Để xác định một xét nghiệm miễn dịch là nhạy, đơn giản và chính xác trong việc phát hiện ra chất ricin trong sữa và huyết thanh, người ta sử dụng ba định dạng của sandwich ELISA xét nghi
Trang 1MÔN: CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC PHẨM
BÁO CÁO:
SO SÁNH VÀ ĐÁNH GIÁ BA ĐỊNH DẠNG ELISA PHÁT HIỆN RICIN TRONG SỮA VÀ
HUYẾT THANH
GVHD: ThS Nguyễn Minh Hải
Nhóm 11:
Ngô Thị Quỳnh Anh -11116002
Lê Thị Chiến -11116008 Phạm Đình Hà -11116024 Phan Văn Luật -11116036 Vanxay phimphone -111160L2
TP HCM, 2014
Trang 2MỤC LỤC
LỜI MỞ ĐẦU 3
LỜI MỞ ĐẦU
Ricin là một loại protein thực vật không mùi, không vị, có độc tính cao được tìm thấy trong tự nhiên, có nhiều trong các hạt thầu dầu Nó được hình thành từ chất thải bị bỏ trong quá trình chế biến dầu từ hạt thầu dầu Ricin phóng thích trong cơ thể ra có thể gây nguy hiểm Nhưng cho đến bây giờ vẫn không có phương thuốc nào có thể giải được độc Ricin Vì độc tính cao và dễ dàng lấy được từ cây thầu dầu, Ricin là một tác nhân sinh học nguy hiểm
và được liệt kê là một trong những chất cực độc gây bênh Ở Mỹ, việc khủng bố đã sử dụng Ricin nên nguy cơ chất này nhiễm vào thực phẩm là rất lớn và đang trở thành mối quan tâm của cộng đồng Vì vậy cần phải có phương pháp nhanh và chính xác để xác định Ricin trong thực phẩm hay các dịch sinh học Người ta đã đưa ra hàng loạt các phương pháp nhưng khá phức tạp và chi phí cao
Phương pháp xét nghiệm miễn dịch liên kết enzyme (ELISA) đã được sử dụng để phát hiện Ricin trong thực phẩm và dịch sinh học Tuy không phải là phương pháp nhạy nhất nhưng nó được ứng dụng phổ biến và cung cấp được nhiều thông tin quan trọng
Trang 3Để hiểu rõ hơn về vấn đề này, bài báo mà nhóm đã dịch nói về việc so sánh và đánh giá xét nghiệm ELISA phát hiện Ricin trong sữa và huyết thanh sẽ cung cấp thêm các thông tin cụ thể
Trong quá trình dịch có thể có nhiều sai sót mong thầy và các bạn thông cảm
So sánh và đánh giá ba định dạng xét nghiệm miễn dịch liên kết enzyme (ELISA)
để phát hiện chất ricin trong sữa và huyết thanh.
Tóm tắt
Khi áp dụng để phát hiện ra độc tố protein cụ thể trong thực phẩm hay một chất dịch sinh học nào đó có khả năng mắc một nguy cơ ô nhiễm, điều quan trọng là phải xét nghiệm được độ nhạy và tính chất đặc trưng riêng biệt của nó Để xác định một xét nghiệm miễn dịch là nhạy, đơn giản và chính xác trong việc phát hiện ra chất ricin trong sữa và huyết thanh, người ta sử dụng ba định dạng của sandwich ELISA (xét nghiệm miễn dịch liên kết enzyme) đã được so sánh và sử dụng cùng cặp kháng thể ELISA sử dụng biotin kết hợp với kháng thể phát hiện chính và streptavidin liên kết hệ enzyme peroxidase trong cây cải ngựa (HRP) cho thấy đây là xét nghiệm có độ nhạy lớn nhất với giới hạn phát hiện (LOD) của 25pg/ml trong dung dịch phosphate
Trang 4buffered saline (PBS), 50pg/ml trong sữa không béo, huyết thanh chuột, và 100pg/ml trong sữa nguyên kem Hiệu quả tốt thứ hai là ELISA sử dụng streptavidin kết hợp với kháng thể phát hiện chính và hệ thống biotin-HRP, giới hạn phát hiện (LOD) cho ricin
