KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA CÂY KHỔ QUA (Momordica charantia L.) VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG ĐÁI THÁO ĐƯỜNG

Tại nhiều nước Châu Á trái khổ qua được dùng làm thức ăn hàng ngày trong bữa ăn.Trái khổ qua có vị đắng, tính hàn nên trong dân gian thường dùng để trị các bệnh mụn nhọt, giải nhiệt, sán

Luận văn này được thực hiện tại phòng Hóa Hợp Chất Thiên Nhiên – Viện Công Nghệ Hóa Học – Viện Khoa học và Công Nghệ Việt Nam, năm 2009 Với tấm lòng

trân trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn đến:

Ban Giám hiệu trường Đại Học Tôn Đức Thắng, Ban chủ nhiệm Khoa Khoa học

Ứng dụng và Bộ Môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô giáo đã trang bị cho

tôi những kiến thức nền tảng vững chắc trong suốt thời gian học tại trường, niên khóa 2005-2010

ThS Phùng Văn Trung, anh đã truyền đạt cho tôi những kiến thức chuyên môn và nhiều kinh nghiệm nghiên cứu quí báu trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp PGS-TS Nguyễn Ngọc Hạnh, cô đã động viên và tạo nhiều điều kiện để tôi hoàn thành tốt luận văn

ThS Phan Nhật Minh, anh đã nhiệt tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt thời gian nghiên cứu

Các anh chị và các bạn thực hiện đề tài luận văn tại phòng Hoá Hợp Chất Thiên Nhiên, năm 2009 đã cùng nhau giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập

Cuối cùng tôi rất cảm ơn người thân trong gia đình đã giúp đỡ, động viên, tạo mọi điều kiện từ vật chất đến tinh thần cho tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này

TP.Hồ Chí Minh, tháng 01, năm 2010

Sinh viên thực hiện

Vy Thị Thanh Nhân

Đề tài:

“KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA CÂY KHỔ QUA

(Momordica charantia L.) VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG ĐÁI THÁO

• Khảo sát hoạt tính kháng đái tháo đường của chất phân lập được với chỉ số IC50=36 μg/l

TRANG

Trang tựa

Lời cảm ơn i

Tóm tắt ii

Mục lục iii

Danh mục các ký hiệu, chữ viết tắt viii

Danh mục các bảng x

Danh mục các hình xi

Danh mục các sơ đồ, đồ thị xii

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.2 MỤC ĐÍCH 1

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ CÂY KHỔ QUA 2

2.1.1 Mô tả cây 2

2.1.2 Phân bố và sinh thái 3

2.1.3 Y học dân gian của cây khổ qua 5

2.1.3.1 Rễ 5

2.1.3.2 Thân 5

2.1.3.3 Lá 5

2.1.3.4 Hoa 5

2.1.3.5 Trái 5

2.1.3.6 Hạt 6

2.2.1 Các công trình nghiên cứu trong nước 6

2.2.1.1 Thành phần hóa học 6

2.2.1.2 Tác dụng dược lý 7

2.2.2 Các công trình nghiên cứu trên thế giới 8

2.2.2.1 Thành phần hóa học 8

2.2.2.2 Một số Triterpene glucoside được phân lập từ cây khổ qua 10

2.2.2.3 Một số Steroid được phân lập từ cây khổ qua 20

2.2.2.4 Tác dụng dược lý 21

2.3 SƠ LƯỢC VỀ BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG 22

2.3.1 Tình hình bệnh đái tháo đường trên thế giới và Việt Nam 22

2.3.2 Bệnh đái tháo đường 23

2.3.2.1 Khái niệm 23

2.3.2.2 Phân loại 23

2.3.2.3 Nguyên nhân 24

2.3.3 Hóa dược trị đái tháo đường 24

2.3.3.1 Ức chế α-glucosidase 24

2.3.3.2 Nhóm Sulfonylurea 25

2.3.3.3 Nhóm Meglitinide 25

2.3.3.4 Nhóm Biguanide 26

2.3.3.5 Nhóm Thiazolidinedione (TZD) 26

2.3.3.6 Insulin 26

2.4 PHƯƠNG PHÁP ỨC CHẾ MEN α-GLUCOSIDASE 26

2.4.1 Men α-glucosidase 2

2.4.2 Vai trò của α-glucosidase trong quá trình hình thành glucose 27

3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM 28

3.1.1 Thời gian 28

3.1.2 Địa điểm 28

3.2 THIẾT BỊ VÀ HOÁ CHẤT 28

3.2.1 Thiết bị 28

3.2.2 Hóa chất 28

3.3 NGUYÊN LIỆU 29

3.4 ĐỊNH TÍNH CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG TRÁI KHỔ QUA 29 3.4.1 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất alkaloid 29

3.4.1.1 Thuốc thử alkaloid 29

3.4.1.2 Định tính alkaloid 30

3.4.2 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất flavonoid 30

3.4.2.1 Thuốc thử flavonoid 30

3.4.2.2 Định tính flavonoid 30

3.4.3 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất sterol 30

3.4.3.1 Thuốc thử sterol 30

3.4.3.2 Định tính sterol 31

3.4.4 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất saponin 31

3.4.4.1 Thuốc thử saponin 31

3.4.4.2 Định tính saponin 32

3.4.5 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất đường khử 33

3.4.6 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất tanin 33

3.4.6.1 Thuốc thử tanin 33

3.4.6.2 Định tính tanin 33

3.4.7.1 Thuốc thử glycoside 33

3.4.7.2 Định tính glycoside 34

3.5 CHIẾT XUẤT, CÔ LẬP VÀ TINH CHẾ 34

3.5.1 Chiết xuất 34

3.5.2 Cô lập và tinh chế 35

3.5.2.1 Các phương pháp sắc ký được sử dụng 35

3.5.2.2 Sắc ký cột thường cao Chloroform (T3) 37

3.6 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ỨC CHẾ MEN α-GLUCOSIDASE 37

