghiêncứu hướng vào khả năng đối kháng và tạo chế phẩm phân bón hay thuốc bảo

vệ thực vật có nguồn gốc từ những loài Trichoderma đặc biệt là ở thành phố

Hồ Chí Minh Tuy nhiên, những nghiên cứu về Trichoderma từ RNM là

hoàn toàn mới mẻ và mới chỉ được sơ bộ đánh giá từ năm 2008 tại Bộ mônCNSH-VS, trường ĐHSP Hà Nội

Chúng ta đang phải đối mặt và giải quyết hậu quả gây ra từ việc sửdụng tràn lan, không có khoa học thuốc hoá học bảo vệ thực vật Hậu quả đókhông những làm ô nhiễm nghiêm trọng môi trường đất, nước, không khíảnh hưởng trực tiếp đến các sinh vật sống trong các môi trường đó Dưlượng thuốc tồn lưu trong các nông phẩm còn ảnh hưởng lớn đến sức khoẻcon người làm phát sinh nhiều bệnh nan y như ung thư, viêm phổi, thai dịdạng…Hơn nữa, do việc quá lạm dụng thuốc còn gây hiện tượng quen thuốccủa vi sinh vật gây bệnh

Đứng trước thực tiễn đó, việc tạo ra các chế phẩm sinh học có hiệu quảcao phòng, trị được sâu, bệnh và tiến tới thay thế dần biện pháp sử dụng chấthoá học bảo vệ thực vật là yêu cầu và đòi hỏi cấp thiết không những để làmgiảm thiệt hại do sâu bệnh gây ra, góp phần nâng cao năng suất, chất lượngsản phẩm nông nghiệp mà còn vì mục đích giải quyết vấn đề môi trường vànâng cao chất lượng cuộc sống con người

Trichoderma từ RNM, với mong muốn tìm ra những chủng có khả năng áp

dụng trong bảo vệ thực vật, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu:

“Nghiên cứu khả năng đối kháng và tiềm năng ứng dụng của một

số chủng Trichoderma phân lập từ RNM trên một số nấm bệnh thực vật”.

Mục tiêu của đề tài là chọn lọc được một số chủng Trichoderma có khả

năng đối kháng cao với nấm bệnh Bước đầu nghiên cứu khả năng ứng dụng

của chủng Trichoderma có khả năng đối kháng mạnh với nấm bệnh

Phytophthora capsici trên ớt

PHẦN NỘI DUNG CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Đặc điểm hình thái, khả năng sinh sản của nấm Trichoderma 1.2 Đặc điểm sinh trưởng của Trichoderma

1.3 Các sản phẩm trao đổi của nấm Trichoderma

1.4 Ảnh hưởng của một số nhân tố môi trường tới Trichoderma 1.5 Một số cơ chế đối kháng của Trichoderma

1.5.1 Cơ chế kí sinh

1.5.2 Cơ chế kháng sinh

1.5.3 Cơ chế enzyme

1.5.4 Cơ chế cạnh tranh

1.5.5 Kích thích cơ chế tự bảo vệ của thực vật

1.5.6 Khả năng kích thích sinh trưởng thực vật của Trichoderma

1.6 Tình hình nấm bệnh hại cây trồng trên thế giới và Việt Nam 1.7 Tình hình bệnh hại ớt

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu

- Các chủng nấm nghiên cứu: Gồm các chủng Trichoderma (34 chủng)

được phân lập từ Rừng ngập mặn Giao Thủy - Nam Định đang được lưu giữtại phòng CNSH – Vi sinh, khoa Sinh học, trường ĐHSP Hà Nội

- Các chủng nấm kiểm định: Phytophthora sp., Fusarium sp (L2) do

Bộ môn CNSH-VS cung cấp; nấm Colletotrichum gloeosporioides do Viện

di truyền Nông nghiệp phân lập và cung cấp; nấm Rhizoctonia solani do Viện bảo vệ thực vật phân lập và cung cấp; nấm Phytophthora capsici được

chúng tôi phân lập tại Bộ môn CNSH-VS từ mẫu bệnh do Viện nghiên cứuRau quả cung cấp

