ĐỀ TÀI: Thử nghiệm chuyển gen GFP trên gà (gallus gallus domesticus) sử dụng vector pt2 BH CVpf SB11

Việc tạo ra các động vật chuyển gen đã trở thành một khía cạnh nghiên cứu trung tâm trong lĩnh vực sinh sản động vật và tạo giống vật nuôi [2],[11].. Chớnh vì những lí do trên, chúng tôi

PHẦN MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Việc nâng cao năng suất, cải tiến tiềm năng di truyền là vấn đề hàng đầu trong phát triển nông nghiệp nói chung và chăn nuôi nói riêng Tuy nhiên, trong công tác cải tạo giống cổ truyền chủ yếu sử dụng phương pháp lai tạo và chọn lọc để cải tạo nguồn gen của vật nuôi nên còn tồn tại nhiều hạn chế (con lai thu được qua lai tạo và chọn lọc vẫn còn mang cả các gen không mong muốn…) Vậy, một câu hỏi đặt ra là làm sao để tạo được những giống vật nuụi cú năng suất cao, phẩm chất tốt và những giống vật nuôi mang nhưng gen mong muốn (gen mã hóa những protein dược liệu quý, gen có khả năng chống chịu tốt ) [2],[9]?

Gần đây, nhờ những thành tựu trong lĩnh vực ADN tái tổ hợp, công nghệ chuyển gen ra đời đã cho phép khắc phục những trở ngại nói trên Nó cho phép chỉ đưa những gen mong muốn vào vi sinh vật, thực vật và động vật

để tạo ra những giống sinh vật có đặc tính mới Việc chuyển gen không chỉ dừng lại ở việc sử dụng nguồn gen cùng loài mà còn có thể đưa gen của loài này vào loài khác Kể từ những năm 1970, các nhà khoa học đã có thể chuyển một gen lạ vào vi khuẩn và bắt nó biểu hiện Ở động vật, quá trình chuyển gen tương đối phức tạp nhưng trong những năm gần đây cũng đã thu được nhiều thành tựu đáng kể

Trong hướng này các nhà nghiên cứu tập trung vào những mục tiêu: tạo

ra động vật chuyên sản xuất protein quý phục vụ y học; tạo ra động vật có sức chống chịu tốt, có tốc độ lớn nhanh, hiệu suất sử dụng thức ăn cao, cho năng suất cao và chất lượng sản phẩm tốt Ðộng vật chuyển gen còn được sử dụng làm mô hình thí nghiệm nghiên cứu các bệnh ở người để nhanh chóng tìm ra các giải pháp chẩn đoán và điều trị các bệnh hiểm nghèo như ung thư, AIDS,

thần kinh, tim mạch Việc tạo ra các động vật chuyển gen đã trở thành một khía cạnh nghiên cứu trung tâm trong lĩnh vực sinh sản động vật và tạo giống vật nuôi [2],[11]

Với những ưu điểm nổi bật, công nghệ tạo động vật chuyển gen đã, đang và sẽ tạo ra các tiềm năng phát triển vô cùng to lớn trong nhiều lĩnh vực của đời sống xã hội Trước các ứng dụng đa năng của sinh vật chuyển gen nói chung và động vật chuyển gen nói riêng, nhiều quốc gia trên thế giới đã chú trọng đầu tư nghiên cứu và phát triển sinh vật chuyển gen Trên cơ sở công nghệ ADN tái tổ hợp, ngành chăn nuôi đang đứng trước những cơ hội thay đổi có tính cách mạng Ngày nay người ta có thể tạo ra những động vật mang các đặc tính kỳ diệu mà bằng phương pháp lai tạo bình thường không thể thực hiện được

Quá trình chuyển gen ở động vật đã được tiến hành thành công trên nhiều đối tượng khác nhau như chuột, cá, thỏ, lợn, cừu, bò Đặc biệt, ở gà,

do cấu tạo và sinh lý có nhiều ưu thế để tiến hành chuyển gen nờn đó có nhiều thí nghiệm chuyển gen thành công với tỉ lệ cao, rất thuận lợi cho việc cải thiện tính hiệu quả của hệ thống chuyển gen một cách trực tiếp Đõy chớnh là đối tượng tuyệt vời để sản xuất protein tái tổ hợp trong trứng éõy là một bước quan trọng để tiến đến mục tiêu nhân giống gà mái có thể đẻ những “quả trứng vàng” mang protein dược phẩm [32]

Ở Việt Nam cũng đã có nhiều nghiên cứu trong lĩnh vực tạo động vật chuyển gen và cũng bắt đầu đạt được những thành công đáng khích lệ Tuy nhiên, ở nước ta, việc tạo động vật chuyển gen vẫn còn là vấn đề chưa được nghiên cứu sâu Việc nghiên cứu mới được bắt đầu vài năm gần đây và mới thực hiện được ở trên đối tượng là cá Đó mới chỉ là những nghiên cứu bước đầu, chúng ta cần có những nghiên cứu với quy mô sâu rộng hơn để có thể

đưa những động vật chuyển gen vào sản xuất Hiện nay, ở Việt Nam chưa có công trình nào công bố về chuyển gen thành công tạo gia cầm chuyển gen

Chớnh vì những lí do trên, chúng tôi chọn đề tài “Thử nghiệm chuyển

gen GFP trên gà (Gallus Gallus Domesticus) sử dụng vector

pT2/BH-CVpf-SB11 bằng phương pháp chuyển gen qua tinh trùng và vi tiêm vào phôi gà 0 giờ ấp” làm đề tài nghiên cứu của mình

pT2/BH Ấp nở thành công trứng gà đó tiờm vector pT2/BHpT2/BH CVpfpT2/BH SB11

- Hoàn thiện phương pháp chuyển gen qua tinh trùng gà

- So sánh được hiệu quả chuyển gen của phương pháp vi tiêm vào phôi

0 giờ ấp và phương pháp chuyển gen qua tinh trùng gà

- Đánh giá được sự biểu hiện của gen chuyển ở các giai đoạn phát triển khác nhau của phôi gà và gà sau khi nở

- Đánh giá được sự biểu hiện của gen chuyển ở cỏc mụ khác nhau của

gà con ở các giai đoạn phát triển khác nhau

PHẦN NỘI DUNG Chương I:

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CHUYỂN GEN Ở ĐỘNG VẬT

Sự ra đời của công nghệ sinh học và kỹ thuật chuyển gen đã tạo ra một bước phát triển mới cho nền nông nghiệp thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng Chuyển gen là việc di chuyển các gen từ cấu trúc di truyền ban đầu gọi

là thể cho (donor) tới một cấu trúc di truyền khác có khả năng dung nạp gen gọi là thể nhận (recipient) thông qua một vector [9]

Ðộng vật chuyển gen là động vật có gen ngoại lai (gen chuyển) xen vào trong ADN genome của nó Gen ngoại lai này phải được truyền lại cho tất cả mọi tế bào, kể cả các tế bào mầm Việc chuyển gen ngoại lai vào động vật chỉ thành công khi các gen này di truyền lại cho thế hệ sau [2]

Với những ưu điểm nổi bật, công nghệ tạo động vật chuyển gen đã, đang và sẽ tạo ra các tiềm năng phát triển vô cùng to lớn trong nhiều lĩnh vực của đời sống xã hội Trước các ứng dụng đa năng của sinh vật chuyển gen chung và động vật chuyển gen nói riêng, nhiều quốc gia trên thế giới đã chú trọng đầu tư nghiên cứu và phát triển sinh vật chuyển gen

1.1.1 Quy trình tạo động vật chuyển gen

Ở động vật, những nghiên cứu chủ yếu tập trung vào việc tạo ra các thế

hệ động vật mới cho năng suất cao, phẩm chất tốt, tăng khả năng chống chịu bệnh tật, có khả năng sản xuất được các loại protein quý hiếm rất cần trong trị liệu Quy trình tạo động vật chuyển gen thể hiện qua hình 1.1, gồm các bước sau:

Hình 1.1: Sơ đồ quy trình tạo động vật chuyển gen [2]

- Tách chiết, phân lập gen mong muốn và tạo tổ hợp gen biểu hiện trong tế bào động vật

- Tạo cơ sở vật liệu biến nạp gen

Ở động vật có vú thì giai đoạn biến nạp gen thích hợp nhất là trứng ở giai đoạn tiền nhân Ở giai đoạn này, tổ hợp gen lạ có cơ hội xâm nhập vào genome của hợp tử và phân chia cho các tế bào con làm tăng khả năng mang gen của tế bào sinh dục