3.6.1 Hóa chất – Thiết bị 37

3.6.1.1 Hóa chất 37

3.6.1.2 Thiết bị 38

3.6.2 Phương pháp ngiên cứu hoạt tính ức chế men α-Glucosidase 38

3.6.2.1 Nguyên tắc 38

3.6.2.2 Phương pháp tiến hành 39

3.6.2.3 Chuẩn bị mẫu thử 39

3.6.3 Xây dựng đường chuấn PNP 40

3.6.4 Tính phần trăm ức chế và chỉ số IC50 40

3.6.4.1 Tính phần trăm ức chế 40

3.6.4.2 Chỉ số IC50 41

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ & THẢO LUẬN 42

4.1 KẾT QUẢ ĐỊNH TÍNH CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG DÂY LÁ

KHỔ QUA 42

4.2 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CÁC ĐẶC TRƯNG VẬT LÝ, KHẢO SÁT

VÀ NHẬN DANH CÁC CHẤT 44

4.2.2 Chất MCD1 46

4.2.2.1 Nhận danh cấu trúc hóa học của MCD1 46

4.2.2.2 Công thức cấu tạo của MCD1 47

4.3 KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ MEN α-GLUCOSIDASE 54

4.3.1 Kết quả xây dựng đường chuẩn cho PNP 54

4.3.2 Kết quả khảo sát hoạt tính ức chế men α-glucosidase của MCD1 55

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57

5.1 CÁC KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐẠT ĐƯỢC 57

5.2 KIẾN NGHỊ 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 58

PHU LỤC

Atb : Độ hấp thu trung bình

B.W : Body Weight (trọng lượng cơ thể)

CHCl3 : Chloroform

COSY : Correlation Spectroscopy (phổ tương quan giữa H và H)

d : Doublet (mũi đôi)

dd : Doublet of doublet (NMR)

đđ : Đậm đặc

DEPT : Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

DMSO : Dimethyl sulfoxide

mp : Melting point (điểm chảy)

NMR : Nuclear Magnetic Resonance (cộng hưởng từ hạt nhân)

PNP-Glc : p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside

ppm : Parts per million

Rf : Retention factor (yếu tố chậm trễ)

s : Singlet (mũi đơn)

t : Triplet (mũi ba)

TLC : Thin Layer Chromatography (sắc ký lớp mỏng) TZD : Thiazolidinedione

UV : Ultra Violet

α-Glc : α-glucosidase

δ : Chemical shift (độ dịch chuyển hóa học)

MCD1 : Tên chất tinh khiết

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1: Công thức của một mẫu thử hoạt tính 40

Bảng 4.1: Kết quả định tính các hợp chất hữu cơ trong dây lá khổ qua 42

Bảng 4.2: Kết quả sắc ký cột thường cao Chloroform (T3) 44

Bảng 4.3: Dữ liệu phổ 1H, 13C-NMR; DEPT và HMBC của MCD1 47

Bảng 4.4: Dữ liệu phổ 1H, 13C-NMR; COSY và HSQC của MCD1 49

Bảng 4.5: Dữ liệu phổ 13C-NMR và DEPT của MCD1 50

Bảng 4.6: So sánh dữ liệu phổ 13C-NMR của MCD1với tài liệu tham khảo 52

Bảng 4.7: Kết quả độ hấp thu A, Atb và % ức chế của PNP chuẩn theo nồng độ 54

Bảng 4.8: Kết quả độ hấp thu A, Atb và % ức chế của MCD1 theo nồng độ 55

DANH MỤC CÁC HÌNH

HÌNH TRANG

Hình 2.1: Cây khổ qua 3

Hình 2.2: Trái khổ qua 3

Hình 2.3: Giàn khổ qua ở Trung tâm Bảo tồn và Phát triển Dược liệu miền Trung 3

Hình 2.4: Var charantia L 4

Hình 2.5: Var abbreviata Ser 4

Hình 3.1: Các phương pháp sắc ký được sử dụng 36

Hình 4.1: Kết quả thử hoạt tính 43

Hình 4.2: Kết quả TLC của các chất khảo sát được 45

Hình 4.3: Tinh thể MCD1 46

Hình 4.4: TLC của MCD1 46

Hình 4.5: Dung dịch PNP chuẩn ở các nồng độ 54

SƠ ĐỒ TRANG

Sơ đồ 2.1: Vai trò của α-glucosidase trong quá trình hình thành glucose 27

Sơ đồ 3.1: Qui trình chiết xuất cao từ dây và lá khổ qua 35

ĐỒ THỊ

Đồ thị 4.1: Đường chuẩn của PNP 55

Đồ thị 4.2: Đường biểu diễn % ức chế của MCD1 theo nồng độ 56

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Khổ qua hay còn gọi là mướp đắng (Momordica charantia L., thuộc họ Bầu bí -