2.1.2 Đối tượng cây sử dụng trong nghiên cứu

- Ớt chỉ thiên (Capsicum annuum L.): hạt ớt chỉ thiên chúng tôi sử

dụng hai loại, một của Tổng công ty Rau quả nông sản Việt Nam, một loại

do chúng tôi thu và xử lí hạt

2.1.2 Hóa chất

2.1.3 Dụng cụ và thiết bị

2.1.4 Các loại môi trường sử dụng trong nghiên cứu

2.1.4.1 Môi trường giữ giống Trichoderma

2.1.4.2 Môi trường nuôi cấy Trichoderma trong nghiên cứu

2.1.4.3 Môi trường xác định hoạt tính enzyme

2.1.4.4 Môi trường tự nhiên kích thích sinh bào tử Phytophthora capsici

2.1.4.5 Môi trường phân lập nấm

2.2 Các phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme

2.2.1.1 Phương pháp cấy chấm điểm

2.2.1.2 Phương pháp nhỏ dịch

2.2.2 Phương pháp cấy trên khối thạch để quan sát đặc điểm hiển vi

2.2.3 Phương pháp phân lập nấm Phytophthora từ mô bệnh

2.2.4 Phương pháp nuôi cấy Dual

2.2.5 Phương pháp tính hiệu lực phòng trừ

2.2.6 Phương pháp thu bào tử Trichoderma

2.2.8 Phương pháp nghiên cứu một vài chỉ tiêu sinh trưởng

2.2.9 Xử lý số liệu theo phương pháp thống kê trên phần mềm

Microsoft Excel bằng phương pháp thống kê toán học

2.2.10 Phương pháp bố trí thí nghiệm

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1 Khả năng đối kháng nấm bệnh của Trichoderma RNM

3.1.1 Khả năng đối kháng của Trichoderma với Phytophthora sp.

Kết quả thử đối kháng giữa các chủng Trichoderma với Phytophthora

sp được thể hiện ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Khả năng đối kháng của Trichoderma với Phytophthora sp.

STT Các chủng 3 ngày 5 ngày 7 ngày 9 ngày 11 ngày

3.1.2 Khả năng đối kháng của Trichoderma với Colletotrichum gloeosporioides

Bảng 3.2 Khả năng đối kháng của các chủng Trichoderma với

3.1.3 Khả năng đối kháng giữa các chủng Trichoderma với Rhizoctonia solani

Kết quả thử đối kháng giữa các chủng Trichoderma với Rhizoctonia

solani được thể hiện ở bảng 3.3:

Bảng 3.3 Kết quả đối kháng giữa các chủng Trichoderma với

Rhizoctonia solani

3.1.4 Khả năng đối kháng giữa các chủng Trichoderma với Fusarium sp.

Kết quả thử đối kháng giữa các chủng Trichoderma với Fusarium sp.

được thể hiện ở bảng 3.4:

Bảng 3.4 Kết quả thử đối kháng giữa các chủng Trichoderma với Fusarium sp (L2)

-STT Các chủng 3 ngày 5 ngày 7 ngày 9 ngày 11 ngày

3.1.5 Khả năng đối kháng giữa các chủng Trichoderma với nấm bệnh Phytophthora capsici

Kết quả thử đối kháng giữa các chủng Trichoderma với Phytophthora

capsici được thể hiện ở bảng 3.5:

Bảng 3.5 Kết quả đối kháng giữa các chủng Trichoderma nghiên cứu với Phytophthora capsici

ức chế 80-90%; *: đối kháng hoàn toàn, hiệu quả ức chế > 90%

3.2 Kết quả hoạt tính enzyme của các chủng Trichoderma nghiên cứu

3.2.1 Khả năng sinh enzyme chitinase của Trichoderma nghiên cứu

Kết quả hoạt tính enzyme chitinase của các chủng Trichoderma nghiên

cứu được thể hiện ở bảng 3.6:

Bảng 3.6 Hoạt tính enzyme chitinase của các chủng Trichoderma

3.2.2 Hoạt tính enzyme cellulase của các chủng Trichoderma nghiên cứu

Kết quả hoạt tính enzyme cellulase của các chủng Trichoderma nghiên

cứu được thể hiện dưới bảng 3.7:

Bảng 3.7 Hoạt tính enzyme cellulase của các chủng Trichoderma

3.3 Kết quả bước đầu nghiên cứu hiệu quả ứng dụng trên cây trồng của

một số chủng Trichoderma có khả năng đối kháng cao được chọn lọc

3.3.1 Ảnh hưởng của hai chủng NHA7.5 và TT4 tới tốc độ sinh trưởng, phát triển của

Bảng 3.8 Chiều cao trung bình và số lượng lá/cây từng tuần theo dõi (TN ứng dụng hai chủng TT4 và