- Chuyển gen vào động vật

Hiện nay có nhiều phương pháp khác chuyển gen nhau đang được sử dụng để tạo động vật chuyển gen: vi tiêm, chuyển gen bằng cách sử dụng các

tế bào gốc phôi, chuyển gen bằng cách sử dụng vector virus, xung điện, chuyển gen qua tinh trùng, chuyển gen vào trứng mới thụ tinh (hình 1.2)

- Nuôi cấy phôi trong ống nghiệm và chuyển vào tử cung cơ thể mẹ (đối với động vật bậc cao)

- Kiểm tra động vật được sinh ra từ phôi chuyển gen

- Tạo nguồn động vật chuyển gen một cách liên tục [2]

Hình 1.2: Một số phương pháp chuyển gen ở động vật [2]

A: Chuyển gen nhờ retovirus; B: Chuyển gen bằng phương pháp vi tiêm

1.1.2 Ứng dụng của động vật chuyển gen

a Trong nghiên cứu cơ bản

Chuyển gen là một công cụ lý tưởng cho việc nghiên cứu thuộc nhiều lĩnh vực của y - sinh học Trong sinh học phân tử, động vật chuyển gen được

sử dụng để phân tích sự điều hoà biểu hiện của gen để đánh giá một biến đổi

di truyền đặc biệt ở mức độ toàn bộ cơ thể động vật Ðộng vật chuyển gen còn được sử dụng để nghiên cứu trong di truyền học phát triển ở động vật có vú [2]

b Trong nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm

Công nghệ chuyển gen động vật ra đời đã cho phép khắc phục những trở ngại của phương pháp cải tạo giống cổ truyền để tạo ra các động vật biểu hiện các tính trạng mong muốn trong một thời gian ngắn hơn và chính xác

hơn Mặt khác, nó cho các nhà chăn nuụi một phương pháp hiệu quả để tăng sản lượng, tăng năng suất và khả năng chống chịu bệnh tật Các nhà khoa học

đã tạo ra các vật nuôi chuyển gen có tốc độ lớn nhanh, hiệu suất sử dụng thức

ăn cao, cho năng suất cao (nhiều thịt, nhiều sữa, nhiều trứng ), chất lượng sản phẩm tốt (nhiều nạc, ít mỡ, sữa chứa ít cholesterol ) và có khả năng kháng bệnh [24],[30] Năm 1985, giáo sư Zuoyan Zhu và nhóm nghiên cứu của ụng đó chuyển được gen hormone sinh trưởng người vào cá Theo Zhu thì thế hệ F1 của cỏ đó được chuyển gen này lớn gấp hai lần so với cá đối chứng (hình 1.3) [2]

Hình 1.3: Cá chép (Common carp) chuyển gen hormone sinh trưởng [2]

c Trong y học

Động vật chuyển gen được sử dụng trong công nghệ cấy ghép cơ quan cho các bệnh nhân mắc các bệnh như tim, gan, thận… Ðộng vật chuyển gen còn được sử dụng làm mô hình thí nghiệm nghiên cứu các bệnh ở người để nhanh chóng tìm ra các giải pháp chẩn đoán và điều trị các bệnh hiểm nghèo như ung thư, AIDS, thần kinh, tim mạch [19]

Liệu pháp gen người bao gồm cả việc thêm một bản sao gen bình thường (gen chuyển) vào genome của một người mang các bản sao gen có thiếu sót

để chữa các bệnh di truyền ở người

Trong kỹ nghệ dược phẩm, động vật chuyển gen được sử dụng để sản xuất protein dược phẩm, thuốc chữa bệnh (hình 1.4) [2],[24]

Hình 1.4: Sơ đồ quy trình tạo động vật chuyển gen sản xuất protein thông qua

tuyến sữa [2]

1.1.3 Khả năng ứng dụng tại Việt nam

Động vật chuyển gen đã và đang trở thành một xu hướng nghiên cứu và phát triển Việc nghiên cứu và tạo động vật chuyển gen để tạo ra các dược phẩm, sản xuất các protein quý và các sản phẩm của chúng đang thực hiện ở nhiều nước trên thế giới Việc chuyển gen vào động vật hiện nay đang gặp những rào cản về pháp lý và đạo đức Nhiều người lo sợ rằng tạo động vật chuyển gen đe dọa phá vỡ sự cân bằng hệ sinh thái hoặc động vật chuyển gen

có khả năng sinh sản thấp, nếu lai với động vật tự nhiên có thể làm giảm khả năng sinh sản, giảm số lượng, đe dọa sự tồn tại của loài Một số trường hợp

động vật chuyển gen có khả năng kháng bệnh kém hoặc có biểu hiện bệnh lý Khả năng trôi dạt của những dòng gen có thể gây ra hiểm hoạ đối với môi trường sinh thái Bên cạnh đó, khi sử dụng retrovirus làm vector có thể sẽ nảy sinh những nguy cơ không thể lường trước được (loại virus thường chứa gen gây ung thư) Thêm vào đó, động vật chuyển gen sử dụng làm thực phẩm cũng không đạt được sự ủng hộ của công chúng [9],[19]

Ở Việt Nam, những nghiên cứu về áp dụng công nghệ sinh học và đặc biệt là công nghệ gen được phát triển khá mạnh mẽ trong những năm gần đây Nghiên cứu chuyển gen đã được tiến hành ở nhiều cơ sở nghiên cứu như Viện

Di truyền nông nghiệp, Viện Công nghệ sinh học, Đại học Khoa học tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh, Trung tâm Công nghệ sinh học - Đại học quốc gia

Hà Nội… Ở động vật, những nghiên cứu chuyển gen mới được bắt đầu và chủ yếu thực hiện ở cá chạch, cá vàng với tổ hợp gen hormone sinh trưởng bằng vi tiêm Ở Việt Nam, chưa có công trình nào công bố thực hiện thành công việc chuyển gen vào gia cầm và động vật có vú Tuy nhiên, các kỹ thuật liên quan đến việc tạo động vật chuyển gen thỡ đó được tiếp cận và thực hiện

ở một số cơ sở nghiên cứu Với điều kiện cơ sở vật chất và con người ở các

cơ quan nghiên cứu ở nước ta, việc kết hợp nghiên cứu để tiến hành chuyển gen vào động vật có vú là hoàn toàn có thể thực hiện được [2],[19]

1.2 CHUYỂN GEN Ở GÀ

Công nghệ chuyển gen ở gà mới phát triển trong những năm gần đây, trong khi công nghệ chuyển gen ở động vật có vú đã phát triển từ trước đó một thời gian dài Chuyển gen ở gia cầm nói chung và gà nói riêng là vô cùng phức tạp và khó khăn Tuy nhiên, gà lại là đối tượng có nhiều tiềm năng cho công nghệ chuyển gen Tại sao các nhà khoa học lại chọn gà làm đối tượng chuyển gen? Để hiểu được những lợi thế của mô hình gà chuyển gen, chúng

ta sẽ tìm hiểu sự phát triển của phôi gà và sinh lý sinh dục gà

1.2.1 Sự phát triển của phôi gà

1.2.1.1 Sự phát triển phôi trước khi đẻ

1.2.1.1.1 Thụ tinh

Quá trình thụ tinh xảy ra ở phần trên của ống dẫn trứng Khi trứng rụng được hứng vào phễu của ống dẫn trứng Tại đây, tinh trùng đến và xâm nhập vào tế bào trứng

1.2.1.1.2 Sự phân cắt

Hình 1.5: Quá trình phân cắt trứng và tạo phôi nang ở gà [41]

Trứng gà thuộc loại đoạn noãn hoàng (teloleciathal) có nghĩa là noãn hoàng tập trung ở cực thực vật của trứng cũn nhõn và tế bào chất tinh khiết ở cực động vật Phân cắt ở phôi gà là dạng phân cắt đĩa (phân cắt không hoàn toàn) (hình 1.5) Noãn hoàng không phân cắt và không có cấu tạo tế bào, còn đĩa phôi phân chia tạo thành một cụm hình đĩa các tế bào nhỏ nằm bên trên khối noãn hoàng Sự phân cắt bắt đầu từ trung tâm của đĩa phôi và cỏc rónh phân cắt dần dần phân chia vùng này ra thành các tế bào [5],[26]

1.2.1.1.3 Giai đoạn tạo phôi nang

Vào lúc trứng được đẻ ra, ở đĩa phôi xuất hiện 2 vựng riờng biệt: Vựng sáng (area pellucida) chủ yếu là từ các tế bào trung tâm của đĩa phôi Vùng

mờ (area opaca) tạo nên do các tế bào ở vùng rìa Ngay sau đó các tế bào vựng rìa phớa đuụi của đĩa phôi di cư về phía đầu nhập với các tế bào di cư từ phía trên tạo thành lá dưới thứ cấp Xoang giữa lỏ trờn và lá dưới gọi là xoang phôi nang[5]