Cucurbitaceae) được trồng ở nhiều nước trên thế giới, đặc biệt là những vùng có khí

hậu nhiệt đới Ở Việt Nam, cây được trồng ở hầu hết các tỉnh từ đồng bằng đến trung

du và miền núi

Tại nhiều nước Châu Á trái khổ qua được dùng làm thức ăn hàng ngày trong bữa ăn.Trái khổ qua có vị đắng, tính hàn nên trong dân gian thường dùng để trị các bệnh mụn nhọt, giải nhiệt, sáng mắt, giảm đau… Khoa học ngày nay đã chứng minh dịch chiết trái khổ qua có khả năng ức chế khối u, có tác dụng hỗ trợ men gan và điều trị bệnh đái tháo đường…

Hiện nay bệnh đái tháo đường là một trong các bệnh mãn tính, gây tử vong cao, đứng hàng thứ ba trên thế giới sau bệnh tim mạch và ung thư Ở Việt Nam, tỉ lệ mắc bệnh ngày một gia tăng, đòi hỏi cấp thiết phải tìm ra các loại thuốc hiệu quả, đặc trị Nhận thấy lợi ích của loại dược liệu này, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài:

“KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY KHỔ QUA (Momordica

charantia L.)VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG ĐÁI THÁO ĐƯỜNG”

Trong luận văn này, chúng tôi trình bày một số kết quả chiết tách, cô lập các hoạt chất cũng như việc xác định cấu trúc các hoạt chất cô lập được, góp phần làm sáng tỏ thêm thành phần hóa học của trái khổ qua Đồng thời, thử hoạt tính ức chế men α-glucosidase (hoạt tính kháng đái tháo đường)

1.2 MỤC ĐÍCH

9 Phân lập các hợp chất tinh khiết bằng các phương pháp sắc ký

9 Xác định cấu trúc hoá học của các chất đã phân lập được

9 Khảo sát hoạt tính kháng đái tháo đường của các chất đã phân lập được

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ CÂY KHỔ QUA

Tên Việt Nam: Khổ qua, mướp đắng, lương qua, cẩm lệ chi…[11, 13]

Ngoài ra nó còn có nhiều tên khác như: Mướp mủ, chua hao, dưa mát, hồng cô nương, hồng dương, bồ đạt, lại qua [4]

Mô tả cây khổ qua:

Cây khổ qua thuộc loại dây leo, có đời sống khoảng một năm Đường kính dây khoảng 5-10mm, dây bò dài 5 – 7m, thân màu xanh nhạt có góc cạnh, leo được nhờ có nhiều tua cuốn, ở ngọn có lông tơ [11]

Lá đơn, nhám, mọc so le, dài 5-10cm, rộng 4-8cm, phiến lá mỏng chia làm 5-7 thùy hình trứng, mép có răng cưa đều, mặt dưới lá màu xanh nhạt hơn mặt trên lá, gân

lá nổi rõ ở mặt dưới, phiến lá có lông ngắn [5, 11]

Hoa mọc đơn ở kẽ lá, hoa đực và hoa cái cùng gốc, có cuống dài Hoa đực có đài

và ống rất ngắn, tràng gồm năm cánh mỏng hình bầu dục, nhụy 5 rời nhau Hoa cái có đài và tràng hoa giống hoa đực Tràng hoa màu vàng nhạt, đường kính khoảng 2cm [3,

5, 17]

Trái hình thoi, dài 8 – 15cm, gốc và đầu thuôn nhọn Mặt vỏ có nhiều u lồi to nhỏ không đều Trái khi chưa chín có màu xanh hoặc xanh vàng nhạt, khi chín có màu vàng hồng Vì thế ở Trung Quốc, khổ qua còn có tên là hồng dương, hồng cô nương [6, 13].Khi chín, trái nứt dần ra từ đầu, tách ra làm ba phần để lộ chùm áo hạt màu đỏ bên trong [11, 13]

Hạt dẹt, dài 13 – 15mm, rộng 7 – 8mm, hình răng ngựa, thắt đột ngột ở hai đầu

Vỏ hạt cứng, quanh hạt có màng màu đỏ như màng hạt gấc

Hình 2.1: Cây khổ qua Hình 2.2:Trái khổ qua

Hình 2.3: Giàn khổ qua ở Trung tâm Bảo tồn và Phát triển Dược liệu miền Trung

(Phú Yên) 2.1.2 Phân bố và sinh thái [3, 23, 27]

Khổ qua được phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới khắp các châu lục Từ

thời xa xưa, khổ qua được trồng lần đầu tiên ở Đông Ấn và Nam Trung Quốc, được sử

dụng như là loại rau ăn quả giàu chất sắt Sau đó cây được du nhập sang châu Phi và

châu Mỹ Latinh Quần thể khổ qua trồng đã trở nên rất phong phú với các giống cây

đa dạng được tạo ra trong quá trình chọn giống và lai tạo

Ở Việt Nam, khổ qua được trồng ở hầu hết các tỉnh từ Bắc Trung Nam, từ đồng bằng đến trung du và miền núi Ở một số vùng núi cao và lạnh như Sa Pa (Lào Cai), Phó Bảng (Hà Giang)…không thấy có khổ qua

Trên thế giới, khổ qua cũng có mặt ở hầu hết các nước nhiệt đới như Ấn Độ, Nam

Á, Đông Nam Á, Trung Quốc, châu Phi và vùng Caribean

Cây khổ qua có biên độ sinh thái tương đối rộng, nhiệt độ thích hợp cho cây sinh trưởng từ 20 đến 35oC, lượng mưa hàng năm từ 1500mm đến 2500mm, cao độ đến 1000m Cây chịu đựng được nhiều điều kiện đất khác nhau nhưng phát triển tốt nhất trên đất thoát thủy tốt, giàu chất hữu cơ