là 100pg/ml trong PBS và sữa, 1ng/ml trong huyết thanh ELISA sử dụng kháng thể phát hiện chính không được gắn thẻ và phức hợp HRP-kháng thể thứ cấp được gắn nhãn thực hiện với độ nhạy thấp nhất trong tất cả các định dạng và LOD của nó là 1ng/mL ở các lần xét nghiệm So với xét nghiệm ELISA trực tiếp (không sử dụng kháng thể bắt giữ), các xét nghiệm sandwich ELISA nhạy hơn 50-500 lần trong dung dịch đệm PBS Ước tính chính xác của các xét nghiệm miễn dịch là việc sử dụng hệ số biến thiên (CV) cho thấy rằng định dạng ELISA nhạy nhất có hệ số biến thiên thấp nhất trong liên khảo nghiệm CV (inter-assay CV) (4,28%) và trong nội khảo nghiệm
CV (intra-assay CV) (2,15%) mặc dù liên và nội khảo nghiệm CV đối với hai ELISA khác tương ứng thấp hơn 10% và 6%, thấp hơn mức chấp nhận được tối đa Vậy kết luận, ELISA sử dụng biotin kết hợp kháng thể phát hiện chính và hệ thống streptavidin-HRP là xét nghiệm tốt nhất trong ba định dạng ELISA cho việc phát hiện chất ricin trong dung dịch PBS, sữa và huyết thanh và việc áp dụng xét nghiệm này sẽ
có giá trị để nghiên cứu an toàn thực phẩm và chẩn đoán lâm sàng
1. Giới thiệu
Ricin là một loại protein bậc II khử hoạt tính ribosome có nguồn gốc từ hạt của cây thầu dầu (Ricinus communis) Nó bao gồm hai chuỗi polypeptide A và B, với trọng lượng phân tử là 32 và 34 kDa Ricin A là một chuỗi N-glycosidase dài nó ức chế việc tổng hợp protein làm bất hoạt ribosome kết quả là làm cho tế bào bị chết Ricin B là một chuỗi lectin gắn với glycoprotein hoặc glycolipid ở trên bề mặt tế bào giúp cho giúp cho ricin đi vào trong tế bào thông qua thụ thể trung gian endocytosis Ricin là một trong những độc tố mạnh nhất với liều lượng gây chết là 30 mg/kg ở chuột, 1-20 mg/kg trọng lượng cơ thể trong con người Vì độc tính cao và dễ dàng lấy
Trang 5được từ cây thầu dầu, ricin là một tác nhân sinh học nguy hiểm và được liệt kê là một trong những chất cực độc gây bệnh Ở Mỹ, việc khủng bố đã có sử dụng ricin nên khả năng chất này nhiễm vào lương thực là rất lớn và đây đang là mối quan tâm của công cộng Vì vậy cần phải có một phương pháp xác định nhanh và chính xác ricin trong thực phẩm hay các dịch sinh học Người ta đã đưa ra hàng loạt phương pháp để phát hiện chất ricin này nhưng khá phức tạp Năm 2008 Garber, các cộng sự Halter đã xét nghiệm trên chuột Năm 2010 Halter và các cộng sự đã dùng phương pháp miễn dịch-PCR để nghiên cứu Năm 2011 McGrath và các cộng sự đã dùng quang phổ để nghiên cứu Nhưng hầu hết các phương pháp đều yêu cầu các thiết bị đắt tiền mà các thiết bị này thì có rất ít hoặc không có trong phòng thí nghiệm
Phương pháp xét nghiệm miễn dịch liên kết enzyme ELISA đã và đang được sử dụng phổ biến để định lượng các chất như: peptide, protein, kháng thể và hormone Mặc dù đây không phải là phương pháp nhạy nhất nhưng nó cung cấp một số thông tin quan trọng Đáng chú ý là nó chỉ đòi hỏi khối lượng mẫu nhỏ và một ít thuốc thử Nó
dễ dàng lắp vào 96 giếng của tấm vi chuẩn và sử dụng với nhiều hệ thống phát hiện khác nhau Do đó, nó trở thành một kỹ thuật phổ biến ứng dụng cho nhiều nghiên cứu
cơ bản, ứng dụng cao Nó có thể cố định chất phản ứng với bề mặt vi đĩa, tạo điều kiện tách khỏi sự phụ thuộc nguyên liệu trong quá trình xét nghiệm
