nghiên cứu điều kiện lên men và tinh chế interleukin-2 tái tổ hợp của người từ escherichia coli

Năm 1992, Cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ FDA đã cho phép đưa vào sử dụng interleukin-2 tái tổ hợp do tập đồn Chiron sản xuất với tên thương mại là Proleukin trong điều trị ung

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-
-

LÊ THỊ LAN ANH

NGHIÊN CỨU ðIỀU KIỆN LÊN MEN VÀ TINH CHẾ INTERLEUKIN-2 TÁI TỔ HỢP CỦA NGƯỜI TỪ

ESCHERICHIA COLI

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Mã số : 60.42.80

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS TRƯƠNG NAM HẢI

TS NGUYỄN ðỨC BÁCH

HÀ NỘI – 2012

LỜI CẢM ƠN

đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Trương Nam Hải, Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học, Trưởng phòng Kỹ thuật di truyền và TS Nguyễn đức Bách, cán bộ giảng dạy và nghiên cứu bộ môn Công nghệ sinh học ứng dụng -

Khoa Công nghệ sinh học, Trường đại học Nông nghiệp - Hà Nội ựã tận tình hướng dẫn và truyền ựạt những kinh nghiệm quý báu cho tôi trong thời gian học tập và nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn sự quan tâm giúp ựỡ, sự chỉ bảo tận tình về chuyên

môn và sự ựộng viên chân thành của NCS Nguyễn Hồng Thanh và NCS Trần Ngọc Tân cùng tập thể cán bộ nghiên cứu của Phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ sinh

học

Tôi xin gửi lời cảm ơn ựến Ban Lãnh ựạo Viện Công nghệ sinh học, các thầy cô giáo trong Khoa Công nghệ sinh học, các cán bộ của Viện đào tạo sau ựại học, Trường đại học Nông nghiệp - Hà Nội ựã tạo mọi ựiều kiện thuận lợi ựể tôi hoàn thành luận văn thạc sỹ này

Cuối cùng, tôi xin ựược gửi tới gia ựình, bạn bè lòng biết ơn vì ựã luôn ựộng viên, giúp ựỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Hà Nội, ngày 22 tháng 5 năm 2012

Học viên cao học

Lê Thị Lan Anh

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan luận văn thạc sỹ công nghệ sinh học với ñề tài

“Nghiên cứu tối ưu ñiều kiện lên men và tinh chế interleukin-2 tái tổ hợp của người từ Escherichia coli” là công trình nghiên cứu của cá

nhân tôi Các kết quả và số liệu trong luận văn là trung thực

Hà Nội, ngày 22 tháng 5 năm 2012

LÊ THỊ LAN ANH

Học viên cao học khóa 19 Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội

EDTA Ethylene diamin tetra acetic acid

HPLC High Performance Liquid Chromatography

IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside

MWCB Manufacturer’s Working Cell Bank

NK Natural killer (tế bào diệt tự nhiên)

OD Optical Density

Pichia

pastoris

Pichia pastoris

PMSF Phenyl Methane Sulphonyl Fluoride

PVDF Polyvinylidene difluoride

rhIL-2 Recombinant human Interleukin-2

SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate – Polyacrylamide Gel

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 Thành phần môi trường M9……….25 Bảng 2 Thành phần dung dịch ñổ gel polyacrylamide 12,6% 29 Bảng 3 Bảng 3 Các dung dịch trong nhuộm bạc……… 30

Bảng 4 So sánh các thông số trong quá trình tạo sản phẩm IL-2 tinh chế từ E coli và P pastoris……… 51

Bảng 5 Dữ liệu kiểm tra hoạt tính của các mẫu IL-2 tái tổ hợp M1.1 – M1.5 lô 1……… 53 Bảng 6 Dữ liệu kiểm tra hoạt tính của các mẫu IL-2 tái tổ hợp M2.1 – M2.4 lô 2……… 54 Bảng 7 Dữ liệu kiểm tra hoạt tính của các mẫu IL-2 tái tổ hợp M3.1 – M3.4 lô 3……… 54 Bảng 8 Hoạt tính theo ñơn vị Units/mg của các mẫu IL-2……… 55

DANH MỤC HÌNH, ðỒ THỊ

Hình 1 Cơ chế gây ung thư 4

Hình 2 Hình thái học ung thư 4

Hình 3 Cơ chế hoạt ñộng của Interleukin-2 13

Hình 4 U hắc tố da 14

Hình 5 Ung thư thận 16

Hình 6 Hệ thống lên men Bioflo 20

Hình 7 Hệ thống tinh chế protein HPLC 22

Hình 8 Khả năng sinh tổng hợp IL-2 của chủng E coli theo thời gian sinh trưởng trong môi trường cảm ứng 39

Hình 9 Ảnh hưởng của nồng ñộ IPTG ñến khả năng tổng hợp IL-2 trong tế bào E coli 40

Hình 10 Khả năng sinh tổng hợp IL-2 của chủng E coli trong các môi trường lên men khác nhau 42

Hình 11 Phân tích IL-2 dạng tan và không tan của IL-2 trong các môi trường lên men khác nhau 44

Hình 12 Sản phẩm IL-2 biểu hiện trong tế bào E coli trong hệ thống lên men Bioflo 110 quy mô 5 lít trên gel SDS-page và western blotting 45

Hình 13 Kiểm tra các mẫu xử lý sinh khối tế bào E coli chứa IL-2 tái tổ hợp trên gel

polyacrylamide 12,6% 46

Hình 14 Kiểm tra tính tan của IL-2 trong các nồng ñộ Gnd-HCl khác nhau trên gel polyacrylamide 12,6% 47

Hình 15 Sắc ký ñồ tinh chế IL-2 trên hệ thống HPLC 49

Hình 16 Kiểm tra sản phẩm tinh chế IL-2 bằng kỹ thuật SDS-page 49

Hình 17 Kiểm tra sản phẩm tinh chế IL-2 bằng kỹ thuật SDS-page 50

Hình 18 Kiểm tra ñộ sạch của các sản phẩm protein 51

Hình 19 ðồ thị hoạt tính theo ñơn vị Units của các mẫu thí nghiệm 55

MỤC LỤC

PHẦN 1 MỞ ðẦU……… 1

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU……… 3

2.1 Tổng quan về ung thư và phương pháp ñiều trị ung thư ……… ……….3

2.1.1 Cơ chế gây ung thư……… 3

2.1.2 Tình hình nghiên cứu ung thư trên thế giới và Việt Nam……… 4

2.1.3 Một số phương pháp ñiều trị ung thư hiện nay……… ………6

2.2 Cytokine……….8

2.2.1 Cytokine và vai trò của chúng trong thực tế……… 8

2.2.2 Các loại cytokine và ứng dụng của chúng trong thực tế……….9

2.3 Interleukin-2……….11

2.3.1 Cấu trúc gen il-2 của người ……… 11

2.3.2 Cơ chế hoạt ñộng của IL-2………12

2.3.3 Sản phẩm IL-2 tái tổ hợp và ứng dụng……… 14

2.3.4 Các nghiên cứu và ứng dụng IL-2 trong ñiều trị ung thư trên thế giới Việt Nam.17 2.3.5 Lên men sản xuất protein tái tổ hợp và hệ thống lên men Bioflo 110………… 19