Khổ qua có thể trồng quanh năm Cây sinh trưởng nhanh trong mùa mưa ẩm, ra hoa quả sau 7 – 8 tuần gieo trồng Hoa thụ phấn chủ yếu nhờ côn trùng Sau khi trái già, cây sẽ tàn lụi và kết thúc vòng đời sau 4 – 5 tháng tồn tại

Hiện nay, cây vẫn còn tồn tại ở hai quần thể: Mọc hoang và được trồng trọt Loại trồng trọt rất phong phú về giống nhưng đều được xếp chung vào chi khổ qua

(Momordica charantia L.) Tuy nhiên, căn cứ vào kích thước, hình dạng, màu sắc của

quả mà chia khổ qua thành hai chủng loại:

− Momordica charantia L var charantia L., trái to (đường kính > 5cm), màu

xanh nhạt, gai tù, ít đắng

− Momordica charantia L var abbreviata Ser., trái nhỏ (đường kính < 5cm),

màu xanh đậm, gai nhọn, vị rất đắng

2.1.3 Y học dân gian của cây khổ qua

Hầu hết các bộ phận của cây như rễ, thân, lá, hoa, trái, hạt đều có thể dùng làm thuốc chữa bệnh [1]

có tác dụng làm sáng mắt, bổ tim, bổ máu, mát gan, rất thích hợp với những người đau gan, đau lá lách [2]

Ở Trung Quốc, trái khổ qua còn dùng để trị đột quị tim, bệnh sốt, khô miệng, viêm họng Ở Ấn Độ, dịch trái khổ qua được dùng trị rắn cắn Người ta còn dùng bột

trái khổ qua để hàn các vết thương (làm kéo da non), trị vết loét ác tính Ở Thái Lan, dịch trái được dùng trị bệnh về gan, lá lách [10]

Với tính diệt khuẩn và chống oxi hóa, trái khổ qua làm da mịn màng, trị mụn trứng cá hay bệnh vẩy nến, và ngay cả với vết thương do côn trùng cắn, nhiễm trùng

da Mặt khác, trái khổ qua còn cung cấp nguồn năng lượng dồi dào và tăng khả năng chịu đựng cho cơ thể [2]

Ngoài các công dụng trên, trái khổ qua còn được dùng để trị nhiều bệnh như: Trị

ho, sốt, kiết lỵ, dạ dày, đau tức, đái dắt, phù thủng do gan, mắt đỏ đau nhức, giải nhiệt, hồi hộp, buồn phiền, tắm cho trẻ em trị rôm sảy, làm hạ đường huyết ở bệnh nhân đái tháo đường type 2 (không phụ thuộc insulin) [6, 11]

2.1.3.6 Hạt

Hạt có chất béo, vị đắng, hơi ngọt, tính ấm, thanh nhiệt, giải độc, giải cảm, trị ho, lợi tiểu Hạt còn chữa rắn cắn, chữa nhọt độc sưng tấy, vết thương nhiễm trùng, hạ sốt [9, 7] đau họng và chống thụ thai [18] Tại nhiều nước khác, hạt khổ qua được dùng để trị bệnh đái tháo đường [2, 14]

Ngoài ra, theo một số nghiên cứu gần đây cho biết các hoạt chất trong hạt khổ qua còn có tác dụng chống ung thư, làm hạ huyết áp, kháng virus HIV …[6]

2.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ KHỔ QUA

2.2.1 Các công trình nghiên cứu trong nước

2.2.1.1 Thành phần hóa học

Các tác giả Phạm Văn Thanh, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Thượng Dong, Vũ Kim Thu, Nguyễn Kim Phượng và Lê Minh Phượng của Viện Dược liệu đã thống kê và khảo sát sơ bộ các nhóm hoạt chất chính của cây khổ qua Tuy nhiên, các tác giả này chưa cô lập được các hoạt chất có hoạt tính dưới dạng chất tinh khiết cũng như chưa xác định cấu trúc của các hoạt chất này, mà chỉ định lượng theo chất G6, một aglycon của nhóm glycoside [17]

Các tác giả Nguyễn Minh Đức và Trần Thị Vy Cầm đã chiết tách và phân lập được 4 hợp chất Mc1, Mc2, Mc3 và Mc4 từ cao MeOH của hạt khổ qua Trong đó Mc1được xác định là Momordicoside A và Mc2 đã được sơ bộ dự kiến cấu trúc [6]

Các tác giả Nguyễn Thanh Hồng, Nguyễn Ngọc Hạnh, Phùng Văn Trung ở Viện công nghệ Hóa học đã cô lập và nhận danh được hai hợp chất từ hạt: Momordicoside

A và Momordicoside B và bốn hợp chất từ trái: Momordicoside K, Momordicoside L, 3-O-[β-D-glucopyranosyl]-stigmasta-5,25(27)-diene và 23-O-β-D-allopyranosyl 5β,19-epoxycucurbita-6,24-dien-3β,22,23ξ-triol 3-O-β-D-allopyranoside

2.2.1.2 Tác dụng dược lý

Y học cổ truyền và dân gian Việt Nam đã có nhiều kinh nghiệm chữa bệnh từ khổ qua, nhưng chỉ ở dạng nguyên liệu thô ban đầu hoặc ở các dạng nước ép, nước sắc mà thôi Ngày nay, trên thị trường đã xuất hiện nhiều sản phẩm trái khổ qua nhưng đa số

ở dạng thực phẩm chức năng như trà hòa tan, trà túi lọc Điển hình là sản phẩm trà khổ qua của Viện Dược liệu hay trà túi lọc khổ qua của Công ty Traphaco