1.2.1.2 Sự phát triển phôi gà sau khi đẻ và được ấp

1.2.1.2.1 Giai đoạn tạo phôi vị

Tạo phôi vị ở gà là quá trình di chuyển các cụm tế bào hoặc các khu vực lỏ trờn để tạo phôi ba lá Các tế bào ở nửa sau của đĩa phôi mới đi vào trong và xuống dưới để tạo trung bì và nội bì, nửa trước di chuyển để phủ kín phần các tế bào đã xuống dưới và hình thành ngoại bì (trong đó có cả ngoại bì thần kinh) Các tế bào đi qua rónh nguyờn thuỷ đầu tiên là nguyên liệu nội bì, phần đi xa về phía trước sẽ tạo ra ruột trước, phần nguyên liệu dịch về phía sau sẽ tạo ruột giữa và ruột sau Tiếp sau nội bì, nguyên liệu trung bì đi qua

hố nguyên thuỷ và phần trước của rónh nguyờn thuỷ vào xoang phôi nang, phần đi qua mép phía trước của hố nguyên thuỷ tạo nên trung bì trục, sau này

sẽ hình thành đầu và dây sống [4],[5]

1.2.1.2.2 Giai đoạn hình thành mô – cơ quan

Hình 1.6: Phôi gà phát triển qua các giai đoạn [65]

Khi được ấp, phôi gà trải qua 1 loạt các biến đổi bao gồm sự tăng sinh

tế bào kết hợp với sự xắp xếp lại cấu trúc phôi sau đó là các quá trình biệt hóa Bốn ngày ấp đầu tiên của sự phát triển phôi gà là sự hình thành các cấu trúc quan trọng Quá trình biệt hóa và hình thành cơ quan biểu hiện ở việc sự xuất hiện mầm các cơ quan có nguồn gốc từ nội bì, ngoài ngoại bì và trung bì (hình 1.6 và phụ lục 2) [4],[5]

1.2.2 Sinh lý sinh sản gà

1.2.2.1 Cơ quan sinh sản của gà mái

Sự hình thành buồng trứng và các tuyến sinh dục phụ xảy ra vào thời

kỳ đầu của sự phát triển phôi Quá trình phát triển của tế bào trứng có ba thời kỳ: tăng sinh, sinh trưởng và chín Mặc dù trong giai đoạn phát triển phụi, phụi cỏi phát triển cả hai buồng trứng nhưng buồng trứng bên phải và ống dẫn trứng thoỏi hoỏ đi, do đó chỉ còn buồng trứng bên trái và ống dẫn trứng bên trái là trưởng thành và thực hiện chức năng Cơ quan sinh dục gà mái gồm

một buồng trứng và một ống dẫn trứng:

* Buồng trứng:

Hình 1.7: Cấu tạo buồng trứng gà [52]

1: nang trứng chín; 2: nang trứng non

- Buồng trứng là một cụm các nang trứng Khi gà nở buồng trứng chứa vài ngàn trứng nhỏ, mỗi trứng trong nang riêng của mình

- Kích thước và hình dạng buồng trứng phụ thuộc vào tuổi gà, buồng trứng gà giống như một chùm nho với các nang trứng ở các giai đoạn phát triển khác nhau

* Tế bào trứng:

Trứng gà là một tế bào khổng lồ chứa rất nhiều noãn hoàng, đú chớnh

là khối lòng đỏ Lòng đỏ có cấu tạo phân lớp, một lớp noãn hoàng nhạt rồi đến một lớp noãn hoàng sẫm đồng tâm kế tiếp nhau Nhân của trứng nằm ở phần tế bào chất tinh khiết tạo thành một đĩa có tỉ lệ rất nhỏ so với khối noãn hoàng Bao quanh tế bào trứng có màng noãn hoàng (hình 1.8) [52]

Mỗi phần của ống dẫn trứng có chiều dài và chức năng khác nhau, thể hiện như sau [51]:

Các phần

của ống

dẫn trứng

Chiều dài

Thời gian trứng di chuyển tại đó

Chức năng

trình thụ tinh Đoạn lòng

- Hình thành 40 -50 % albumin trong lòng trắng trứng

- Hình thành tiếp 10% Albumin

lớp vỏ đá vôi

- Trứng đi qua khi gà đẻ

* Sự tạo trứng và tạo vỏ trứng: Sau khi giao phối, tinh trùng di chuyển

trong ống dẫn trứng, tập trung tại phần phễu Khi trứng đi qua, một tinh trung xuyên thủng màng noãn hoàng, gặp tế bào trứng, hoàn thành quá trình thụ tinh Sau đó màng noãn hoàng dầy lên, ngăn cản sự xâm nhập của các tinh trùng khác Quỏ trình phân cắt trứng diễn ra khi trứng di chuyển dần xuống phía dưới Noãn bào ở trong đoạn phễu của ống dẫn trứng khoảng 15 phút, sau

đó di chuyển xuống đoạn lòng trắng Tại đây, hợp tử được phủ bởi 1 lớp albumin Sau đó hợp tử di chuyển xuống phần eo rồi đến tử cung Khoảng 23 - 24h sau khi rụng, trứng được đẻ ra ngoài [52],[60]

1.2.2.2 Cơ quan sinh sản của gà trống và thành phần tinh dịch gà

1.2.2.2.1 Cơ quan sinh sản của gà trống

Cơ quan sinh sản gà trống gồm: tinh hoàn, hệ thống ống dẫn và cơ quan giao phối (hình 1.10):

* Tinh hoàn: có kích thước thay đổi tùy thời kỳ hoạt động sinh dục, với

gà trống trưởng thành, thời kỳ đang hoạt động sinh dục, tinh hoàn dài khoảng 4,7 cm, rộng khoảng 2,7 cm và khối lượng khoảng 17 - 19 gram; khi thay

lông, giảm còn 3 - 5 gram Khác với sự sắp xếp ở loài có vú, các ống sinh tinh trong tinh hoàn gia cầm không tập hợp thành cỏc thùy rõ rệt được vây quanh bởi các mô liên kết, mà các ống sinh tinh nối lại với nhau thành nhánh nằm trong lớp vỏ màng liên kết trắng [1]

Hình 1.10: Cấu trúc hệ sinh dục gà trống [1]

1: Tinh hoàn; 2: ống dẫn tinh; 3: trực tràng; 4: huyệt

* Hệ thống ống dẫn: Tinh trùng từ các ống sinh tinh, đi qua mạng lưới tinh hoàn đến các ống dẫn ra Từ ống dẫn này, tinh trùng đi qua hàng loạt ống kết nối và được chuyển đến ống tinh hoàn phụ Ống tinh hoàn phụ đổ vào ống dẫn tinh ra Ống dẫn tinh ra là một ống có độ uốn lượn cao và ở đầu cuối thì duỗi thẳng và to hơn [1]

* Cơ quan giao phối: ở gà không phát triển, chỉ là một gai giao cấu để

tiếp xúc với âm đạo và được lộn ra khi giao phối

1.2.2.2.2 Đặc điểm cấu trúc của tinh trùng gà

Quá trình sản sinh tinh trùng ở gia cầm cũng tương tự như ở động vật

có vú Tinh trùng gia cầm có dạng hình sợi, phân biệt rõ 2 phần: đầu, đuôi Đầu tinh trùng gà dài, hơi cong, acrosome hình nón, được bọc bởi một màng acrosome liên tục, không có đoạn xích đạo hoặc một phiến đặc sau acrosome điển hình như ở tinh trùng động vật có vú mà có một khoảng trống dưới

acrosome Đuôi tinh trùng gồm đoạn cổ (tương ứng với đoạn cổ của tinh trùng động vật có vú), đoạn giữa (tương ứng với phần thân) và đoạn chớnh (tương ứng với phần đuôi) [1]

tinh thì tỉ lệ phôi sẽ giảm [1]

1.2.3 Thuận lợi và khó khăn khi sử dụng gà làm đối tượng chuyển gen

Từ những đặc điểm trên, ta thấy gà có nhiều thuận lợi cho quá trình chuyển gen, nhưng bên cạnh đó cũng có một số khó khăn:

- Năng suất trứng cao: hàng năm mỗi gà mái có thể đẻ xấp xỉ khoảng

330 quả trứng Trứng thụ tinh rẻ và có thể bảo quản được từ 1- 2 tuần ở 15o

C Tuy nhiên so với động vật có vú, thuận lợi lớn nhất của phôi gà là không cần con mẹ để phát triển [41]