2.4 Hệ thống tinh chế protein HPLC……… 21

2.5 Thử hoạt tính sinh học của interleukin-2 trên dòng tế bào CTLL2……… ………22

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……….24

3.1 Vật liệu……….………24

3.1.1 Các chủng sinh vật, plasmid và tế bào CTLL2……….24

3.1.2 Hóa chất, enzym, máy móc và thiết bị……… ………24

3.1.3 Các dung dịch sử dụng và môi trường nuôi cấy………25

3.2 Phương pháp nghiên cứu……… 27

3.2.1 Lên men tạo sản phẩm IL-2 với dòng tế bào E coli……… 27

3.2.2 Phương pháp ñiện di protein trên gel polyacrylamide-SDS……… 27

3.2.3 Phương pháp kiểm tra tính bắt cặp ñặc hiệu với kháng thể kháng hIL-2 bằng phương pháp Western blotting………30

3.2.4 Lên men lượng lớn tạo sản phẩm IL-2 với dòng tế bào E coli trên hệ thống lên men Bioflo 110 quy mô 5 lít 32

3.2.5 Phá tế bào bằng siêu âm………33

3.2.6.Phá tế bào và xử lý mẫu protein IL-2 trước khi qua cột sắc ký………… ………34

3.2.7 Tinh chế protein bằng hệ sắc ký HPLC……….35

3.2.8 Xác ñịnh ñộ tinh khiết của sản phẩm IL-2 tái tổ hợp sau tinh sạch 36

3.2.9 Phương pháp kiểm tra hoạt tính IL-2 sau tinh sạch……… 37

PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN……… 39

4.1 Lựa chọn ñiều kiện lên men E coli biểu hiện IL-2 dạng ñơn ……… 39

4.1.1 Lựa chọn thời gian thu mẫu sau cảm ứng……… 39

4.1.2 Nồng ñộ IPTG thích hợp cho sinh tổng hợp IL-2………40

4.1.3 Lựa chọn môi trường lên men phù hợp………41

4.1.4.Kiểm tra tính tan (solution bodies) và không tan (inclusion bodies) của protein tái tổ hợp IL-2 trong E coli trong các môi trường……… 43

4.2 Lên men sản phẩm IL-2 trong hệ thống lên men Bioflo 110 quy mô 5 lít……… 44

4.3 Phá tế bào E coli và xử lí tiền tinh chế IL-2………45

4.4 Kiểm tra tính tan của IL-2 trong các nồng ñộ GuHCl khác nhau……… ……….46

4.5 Tinh sạch IL-2 từ dòng tế bào E coli……… ………48

4.6 Kiểm tra ñộ sạch của sản phẩm protein IL-2 bằng phần mềm Quantity One…… 51

4.7 Kiểm tra hoạt tính IL-2 tái tổ hợp trên tế bào CTLL2……… 52

PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ……… 57

5.1 Kết luận………57

5.2 Kiến nghị……… ………57

TÀI LIỆU THAM KHẢO……… 58

PHỤ LỤC………63

PHẦN 1 MỞ ðẦU

Hiện nay, ung thư là nguyên nhân chủ yếu của các ca tử vong trên tồn thế giới Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), năm 2008 cĩ hơn 12,4 triệu trường hợp mới mắc bệnh ung thư, 7,6 triệu trường hợp tử vong do ung thư và 28 triệu người

bị mắc bệnh ung thư được phát hiện trong vịng 5 năm [10] Dự tính số các bệnh nhân chết vì ung thư trên thế giới sẽ tiếp tục tăng lên trên 11 triệu người vào năm 2030 [50]

Ở Việt Nam, ước tính trên cả nước mỗi năm cĩ hơn 150.000 ca ung thư mới Tỷ lệ này đang khơng ngừng gia tăng ở bất kỳ lứa tuổi nào Nguyên nhân chủ yếu gây ung thư là

do các tác động của mơi trường ơ nhiễm như khĩi bụi cơng nghiệp, hĩa chất, vi sinh vật biến đổi gen, kết hợp với các yếu tố di truyền làm rối loạn quá trình sinh trưởng

và phát triển ở mức độ phân tử của tế bào

Các phương pháp điều trị ung thư chủ yếu hiện nay là phẫu thuật, xạ trị, hố trị, liệu pháp gen và miễn dịch trị liệu [52] Trong đĩ điều trị bằng phẫu thuật, xạ trị và hố trị liệu chỉ cĩ tác động giới hạn trong một giai đoạn nhất định của bệnh kèm theo các tác động cĩ hại để lại di chứng nặng nề, điều này đã gây trở ngại rất lớn trong điều trị Liệu pháp gen là quá trình thay thế các gen bị thiếu hay bị sai hỏng bằng các gen lành, tuy nhiên việc dùng vector là virus để đưa các gen lành vào sẽ gây nguy cơ làm gây nhiễm cả tế bào bình thường và tế bào ung thư Một nguy cơ khác nữa là các gen mới cĩ thể được đưa vào sai vị trí bên trong DNA cĩ thể gây ra những đột biến nguy hiểm cho DNA hoặc thậm chí gây ung thư [52 ] Với liệu pháp miễn dịch là dựa vào

hệ thống miễn dịch của chính cơ thể để phản ứng lại các nhân tố lạ chứ khơng phải đưa thêm các tác nhân khác từ ngồi vào để tiêu diệt tế bào ung thư Vì vậy phương

pháp này hiện nay được cho là an tồn hơn cả

Năm 1992, Cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) đã cho phép đưa vào sử dụng interleukin-2 tái tổ hợp do tập đồn Chiron sản xuất với tên thương mại là Proleukin trong điều trị ung thư thận, u hắc tố da và hỗ trợ điều trị HIV theo liệu pháp

miễn dịch [20] [55] IL-2 là một cytokine trong hệ thống miễn dịch được phát hiện

lần đầu tiên vào năm 1975 Khi cĩ các tác nhân lạ xâm nhập vào cơ thể, IL-2 sẽ kích thích sự tăng sinh các tế bào T, NK [48] để tấn cơng và phá huỷ các tác nhân đĩ đồng

thời phá huỷ các khối u Khối u là một trong những dạng tế bào lạ, ñược hệ thống miễn dịch phát hiện và tiêu diệt Tùy theo mức ñộ nhạy cảm với hệ thống miễn dịch và mức

ñộ khỏe mạnh của ung thư mà khối u bị áp chế hoặc phát triển

Bằng công nghệ DNA tái tổ hợp, gen il-2 ñược biểu hiện thành công trên tế bào

E coli BL21 [7] Tuy nhiên, ñể tạo ñược sản phẩm protein tái tổ hợp thương mại ñòi

hỏi phải qua nhiều công ñoạn phức tạp như lên men lượng lớn, tinh chế sản phẩm, thử hoạt tính sản phẩm IL-2 trên các dòng tế bào ung thư thực nghiệm, tiến hành sản xuất thử theo tiêu chuẩn GMP, thử nghiệm trên người bệnh, Giai ñoạn lên men thu sản phẩm ñòi hỏi phải tiến hành trong ñiều kiện tối ưu ñể thu ñược sản phẩm mong muốn

với hiệu suất cao nhất Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình lên men chủng E coli sinh tổng hợp IL-2 mà chúng ta cần phải nghiên cứu như thành phần môi trường,

nhiệt ñộ nuôi cấy, pH môi trường, nồng ñộ chất cảm ứng, thời gian thu sản phẩm sau cảm ứng, yếu tố ảnh hưởng ñến mật ñộ tế bào cuối cùng Vì vậy, cần thiết phải có quá trình tối ưu ñiều kiện lên men ñể ñạt hiệu suất thu hồi sản phẩm protein tái tổ hợp cao nhất, cũng như quá trình tinh chế ñể nhận ñược IL-2 tái tổ hợp dạng sạch phục vụ cho các nghiên cứu, khảo nghiệm sản phẩm sau này

Xuất phát từ những cơ sở khoa học và thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành thực

hiện ñề tài: “Nghiên cứu ñiều kiện lên men và tinh chế interleukin-2 tái tổ hợp của

người từ Escherichia coli’ nhằm sản xuất thành công IL-2 tái tổ hợp phục vụ cho ñiều

trị ung thư tại Việt Nam

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về ung thư và phương pháp ñiều trị ung thư

2.1.1 Cơ chế gây ung thư

Ung thư là một nhóm các bệnh liên quan ñến việc phân chia tế bào một cách vô

tổ chức và những tế bào ñó có khả năng xâm lấn những mô khác bằng cách phát triển trực tiếp vào mô lân cận hoặc di chuyển ñến nơi xa (di căn) Bản chất của ung thư là

sự ñột biến không sửa chữa ñược trong DNA do sự tác ñộng của các yếu tố sinh ung (hóa học, bức xạ, virus…) [60]