Nhóm tác giả Phạm Văn Thanh, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu và cộng sự đã sản xuất chế phẩm Morantin từ thành phần glycoside của trái khổ qua dạng to, màu trắng và chứng minh tác dụng hạ đường huyết của nhóm glycoside trên thỏ gây đái tháo đường thực nghiệm bằng Alloxan [21]

Các tác giả Nguyễn Thị Như, Nguyễn Thị Bay đã nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của một bài thuốc nam trên thực nghiệm lâm sàng, đó là sản phẩm trà túi lọc mà thành phần trái khổ qua chiếm 60%

Các tác giả Mai Phương Mai, Võ Phùng Nguyên cũng đã thăm dò tác dụng hạ đường huyết của một số bài thuốc dân gian ở mô hình đái tháo đường bằng streptozotocin trên chuột nhắt, mà thành phần của bài thuốc cũng có chứa trái khổ qua Các tác giả Mai Phương Mai, Nguyễn Thị Hạnh, Nguyễn Ngọc Hạnh đã chứng minh tác dụng hạ đường huyết của các dịch chiết từ trái khổ qua thu hái tại Phú Yên bằng các dung môi khác nhau [34]

2.2.2 Các công trình nghiên cứu trên thế giới

• Momordicine II, momordicine III

• Goyaglycosides -a, -b, -c, -d, -e, -f, -g, -h

• Momorcharaside A, momorcharaside B

• Momordicin I, momordicin II

− Triterpene saponin: Goyasaponins I, II, III

− Các triterpene khác:

• Momordicin, momordicinin, momordicilin

• Cucurbitane triterpenoid 3, cucurbitane triterpenoid 6

− Sterol: Elasterol; lanosterol; momordenol; β-sitosterol; α-spinasterol; stigmasterol; stigmasta-5-ene-3β,25-diol; stigmasta-5,25-dien-3β-ol; stigmasta-7,22,25-trien-3β-ol; stigmasta-7,22-dien-3β-ol

™ Protein

− p-insulin, v-insulin

− Momorcharin I, momorcharin II, α-momorcharin, β-momorcharin,

∆-momorcharin, ε-momorcharin, γ-momorcharin

− Momordin, momordin A, momordin B

− Ribosome-inactivating proteins 1, 2, 3, 4

− Trypsin inhibitor mcti-I, trypsin inhibitor mcti-II, trypsin inhibitor mci-3

− Các protein khác: Alanine, β-alanine, phenylanaline, arginine, asparagine, aspartic acid, BGIT, γ-aminobutyric acid, citrulline, glutamic acid, glycine, histidine, lectin, leucine, isoleucine, lysine, momordica agglutinin, ornithine, proline, serine, threonline, tyrosine…

™ Lipid

Arachidic acid, capric acid, cholesterol, α-elaeostearic acid, lauric acid, linoleic acid, linolenic acid, myristic acid, oleic acid, palmitic acid, palmitoleic acid, petroselinic acid, soya cerebroside I, stearic acid

Trong nhiều nghiên cứu, người ta đã chứng minh được rằng có ít nhất ba nhóm hợp chất có tác dụng làm giảm lượng đường huyết hoặc có hoạt tính kháng đái tháo đường Đó là hỗn hợp của hai saponin steroid gọi là charantin, các peptide giống

insulin (p-insulin) và alkaloid Các hợp chất này chủ yếu tập trung ở trái khổ qua

2.2.2.2 Một số triterpene glycoside được cô lập từ cây khổ qua

™ Các triterpene glycoside được cô lập từ hạt khổ qua

OH

HO HO

1 2 4 5 6 7 8

9 10

11 12 13 14

15

16 17 18

19

20 21

1' 2' 3' 4' 5' 6'

4 5 6 7 8 9 10

11 12 13 14

15 16 17 18

19

20 21

OH

HO

1' 2' 3' 4' 5' 6'

O

1''' 2''' 3''' 4''' 5'''

OH

OH

OH

OH OH

OH

HO HO

1 2

4 5 6 7 8

9 10

11 12 13 14

15

16 17 18

19

20 21

1' 2' 3' 4' 5' 6'

O O OO

OH

HO HO

1 2

4 5 6 7 8

9 10

11 12 13 14

15

16 17 18

1' 2' 3' 4' 5' 6'

OMe

OH

OHHO

1 2

4 5 6 7 8

9 10

11 12 13 14

15

16 17 18

1' 2' 3' 4' 5' 6'

O

9 Momordicoside F 2

− Là 3-O-β-D-allopyranoside của 5,19-epoxy-5β-cucurbita-6,23-dien-3β,25-diol

− Công thức chung: C35H58O8; M = 618 đvC; kết tinh trong acetone-nước cho tinh thể hình vảy, không màu; mp = 155 – 158oC

− Công thức cấu tạo:

OOHO

OH

OH

1 2

4 5 6 7 8

9 10

11 12 13 14

15

16 17 18

19

20 21

1' 2' 3' 4' 5' 6'

O

OH HO

4 5 6 7 8

9 10

11 12 13 14

15

16 17 18

19

20 21

1' 2' 3' 4' 5' 6'

O

OH HO

OH

1 2

4 5 6 7 8

9 10

11 12 13 14

15

16 17 18

19

20 21

1' 2' 3' 4' 5' 6'

O

OH HO

4 56 7 8 9 10

11 12

13 14 15 16 17 18

19

20 21

22 23

O

1'

2' 3' 4' 5' 6'

OHC

O HO

OH OH HO

4 5

6 7 8 9 10

11 12 13 14

15 16 17 18

19

20 21

22 23

O

1' 2' 3' 4' 5' 6'