Khả năng rửa trôi một cách không đặc hiệu với liên kết vật liệu làm cho ELISA trở thành công cụ hữu hiệu để đo chất phân tích trong ma trận phức tạp Hơn thế nữa, tất cả các hoá chất và thiết bị cần thiết cho ELISA đều sẵn có ở hầu hết các phòng thí nghiệm
Các ELISA có thể thể hiện bằng những con số sửa đổi từ những quy trình cơ bản Bước quan trọng là sự cố định của kháng nguyên có thể thực hiện bằng cách hấp thu trực tiếp với đĩa thí nghiệm hoặc gián tiếp thông qua một kháng thể bắt giữ đã được gắn vào đĩa Sau đó kháng nguyên được phát hiện trực tiếp (có gắn kháng thể chính) hoặc gián tiếp (gắn kháng thể thứ cấp)
Trang 6ELISA mạnh nhất là sandwich ELISA Trong xét nghiệm này, kháng nguyên được kẹp giữa hai kháng thể chính, kháng thể bắt và kháng thể phát hiện Đây là phương pháp phổ biến do nó rất nhạy và phản ứng mạnh hơn so với xét nghiệm trực tiếp cố định kháng nguyên trên đĩa Một số định dạng sandwich ELISA đã được phát triển để phát hiện chất ricin (Brandon 2011;Guglielmo-Viret et al., 2007), nhưng không có tài liệu báo cáo việc thực hiện các ELISA trong các định dạng đĩa khác nhau thông qua so sánh trực tiếp
Trong nghiên cứu này, mục đích chính là nhận biết và xác định ELISA đó là đơn giản, nhạy và có tính lặp lại trong việc phát hiện chất ricin có trong sữa và huyết thanh Thông qua nghiên cứu, việc đánh giá và so sánh ba định dạng ELISA đã được thực hiện Kháng thể bắt trong ba xét nghiệm không bị điều chỉnh, nhưng kháng thể phát hiện chính được biến đổi theo các dạng khác nhau (Hình 1)
Hình 1 Sơ đồ biểu diễn ba định dạng ELISA mô tả các phân tích những vùng phức hợp trên bề mặt của một giếng được xét nghiệm ELISA-1: sandwich ELISA gián tiếp
sử dụng kháng thể phát hiện chính không có nhãn và phức hợp kháng thể thứ cấp-HRP; ELISA-2: sandwich ELISA gián tiếp sử dụng kháng thể phát hiện chính có gắn
Trang 7streptavidin (SA) và biotin (B)-HRP; ELISA-3: sandwich ELISA gián tiếp sử dụng
kháng thể phát hiện chính có gắn biotin và SA-HRP
ELISA-1 Sử dụng một kháng thể phát hiện chính không có nhãn và phức hợp HRP-kháng thể thứ cấp ELISA-2 Sử dụng biotin kết hợp kháng thể phát hiện chính
và HRP-streptavidin để khuếch đại tín hiệu ELISA-3 Sử dụng streptavidin kết hợp kháng thể phát hiện chính và HRP-biotin để khuếch đại tín hiệu Sử dụng cùng cặp kháng thể bắt và phát hiện trong tất cả các định dạng ELISA để đảm bảo rằng sự khác biệt hiệu suất quan sát thấy là hoàn toàn do khả năng phát hiện, không phụ thuộc tính chất của các kháng thể Tất cả ba định dạng ELISA được tối ưu hóa kỹ lưỡng trước khi được sử dụng trong nghiên cứu này
2. Phương pháp thực hiện
2.1 Ricin và kháng thể
Ricin và kháng thể đa dòng kháng ricin (PAB) ở dê được mua từ Vector Laboratories (Burlingame, CA) Kháng thể đơn dòng ở chuột, mAb1642 (chống lại chuỗi ricin A), đã được cung cấp bởi David Brandon (USDA-ARS-WRRC) (Brandon
et al., 2009) Phức hợp Streptavidin-kháng thể (SA-PAB) đã được chuẩn bị Trong một thời gian ngắn, 100µl kháng thể (1µg/µl) được gắn nhãn và trộn với 10µl LL-Modifier thuốc thử (1µg/µl) và sau đó cho vào một lọ chứa 100µg của lyophilized L-streptavidin Sau khi ủ hỗn hợp trong 3 giờ ở nhiệt độ phòng, 10µl LL-thuốc thử đã được thêm vào (SA-PAB) có thể được sử dụng sau khi 30 phút hoặc được bảo quản ở