- Kích thước thích hợp cho điều khiển và dễ dàng trong quản lý đối với quá trình sản xuất với số lượng lớn, trứng có môi trường vô trùng tự nhiên nên tỉ lệ chuyển gen thành công tương đối cao [15]

- Quan trọng nhất, với thành phần protein đơn giản của trứng làm cho công việc tách chiết các protein khác nhau từ trứng và tinh chế các nguyên liệu mong muốn một cách dễ dàng [15]

- Hơn nữa, sự di cư của tế bào mầm sinh dục trong mạch máu, điều này chỉ có thể được quan sát ở các loài gia cầm, làm cho các tế bào mầm sinh dục mang gen lạ có thể được cấy ghép vào phôi với mục đích chuyển gen có hiệu quả thông qua quá trình truyền dòng sinh cho thế hệ sau [15]

1.3.2.2 Khó khăn

- Không như các động vật khác, việc nghiên cứu chuyển gen ở gà gặp phải một số hạn chế nhất định Ở động vật có vú và cá, trứng là một tế bào có tiền nhân có thể được nhìn thấy để vi tiêm ADN ngoại lai vào Trong khi đó trứng gà ngay khi vừa được đẻ ra, phôi đã bắt đầu phát triển và chứa khoảng 40.000-60.000 tế bào [2],[41]

- Trứng gà sau khi đẻ thì trứng lớn, dễ vỡ và khó thao tác Vi tiêm vào trứng mới thụ tinh là rất khó bởi vì trứng được bao bọc với màng có nhiều dịch nhày (mucin) trong 15 phút sau khi rụng trứng Ngay sau đó được bao bọc bởi khối lòng trắng dày và một vỏ trứng

- Việc tạo ra gà chuyển gen còn bị cản trở bởi đặc tính riêng biệt của hệ thống sinh sản gia cầm Những khó khăn chính gặp phải là khó tiếp cận giai đoạn phôi sớm của chúng Để lấy được trứng đã thụ tinh (hoặc trứng chưa thụ tinh từ gà mái), gà mái bị giết sau 2 - 2,5h rụng trứng, khi trứng đang ở dạ con Việc tính toán đúng thời điểm này là rất phức tạp [41]

Với mục đích vượt qua những giới hạn này, sự chuyển gen qua trung gian các tế bào phụi, cỏc tế bào sinh dục nguyên thủy và các tế bào tinh trùng

đã được phát triển

1.2.4 Lịch sử nghiên cứu gà chuyển gen

- Con gà chuyển gen đầu tiên được tạo ra lại theo phương pháp sử dụng vector retrovirus Thông qua sử dụng vector retrovirus (vi rút phiờn mó ngược), trường đại học North Carolina State đã tạo ra được cỏc dũng gà chuyển gen biểu hiện β - galactosidase Vector này được thiết kế bởi Takashi

Mikawa [42]

- Vào giữa thập niên 1980, một nhà nghiên cứu ở Viện Sinh lý học Ðộng vật và Di truyền ở Edinburgh đã vi tiêm ADN ngoại lai vào các tế bào phôi gà đơn lẻ tạo ra các “gà con ống nghiệm” đầu tiên trên thế giới cho phép các nhà nghiên cứu tạo ra “gà siêu hạng” bằng cách xen ADN ngoại lai vào phôi [2]

- Harvey và cộng sự (2002) thuộc trường Ðại học Georgia ở Athens đã đưa gen mó hoỏ enzyme beta-lactamase vi khuẩn vào trong phôi của gà Leghorn trắng Khoảng 2% cỏc phụi này đã sinh trưởng đến thành thục và đã biểu hiện enzyme beta-lactamase trong một số tế bào Bước tiếp theo, các nhà nghiên cứu đã cho lai các gà bình thường với các gà trống và gà mái đã biểu hiện beta-lactamase trong tinh trùng hay trong trứng của chúng Thế hệ con sinh ra đã mang các bản sao của gen beta-lactamase ở trong tất cả các tế bào

và các gen chuyển ổn định trong gà [27],[28]

- Mo Sun Kwon năm 2004 đã tạo gà chuyển gen biểu hiện protein phát huỳnh quang tăng cường eGFP (Enhanced green fluorescent protein) nhờ sử dụng hệ thống chuyển gen qua vector retrovirut (hình 1.11) [35]

Hình 1.11: Gà chuyển gen GFP có khả năng phát sáng dưới ánh sáng

huỳnh quang (trái) bên cạnh gà bình thường (phải) [35]

- Năm 2005, Zhu và cộng sự công bố sản xuất thành công lượng lớn kháng thể đơn dòng từ trứng của gà khảm bằng cách chuyển nhiễm các tế bào gốc phôi vào đĩa phôi gà giai đoạn X

- Đến năm 2006, Bon Chul Koo và cộng sự đã tạo ra gà khảm dòng sinh biểu hiện protein phát huỳnh quang sử dụng vector MoMLV (moloney murine leukemia virus) được thiết kế dựa trên dựa trên vector retrovirut [47]

Tuy nhiên, cho đến nay gà là đối tượng chuyển gen thu được ít thành tựu nhất

1.2.5 Các phương pháp chuyển gen ở gà

Về nguyên tắc, các phương pháp tạo ra động vật chuyển gen đều có thể

áp dụng với gia cầm để tạo ra gia cầm chuyển gen Như đã mô tả ở trên, quá trình sinh lý sinh sản của gia cầm phức tạp, vì thế đối với gia cầm người ta sử dụng các phương pháp chuyển gen với trứng chủ yếu là giai đoạn sau khi đẻ Trong nội dung của luận văn này, chúng tôi sử dụng hai phương pháp là vi tiêm và chuyển gen qua tinh trùng, mỗi phương pháp đều có những ưu – nhược điểm nhất định

1.2.5.1 Phương pháp vi tiêm

* Nguyên tắc: một lượng nhỏ ADN được tiêm trực tiếp vào nhân tế bào

phôi trần hoặc tế bào nguyên vẹn một cách cơ học dưới kính hiển vi Tuy nhiên sự xâm nhập của gen chuyển vào ADN tế bào vật chủ là một quá trình

ngẫu nhiên và xác suất để gen chuyển xen vào vị trí ADN vật chủ mà sẽ cho phép nó biểu hiện là thấp Hiệu quả của vi tiêm là không cao [2]

Hình 1.12: Phương pháp vi tiêm vào trứng gà [41]

Vào năm 1994, một phương pháp tạo gà chuyển gen bằng vi tiêm ADN ngoại lai từ hai loại vi khuẩn khác nhau đã được mô tả Trước tiên gà mái được TTNT với tinh dịch của gà trống khoẻ mạnh Sau đó giết chết gà mái bằng cách tiêm vào tĩnh mạch của nó chất gây mê với liều cao Mổ bụng gà mái đã chết và di chuyển bộ phận ống dẫn trứng chứa trứng thụ tinh không

vỏ Sau đó đặt trứng vào các vỏ thay thế và tiêm ADN plasmid vi khuẩn vào đĩa phôi của hợp tử (phôi 1 tế bào) Ðổ đầy vỏ trứng dung dịch nuôi cấy và hàn gắn lại Với 128 trứng vi tiêm, 7 gà con vi tiêm sống đến thành thục sinh dục Trong đó 1 gà trống đã truyền ADN plasmid vi khuẩn cho 3,4% con cái của nó Các gà con chuyển gen này sống đến thành thục sinh dục và được nhân giống để sản xuất gà chuyển gen Kết quả này chứng tỏ sự di truyền ADN ngoại lai ổn định có thể đạt được bằng phương pháp này [2]

* Ưu điểm: Phương pháp này cho phép đưa gen vào đúng vị trí mong

muốn ở mỗi tế bào với hiệu quả tương đối cao

* Nhược điểm: Tuy nhiên do đòi hỏi phải tinh vi, tỉ mỉ và cực kỳ chính

xác nên hạn chế số lượng tế bào vi tiêm và ngoài ra còn có thể làm tổn thương đến tế bào phôi do tác nhân cơ học gây ra khi tiến hành vi tiêm [2]

1.5.2.2 Chuyển gen vào tinh trùng

Hiện nay có nhiều phương pháp để tạo vật nuôi chuyển gen, tuy nhiên các phương pháp này có nhược điểm là hiệu quả thấp, chi phí cao, cần thao tác trờn phụi ở giai đoạn sớm, và đặc biệt là có thể không an toàn khi sử dụng retrovirus Năm 1989, một phương pháp tạo động vật chuyển gen mới ra đời