OHC

O HO

OH

OH HO

9 Goyasaponin I [38]

- Dạng bột, màu trắng, [α]24D = -13.5o (C=0.5; pyridine)

- Là 28-O-β-D-xylopyranosyl (1-4)- rhamnopyranosyl(1-2)-[ rhamnopyranosyl (1-3)- β-D-fucopyranosyl gypsogenin 3-O- β-D-galactopyranosyl (1-2)- β-D-glucopyranosiduronic acid

α-L-O

O

O COOH

OH OH O HO

OH OH OH H

H

CHO

C O O

O O

O O

CH 3

OH O H H

OH

H

CH3

OH OH H

OH

OH OH OH

CH 3

OH

O

Goyasaponin I

9 Goyasaponin II

- Dạng bột, màu trắng, [α]24D = -18.5o (C=1.0; pyrydine)

- Là

28-O-β-D-xylopyranosyl(1-3)-β–D-xylopyranosyl(1-4)-α-L-rhamnopyranosyl(1-2)-[α-L-rhamnopyranosul(1-3)]-β-D-fucopyranosyl gypsogenin- 3-O- β-D-galactopyranosyl(1-2)- β-D-glucopyranosiduronic acid

- Công thức cấu tạo:

O

O

O COOH

OH OH O

HO OH OH OH H

H

CHO

C O O

O O

O O

CH 3 OH O H H

OH

H

CH 3

OH OH H

OH

OH OH

OH

CH 3 OH

O

Goyasaponin II

O

H OH

O OH

O

O COOH

O

O

HO

OH OH

OH H

OH OH

OH H

4 5 6 7 8

9 10

11 12 13 14

15

16 17 18

19

20 21

O O

OH

OH

1' 2' 3'

4' 5' 6'

HO OH OH

1 2

4 5 6 7 8

9 10

11 12 13 14

15

16 17 18

19

20 21

OHCHO

4 5 6 7 8

9 10

11 12 13 14

15

16 17 18

19

20 21

OHCHO

1 2

4 5 6 7 8

9 10

11 12 13 14

15 16 17 18

19

20 21

OH

OHC

OH

9 Momordicine II

− Là 23-O-β-glucopyranoside của 3β,7β,23ξ-trihydroxycucurbita-5,24-dien-19-al

− Công thức chung: C36H58O9; M = 634 đvC; kết tinh trong CHCl3 cho tinh thể dạng bột không màu

− Công thức cấu tạo:

HO

1 2

4 5 6 7 8

9 10

11 12 13 14

15 16 17 18

19

20 21

4' 5' 6'

HO OH

1 2

4 5 6 7 8

9 10

11 12 13 14

15

16 17 18

19

20 21

4' 5' 6'

HO OH O

2.2.2.3 Một số steroid được cô lập từ cây khổ qua

Năm 1962, Lotlikar và Rao lần đầu tiên cô lập được charantin với hàm lượng khoảng 0.01% [36] Đến năm 1965, Sucrow đã xác định được đây là một hỗn hợp 2 steroid glycosides (tỉ lệ 1:1) gồm 3-O-[β-D-glucopyranosyl]-stigmasta-5,25(27)-diene

và β-sitosterol-3-O-β-glucoside, với công thức lần lượt như sau:

O H

HO

H HO

H

H OH H

2 3 4

5 6 7 8

9 10

11 12 13

16 17

20 18

19

22 21

1'

2' 3'

4'

5' 6'

O

CTPT: C35H58O6 (M = 574)

O H

HO

H HO

H

H OH H

2 3 4

5 6 7 8

9 10

11 12 13

16 17

20 18

19

22 21

1'

2' 3'

4'

5' 6'

O

CTPT: C35H60O6 (M = 576)

2.2.2.4 Tác dụng dược lý

Theo y học hiện đại, khổ qua có tác dụng:

− Diệt vi khuẩn và virus, chống lại các tế bào ung thư, hỗ trợ đắc lực cho bệnh nhân ung thư đang chữa bằng tia xạ

− Chống các gốc tự do, là nguyên nhân gây lão hóa và phát sinh các bệnh tim mạch, tăng huyết áp, rối loạn lipid máu, tổn thương thần kinh, viêm đường tiết niệu, đái tháo đường

− Tăng oxy hóa glucose, ngăn chặn sự hấp thu glucose vào tế bào Ức chế hoạt tính các men tổng hợp glucose

− Có tác dụng sinh học giống insulin, giúp cơ thể tăng tiết insulin

− Có tác dụng tốt với người mắc bệnh đái tháo đường type 2 Hỗ trợ tăng tác dụng, giảm liều và giảm tác dụng phụ của các loại sulfamid trị đái tháo đường type 2 Dịch chiết trái khổ qua có khả năng ức chế khối u [22, 24, 28], hỗ trợ men gan, chữa được nhiều bệnh như đái tháo đường, lách, gan, khớp, gout …[35, 17, 30, 33]

Theo tài liệu [30], cao MeOH 50% từ trái khổ qua cho tác dụng hạ đường huyết 25% (liều dùng 30mg/kg), cao butanol cho kết quả là 34% với liều dùng như trên Các tác giả này cho rằng các hợp chất phân cực, tan nhiều trong butanol có khả năng làm giảm đường huyết Cơ chế hoạt động tương tự insulin hoặc thông qua sự tiết insulin từ tuyến tụy