Ung thư xảy ra trong quá trình phân chia tế bào, trong những ñiều kiện nhất ñịnh ở hầu hết các mô trong cơ thể sinh vật ña bào Bình thường sự cân bằng giữa tốc

ñộ của quá trình tăng sinh và quá trình chết của tế bào ñược ñiều hòa một cách chặt chẽ ñể ñảm bảo cho tính toàn vẹn của cơ quan và mô Khi xuất hiện những ñột biến trong DNA, chúng có thể phá vỡ cơ chế ñiều khiển cân bằng này và dẫn ñến ung thư [6]

Có rất nhiều nguyên nhân gây ung thư Chúng ñược chia thành 3 nhóm: (1) các virus gây ung thư; (2) các tác nhân lí hóa gây ung thư; (3) một số trường hợp ung thư hiếm ở người mang tính di truyền, như bướu Wims, bệnh Xeroderma pigmentosum

Nhờ những tiến bộ của sinh học phân tử cho phép phân tích DNA của các eukaryote, người ta mới nhận thấy rằng dù ung thư có biểu hiện rất ña dạng, nguyên nhân gây bệnh cũng rất khác nhau nhưng căn nguyên của bệnh cũng chỉ là sự rối loạn trong chương trình di truyền của tế bào, hay nói khác ñi là sự rối loạn của DNA

Sự tăng sinh không kiểm soát và thường là nhanh chóng của tế bào sẽ tạo thành các khối u lành tính hay khối u ác tính (ung thư) Những khối u lành tính không lan tràn ñến những nơi khác trong cơ thể hay xâm lấn vào các mô khác, và chúng hiếm khi

ñe dọa ñến tính mạng trừ khi chúng chèn ép ñến các cấu trúc sống còn Các khối u ác tính có thể xâm lấn vào các cơ quan khác, lan ñến những nơi xa hơn (di căn) và ñe dọa ñến tính mạng Do ñó việc phát hiện sớm và có phương pháp ñiều trị phù hợp thì ung thư không còn là mối lo ngại của con người

2.1.2 Tình hình ung thư trên thế giới và Việt Nam

* Trên thế giới

Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) mỗi năm ước tính có khoảng trên 6 triệu người chết do ung thư Tỷ lệ chết do ung thư chiếm tới 12% trong số các nguyên nhân gây tử vong ở người Tỷ lệ mắc bệnh ung thư có xu hướng gia tăng ở phần lớn các nước trên thế giới Hiện tại, qua thống kê cho thấy trên toàn cầu có

Hình 1 Cơ chế gây ung thư Hình 2 Hình thái học ung thư

khoảng 20 triệu người ñang sống chung với bệnh ung thư Nếu không có các biện pháp can thiệp kịp thời thì con số này sẽ lên tới 30 triệu vào năm 2020

Ung thư ñang trở thành một căn bệnh hết sức nguy hiểm, ñe dọa mạng sống của con người Ở các nước phát triển ung thư là nguyên nhân gây tử vong ñứng hàng thứ hai sau bệnh tim mạch Còn ở các nước ñang phát triển ung thư ñứng hàng thứ ba sau bệnh nhiễm trùng/ký sinh trùng và tim mạch Số lượng bệnh nhân bị ung thư ñang tăng dần tại các nước ñang phát triển do tỷ lệ tử vong ở trẻ em và số người chết do các bệnh nhiễm trùng có xu hướng giảm và nhiều người có khả năng sống lâu hơn Hơn nữa, người dân ở những nước này ñang ngày càng thích ứng với lối sống của các nước phát triển như hút thuốc, uống rượu, ăn nhiều thực phẩm giàu calo và chất béo

Theo Cơ quan nghiên cứu ung thư thế giới IARC (The International Agenecy for Research on Cancer), trong số các trường hợp mắc bệnh ung thư và tử vong do ung thư trên thế giới, các nước có thu nhập thấp và trung bình là những nơi chiếm tỷ lệ ung thư cao (chiếm 2/3 trường hợp ung thư trên toàn thế giới) Tỷ lệ dạng ung thư khác nhau cũng tùy thuộc vào mức ñộ thu nhập của các quốc gia, tập quán của người dân Tuy nhiên, tỷ lệ bệnh ung thư chủ yếu tập trung vào các dạng ung thư như: ung thư phổi, ung thư vú, ung thư ruột già, ung thư dạ dày, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư thận, ung thư da, ung thư giáp trạng, ung thư buồng trứng…

* Tại Việt Nam

Trước ñây, ở Việt Nam, mô hình bệnh tật ñiển hình là của một nước thu nhập thấp, kém phát triển, có ñời sống chưa cao, ý thức vệ sinh thấp, vùng khí hậu nhiệt ñới nóng bức ẩm ướt, nên các bệnh tật chủ yếu là những bệnh truyền nhiễm và các bệnh suy dinh dưỡng Hiện nay, cùng với sự thay ñổi mạnh mẽ về kinh tế, mô hình bệnh tật

ñã có xu hướng giống các nước phát triển, các bệnh ung thư, tim mạch…ngày càng phổ biến So với tỷ lệ chung trên thế giới về ung thư thì Việt Nam thuộc nhóm nước có

tỷ lệ mắc ung thư cao Trung bình mỗi năm nước ta có khoảng 150.000 người mắc ung thư và 100.000 người chết (năm 2008) [1] Số liệu thống kê mới nhất năm 2010 nước

ta có 126.300 ca mắc ung thư mới Mặc dù số người mắc ung thư mới có giảm so với năm 2008, tuy nhiên các loại ung thư mới xuất hiện càng nhiều Những loại ung thư

thường gặp là phổi, dạ dày, gan, đại trực tràng, vịm họng, thận, da, vú, cổ tử cung… Khoảng 85% số bệnh nhân ung thư tại Việt Nam được phát hiện khi đã ở độ tuổi trên

40, rất nhiều người đang ở độ tuổi thành đạt về nghề nghiệp ðiều này đã gây những hậu quả nặng nề cho gia đình và xã hội [61] Vì vậy, chẩn đốn chính xác được loại ung thư và cĩ phương pháp điều trị thích hợp là việc làm hết sức cần thiết trong giai đoạn hiện nay

2.1.3 Một số phương pháp điều trị ung thư hiện nay

Cùng với sự phát triển của khoa học và cơng nghệ hiện đại, các phương pháp điều trị ung thư ngày càng đa dạng và hiệu quả nhằm giúp cải thiện chất lượng cuộc sống của nhiều bệnh nhân ung thư và ở một số loại ung thư nhất định, các phương pháp này giúp các bệnh nhân thốt khỏi căn bệnh ung thư Hiện nay cĩ 6 phương pháp điều trị ung thư mà thế giới đang áp dụng là phẫu thuật, xạ trị, hĩa trị, liệu pháp sinh học, liệu pháp quang động và liệu pháp miễn dịch [52]

* Phương pháp phẫu thuật

Phẫu thuật là phương pháp sử dụng để phịng ngừa, điều trị, xác định và chẩn đốn ung thư Liên quan đến điều trị ung thư, phẫu thuật được thực hiện để loại bỏ các khối u hay các tế bào ung thư [53] Bằng việc cắt bỏ khối u, bác sĩ cĩ thể cắt bỏ một số

mơ xung quanh hoặc một số hạch bạch huyết gần khối u Tuy nhiên, phương pháp này phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm kích thước khối u, vị trí khối u, cách phẫu thuật

và tình trạng của bệnh nhân ðể tăng hiệu quả điều trị ung thư, phẫu thuật thường được thực hiện kết hợp với hĩa trị hoặc xạ trị ðiều trị ung thư bằng phẫu thuật chỉ hiệu quả khi tế bào ung thư đang ở giai đoạn đầu, khi ung thư di căn (lan sang các mơ khác) thì phương pháp này khơng cịn hiệu quả nữa