NHA7.5)

Thời

gian

Các công thức TN

5)

23,26 ± 0,45 35

ĐC1 22,37 ± 0,46 35 ĐC2 23,56 ± 0,36 35

Tuần

2

TT4(1) 28,49 ± 0,42 22 13 TT4(2) 28,71 ± 0,35 19 16 NHA7.5(1) 30,11 ± 0,38 12 22 1 NHA7.5(2) 28,49 ± 0,39 22 12 1

TT4( TT4(

NHA7.5 )

NHA7.5 )

NBCT(TT4)

NBCT(NHA

Hình 3.10 Biểu đồ so sánh chiều cao trung bình của cây ở các công thức thí nghiệm khác nhau qua từng tuần (TN ứng dụng hai chủng TT4 và NHA7.5)

Cây ở các công thức thí nghiệm có xử lí Trichoderma cao hơn rõ rệt so với cây ở các công thức không được xử lí với Trichoderma Hơn nữa thông

qua việc quan sát hàng ngày màu sắc lá của cây ở các công thức thí nghiệmkhác nhau cho thấy: ở các lô thí nghiệm xử lí hạt trước khi gieo trồng với

nấm Trichoderma lá cây có màu xanh hơn và mỡ hơn, cây khoẻ hơn so với các lô không được xử lí với nấm Trichoderma

3.3.2 Ảnh hưởng của hai chủng R221A1 và GTd4.2 tới tốc độ sinh trưởng, phát triển của cây.

Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của R221A1 và GTd4.2 tới tốc độ sinhtrưởng, phát triển của cây (chiều cao cây, tốc độ ra lá, màu sắc lá) được thểhiện ở bảng 3.9:

Bảng 3.9 Chiều cao trung bình và số lượng lá/cây từng tuần theo dõi (TN ứng dụng hai chủng GTd4.2 và

R221A1)

Thời

gian

Các công thức TN

Chiều cao TB (mm)

Số cây

2 lá

3 lá

4 lá

5 lá

6 lá

7 lá

Tuần

1

GTd 4.2(1) 27,53 ± 0,38 30 GTd 4.2(2) 27,48 ± 0,47 30 R221A1(1) 27,65 ± 0,43 30 R221A1(2) 27, 95 ± 0,45 30 NBCT(GTd4.2) 25,89 ± 0,54 30 NBCT(R221A1) 25,22 ± 0,50 30

gian thức TN (mm) 2

lá

3 lá

4 lá

5 lá

6 lá

gian

Các công thức TN

Chiều cao TB (mm)

Số cây

2 lá

3 lá

4 lá

5 lá

6 lá

7 lá

Qua bảng kết quả thấy rằng, chiều cao trung bình hàng tuần và tốc độ

tăng trưởng chiều cao của những lô thí nghiệm có Trichoderma hơn hẳn so với những lô không có xử lí Trichoderma Quan sát màu sắc lá cây ở các

công thức thí nghiệm có GTd4.2 và R221A1 cũng nhận thấy, nhiều cây lá cómàu xanh hơn, bề mặt lá to hơn

3.4 Hiệu quả phòng, trừ và ứng dụng của 4 chủng Trichoderma (NHA7.5, TT4, R221A1, GTd4.2) với nấm bệnh Phytophthora capsici trên ớt

3.4.1 Hiệu quả ứng dụng phòng, trừ của hai chủng NHA7.5, TT4 với

Các công thức thí nghiệm Tỉ lệ bệnh (%) Hiệu lực phòng trừ (%)

NHA7.5(2) (xử lí hạt, bổ sung NHA7.5

NBCT(NHA7.5) (xử lí với NHA7.5 sau

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

TT4( TT4(

NHA7.5 )

NHA7.5 )

NBCT(TT4)

NBCT(NHA7.

Xử lí Trichoderma (chủng TT4) trước khi chủng bệnh; NHA7.5(1): Xử lí

Trichoderma (chủng NHA7.5) không xử lí nấm bệnh; NHA7.5(2): Xử lí Trichoderma (chủng NHA7.5) trước khi chủng bệnh; NBCT(TT4): Xử lí Trichoderma (chủng TT4) khi cây có biểu hiện bệnh sau một gian chủng

bệnh; NBCT(NHA7.5): Xử lí Trichoderma (chủng NHA7.5) khi cây có biểu

hiện bệnh sau một thời gian chủng bệnh; ĐC1: Không xử lí bất cứ nấm gì cả

GTd4.2(2) ( xử lí hạt, bổ sung vào đất với

NBCT (GTd4.2) (xử lí với GTd4.2 sau khi

R221A1 (2) (xử lí hạt, bổ sung vào đất với

NBCT(R221A1) (xử lí với R221A1 sau khi

0 10

GTd

4.2 (2)