Nghiên cứu in vivo trên thỏ gây đái tháo đường thực nghiệm bằng Alloxan cho

thấy, khi dùng nước ép trái khổ qua với liều dùng 6ml/kg B.W cho kết quả tối ưu, làm giảm lượng đường máu ở thỏ bình thường sau 2 giờ và tăng trở lại sau 3 giờ Tuy nhiên ở thỏ mắc bệnh, lượng đường máu tiếp tục giảm tới 4 giờ sau khi cho uống rồi mới bắt đầu tăng trở lại [29]

Theo báo cáo của Đại học Y khoa Calcuta (Ấn Độ), đã thử nghiệm cho 6 bệnh nhân đái tháo đường type 2 uống mỗi ngày một lần 100ml nước sắc khổ qua tươi Sau

3 tuần lễ uống thuốc liên tục, đo lượng đường trong máu (khi đói) đã giảm được 54%

so với ban đầu Sau 7 tuần dùng thuốc, cả 6 bệnh nhân đều không thấy đường trong nước tiểu, lượng đường trong máu như người bình thường

2.3 SƠ LƯỢC VỀ BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG

2.3.1 Tình hình bệnh đái tháo đường trên thế giới và Việt Nam

Theo công bố của WHO năm 1985 có khoảng 30 triệu người mắc bệnh đái tháo đường, năm 1994 có 98.9 triệu người và năm 2005 lên đến 150 triệu người Theo ước tính của Viện nghiên cứu đái tháo đường quốc tế thì năm 2010 có khoảng 215.6 triệu người mắc bệnh đái tháo đường và đến năm 2025 sẽ tăng lên 300 triệu người

Một số nghiên cứu cho thấy tỷ lệ mắc bệnh đái tháo đường ở Singapore năm

1975 là 1.9%, 1985 là 4.7%, 1992 là 8.6%; ở Pháp là 1.4%; Châu Âu là 3%; Philippin

là 4.27%; Thái Lan là 3.58%; Malaysia là 3.01% Theo công bố tại Hội nghị đái tháo đường 12/1997 tại Singapore, số người mắc bệnh đái tháo đường ở một số quốc gia tiêu biểu như: Ấn Độ có 19.4 triệu người, Nga có 8.9 triệu người, Trung Quốc có 16 triệu người, Mỹ có 13.9 triệu người, Nhật có 6.3 triệu người Giữa những chủng tộc người khác nhau cũng có sự khác biệt, tỉ lệ người mắc bệnh ở thành thị cao hơn nông thôn

Riêng ở Châu Á, năm 1995 đã có 62.8 triệu người mắc bệnh đái tháo đường Dự báo tới 2010 sẽ có khoảng 132.3 triệu người, trong đó đái tháo đường type 2 chiếm 130.1 triệu người

Ở Việt Nam hiện nay có khoảng 2 triệu người mắc bệnh đái tháo đường Các tác

1991) lên tới 2.42% (năm 1999), ở Thành phố Hồ Chí Minh là 2.68% (1992-1993), ở Huế là 0.98% (năm 1994)

2.3.2 Bệnh đái tháo đường [16]

2.3.2.1 Khái niệm

Đái tháo đường (Diabetes Mellitus) là hội chứng rối loạn sự thay thế chuyển hóa các chất glucose, protein và chất béo do trong cơ thể thiếu insulin hoặc tăng thêm những kích thích chống insulin gây nên Đặc trưng của nó là trong quá trình tuần hoàn máu, nồng độ glucose tăng cao khác thường, dẫn đến lượng đường trong máu và trong nước tiểu quá cao, xuất hiện triệu chứng ba nhiều một ít điển hình, tức uống nhiều, tiểu nhiều, ăn nhiều và thể trọng giảm nhẹ

Khi bị bệnh nặng có thể phát sinh ngộ độc cetone (ketoacidosis), bị hôn mê do bệnh đái tháo đường có tính thẩm thấu cao, đồng thời rất dễ kèm theo các loại bệnh nhiễm trùng Người bị bệnh kéo dài sẽ gây nên các biến chứng mãn tính về tim, xơ vữa động mạch, bệnh mạch máu não, suy kiệt công năng thận, mù cả hai mắt, hoại thư chân, có thể dẫn tới tử vong hoặc tàn phế

2.3.2.2 Phân loại

Có 2 dạng đái tháo đường chính:

− Đái tháo đường type 1: Phụ thuộc hoàn toàn vào insulin Dạng đái tháo đường này xảy ra khi tuyến tụy sản xuất ra quá ít hay không sản xuất ra insulin Rối loạn này thường phát triển đột ngột ở trẻ em hay ở độ tuổi vị thành niên Mặc dù các biện pháp

ăn uống cũng rất quan trọng, bệnh phải được điều trị bằng việc tiêm insulin

− Đái tháo đường type 2: Không phụ thuộc vào insulin Đây là nhóm bệnh phổ biến, chiếm hơn 90% bệnh nhân tiểu đường và có xu hướng tăng mạnh ở các nước đang phát triển Trong dạng bệnh này, tuyến tụy vẫn tiếp tục tiết insulin, nhưng các tế bào của cơ thể trở nên đề kháng với tác dụng của insulin Dạng đái tháo đường này chủ yếu ảnh hưởng đến những người trên 40 tuổi và thường gặp ở những người bị thừa cân hơn Bệnh trạng phát triển chậm và thường không được phát hiện trong những năm đầu Ở giai đoạn khởi phát, các biện pháp ăn uống có thể đủ để kiểm soát bệnh trạng, nhưng khi bệnh tiến triển cần dùng thuốc và đôi khi cũng phải tiêm insulin