* Phương pháp xạ trị

Xạ trị là phương pháp sử dụng các loại năng lượng như tia X, tia gamma hay các electron để thu hẹp khối u hay loại bỏ các tế bào ung thư Nĩ làm việc bằng cách phá hủy DNA của tế bào ung thư làm cho chúng khơng thể nhân lên Các tế bào ung thư rất mẫn cảm với các tia xạ vì vậy chúng dễ dàng chết khi bị xử lý bằng tia xạ Phương

pháp này có thể gây ảnh hưởng ựến các tế bào khỏe gần ựó, tuy nhiên những tế bào khỏe này có thể hồi phục lại ựược [53]

* Phương pháp hoá trị liệu

Phương pháp hóa trị liệu là phương pháp liên quan ựến việc sử dụng các loại thuốc (hóa chất) nhằm loại bỏ các tế bào ung thư Không giống như phẫu thuật, hóa trị tác ựộng lên toàn bộ cơ thể không loại trừ bất kỳ bộ phận nào Nó làm việc bằng cách tác ựộng nhanh vào các tế bào ung thư ựang phân chia đáng tiếc là các tế bào khác trong cơ thể chúng ta cũng phân chia với tốc ựộ cao như các tế bào nang tóc và các tế bào trong dạ dày dễ bị ảnh hưởng đó là lắ do tại sao ựiều trị bằng hóa chất gây hiện tượng rụng tóc và rối loạn tiêu hóa ở các bệnh nhân ung thư [53]

* Liệu pháp sinh học

Liệu pháp sinh học tác dụng lên tế bào khối u bằng cách khóa quá trình sinh học cho sự sinh trưởng và phát triển của khối u, hoặc cắt bỏ nguồn máu cung cấp tới khối u làm khối u chết do thiếu máu Tuy nhiên, phương pháp này chỉ sử dụng trong một vài loại khối u nhất ựịnh Liệu pháp này có thể sử dụng riêng lẻ, nhưng thông thường ựược

sử dụng như một liệu pháp hỗ trợ (nghĩa là sử dụng song song hay sau liệu pháp khác)

ựể tăng cường tác dụng chống ung thư của liệu pháp chắnh điểm nổi trội của liệu pháp ựiều trị mới này là khả năng ựiều trị ngăn chặn chắnh xác ung thư mà không cần phá hủy (vắ dụ như các vaccine phòng ung thư), có thể giúp ựưa tế bào ung thư trở lại bình thường (vắ dụ các liệu pháp gen) hay có thể ựiều trị với cách tác ựộng nhẹ nhàng hơn làm ức chế ung thư (vắ dụ liệu pháp kháng sinh mạch, các ựộc miễn dịch ựặc hiệu tế bào ựắch, các chất ựiều biến sinh học nâng cao hệ miễn dịch) [11]

* Liệu pháp quang ựộng (PDT)

Liệu pháp quang ựộng (PDT) là cách ựiều trị ựặc biệt bằng một loại thuốc gọi là photosensitizer hoặc photosensitizing agent phối hợp với 1 loại ánh sáng ựặc biệt ựể tiêu diệt tế bào ung thư [55] đây là một phương pháp mới ựược ựưa vào ứng dụng năm 2012 Ưu ựiểm của liệu pháp này là: (1) khá chọn lọc và chuyên biệt cho các tế bào ung thư; (2) với phương pháp này có hiệu quả ựối với tất cả các loại khối u; (3) ựối

với những người trong giai ñoạn ñầu của bệnh, tỷ lệ thành công cao ñến 90% cho ung thư giai ñoạn ñầu (ung thư thực quản (esophageal) và ung thư phổi) ðối với ung thư

ñã phát triển thì tỷ lệ thành công trên 70%; (4) không ñộc hại, không ức chế miễn dịch

và ức chế tủy xương; (5) không ảnh hưởng ñến các liệu pháp khác (hóa trị/xạ trị) và có tác dụng bổ sung; (6) thời gian ñều trị ngắn và có hiệu quả trong vòng 48-72 giờ Liệu pháp này ñã ñược ứng dụng rất thành công trong ñiều trị một vài loại ung thư như: khối u miệng-hầu, ung thư giai ñoạn ñầu miệng, mũi, và mũi-hầu, ung thư thực quản, ung thư thực quản-cổ, ung thư phổi, ung thư dạ dày, ung thư bàng quang, ung thư da

và khối u dưới da ðây là một liệu pháp mới nhất cho ñiều trị ung thư hiện nay

* Liệu pháp miễn dịch

Trong khoảng 20 năm gần ñây, những hiểu biết về hệ thống miễn dịch ngày càng tiến bộ, nhiều người ñã sử dụng các cytokine và kháng thể ñơn dòng có khả năng ñiều hòa hoạt ñộng của hệ miễn dịch trong ñiều trị ung thư và một số bệnh lý khác Các chất miễn dịch không ñặc hiệu có nguồn gốc sinh học như: BCG (Bacillus Calmette – Guerin) và Carynebacterium barvum ñã ñược sử dụng trên thực nghiệm và trên người Các chất kích thích miễn dịch không ñặc hiệu có nguồn gốc hoá học như LH1… cũng ñang ñược nghiên cứu

Mục ñích chính của ñiều trị bằng liệu pháp miễn dịch là làm tăng sức ñề kháng của cơ thể ñể cơ thể có thể tự tiêu diệt các tế bào ung thư còn sót lại mà các phương pháp kinh ñiển như phẫu thuật, xạ trị, hóa chất không diệt hết ñược Có 2 loại miễn dịch là miễn dịch chủ ñộng - dùng một số chất kích thích miễn dịch ñưa vào cơ thể bệnh nhân: như BCG, LH1 và miễn dịch thụ ñộng - dùng các kháng nguyên tế bào ung thư của bệnh nhân ñưa vào cơ thể khác (người khác hoặc ñộng vật thí nghiệm) gây miễn dịch với tế bào ung thư Dùng một phần huyết thanh hoặc bạch cầu ñã miễn dịch

ñó truyền trở lại cho người bệnh ñể diệt tế bào ung thư ðây là phương pháp ñiều trị ung thư khá an toàn và hiệu quả trong giai ñoạn hiện nay

2.2 Cytokine

2.2.1 Cytokine và vai trò của chúng trong hệ miễn dịch

Cytokine có nhiều tên gọi khác nhau như lymphokine, interleukine và chemokine, dựa trên chức năng giả ñịnh của chúng, tế bào tiết ra chúng hoặc ñích tác dụng của chúng Các cytokine có bản chất là các phân tử protein hay glycoprotein ñóng vai trò là các tín hiệu hay các phân tử truyền thông tin của hệ thống miễn dịch Các cytokine ñược tiết bởi các tế bào miễn dịch Chúng có thể tự tiết hoặc hoạt ñộng như hoocmon tại vị trí nhất ñịnh hoặc ở một vị trí cách xa ñể tăng cường hoặc ức chế

hệ miễn dịch Do vậy, người ta ñã sử dụng cytokine trong ñiều trị ung thư với mục ñích tăng cường hệ miễn dịch của cơ thể ñể chống lại các tế bào ung thư [54]

Cơ chế hoạt ñộng của các cytokine là chúng gắn vào các thụ thể (receptor) ñặc hiệu nằm trên màng các tế bào ñích ñể khởi ñộng các con ñường dẫn truyền tín hiệu vào bên trong tế bào và cuối cùng dẫn ñến thay ñổi quá trình biểu hiện gene của tế bào ñích Tiến trình này có thể gồm nhiều gene và các yếu tố dịch mã các gene ñó tham gia tiến trình ñiều hoà thuận hoặc nghịch, cuối cùng sản xuất ra các cytokine khác, tăng số lượng các receptor bề mặt tế bào, hoặc là ức chế tác dụng của chúng do hiện tượng ức chế ngược