đó là phương pháp chuyển gen qua tinh trùng - Sperm-Mediated Gene Transfer (SMGT) [39]

* Nguyên tắc: dựa trên hoạt động của tinh trùng kết hợp với ADN ngoại

lai và chuyển chúng vào trứng (oocyte) trong thụ tinh [34] Đã có nhiều nghiên cứu tạo động vật chuyển gen thành công nhờ phương pháp này như ở

bò, lợn, cừu và cá ADN ngoại lai sẽ kết hợp với phần đầu của tinh trùng ở vùng dưới acrosome ở gần vùng xích đạo [34] (hình 1.13)

Hình 1.13: Quy trình chuyển gen qua tinh trùng [39]

Sau khi ADN và tinh trùng tương tác với nhau, hấp thụ nhau, bước tiếp theo là sự kết hợp của ADN vào hệ genome Thật thú vị là sử dụng kỹ thuật SMGT, thấy rằng trình tự ADN ngoại lai hoàn toàn kết hợp với nhân tinh

trùng Phân tích trình tự ngẫu nhiên thu từ ngân hàng ADN genome tinh trùng ủ với plasmid pSV2CAT đã cho thấy trình tự ngoại lai đã kết hợp ở một

vị trí duy nhất của genome tinh trùng (Magnano và CS 1998) [23]

Có 2 thông số quan trọng phải được tối ưu để kĩ thuật SMGT có hiệu quả là: (1) chất lượng của tinh dịch thí nghiệm; và (2) sự kết hợp của ADN,

nó phụ thuộc trước hết vào khả năng và sự di động [39], thể tích, mật độ tinh trùng, tỉ lệ tinh trùng dị hình, hoạt lực ), và khả năng của tinh trùng mang và kết hợp với ADN ngoại lai Các thí nghiệm thực hiện cách đây khoảng gần một thập kỷ cho thấy rằng tinh trùng ủ với ADN có thể mang ADN đến trứng trong quá trình thụ tinh dẫn đến kết quả là tạo ra chuột chuyển gen (hình 1.14) [2]

Hình 1.14: Chuyển gen qua tinh trùng [2]

A Tinh trùng đã rửa ủ với ADN được sử dụng để thụ tinh in vivo hoặc in vitro Phương pháp này không có hiệu quả đặc hiệu đối với việc tạo động vật chuyển gen và các gen đã hợp nhất thường bất hoạt do sự sắp xếp lại ADN

B Màng tinh trùng bị tổn thương bởi chất tẩy nhẹ ADN ngoại lai đi vào tinh trùng một cách tự do Các tinh trùng này được sử dụng để thụ tinh in vitro.

Một nghiên cứu đã cho thấy rằng ngay cả sau khi đã rửa cẩn thận, tinh trùng chứa ADNse đã phân hủy ADN ngoại lai ADNse có rất nhiều trong nguyên sinh chất của tinh trùng ADN ngoại sinh gây ra hoạt tính ADNse ở tinh trùng đó tỏch chiết ra Có thể giải thích hiện tượng này là ADNse một

phương tiện để bảo vệ tinh trùng tránh khỏi sự nhiễm ADN ngoại sinh trên đường từ mào tinh hoàn đến tế bào trứng [2].

* Ưu điểm: Lợi ích lớn nhất của công nghệ SMGT là hiệu quả chuyển

gen cao, giá thành thấp và dễ sử dụng so với các phương pháp khác Hơn nữa, SMGT không đòi hỏi các thao tác trờn phụi và các thiết bị đắt tiền Sự tuyệt vời của SMGT là sử dụng vector tự nhiên (natural vector) để làm phương tiện chuyển gen - tinh trùng [34]

* Nhược điểm: Tuy nhiên, tinh trùng trưởng thành có genome bất hoạt

không có khả năng tái bản và có sự bảo vệ tự nhiờn chống lại sự xâm nhập của ADN ngoại lai (ADN của nó được bao phủ bởi protamine làm cho ADN ngoại lai rất khó đi vào trong genome tinh trùng) nên hiệu quả chuyển gen còn thấp [39],[40]

Các thử nghiệm để tăng khả năng xâm nhập của ADN vào tinh trùng đã được thực hiện Sử dụng xung điện hoặc chuyển nhiễm với các tác nhân hóa học đã làm tăng sự hấp thu ADN vào tinh trùng hoặc rửa tinh trùng bằng các chất tẩy nhẹ, giúp cho ADN ngoại lai đi vào tinh trùng dễ dàng hơn Tuy nhiên, sau đó tinh trùng mất hoặc giảm khả năng thụ tinh cho tế bào trứng Do

đó, một phương pháp mới ra đời là phương pháp chuyển gen sử dụng liposome

1.2.5.3 Chuyển gen qua liposome

Vào thập niên 1980, liposome nhân tạo đã được sử dụng để đưa ADN vào tế bào Lipid với toàn bộ lưới tích điện dương ở pH sinh lý là thành phần lipid tổng hợp phổ biến nhất của liposome được phát triển cho chuyển gen Phần cation của phân tử lipid kết hợp với ADN tích điện âm và kết quả là chứa đầy ADN trong phức hợp liposome-ADN (hình 1.15) [2]

Ðối với các tế bào nuôi cấy, toàn bộ lưới tích điện dương của phức hợp liposome-ADN nói chung là gây ra hiệu quả chuyển gen cao hơn bởi vì nó cho phép phức hợp này kết hợp với màng tế bào tích điện âm bền hơn Nhờ

cơ chế nhập bào, các phức hợp xuất hiện trong endosome và sau đó đi vào nhân Trong phương pháp này, các đại phân tử trước hết được đưa vào trong

cỏc tỳi phospholipid [2]

Hình 1.15: Phức hợp ADN và cơ chế hoạt động của

liposome-liposome [2]

* Ưu điểm: có hiệu quả tốt đối với cả tế bào in vitro và in vivo, có thể

mang được các ADN có kích thước rất lớn, độ tinh khiết cao, khụng gõy miễn dịch, có thể sử dụng với các tế bào mà biến nạp bằng kỹ thuật calcium phosphat không có hiệu quả

* Nhược điểm: Liposome đã được sử dụng để đưa protein, lipid và các

phân tử nhỏ vào nhiều loại tế bào nuôi cấy, tuy nhiên hiệu quả thấp hơn vi tiêm đối với RNA hoặc protein Cũng như thế, chuyển gen qua liposome và

sự biểu hiện của gen chuyển là không vượt qua được các phương pháp chuyển gen thông thường (như hệ thống virus), sự biểu hiện gen chuyển thường nhất thời, sự ức chế bởi các thành phần của huyết thanh có thể xảy ra Ứng dụng trong tương lai của kỹ thuật này chủ yếu sẽ là khả năng phân phối thuốc vào các tế bào của cơ thể sống Hiện nay kỹ thật này đang được phát triển để cải tiến sự phân phối đặc hiệu của liposome bằng cách ghộp cỏc kháng thể đặc hiệu với bề mặt của liposome đích [2]

LipofectaminTM 2000 là một dạng liposome được dựng khỏ phổ biến trong kĩ thuật chuyển gen Khi trộn với ADN, các hạt lipit tích điện dương này tạo thành 1 lớp bao quanh ADN, hình thành phức hệ ADN - lipofectamin mang điện tích dương Phức hệ này gắn với đuôi axit salic tích điện õm trờn

bề mặt tế bào và do đó kích thích sự vận chuyển ADN qua màng tế bào

Để tận dụng những ưu điểm và khắc phục những hạn chế của phương pháp chuyển gen qua tinh trùng và chuyển gen nhờ liposome, người ta đã đề xuất phương pháp chuyển gen qua tinh trùng nhờ liposome

1.2.6 Ứng dụng của gà chuyển gen

Gà mái và trứng của chúng đang được sử dụng như là các nhà máy sản xuất protein và kháng thể Các nhà khoa học đã tạo ra gà chuyển gen có thể sản xuất protein trong trứng éõy là một bước quan trọng để tiến đến mục tiêu nhân giống gà mái có thể đẻ những “quả trứng vàng” mà thuốc được đóng gói trong đó Gà cũng sản xuất được nhiều protein, hàng năm mỗi gà mái có thể

đẻ xấp xỉ khoảng 330 quả trứng chứa 6,5 gam các protein khác nhau Hướng nghiên cứu tiếp theo mà các nhà khoa học đang tập trung vào là chuyển các gen mó hoỏ cỏc protein sử dụng cho chữa bệnh và phát triển các phương pháp