Ngoài ra bệnh đái tháo đường có thể phát triển khi mang thai, được gọi là đái tháo đường thai sản và có thể cần được điều trị bằng insulin để duy trì sức khỏe của

mẹ và con Đái tháo đường thai sản thường biến mất sau khi sinh con, tuy nhiên phụ

nữ nào đã mắc bệnh này có nguy cơ phát triển đái tháo đường type 2 ở giai đoạn về sau

Các nguyên nhân của đái tháo đường type 2 ít được hiểu rõ hơn, nhưng di truyền

và béo phì là các yếu tố quan trọng Ở những người có khả năng mắc bệnh tiểu đường, bệnh có thể được kích hoạt bởi việc sử dụng các thuốc corticosteroid hay bởi mức hormone corticosteroid tự nhiên quá cao, corticosteroid có tác động đối kháng với insulin

2.3.3 Hóa dược trị đái tháo đường

2.3.3.1 Ức chế α-glucosidase

− Các loại thuốc thường dùng:

• Acarbose (C25H43NO18)

• Miglitol (C8H17NO5)

− Dùng cho đái tháo đường type 2

− Cơ chế: Acarbose và Miglitol ức chế men α-glucosidase trong ruột khiến các polysaccharose (tinh bột, đường mía saccharose …) chậm thủy phân thành glucose, kết quả là glucose vào máu từ từ nên glucose huyết không tăng nhiều sau bữa ăn

− Dùng cho đái tháo đường type 2

− Cơ chế: Nhóm Sulfonylurea có tác dụng kích thích tế bào beta của tuyến tụy tiết ra insulin Sulfonylurea chỉ tăng tiết insulin chứ không liên quan đến việc tổng hợp chất này

2.3.3.3 Nhóm Meglitinide

− Các loại thuốc thường dùng:

• Nateglinide (C19H27NO3)

• Repaglinide (C27H36N2O4)

• Mitiglinide (C38H48CaN2O6.2H2O)

− Dùng cho đái tháo đường type 2

− Cơ chế: Tương tự nhóm Sulfonylurea So với nhóm này, nhóm Meglitinide

có tác dụng nhanh hơn nhưng thời gian ngắn hơn

2.3.3.4 Nhóm Biguanide

− Thuốc thường dùng: Metformin (C4H11N5)

− Dùng cho bệnh nhân đái tháo đường type 2 mà ăn kiêng và thay đổi nếp sống vẫn không khống chế được glucose huyết

− Cơ chế: Metformin ức chế sự thủy phân glycogen thành glucose ở gan, giảm hấp thụ glucose ở ruột và tăng độ nhạy của tế bào đối với insulin Metformin không kích thích tiết insulin mà chỉ tăng khả năng dùng insulin

− Có nhiều loại chế phẩm insulin có thời gian tác dụng thay đổi khác nhau

− Dùng cho bệnh nhân đái tháo đường type 1 do tế bào beta của tuyến tụy bị thoái hóa, không sản xuất ra insulin Cũng có thể dùng cho đái tháo đường type 2 mãn tính, khi thuốc uống không hiệu nghiệm

2.4 PHƯƠNG PHÁP ỨC CHẾ MEN α-GLUCOSIDASE

2.4.1 Men α-glucosidase

Là một loại enzyme nằm ở tế bào biểu mô niêm mạc ruột non

Tên khác: Maltase, Glucoinvertase, Glucosidosucrase, Maltase-glucoamylase, glucopyranosidase, Glucosidoinvertase, α-D-glucosidase, α-glucosidase hydrolase, α-1,4-glucosidase

α-2.4.2 Vai trò của α-glucosidase trong quá trình hình thành glucose

Sơ đồ 2.1: Vai trò của α-glucosidase trong quá trình hình thành glucose

Dưới tác dụng của men amylase, tinh bột (kết hợp nhiều phân tử đường glucose)

sẽ bị thủy phân thành maltose (gồm 2 phân tử đường glucose) Sau đó, với tác dụng của men α-glucosidase, đường maltose sẽ tiếp tục bị thủy phân thành đường glucose Ngoài sự hấp thu tinh bột, cơ thể còn hấp thu saccharose (gồm 1 phân tử đường glucose kết hợp với 1 phân tử đường fructose) Dưới tác dụng của men α-glucosidase, đường saccharose cũng bị thủy phân thành đường glucose và đường fructose

Các phân tử đường glucose này sẽ được hấp thụ vào mạch máu trong cơ thể con người và trở thành glucose huyết cung cấp năng lượng cho mọi hoạt động sống

Nhưng với sự xuất hiện của một chất ức chế nào đó, men α-glucosidase sẽ hạn chế hoạt động, quá trình thủy phân maltose và saccharose diễn ra chậm Vì vậy hàm lượng glucose không tăng mạnh sau khi ăn

Tinh bột

Maltose (Glucose + Glucose)

Amylase

Saccharose (Glucose + Fructose)

CHƯƠNG 3 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

− Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR được đo trên máy AV500, Bruker

− Sắc ký cột thường dùng silicagel 60 F254, MERCK, đường kính hạt: 0.04 – 0.63mm, 0.063 – 0.200mm

− Sắc ký lớp mỏng TLC được thực hiện trên bản silicagel 60 F254, MERCK tráng sẵn

− Máy cô quay chân không

3.2.2 Hóa chất

− Ether petrol, Trung Quốc

− Diethyl ether, Trung Quốc

− Chloroform, Trung Quốc

− Ethyl acetate, Trung Quốc

− Acetone, Trung Quốc

− Methanol, Trung Quốc