2.2.2 Các loại cytokine và ứng dụng của chúng trong thực tế

* Các loại cytokine

Có rất nhiều loại cytokine ñã ñược thử nghiệm lâm sàng có hiệu quả trong hỗ trợ ñiều trị ung thư Trong ñó có Interleukin-2 (IL-2) và interferon-alfa 2b là hai loại cytokine ñã ñược FDA cho phép sử dụng [58] IL-2 ñã ñược chứng minh là có khả năng chống lại tế bào ung thư biểu mô, ung thư da, melanoma (u hắc tố da), lymphoma (một nhóm các loại ung thư) và leukemia (bệnh bạch cầu) Bên cạnh ñó, IL-2 còn ñược ứng dụng trong hỗ trợ ñiều trị ung thư thận và HIV Còn interferon-alfa 2b cũng có các tác dụng tương tự Ngoài các cytokine khác cũng ñã ñược ứng dụng trong hỗ trợ ñiều trị ung thư như GM-CSF, interleukin-12 (IL-12) Tuy nhiên, qua các thử nghiệm lâm sàng cho thấy rằng, phần lớn các cytokine trong ñiều trị ung thư không hoạt ñộng riêng

lẻ mà có sự hỗ trợ cho nhau [54]

* Phân loại cytokine dựa và chức năng

Cytokine có rất nhiều chức năng, tuy nhiên, theo tác dụng của chúng người ta có thể xếp nhóm như sau: (1) tác dụng tự thân (autocrine) tức là cytokine tác dụng lên chính tế bào tiết ra nó; (2) tác dụng kế cận (paracrine) khi cytokine tác dụng lên tế bào

ở khu vực gần kề với tế bào tiết ra nó; (3) tác dụng nội tiết (endocrine), nếu cytokine khuyết tán ñến các vùng xa hơn của cơ thể (do máu hoặc huyết tương mang ñi) ñể tác dụng trên các mô khác nhau

*Hoạt tính sinh học của cytokine trong hỗ trợ ñiều trị ung thư

Cytokine ñã ñược ứng dụng rộng rãi trên thế giới ñể hỗ trợ ñiều trị ung thư từ hơn

20 năm trước Tuy nhiên, ở Việt Nam, nói ñến liệu pháp này vẫn còn khá mới mẻ Có hàng loạt các cytokine khác nhau ñã ñược sản xuất và thử nghiệm trong ñiều trị lâm sàng Tuy nhiên, tính ñến thời ñiểm hiện tại, số lượng cytokine ñã ñược phép sử dụng tại Hoa Kỳ ñể chữa ung thư và các bệnh liên quan ñến ung thư chỉ bao gồm: IL-2, IFN-α, G-CSF, GM-CSF, IL-11 và erythropoietin (EPO) Các cytokine khác như IL-

12, TNF-α cũng ñã ñược cho phép sử dụng nhưng vẫn còn những hạn chế do chưa kiểm soát hoàn toàn ñược khả năng loại thải cũng như các hiệu ứng phụ khác

Ưu ñiểm nổi trội của cytokine trong việc hỗ trợ ñiều trị ung thư là kiểm soát ñược ung thư và các ảnh hưởng của ung thư Việc ñiều trị với GM-CSF và G-CSF tiếp sau phương pháp hóa trị liệu hoặc cấy ghép tủy xương có thể thúc ñẩy nhanh khả năng phục hồi của các tế bào myeloid, giảm rủi ro xảy ra từ việc lây nhiễm khác Bệnh thiếu máu liên quan ñến ung thư có thể làm giảm bớt nhờ ñiều trị bằng EPO IL-11 có thể kích thích sự tạo thành tiểu cầu và ñược áp dụng trong ñiều trị với bệnh thrombocytopenia (một loại bệnh thiếu tiểu cầu) sau khi ñã ñược hóa trị liệu [53] IL-2 ñược cấp phép ñể ñiều trị bệnh ung thư thận và ung thư da IFN-α không những có thể

sử dụng ñộc lập mà còn có thể kết hợp ñiều trị với cytokine khác (ví dụ: IL-2) ñể ñiều trị một số bệnh khác như: các khối u ác tính, ung thư tế bào biểu mô, ung thư hệ bạch huyết, máu trắng (CML), bệnh ung thư da có liên quan ñến nhiễm HIV Kaposi sarcoma … Các cytokine khác cũng ñang ñược áp dụng ñể ñiều trị thử nghiệm chữa trị, hỗ trợ ñiều trị ung thư: IL-3 có thể sử dụng ñiều trị bệnh thiếu tiểu cầu, IL-7 ứng

dụng hồi phục mạch bạch huyết sau khi xử lý phẫu thuật với tủy xương, IL-12 mặc dù hiệu quả sử dụng ñể ñiều trị khối u là không cao nhưng cytokine này lại có thể sử dụng như là một tá chất cho vaccine [56]

2.3 Interleukin-2

2.3.1 Cấu trúc gen il-2 của người

Interleukin-2 của người là một cytokine ñóng vai trò quan trọng trong hệ thống miễn dịch Gen mã hoá cho IL-2 ñược tách dòng từ tế bào lách của người [49], và ñược xác ñịnh là ñịnh vị trên nhiễm sắc thể số 4 Khung ñọc mở suy diễn từ cDNA mã hóa cho phân tử IL-2 hoàn chỉnh gồm 153 axit amin, trong ñó có 20 axit amin mở ñầu

là trình tự của tín hiệu tiết Trong cấu trúc DNA, gen mã hóa cho IL-2 cũng bao gồm hộp TATA, vị trí khởi ñầu sao phiên mã, bốn vị trí exon và ba vị trí intron [46]

Interleukin-2 của người (hIL-2) thuộc nhóm lymphokine có khả năng hoạt hóa in vitro các tế bào lympho T, hIL-2 tham gia một số chức năng quan trọng như tính ñộc

của tế bào T, tế bào giết tự nhiên (NK), tế bào B hoạt hóa và các tế bào giết tự nhiên hoạt hóa bởi lymphokine Trải qua quá trình biến ñổi sau dịch mã, protein hIL-2 bị cắt ñoạn trình tự tín hiệu tiết dài 20 axit amin và tạo thành hIL-2 hoàn chỉnh chứa 133 axit amin Các kết quả nghiên cứu trước ñây cho thấy có 3 vùng trên phân tử hIL2 có vai trò quyết ñịnh hoạt tính sinh học của cytokine này ñó là: (1) vùng tận cùng ñầu

N (các gốc axit amin 1-20), (2) vùng tận cùng ñầu C (các gốc axit amin 121-133) và (3) cầu disunfide giữa các gốc Cys58 và Cys105 Nghiên cứu của Grace (1987) cho thấy các ñột biến mất 20 axit amin ở ñầu N và 10 gốc axit amin ở ñầu C có thể làm mất 99% hoạt tính của IL-2 và khả năng liên kết của chúng với các thụ thể IL-2 Phân tích trình tự axit amin cho thấy IL-2 tự nhiên của người có chứa 3 gốc Cys tại các

vị trí 58, 105, 125 trong ñó hai gốc Cys58 và Cys105 tạo cầu disulfide [49] Việc hình thành chính xác cầu disulfide này sẽ quyết ñịnh ñến hoạt tính sinh học của IL-2 Các kết quả nghiên cứu trước ñây cho thấy ñột biến các gốc Cys105 làm phá huỷ cầu disulfide do vậy làm giảm 8 - 10 lần hoạt tính của hIL-2, trong khi ñó sự thay thế hoặc ñột biến Cys58 làm hoạt tính của IL-2 giảm tới 250 lần Tuy nhiên, sự ñột biến mất gốc Cystại vị trí 125 chỉ ảnh hưởng rất ít tới hoạt tính IL-2 và sự thay ñổi gốc Cys125 thành