40C (Biotin-PAB) được thực hiện bằng cách sử dụng LC-NHS-(+)-Biotin (Pierce, Rockford, IL) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.Phức hợp Biotin-HRP và streptavidin được mua từ Invitrogen (Carlsba, CA)
Trang 82.2 Chuẩn bị mẫu
Sữa không béo và sữa nguyên kem được mua từ các cửa hàng tạp hóa địa phương
và bảo quản ở 40C đến khi sử dụng Huyết thanh chuột được thu thập từ 1 con chuột (chuột cái 4.5 tuần tuổi, nặng 19-20g) được lấy từ Charles River Laboratories (Hollister, California)
Huyết thanh được pha loãng 1:9 trong dung dịch đệm PBS có pH = 7.3 trước khi
cố định với ricin Các mẫu sữa được spiked (đinh mấu) với chất ricin và xét nghiệm trực tiếp không cần pha loãng
2.3 ELISA trực tiếp và sandwich ELISA
Đối với ELISA trực tiếp, một tấm vi chuẩn NUNC MaxiSorp (Cat No
12-565-136 Fisher Scientific) được tráng bằng một tập hợp các độ pha loãng theo thứ tự ricin tinh khiết trong PBS, 100µl/giếng để qua đêm ở 40C Các giếng được đổ đầy với 300µl BSA 3% trong PBS ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ Sau khi được đổ đầy, các tấm nhựa được rửa sạch 6 lần bằng nước và 100µL/giếng kháng thể phát hiện chính được thêm vào (ELISA-1: thêm pAb; ELISA-2: thêm streptavidin–pAb và ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ Các đĩa được rửa sạch như ở trên sau đó được ủ 1 giờ với phức hợp HRP thích hợp (ELISA-1: thêm donkey-anti-goat IgG-HRP ; ELISA-2: thêm biotin-HRP) Sau được rửa sạch, 100µl cơ chất K-Blue (NeogenCorp.,Lexington, KY) được thêm vào mỗi giếng và ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút Phản ứng dừng lại ở 100µl HCL 0.3N và đo ở bước sóng hấp thụ 450nm
Phương thức sandwich ELISA cũng thực hiện tương tự như trên, ngoại trừ các vi đĩa được tráng và để qua đêm với mAb1642 (một loại kháng thể đơn dòng) ở nồng độ 4µg/ml trong dung dịch đệm PBS Tiếp theo sau giai đoạn đổ đầy và rửa là giai đoạn pha loãng theo thứ tự ricin tinh khiết đã được thêm vào trong dung dịch đệm PBS và ủ
Trang 9ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ Sau khi phát hiện ra các kháng thể khác nhau, HRP (enzyme peroxidase trong cây cải ngựa) liên hợp đã được sử dụng để gắn vào các kháng thể này (ELISA-1: non-tagged goat pAb/ donkey-anti-goat IgG–HRP; ELISA-2: SA-pAb/biotin–HRP; ELISA-3: biotin–pAb/SA–HRP) Để xác định thiết lập cho phép
độ nhạy lớn nhất, cơ chất sử dụng ít nhất, và sai số tối thiểu, một số sự kết hợp của kháng thể được so sánh như các thiết bị bắt giữ và thiết bị dò tìm Một số pha loãng của HRP liên hợp kháng thể phát hiện và Bio-HRP và SA-HRP cũng đã được xét nghiệm để xác định nồng độ tối ưu Dựa trên kết quả tối ưu hóa thu được từ chất ricin trong dung dịch đệm PBS, chúng tôi tiếp tục thực hiện các xét nghiệm với chất ricin tăng vọt trong sữa và huyết thanh