R221A1 (1)

R221A1 (2)

NBCT(GTd

4.2)

NBCT(R221A1)

Trong đó: - GTd4.2(1): Xử lí Trichoderma (chủng GTd4.2) không xử

lí nấm bệnh; GTd4.2(2): Xử lí Trichoderma (chủng GTd4.2) trước khi chủng bệnh; R221A1(1): Xử lí Trichoderma (chủng R221A1) không xử lí nấm bệnh; R221A1(2): Xử lí Trichoderma (chủng R221A1) trước khi chủng bệnh; NBCT(GTd4.2): Xử lí Trichoderma (chủng GTd4.2) khi cây có biểu hiện bệnh sau một gian chủng bệnh; NBCT(R221A1): Xử lí Trichoderma

(chủng R221A1) khi cây có biểu hiện bệnh sau một thời gian chủng bệnh;

ĐC1: Không xử lí bất cứ nấm gì cả nấm bệnh và nấm Trichoderma; ĐC2: Chủng nấm bệnh, không xử lí nấm Trichoderma.

hiện bệnh sau khi chủng bệnh

Hình 3.14 Cây ớt có biểu hiện nhiễm P capsici sau khi chủng bệnh

Hình 3.15 Nấm Phytophthora capsici được phân lập lại từ mẩu thân và rễ của cây ớt bệnh trên môi trường Agar – nước cất A: Phân lập

P capsici từ thân; B: phân lập P

3.6 Một số cơ chế đối kháng có thể của các chủng Trichoderma với các nấm bệnh nghiên cứu đặc biệt với nấm Phytophthora capsici

Chúng tôi nhận thấy chủng NHA7.5, R221A1, GTd4.2, TT4, GTB2.4,TT44 biểu hiện cao cả hoạt tính chitinase và cellulase đều có khả năng đốikháng cao với hầu hết 5 loại nấm kiểm định đã thử nghiệm Khả năng sinh

enzyme và tính đối kháng của các chủng Trichoderma nghiên cứu có liên

quan mật thiết Các chủng biểu hiện hoạt tính cellulase cao trong nghiên cứu

này thường thể hiện tính đối kháng cao với nấm Phytophthora (cellulose và

glucan là thành phần chính của thành tế bào) Ngoài ra, tốc độ sinh trưởngmạnh mẽ của các chủng nghiên cứu lấn át nấm bệnh cũng được quan sát thấy.Tốc độ sinh trưởng và khả năng sinh enzyme của các chủng nghiên cứu tácđộng đồng thời tạo nên tính kháng bệnh cao của chúng Một số chủng mạnhnhư NHA7.5 và R221A1, GTd4.2, TT4, TT44, GTB2.4 chỉ sau 5 ngày nuôitheo phương pháp Dual, đã biểu hiện hiệu quả ức chế hoàn toàn nấm bệnh

Khuẩn lạc

nấm

Phytophthora

Khuẩn lạc nấm

Phytophthora

Những hình ảnh quan sát dưới kính hiển vi cho thấy các sợi nấm

Trichoderma sinh trưởng bám sát và hướng tới nấm bệnh kết hợp với những

kết quả quan sát được khi thử nghiệm đối kháng theo phương pháp Dual vàkết quả hoạt tính enzyme chitinase và cellulase, có thể cho rằng những chủng

Trichoderma này có khả năng cạnh tranh dinh dưỡng mạnh với nguồn bệnh.

Chúng tiết ra các enzyme làm tiêu hủy thành tế bào nấm bệnh, phá hủy cấu

trúc hệ sợi làm chúng tàn lụi và chết dần Sợi nấm Trichoderma thường rất

nhỏ so với sợi nấm bệnh Do đó tại vị trí tiếp xúc khi các enzyme phá hủythành tế bào được tiết ra có thể hình thành những lỗ thủng tại một số chỗ tiếp

xúc và các sợi nấm nhỏ Trichoderma này có thể qua các lỗ thủng đó chui vào

khoang trong của sợi nấm bệnh và sử dụng chất dinh dưỡng của nấm bệnh,sinh trưởng trong đó, nhanh chóng tiêu hủy và làm chết nấm bệnh