Ser125 không ảnh hưởng tới hoạt tính của IL-2 [2] Do vậy, ñột biến thay ñổi Cys ở vị trí 125thành Ser có thể ngăn cản sự tạo thành cầu disulfide không mong muốn giữa gốc này với Cys58 hoặc Cys105[42] Ngoài ra, tại ñầu N của protein IL-2 có ñiểm glycosyl hóa ñược nhận biết bởi trình tự Ala-Pro-Thr ở 3 vị trí axit amin ñầu tiên IL-2 trong tự nhiên tồn tại ở dạng glycosyl hóa có tính thấm cao hay tính sinh miễn dịch mạnh với màng tế bào do vậy liều lượng lớn IL-2 sẽ gây nên ñộc tính của protein này trong cơ thể Vì vậy, IL-2 dạng thương phẩm dùng làm thuốc tiêm không ñược mang các gốc ñường ở ñầu N

Các nghiên cứu trước ñây cho thấy, việc sử dụng IL-2 trong hỗ trợ ñiều trị ung thư có thể làm tăng khả năng sống sót cho các bệnh nhân Nghiên cứu của Rosenberg 1980 tại Viện Ung thư Quốc gia (National Cancer Institute - NCI, Tây Ban Nha) cho thấy, khi ñiều trị cho các bệnh nhân ung thư thận ác tính bằng IL-2 với các liều lượng khác nhau có thể làm giảm tỷ lệ di căn của các khối u từ 15 - 20%, ngoài ra IL-2 còn có vai trò quan trọng trong việc ñiều trị các bệnh ung thư ác tính khác như ung thư bạch cầu, ung thư phổi, ung thư buồng trứng… Trong những năm tiếp theo từ năm 1990, các nhà khoa học ñã tiếp tục nghiên cứu ñể làm tăng hoạt tính của IL-2 và sử dụng kết hợp nhiều phương pháp trị liệu khác như hóa trị liệu và miễn dịch trị liệu, kết quả là khoảng 5 - 10% các bệnh nhân ñược ñiều trị có thể sống sót sau 10 năm ðây là một trong rất nhiều nỗ lực lớn của các nhà khoa học trên thế giới trong việc nghiên cứu và ứng dụng IL-2 trong việc ñiều trị các căn bệnh nan y này

2.3.2 Cơ chế hoạt ñộng của IL-2

* Cơ chế hoạt ñộng của IL-2

IL-2 là một protein tự nhiên trong cơ thể và ñóng vai trò quan trọng trong tăng cường hệ thống miễn dịch Hệ miễn dịch bảo vệ cơ thể khỏi nhưng tác ñộng của các hợp chất, các tế bào hay mô lạ bằng cách phản ứng và chống lại chúng khi có tác nhân

lạ xâm nhập vào cơ thể IL-2 tự nhiên trong cơ thể cũng hoạt ñộng như vậy IL-2 kích hoạt hệ miễn dịch nhận biết và loại bỏ các tế bào ung thư, cụ thể IL-2 kích hoạt các tế bào bảo vệ ñặc hiệu như tế bào T, tế bào NK ñể tấn công và phá hủy các mầm bệnh

Do ñó, IL-2 cũng kích thích những tế bào này tấn công và tiêu diệt tế bào ung thư [55]

Cơ chế tổng quát của IL2 ñược trình bày trên hình 3

Thông qua nghiên cứu cơ chế hoạt ñộng của IL-2, các nhà khoa học ñã tạo ra ñược sản phẩm IL-2 bằng công nghệ DNA tái tổ hợp với mục ñích hỗ trợ ñiều trị ung thư

* Hoạt tính và chức năng của IL-2

Hầu hết các hoạt tính quan trọng của IL-2 là ñiều hòa theo hướng giảm các ñáp ứng miễn dịch ñể ngăn ngừa hiện tượng tự nhiễm Những tác ñộng ức chế của IL-2 tạo ra một vòng thông tin phản hồi mà ñạt ñược nhờ một số cơ chế Thứ nhất là:

sự sản sinh IL-2 chỉ là nhất thời, vì vậy khi không có sự kích thích của kháng nguyên thì các tế bào T ñược hoạt hóa sẽ chết do sự mất ñi các cytokine trong môi trường Thứ hai: IL-2 khởi ñầu một con ñường chết theo chương trình ñã ñược ñịnh sẵn

IL-2 ñược sử dụng trong ñiều trị bệnh ung thư bao gồm ung thư thận, u hắc tố

và ung thư da IL-2 giúp làm tăng sản lượng của các thành phần khác nhau của hệ thống miễn dịch trong máu, bao gồm tế bào lympho T và các tế bào giết tự nhiên (NK) Khi chạm trán tế bào khối u, tế bào NK ñã hoạt hóa liền tấn công màng tế bào ung thư và tiêm những hạt tế bào chất vào làm phân hủy tế bào ñích Cho dù kích thước nhỏ hơn tế bào ung thư hay virus, tế bào NK thường bắt trói 2 hoặc nhiều tế bào ung thư cùng một lúc Nó có thể cải tiến chức năng của hệ thống các tế bào miễn dịch

Hình 3 Cơ chế hoạt ñộng của Interleukin-2

PROLEUKIN IL-2

Kích hoạt và làm tăng sự sản sinh tế bào

Tế bào T

Tế bào Ung thư

Tế bào T ñặc hiệu

khác, như lymphokine cĩ hoạt tính giết chết các tế bào và các tế bào lympho xâm lấn khối u ðiều này đã giúp cho cơ thể chống lại bệnh ung thư

2.3.3 Sản phẩm IL-2 tái tổ hợp và ứng dụng

* Sản phẩm IL-2 tái tổ hợp

Năm 1992, tập đồn Chiron của Mỹ đã cho ra đời sản phẩm IL-2 tái tổ hợp với

sự sửa đổi một acid amin ở vị trí 125 và khơng cĩ acid amin alanine ở đầu N cĩ tên thương mại là Proleukin và được FDA cho phép sử dụng trong điều trị ung thu thận, u hắc tố da và hỗ trợ điều trị HIV cùng một số ung thư khác như ung thư phổi, ung thư vú, Tuy nhiên, hai loại ung thư phổ biến đã và đang được điều trị hiện nay bằng IL-

2 là u hắc tố da và ung thư thận

* U hắc tố da (melanoma):

Melanoma là một loại ung thư da xảy ra khi các tế bào da đặc biệt được gọi là melanocytes (tế bào biểu bì tạo hắc tố) bị thương tổn do các yếu tố như mẫn cảm với ánh nắng mặt trời, cháy nắng, từ các vết bỏng rộp, từ các nốt dị thường trên cơ thể hoặc do tiền sử gia đình Nếu các thương tổn này khơng được loại bỏ sớm, các tế bào này sẽ phát triển trên bề mặt da và lan sang các mơ khỏe (di căn), lúc này việc điều trị

sẽ trở nên khĩ khăn hơn

Ở Việt Nam, số người mắc ung thư da rất ít, tuy nhiên trên thế giới tỷ lệ mắc ung thư da là khơng nhỏ Trong đĩ New Zealand là nước cĩ tỷ lệ ung thư da cao nhất và là loại ung thư phổ biến thứ 4 ở Australia [56] Theo thống kê của Viện ung thư Quốc gia, năm 2010 ở Mỹ cĩ 68.130 ca mắc ung thư mới và cĩ 8.700 người chết vì ung thư

Hình 4 U hắc tố da

này Còn ở Anh, mỗi năm có khoảng 10.000 người phát hiện mắc ung thư da melanoma trong ñó có 2.000 người chết hàng năm vì ung thư này Mặc dù, tỷ lệ số người mắc ung thư da là rất ít chiếm 4%, tuy nhiên ñây lại là loại ung thư có tỷ lệ chết rất cao 79% [57] Vì vậy, việc tìm ra một loại thuốc và liệu pháp ñiều trị phù hợp là vô cùng cần thiết