Giới hạn phát hiện (LOD) được định nghĩa là nồng độ thấp nhất được sử dụng cho các đường cong tiêu chuẩn mà tại đó độ hấp thu trung bình đọc tại bước sóng 450nm là cao hơn so với đối chứng âm cộng với ba lần độ lệch chuẩn LOD là ma trận, phương pháp, và phân tích cụ thể Các hệ số biến thiên (CV) được định nghĩa là giá trị thu được bằng cách lấy độ lệch chuẩn chia cho giá trị trung bình của một tập hợp các phép đo The intra-assay CV là thước đo độ chính xác của một xét nghiệm và báo cáo trong nghiên cứu này là một giá trị trung bình tính từ các CV riêng tại mỗi nồng độ chất ricin được biết đến CV% cho mỗi nồng độ chất ricin được tính toán bằng cách lấy
độ lệch chuẩn chia cho giá trị trung bình của 3 lần xét nghiệm và nhân với 100 Điều quan trọng cần lưu ý là độ chính xác của mỗi xét nghiệm có thể khác nhau trên phạm
vi tập trung khảo nghiệm
The inter-assay CV là một biểu hiện tính kiên định ngày này qua ngày khác Trong thí nghiệm này, bộ mẫu tương tự được chạy ba lần mỗi ngày và lặp đi lặp lại trên ba ngày khác nhau để theo dõi sự thay đổi theo từng ngày Giá trị trung bình cho mỗi nồng độ xét nghiệm được tính toán và sau đó được sử dụng để tính toán giá trị trung bình chung, độ lệch chuẩn, và CV% của3 ngày Giá trị CV% = độ lệch chuẩn trung bình /trung bình chung x100 Mức trung bình của CV% từ tất cả các nồng độ xét nghiệm được báo cáo là the inter-assay CV
Trang 103 Kết quả
3.1 Ước lượng của ba định dạng ELISA trong việc phát hiện chất ricin
Trang 11Độ nhạy của ba định dạng ELISA trong việc phát hiện chất ricin đã được ước lượng bằng cách lần lượt pha loãng một lượng chất ricin đã biết trong dung dịch đệm PBS và xác định LOD (xem định nghĩa trong Vật liệu và phương pháp) Mỗi độ pha loãng theo thứ tự của ricin được đo 3 lần (khoảng nồng độ: 25-100,000pg/l) cộng với một đối chứng âm chưa tăng vọt Bảng1 cho thấy LOD cho ELISA-1 là1000pg/ml (tại 1000pg/ml A450 đọc là 0,62, >A450 tại 0 pg/ml+3 x 0,008) và phạm vi tuyến tính của tín hiệu hấp thu với lượng chất phân tích là từ 10.000 đến 200.000pg/ml (R2 = 0,97); LOD cho ELISA-2 là 100pg/ml và phạm vi tuyến tính là 1000 đến 100.000pg/ml (R2 = 0,98); LOD cho ELISA-3 là 25pg/ml và phạm vi tuyến tính là 100 đến 5000pg/ml (R2
= 0,99) (Hình 2)
Hình 2 So sánh quá trình thực hiện ba định dạng ELISA Tín hiệu hiển thị đọc ở bước sóng hấp thụ trung bình ở 450nm cho ba lần đo lặp lại của chất ricin trong dung dịch đệm PBS với độ lệch chuẩn Quy mô bán logarit đã được sử dụng để hiển thị dốc của
đường thẳng
Trang 12Bảng 1 Phát hiện ricin trong PBS bằng ba định dạng sandwich ELISA gián tiếp
LOD cho ELISA-1 là 1000pg/ml, LOD cho ELISA-2 là 100pg/ml, LOD cho ELISA-3
là25pg/ml ND, không xác định.
Bảng 2 Phát hiện ricin trong PBS bằng hai định dạng ELISA bắt giữ trực tiếp
LOD cho ELISA-1 và ELISA-2 trực tiếp là 50000pg/mL.
Cố định trực tiếp ricin trên vi đĩa mà không sử dụng một kháng thể bắt có thể cung cấp lợi thế Rất nhanh chóng bởi vì sử dụng ít thao tác thực hiện và nó có thể có ít
bị nhiễu vì phản ứng chéo của kháng thể bắt giữ được loại bỏ Vì vậy, người ta tiến hành đo độ nhạy của ELISA-1 và ELISA-2 bằng cách hấp thụ trực tiếp chất ricin trên các đĩa mà không sử dụng một kháng thể bắt giữ Bảng 2 cho thấy LOD cho cả hai ELISA là 50 ng/ml, nó cao hơn 50-500 lần so với những kết quả thu được từ xét nghiệm sandwich Không có khác biệt đáng kể trong độ nhạy khi sử dụng kháng thể