để tạo ra nhiều protein ngoại lai duy nhất trong cỏc mụ đặc biệt [41] Nghiên cứu gà chuyển gen đang được sử dụng để:

- Chế tạo vaccin [47]

- Sản xuất kháng thể trong trứng [32]

- Sản xuất protein tái tổ hợp lactoferrin và lysozym [47]

- Sản xuất kháng thể chống ung thư ở người

- Tiết ra hormone sinh trưởng người để chữa bệnh lùn

- Sản xuất trứng có hàm lượng cholesterol thấp

- Sản xuất isoflavon đậu nành trong trứng

- Sản xuất các kháng thể như immoglobulin chim hoặc IgY một cách đặc biệt, thay thế cho việc sử dụng các động vật thớ nghiêm [42]

- Tạo dòng sản xuất gà thịt [47]

- Nghiên cứu sự phát triển phôi: Hiện nay cỏc phụi gà chuyển gen này được sử dụng như là một mô hình để hiểu được sự phát triển của phôi bình thường và phôi không bình thường Cỏc dũng gà chuyển gen mới này được sử dụng trong các nghiên cứu với mục đích tìm hiểu các khuyết điểm sinh sản… [2]

1.3 TRANSPOSON VÀ VECTOR TRANSPOSON SLEEPING BEAUTY

1.3.1 Transposon

Gene chuyển vị (transposon) là một đoạn ADN có khả năng tự tái bản một cách độc lập và xen vào một vị trí mới trong cùng nhiễm sắc thể hoặc một nhiễm sắc thể khác Transposon được phát hiện lần đầu tiên vào những năm 1940 bởi MC Clintock (1949) trong hệ gen của ngô; transposon là yếu tố cần thiết và thường gặp ở tất cả các loài sinh vật [45]

Transposon có cấu trúc gồm một hay nhiều đoạn gene nằm giữa hai yếu

tố IS có chứa các trình tự lặp lại đảo ngược (inverted repeat sequence – IR) (hình 1.16) Một trong hai yếu tố IS chứa trình tự mã hóa cho enzyme transposase có chức năng nhận diện, cắt và nối ADN trong quá trình chuyển

vị [2]

Hình 1.16: Cấu trúc của transposon [2]

Hai dạng chính của yếu tố transposon được phân chia dựa vào cách thức vận động trong hệ gen của transposon Retrotransposon di chuyển qua trung gian ARN theo kiểu copy - dán Theo kiểu này, transposon được sao chép và một bản sao của nó được gắn vào vị trí mới, còn bản gốc vẫn duy trì

ở vị trí cũ mà không mất đi Kiểu vận động thứ 2 của transposon là kiểu cắt- dán Cách thức vận động này đi liền với sự đứt ra của trình tự gốc và gắn vào một vị trí khác trong hệ gen Sự cắt - dán của transposon luôn được xúc tác

bởi enzyme đặc biệt là transposase Một số transposon có chứa trình tự mó hoỏ cho enzyme transposase [45]

Kích thước của transposon nói chung là không dài hơn 2kb Transposon được phiờn mó thành RNA, RNA được phiờn mó ngược thành ADN sợi kép ADN sợi kép này hợp nhất vào genome với hiệu quả cao Sự hợp nhất được điều khiển bởi gen transposase mã hóa transposon và các trình tự lặp lại đảo ngược ITR Các trình tự lặp lại đảo ngược có mặt ở cả hai đầu của transposon Transposon là vector có tiềm năng đối với sự hợp nhất gen ngoại lai vào genome Ðể làm được điều này, một phần lớn vựng phiờn mó của transposon

bị mất đi, tạo ra khoảng trống đối với gen ngoại lai ADN tái tổ hợp chứa gen ngoại lai không có khả năng đặc biệt để tự hợp nhất vào genome Sự có mặt của gen transposase là cần thiết đối với mục đích này Một số transposon có chứa trình tự mó hoỏ cho enzyme transposase [2]

Trong quá trình vận động, các transposase gắn vào vị trí đầu hoặc gần đầu của trình tự vận động, đồng thời cắt mạch ADN sợi kép tại vị trí gốc Việc cắt phân tử ADN sợi kép ở vị trí này làm tách trình tự vận động khỏi nhiễm sắc thể hoặc plasmid, nhờ đó chúng có thể vận động tới một vị trí khác trong hệ gen Khi yếu tố vận động gắn vào một vị trí mới trên nhiễm sắc thể hoặc plasmid, nó sẽ gây ra sự nhân đôi một trình tự ngắn ở hai đầu tại vị trớ

nó gắn vào Vì vậy, vector transposon cho phép tạo ra các động vật chuyển gen đối với các loài mà vi tiêm ADN thông thường không thành công [2]

Tuy nhiên, transposon chỉ có thể mang các đoạn ADN ngoại lai với chiều dài giới hạn Ngoài ra, các cơ chế tế bào phá hủy transposon có thể ức chế sự biểu hiện của gen chuyển trong một số trường hợp [16],[22],[25]

1.3.2 Vector transposon Sleeping Beauty

Vector transposon Sleeping Beauty (SB) là một thành viên của họ Tc1/ marine Đây là họ các yếu tố di truyền vận động có tính chất cổ xưa và có

mức độ phổ biến cao, được tìm thấy ở rất nhiều các loài động vật có xương

sống bao gồm cả con người Hệ thống transposon SB chứa một gen đơn mó hoỏ cho enzyme transposase và một transposon chứa đầu tận cùng lặp lại tại

vị trí liên kết với transposase (hình 1.17) [45]

Đặc điểm này cho phép transposase vận chuyển transposon theo kiểu

trans khi chúng được sử dụng như một hệ thống gen chuyển Sau khi liên kết

đặc hiệu enzyme transposase sẽ cắt mạch đơn của phân tử ADN đích (transposon SB) tại vị trí lặp lại ngược chiều IR/DR chứa khoảng 15-20 bp ở đầu tận cùng của mỗi IR, và dài khoảng 200-250 bp Transposon SB sau đó sẽ cài một cách ngẫu nhiên vào bất cứ vị trí nào có 2 nu TA trên toàn hệ gen (hình 1.17) [22]

Hình 1.17: Cấu trúc và hoạt động của

transposon Sleeping beauty

(theo Perry et al., 2004 và B.-W Kong, 2008 )

Vector Transposon Sleeping Beauty (SB) được sử dụng rộng rãi trên

nhiều đối tượng, từ cá tới người như một công cụ chuyển gen Nó đó được sử dụng thành công để chuyển gen biểu hiện lâu dài trên chuột và cá ngựa vằn Thêm vào đó, chuyển gen qua vector transposon SB cũng cho thấy hiệu quả chuyển gen tăng gần 10 lần so với khi sử dụng các hệ thống transposon ADN khác Mới đây nhất, năm 2008, Kong và các cộng sự đã đồng vận chuyển

đoạn ADN chứa gen kháng puromycin với vector transposon Sleeping Beauty

vào tế bào nguyên bào sợi phôi gà “bất tử” (immortal chicken embryo fibroblast) bằng phương pháp chuyển gen nhờ calcium phosphate Sau đó các

tế bào được nuôi cấy trong môi trường chứa kháng sinh puromycin Dựa vào

số lượng các quần lạc tế bào có khả năng kháng puromycin, họ đã đánh giá được hiệu quả chuyển gen có sự hỗ trợ của vector SB Kết quả cho thấy hiệu quả chuyển gen đã tăng từ 15 tới 35 lần khi transposon mã hóa cho gen kháng puromycin được đồng vận chuyển với một cấu trúc mã hóa cho SB Khi phân tích trình tự ADN genome gà, người ta biết được transposon đã cài vào 18 vị trí trên 11 nhiễm sắc thể của hệ gen Điều này cho thấy đối với hệ gen gia cầm, sự vận động transposon thông qua trung gian transposase là sự bổ sung rất tiềm năng cho các công cụ di truyền khác [22],[45]

1.4 GFP - eGFP VÀ VAI TRÒ CỦA GEN BÁO CÁO

GFP là từ viết tắt của Green Fluorescent protein - một loại protein gồm

238 axit amin (26.9 kDa), lần đầu tiên được phân lập từ loài sứa Aequorea victoria sống ở ven biển Tây Bắc Thái Bình Dương Ở phía dưới chiếc dự xoè

rộng của nó có những mấu cơ phát ra một thứ ánh sáng xanh mờ mờ Đó là một loại protein có khả năng phát ánh sáng màu xanh lục khi chiếu ánh sáng

cực tím GFP của A victoria có đỉnh phát sáng ở bước sóng 509 nm tương

ứng với vùng ánh sáng xanh trong phổ ánh sáng nhìn thấy [48]