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN

1 Hầu hết các chủng Trichoderma đều biểu hiện khả năng đối kháng với nấm bệnh (với nấm Phytophthora sp có 30/34 chủng, với nấm

Colletotrichum gloeosporioides có 27/34 chủng, với nấm Rhizoctonia solani

có 30/34 chủng, với nấm Fusarium sp có 19/34 chủng, với nấm

Phytophthora capsici cả 34 chủng đều biểu hiện khả năng đối kháng) Nhiều

chủng có khả năng đối kháng rất mạnh và hoàn toàn, trong đó 3 chủng

(R221A1, TT4, TT5) đối kháng hoàn toàn với Phytophthora sp., 3 chủng (NHA7.4, GTd4.2, TT44) đối kháng hoàn toàn với nấm Colletotrichum

gloeosporioides, 4 chủng (R221A1, TT4, TT5, TT44) có khả năng đối

kháng hoàn toàn với Rhizoctonia solani, 3 chủng (NHA7.5, GTa2.2, L2T)

có khả năng đối kháng hoàn toàn với Fusarium sp., có 8 chủng có khả năng đối kháng hoàn toàn với Phytophthora capsici trong đó 4 chủng biểu hiện

tính đối kháng nhanh và mạnh là NHA7.5, GTd4.2, R221A1, TT4 Bốnchủng này được chúng tôi chọn lọc để nghiên cứu tiếp ở giai đoạn ứng dụng

2 Nghiên cứu hoạt tính enzyme chitinase và cellulase cho thấy có 33/34chủng có biểu hiện hoạt tính enzyme chitinase, trong đó chủng GTd4.2 có hoạttính mạnh nhất (27mm) Biểu hiện hoạt tính cellulase có 28 chủng, hai chủng

có hoạt tính cao nhất là R221A1 (37mm) và NHA7.5 (35mm)

có ảnh hưởng tích cực đến khả năng sinh trưởng, phát triển của cây, kíchthích khả năng nảy mầm nhanh hơn của hạt, làm tăng sinh trưởng thân, tăngtốc độ cao trung bình, tốc độ ra lá nhanh hơn, màu sắc lá xanh hơn

4 Kết quả nghiên cứu hiệu lực phòng trừ của 4 chủng NHA7.5,R221A1, TT4, GTd4.2 cho thấy cả 4 chủng đều có khả năng phòng trừ đáng

kể, trong đó hiệu quả phòng cao hơn trị Hiệu quả phòng của 4 chủngNHA7.5, R221A1, TT4, GTd4.2 theo thứ tự là 60%, 52,94%, 46,67%,35,29% Hiệu quả trị của 4 chủng trên theo thứ tự là 26,67%, 23,53%, 20%,11,76% Như vậy trong 4 chủng, chủng NHA7.5 có hiệu quả phòng trị caonhất, chủng GTd4.2 có hiệu quả phòng trị thấp nhất Hai chủng có nhiềutiềm năng ứng dụng tạo chế phẩm phân bón hay chế phẩm thuốc bảo vệ thựcvật là NHA7.5, R221A1

KIẾN NGHỊ

Cần nghiên cứu tiếp khả năng ứng dụng của của các chủng

Trichoderma có khả năng đối kháng hoàn toàn với 4 loại nấm kiểm định còn

lại Từ đó đưa ra những kết luận, đánh giá khả năng ứng dụng của các chủng

có hiệu quả đối kháng cao với nấm bệnh trên nhiều đối tượng cây trồng

Tiếp tục nghiên cứu xa hơn nữa, khả năng ứng dụng tạo chế phẩmphân bón vi sinh hay chế phẩm sinh học bảo vệ thực vật có phối trộn vàchứa các chủng có hiệu quả cao như NHA7.5, R221A1 để đưa ra những kếtluận chính xác hơn nữa về tiềm năng ứng dụng trong thực tiễn của nhữngchủng này

Tiếp tục có những nghiên cứu sâu hơn nữa về cơ chế đối kháng của

các chủng nấm Trichoderma có hiệu quả cao với nấm bệnh đặc biệt là hai

chủng NHA7.5 và R221A1 Vì đây là hai chủng có khả năng đối khángmạnh và hoàn với hầu như cả 5 loại nấm kiểm định đã thử nghiệm Trên cơ

sở hiểu rõ được cơ chế đối kháng của nó để có phương pháp ứng dụngchúng sao cho có hiệu quả nhất trong thực tiễn