Năm 1992, Martin Chalfie công bố thành tựu cài những đoạn mó hoỏ của GFP vào tế bào khác loài Từ đó, tại nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới người ta đã tạo ra các loại cây toả sáng, những con vật như chuột, thỏ, lợn… phát ra ánh sáng xanh lục khi đặt chúng vào dưới ánh sáng cực tím (hình 1.18)

Hình 1.18: Elba, thỏ chuyển gen protein huỳnh quang màu xanh lá cây[2]

Người ta đã lợi dụng tính phát quang của GFP dùng như một chất đánh dấu rất đặc trưng Gen mó hoỏ cho GFP vì thế được sử dụng như một gen chỉ thị (gen báo cáo) trong công nghệ chuyển gen Các dạng dẫn xuất của GFP (phát ánh sáng có màu khác) thu được khi gây đột biến GFP Năm 1995, Robert Y Tsien tại Trường Đại học California đã nâng cao được đặc trưng quang phổ của GFP, với cường độ phát quang cao và bền hơn hàng chục lần,

đú chớnh là eGFP eGFP - enhanced Green Flourescent Protein là một protein tái tổ hợp gồm 265 axit amin 2 axit amin ở vị trí 64 và 65 của GFP là Phenyl

và Serin được thay thế lần lượt là Lơzin và Threonin ở eGFP Protein này được biểu hiện và tinh sạch từ vi khuẩn E coli, nó cú đặc điểm cho khả năng phát huỳnh quang tối đa và bền vững hơn GFP [59],[65]

1.5 PUROMYCIN VÀ ỨNG DỤNG SÀNG LỌC TẾ BÀO CHUYỂN GEN

Puromycin là một loại kháng sinh được sử dụng trong nghiên cứu sinh học tế bào với mục đích chọn lọc tế bào đã biến đổi nhờ kĩ thuật di truyền

Hình 1 19: Cấu tạo hóa học của Puromycin và cơ chế tác động của nó tới quá trình dịch mã: A So sánh cấu trúc của puromycin với phức hệ tysosyl- tARN

B Mô hình hoạt động của puromycin [59]

Puromycin kìm hãm sự sinh trưởng của rất nhiều tế bào Prokaryote và Eukaryote bằng cách can thiệp vào quá trình tổng hợp protein Sự có mặt của Puromycin sẽ gây kết thúc sớm chuỗi polipeptide khi quá trình dịch mã đang

diễn ra trên ribosome Một thành phần của Puromycin giống với đầu tận cùng 3’ của tARN vận chuyển axit amin vì thế nó có khả năng liên kết vào vị trí A của ribosome và làm ngừng quá trình dịch mã, giải phóng chuỗi polypeptide ngắn hơn bình thường (hình 1.19) Cơ chế chính xác của quá trình này cho đến nay vẫn chưa biết rõ nhưng vị trí 3’ chứa một liên kết amide thay cho liên kết este bình thường của tARN Liên kết amide này làm cho phân tử khó bị thuỷ phân, từ đó khiến cho ribosome dừng hoạt động [54]

Trong sinh học tế bào, puromycin là nhân tố chọn lọc trong hệ thống nuôi cấy tế bào, cho phép chọn lọc và duy trì những tế bào biểu hiện gen kháng Puromycin Liều lượng thích hợp để chọn lọc trong nuôi cấy tế bào là trong khoảng từ 10 - 100 g/ml Mặc dù ở nồng độ thấp như 1 g/ml nó đó

có thể gây chết tới 99% tế bào không có khả năng kháng puromycin chỉ sau 2 ngày sàng lọc [59],[65]

1.6 THỤ TINH NHÂN TẠO Ở GÀ

Thụ tinh nhân tạo (artificial insermination) là một tiến bộ kỹ thuật trong ngành chăn nuôi được áp dụng ở nước ta từ những năm 1960 TTNT là một phương pháp truyền giống tiên tiến do con người tiến hành để bộ phận sinh dục cái tiếp nhận được tinh dịch của con đực khụng thụng qua giao phối trực tiếp [1]

1.6.1 Lợi ích và khó khăn của TTNT

1.6.1.1 Lợi ích

* Cải thiện di truyền: Cho phép sử dụng rộng rãi những đực giống năng suất cao, từ đó cải thiện được năng suất các thế hệ đời sau Cho phép sử dụng tinh dịch đông lạnh của những đực giống cao sản (thậm chí khi chúng đã chết) Bằng kỹ thuật TTNT có thể làm dễ dàng hơn việc kiểm tra năng suất qua đời sau trong những điều kiện về môi trường và quản lý khác biệt nhau

* An toàn dịch bệnh: Không du nhập bệnh mới, khống chế được lây lan

dịch bệnh thông qua giao cấu hoặc do tiếp xúc giữa đực và cái [1]

* Hạn chế những khó khăn hoặc nguy hiểm trong giao phối tự nhiên mà

nguyên nhân thường từ phía con đực Như: Ðực giống có thể trọng quá lớn so với con cái; đực giống hung dữ gây tổn thương cho con cái; đực giống bị què, đau chân không nhảy ôm được con cái [1]

1.6.1.2 Khó khăn của TTNT

- Công tác TTNT đòi hỏi trình độ quản lý cao

- TTNT đòi hỏi xác định đúng thời điểm dẫn tinh để nâng cao tỉ lệ đẻ

và số con sinh ra trong ổ Ðể dẫn tinh đạt hiệu quả cao, cần phát hiện động dục 2 lần mỗi ngày

- Nếu tinh dịch không pha loãng, chỉ nên sử dụng trong vòng vài giờ sau khi lấy tinh Nếu dùng tinh dịch đông lạnh, tỉ lệ thụ thai và số con sinh ra thường thấp hơn nhiều so với sử dụng tinh dịch tươi hoặc giao phối tự nhiờn

- Việc vệ sinh vô trùng và những phương tiện, thiết bị dùng trong TTNT cũng đòi hỏi những chớ phớ nhất định [1]

1.6.2 TTNT ở gà

TTNT ở gà phát triển muộn hơn so với ở gia súc Đến năm 1986, người

ta mới bắt đầu nghiên cứu TTNT ở gà

TTNT giúp gia tăng tỉ lệ phối và sử dụng gà tốt trong thời gian dài hơn

so với phối tự nhiên Ngoài ra, việc TTNT giúp kiểm soát được tình hình chính xác gia phả của gà con thế hệ sau từ những quả trúng gà giống đã được đánh dấu và cho ấp nở cá thể

Trước khi TTNT khoảng 3 tuần cần nuôi tách riêng con mái do tinh trùng gà có thể sống trong ống dẫn trứng khoảng 17 – 20 ngày

Quy trình TTNT trên gà được thực hiện bởi chế độ lấy tinh và gieo tinh

2 lần/tuần Việc lấy tinh gà 2lần/tuần tuy có ảnh hưởng đến thể tích tinh dịch nhưng lại không ảnh hưởng tới hoạt lực và nồng độ tinh dịch Tuy nhiên, sau khi lấy tinh trùng của gà cần phải tiến hành gieo ngay để không làm giảm hoạt lực của tinh dịch Thời gian gieo tinh được tính bắt đầu sau khi gà đẻ hết

trứng trong ngày để trứng không ngăn cản đường đi của tinh trùng (sau 14h) Dụng cụ gieo tinh phải được vệ sinh hàng ngày và dùng riêng cho từng con giống TTNT nên tiến hành liên tiếp trong 2 ngày của tuần đầu tiên và sau đó

3 ngày 1 lần [1]

1.7 KHÁI QUÁT VỀ NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

Từ những năm cuối thế kỷ XIX các nhà khoa học đã bắt đầu nghiên cứu đưa ra những phương pháp bổ sung thờm cỏc nguyên tố vi lượng vào dung dịch muối để có thể duy trì sự sống cho những tế bào bên ngoài cơ thể

Đú chớnh là những bước thí nghiệm đầu tiên cho nghiên cứu nuôi cấy tế bào Trong gần 40 năm trở lại đây, công nghệ nuôi cấy tế bào đã ghi nhận những bước tiến nhảy vọt [6]

Nuôi cấy tế bào là công cụ để nghiên cứu chức năng và cấu trúc của gen, lập bản đồ gen của các loài sinh vật, nghiờn cứu hoạt động của các tế bào ung thư Bên cạnh đó, trong những năm gần đây công nghệ chuyển gen động vật đã trở thành một hướng nghiên cứu đầy triển vọng cho công nghệ sinh học

và nó hứa hẹn sẽ mang lại những ứng dụng to lớn cho đời sống [6]

Môi trường nuôi cấy tế bào gồm các thành phần sau: muối vô cơ, carbohydrate, acid béo, amino acid, vitamin, yếu tố vi lượng, các chất điều hòa sinh trưởng Đối với tế bào động vật trong môi trường còn phải bổ sung thêm huyết thanh Mỗi thành phần có chức năng khác nhau[8],[65]

1.8 ĐẠI CƯƠNG VỀ NGUYÊN BÀO SỢI

Nguyên bào sợi có nguồn gốc từ những tế bào trung mô trong phôi thai

và những tế bào nguyên bào sợi phân chia trong cơ thể trưởng thành Nguyên bào sợi là loại tế bào thường gặp nhất trong các mô liên kết Ngoài ra nguyên bào sợi có thể xuất phát từ những tế bào trung mô tiền thân được duy trì trong các mô liên kết trưởng thành [5],[65]

Dưới kính hiển vi điện tử thì nguyên bào sợi là những tế bào chưa trưởng thành, ít biệt hóa Nguyên bào sợi thường có dạng hình thoi, ớt nhỏnh

ngắn, kích thước không quá 20 - 25 μm, nhân bầu dục hoặc có hình cầu, có một hoặc vài nhõn Nhõn của nguyên bào sợi cô đặc được kéo dài theo trục tế bào Bào tương ưa bazơ nhạt, lưới nội bào, ti thể phát triển và có ranh giới với chất ngoại bào không rõ rệt Nguyên bào sợi có khả năng phân chia mạnh, tế bào có thể di động yếu do yếu tố vi sợi actin và myozin ở ngoại vi bào tương

Tế bào có những nhánh là chân giả dạng sợi (hình 1.20)[6],[65]

Hình 1.20: Hình dạng của một nguyên bào sợi gà điển hình [65]

Nguyên bào sợi gà hình thoi, ít tua ngắn, nhân hình elip và chứa rất nhiều vi sợi

actin và myozin ở bào tương

Nguyên bào sợi phân tán khắp nơi trong mô liên kết của cơ nơi chúng tiết ra chất nền ngoại bào một cách linh động giàu collagen

Khi mô liên kết bị hủy hoại chúng gần như di chuyển vào trong vết thương, tăng sinh và tiết ra một lượng chất nền collagen rất lớn giúp cô lập đồng thời sửa chữa vết thương Khả năng phát triển nhanh trên bề mặt của mô

bị thương cũng như sự phát triển độc lập của chúng là lí do khiến chúng là loại tế bào dễ phát triển nhất trong môi trường nuôi cấy Nguyên bào sợi là loại tế bào linh hoạt nhất trong mô liên kết bởi chúng khả năng có thể biệt hóa thành cỏc dũng tế bào khác nhau của họ mô này Các tế bào này tổng hợp collagen, lưới, sợi elastic và glycosaminoglycan và glycoprotein của chất nền nội bào vô định hình Các nguyên bào sợi như là những giá thể để cho các tế bào gốc bám vào để tăng trưởng [8],[65]

CHƯƠNG 2:

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Chúng tôi sử dụng giống gà Lơgo (Leghorn) được cung cấp bởi trung tâm nghiên cứu gia cầm Thụy Phương, Viện Chăn nuôi Quốc Gia

Gà Leghorn là giống chuyên trứng cao sản nhất thế giới hiện nay, có ảnh hưởng lớn đến toàn bộ ngành gà công nghiệp thế giới Đây là giồng gà nuôi công nghiệp, nguồn gốc từ Italia, phát triển ở vịnh Địa Trung Hải, hiện nay được nuôi rộng rãi ở hầu khắp các nước, ở cỏc vựng khí hậu khác nhau trên thế giới Giống gà này đã nhập vào nuôi ở Việt Nam từ rất sớm (khoảng những năm 50 - 60 của thế kỷ XX)

Đây là giống gà chuyờn trứng, sức đẻ năm đầu là 280 - 300 trứng, sản lượng trứng một năm khoảng 250 - 270 quả/1 con mái Trứng to, nặng 60-65g, tỉ lệ lòng trắng so với lòng đỏ cao hơn các loại trứng gà khác, vỏ trứng màu trắng, dễ kiểm tra phôi trong quả trứng ấp

Đặc điểm hình thái: Gà leghorn có lông màu trắng, đầu nhỏ, mào và tích phát triển Trọng lượng cơ thể lúc trưởng thành khoảng 1,8 - 2 kg/con ở

gà trống; 1,4 - 1,8 kg/con ở gà mái Bộ lông dày, sít, xếp sát vào thân Cấu trúc cơ thể chắc chắn, bộ xương khoẻ chắc Mào đơn có 5 khía răng cưa nhỏ, gà mái khi đã đẻ gà thường ngả về một phía Cổ dài trung bình, ngực phát triển và hơi thẳng Bụng và đuôi phát triển, với lông dài, mỏ, da, chân màu vàng [12,13,59,64]

Với những đặc điểm trên, trứng gà Leghorn là đối tượng rất thuận lợi cho các nghiên cứu chuyển gen ở gia cầm với mục đích sản xuất protein dược liệu trong lòng trắng trứng

Hình 2.1: Gà Leghorn (A: Gà trống; B: Gà mái)

2.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

3 Giếng nuôi cấy, đĩa nuôi cấy 24

4 Đĩa thủy tinh, bình tam giác, đèn

2.2.2 Thiết bị nghiên cứu

Các thiết bị nghiên cứu cần thiết cho đề tài như sau:

Bảng 2.2: Các thiết bị nghiên cứu được sử dụng trong đề tài

Microforge

Mỹ

10 Máy khuấy từ

2.2.3 Hoá chất nghiên cứu

Cỏc hoá chất sử dụng trong đề tài bao gồm:

Bảng 2.3: Các hóa chất sử dụng trong đề tài

ST

xuất Nước sản xuất

2.2.4 Vector transposon Sleeping Beauty

Vector transposon Sleeping Beauty (SB) là quà tặng của GS Carmel

Alvarez thuộc bộ môn di truyền, đại học Tổng hợp Malaga, Tây Ban Nha dành tặng phòng công nghệ tế bào động vật, trường Đại học Khoa học Tự

Nhiên

Hình 2.2: Cấu trúc vector Transposon Sleeping Beauty (vector

pT2/BH-CVpf-SB11)

Vector transposon Sleeping Beauty chúng tôi sử dụng là một plasmid

có kích thước 8230 bp, là tổ hợp của 3 plasmid pCVpf, pT2 - BH và spUb - SB11, trong đó plasmid pCVpf có mang đoạn gen kháng puromycin và đoạn gen mó hoỏ cho eGFP, plasmid pT2 - BH mang transposon SB và plasmid spUb - SB11 chứa đoạn gen mã hóa cho enzyme transposase có liên quan đến

sự di chuyển của transposon Vector này được thiết kế sao cho gen kháng

Puromycin và gen eGFP nằm giữa 2 đầu lặp lại ngược chiều IR/DR của transposon, do đó cho phép enzyme transposase cắt transposon (chứa gen kháng Puromycin và gen eGFP) từ vector này vào genome tế bào nhận

Ban đầu vector pT2/BH-CVpf-SB11 được biến nạp vào vi khuẩn

Escherichia coli Vector được tách từ vi khuẩn bằng bộ kit Quick Plasmid

Miniprep của hãng Invitrogen

2.2.5 Mồi sử dụng cho PCR

Hai cặp mồi chúng tôi sử dụng trong phản ứng PCR là cặp mồi eFGP

và cặp mồi 18S Các cặp mồi được cung cấp bởi BIONEER, Hàn Quốc Hai cặp mồi đều có kích thước 18 bp (bảng 2.4 và 2.5)

Bảng 2.4: Trình tự mồi xuôi và ngược sử dụng để khuếch đại đoạn

ADN có kích thước 418 bp của gen eGFP

Bảng 2.5: Trình tự mồi xuôi và mồi ngược của đoạn gen có kích

thước 318 bp của gen 18S ribosome

2.2.6 Môi trường nuôi cấy và đệm

- Thành phần môi trường nuôi cấy nguyên bào sợi: DMEM + 15% FBS + 1% streptomycin/penicillin (100U/ml penicillin, 100 àg/ml streptomycin) hoặc optimen + 5% FBS + 1% streptomycin/penicillin

- Đệm TBE (Tris base, Boric acide, EDTA)

- Đệm TE (Tris- EDTA) (pH=8)