Với hầu hết các loại ung thư nếu ñược phát hiện kịp thời thì dễ dàng ñược loại bỏ bằng phẫu thuật, xạ trị và hóa trị Tuy nhiên, với ung thư da ở giai ñoạn cuối thì việc ñiều trị là vô cùng khó khăn Hiện nay, phương pháp ñiều trị chính với loại ung thư này là sử dụng interferon và IL-2 [58] IL-2 ñã ñược FDA cho phép sử dụng từ năm

1992 cho ñiều trị ung thư da và hiện nay, IL-2 vẫn ñược sử dụng kết hợp cùng với các loại vaccine thế hệ mới nhằm nâng cao hiệu quả ñiều trị Các nghiên cứu về ñiều trị u hắc tố da ñã ñược Atkin và cộng sự ghi nhận ñược kết quả khả quan với số bệnh nhân

u hắc tố ác tính là 270, quá trình ñiều trị thử nghiệm ñã ñược tiến hành từ năm 1985 ñến 1993 Kết quả cuối cùng cho thấy, có 16% bệnh nhân ñáp ứng, trong ñó có 6% bệnh nhân ñáp ứng hoàn toàn Sau 5 năm ñiều trị, 28 bệnh nhân (10%) ñã ñược xác ñịnh khỏi bệnh

* Ung thư thận (kidney cancer):

Thận là một phần trong hệ tiết niệu Chức năng chính của nó là lọc máu và sản xuất nước tiểu ñể loại bỏ chất thải ra ngoài cơ thể Khi ung thư thận phát triển, nó có thể xâm lấn vào các cơ quan ở gần thận như gan, ñại tràng, hoặc tuyến tụy Tế bào ung thư thận có thể tách khỏi khối u ban ñầu và di căn tới các bộ phận khác của cơ thể Các triệu chứng của ung thư thận là ñi tiểu ra máu, có khối u ở vùng thận Các triệu chứng

ít gặp hơn như mệt mỏi, chán ăn, ñau ở vùng thắt lưng không khỏi, sốt lặp ñi lặp lại nhiều lần Ung thư thận tăng lên theo ñộ tuổi, bệnh thường xuất hiện nhiều nhất là trong ñộ tuổi 50 - 70 Bệnh xảy ra ở nam giới nhiều gấp ñôi nữ giới Nguyên nhân của ung thư thận là do ñột biến gen, sử dụng thuốc lá, béo phì, sự phơi nhiễm trong nghề nghiệp, tia xạ… Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới, mỗi năm Mỹ có khoảng 31.200 trường hợp ung thư thận ñược phát hiện, trong ñó 11.900 trường hợp tử vong (năm 2006) [59] và số liệu mới nhất năm 2011 tính ñến thời ñiểm này ở Mỹ có 60.920

người mắc mới và 13.120 người chết do ung thư thận [58] Mặc dù ở Việt Nam chưa

cĩ số liệu thống kê đầy đủ nhưng ung thư thận được xếp hàng thứ 3 trong các loại ung thư của hệ tiết niệu Hiện nay, ung thư thận được điều trị chủ yếu bằng hormone, hĩa chất, liệu pháp miễn dịch

Ung thư thận khơng phải là một bệnh khơng thể điều trị, tuy nhiên nếu khơng được phát hiện và chẩn đốn sớm bệnh sẽ để lại những hậu quả nghiêm trọng Năm

1992, FDA đã cho phép sử dụng IL-2 trong điều trị ung thư thận bằng liệu pháp miễn dịch Việc điều trị bệnh ung thư thận dựa trên sản phẩm IL-2 cĩ thể điều trị riêng lẻ hoặc kết hợp với các phương pháp điều trị ung thư khác cũng như là với các cytokine khác Tuy nhiên, hiệu quả điều trị tăng lên rõ rệt khi kết hợp giữa IL-2 với IFN-α Khi nghiên cứu thử nghiệm sự kết hợp của IL-2 với IFN-α trên 425 bệnh nhân ung thư thận, Negrier và cộng sự đã nhận thấy, việc điều trị kết hợp liều IL-2 (18 x 106 IU/mg/ngày) với liều IFN (6 x 106 IU) cho đáp ứng tốt hơn 2,86 lần khi điều trị chỉ bằng IL-2 cùng liều lượng Hiện nay, liệu pháp điều trị ung thư thận bằng IL-2 vẫn được áp dụng rộng rãi trên thế giới

Ngồi hai ứng dụng chính của 2 trong điều trị ung thư thận và u hắc tố da,

IL-2 cịn được sử dụng trong hỗ trợ điều trị cho các bênh nhân HIV Việc điều trị bệnh nhân HIV bằng IL-2 giúp hoạt hĩa kích thích tố miễn dịch, chủ yếu là tế bào T-CD8+

và NK để giải phĩng ra các chemokine ức chế HIV và các yếu tố CD8 ức chế virus (CAF) Ngồi ra, bằng việc điều trị kéo dài theo từng đợt, IL-2 cĩ thể hồi phục được số lượng của tế bào CD4+ bị thiếu hụt trong quá trình lây nhiễm HIV Hiệu ứng tiền viêm

Ung thư thận

Hình 5 Ung thư thận

của IL-2 giúp giải phóng các cytokine khác như TNF-α, IL-1, INF-α … Hiệu ứng này

có thể coi là hiệu ứng không mong muốn nhưng ñổi lại là khả năng tạo ra hiệu ứng kháng virus của tế bào CD8 Thêm vào ñó, IL-2 còn giúp tăng sinh dòng tế bào CD4+ không bị nhiễm HIV, kéo dài thời gian sống cho bệnh nhân

* Một số phản ứng phụ khi sử dụng IL-2 tái tổ hợp

IL-2 là một protein nên trong ñiều trị không thể chế ở dạng thuốc viên vì nếu ñiều chế ở dạng thuốc viên uống thì khi vào trong cơ thể IL-2 sẽ bị tiêu hóa và mất tác dụng Do ñó, IL-2 ñược ñiều chế dưới dạng thuốc tiêm và tiêm vào cơ thể, có thể tiêm dưới da hoặc tiêm tĩnh mạch Qua một số thống kê gần ñây thì khi ñiều trị bằng IL-2

có thể gây ra những phản ứng phụ thông thường như: giảm huyết áp, buồn nôn, tiêu chảy, chứng thở gấp, bệnh phù phổi, yếu thận, chứng sốt phát ban, chứng rùng mình, cảm giác khó chịu trong người ðặc biệt, ñối với những bệnh nhân có vấn ñề về tim mạch khi sử dụng liều cao IL-2 cần có sự giám sát chặt chẽ của bác sĩ ñể theo dõi các phản ứng phụ có thể xảy ra Tuy nhiên, với kết quả mà IL-2 có ñược thì IL-2 vẫn là nguồn sáng duy nhất cho các bệnh nhân ung thư

2.3.4 Các nghiên cứu và ứng dụng IL-2 trong ñiều trị ung thư trên thế giới và Việt Nam

Theo báo cáo của Liên hợp quốc ñưa ra ngày 14-9, tại Diễn ñàn khoa học năm

2010 trong thập kỷ vừa qua số người mắc bệnh ung thư ñã tăng lên 20%

Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), bệnh ung thư ñã gây tử vong cho 7,1 triệu người hàng năm, chiếm 12,5% tổng số người bị chết hàng năm trên toàn cầu và lớn hơn cả tổng số người chết vì các bệnh HIV/AIDS, lao, và sốt rét cộng lại Trong ñó, thuốc lá là thủ phạm gây ra bệnh ung thư lớn nhất, gây ra tới 30% số người chết vì bệnh ung thư trên thế giới

Với tốc ñộ tăng như hiện nay, WHO dự báo số người mắc bệnh ung thư trên thế giới sẽ tăng từ 10 triệu người năm 2000 lên tới gần 15 triệu người vào năm 2020 và xấp xỉ 30 triệu người vào năm 2030, trong ñó 60% là ở các nước ñang phát triển [52] Còn ở Việt Nam, theo số liệu công bố tại Hội thảo Quốc gia phòng chống ung thư,

năm 2010 Việt Nam cĩ 126.300 ca mắc mới Số ca ung thư ngày càng tăng cả về số lượng và chủng loại ung thư Vì vậy, việc nghiên cứu về ung thư cũng như liệu pháp điều trị phù hợp vẫn đang là mối quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới

Năm 1987, sản phẩm protein tái tổ hợp IL-2 đã được thử nghiệm vào trong hỗ trợ điều trị ung thư bằng liệu pháp miễn dịch IL-2 đã được FDA cho phép sử dụng trong điều trị ung thư thận, u hắc tố da và hỗ trợ điều trị HIV vào năm 1992 với tên thương mại là Proleukin [55] ðến nay, các nhà khoa học vẫn khơng ngừng nghiên cứu để tăng hiệu quả của IL-2 và phát minh mới nhất hiện nay là kết hợp IL-2 với vaccine trong điều trị ung thư với kết quả thử nghiệm lâm sàng cho thấy hiệu quả tăng lên rõ rệt Sau khi tập đồn Chiron cho ra đời sản phẩm Proleukin, rất nhiều nhà khoa học trên thế giới đã bắt tay vào nghiên cứu nhằm tạo ra sản phẩm IL-2 tái tổ hợp này Cĩ rất nhiều hệ biểu hiện khác nhau được các nhà khoa học

khác nhau lựa chọn để nghiên cứu là E coli, P pastoris, tế bào động vật, Từ đĩ đã cĩ rất

nhiều cơng trình khoa học nghiên cứu về protein IL-2 được cơng bố Cịn ở Việt Nam, do hai loại ung thư thận và u hắc tố da này khơng nằm trong danh sách những căn bệnh ung thu phổ biến nhất nên việc nghiên cứu về hai loại ung thư này cịn khá nhiều hạn chế Vì vậy, hầu hết các bệnh nhân ung thư thận và u hắc tố da đều phải điều trị bằng các loại thuốc nhập khẩu rất đắt tiền, do đĩ rất khĩ khăn cho việc điều trị Tuy nhiên, dựa vào những thành quả khoa học

về protein này, cùng với nhu cầu ngày càng lớn về sinh phẩm interleukin-2, đã cĩ nhiều cơng trình nghiên cứu nhằm tạo ra IL-2 tái tổ hợp với giá thành hợp lý hơn Trong thực tế, đã cĩ một số cơng trình nghiên cứu thành cơng và chuyển giao cho các cơng ty để sản xuất ra được sản phẩm IL-2 thương phẩm Sản phẩm IL-2 thương phẩm đã thể hiện được tính ưu việt của một liệu pháp miễn dịch nên được sử dụng ngày càng nhiều trong điều trị bệnh ung thư và bổ trợ điều trị cho các bệnh khác cần tăng cường hệ miễn dịch Tuy nhiên, trong thực tế, khơng chỉ cĩ IL-2 tái tổ hợp mà hầu hết các sinh phẩm tái tổ hợp nĩi chung vẫn chưa thể tự sản xuất tại Việt Nam Hầu hết các sản phẩm đĩ đều nhập ngoại với giá thành cao Sản phẩm IL-2 tái

tổ Proleukin do tập đồn Chiron sản xuất hiện nay bán khá đắt với giá 680 USD/mg ðây cũng chính là lý do lý giải cho việc sử dụng liệu pháp điều trị miễn dịch như IL-2 tái tổ hợp vẫn cịn bị bỏ ngỏ Xuất phát từ thực tế đĩ, hiện nay, IL-2 tái tổ hợp đã được các nhà nghiên cứu của Viện Cơng nghệ sinh học biểu hiện thành cơng IL-2 bằng cơng nghệ DNA tái tổ hợp [7] ðây là một nghiên cứu vơ cùng quan trọng trong Y - Dược nhằm tạo ra được sản phẩm IL-2 cho điều trị ung thư thận, u hắc tố da và hỗ trợ điều trị HIV tại Việt Nam [56]

2.3.5 Lên men sản xuất protein tái tổ hợp và hệ thống lên men Bioflo 110

* Lên men sản xuất protein tái tổ hợp

Lên men nuôi cấy vi sinh vật sản xuất protein tái tổ hợp là quá trình nuôi cấy vi sinh vật trong một môi trường dinh dưỡng và ñiều kiện phù hợp ñể vi sinh vật sinh trưởng, phát triển tạo sản phẩm protein tái tổ hợp mong muốn Sản xuất protein tái tổ hợp là quá trình ñưa một gen vào trong một vi sinh vật ñể vi sinh vật tổng hợp ra sản phẩm protein mong muốn Các sản phẩm protein tái tổ hợp ñược tạo ra hiện nay là interferon, insulin, albumin huyết thanh người, factor VIII, factor IX, epidermal growth factor, somatostatin bò, chymosin bò, IL-2, Quá trình lên men sản xuất protein tái tổ hợp ñòi hỏi các yếu tố như tiết protein mong muốn, tối thiểu việc phân hủy sản phẩm mong muốn và luôn kiểm soát ñược toàn bộ quá trình tổng hợp trong thời gian lên men Tùy từng loại protein và mục ñích nghiên cứu mà các nhà khoa học lựa chọn các chủng vi sinh vật chủ khác nhau Hiện nay có rất nhiều chủng vi

sinh vật ñược lựa chọn cho sản xuất protein tái tổ hợp như E coli, nấm men Pichia pastoris, Saccharomyces, Bacilus subtilis, tế bào ñộng vật, Trong ñó, chủng E coli

là chủng ñược lựa chọn nhiều hơn cả vì rất nhiều lợi ích: sinh trưởng nhanh trong môi trường nuôi cấy ñơn giản và rẻ tiền, cho sinh khối cao, Tuy nhiên, với bất kỳ một chủng nuôi cấy nào, ñể tạo ñược sản phẩm protein mong muốn với hiệu suất cao cần phải có quá trình tối ưu ñiều kiện nuôi cấy trước khi ñưa vào sản xuất thử nghiệm ở quy mô lớn Trong quá trình lên men, có rất nhiều yếu tố quyết ñịnh ñến hiệu suất lên men và chất lượng sản phẩm lên men như: môi trường dinh dưỡng, lượng oxy hòa tan trong môi trường, nhiệt ñộ và pH trong quá trình nuôi cấy, thời gian nuôi cấy, [34] Vì vậy, ñể tối ưu ñược các ñiều kiện chuẩn trên cần có một hệ thống lên men trong ñó các thông số và diễn biến của quá trình lên men ñược kiểm soát chặt chẽ Nhằm ñảm bảo ñiều này chúng tôi ñã sử dụng hệ thống lên men Bioflo

110, với hệ thống này các thông số của quá trình lên men ñều ñược kiểm soát chặt chẽ qua hệ thống máy tính giúp cho việc theo dõi diễn tiến của quá trình lên men ñược ñảm bảo Từ ñó giúp chúng ta dễ dàng theo dõi tiến trình lên men và có biện pháp xử lý kịp thời khi có sự cố

* Hệ thống lên men Bioflo 110

4: ðo lường và kiểm soát CO2

11: Bình dung dịch (axit hoặc bazơ hoặc môi trường mới)

Hình 6 Hệ thống lên men Bioflo

Hệ thống lên men Bioflo 110 là một hệ thống lên men tự ñộng với dung tích 4 ñến 10 lít ñược sử dụng cho lên men nuôi cấy tế bào ñộng vật, tế bào thực vật, tế bào côn trùng, nấm men và vi khuẩn Với hệ thống lên men này chúng ta hoàn toàn có thể theo dõi ñược mọi diễn biến của quá trình lên men, nắm ñược các thông số quan trọng như nhiệt ñộ, pH, oxy hòa tan, và dễ dàng thu mẫu cũng như bổ sung thêm nguyên liệu trong quá trình nuôi cấy Nắm bắt ñược các thông số giúp chúng ta kịp thời khắc phục ñược những biến cố xảy ra trong quá trình lên men Vì ñây là hệ thống lên men dung tích lớn, do vậy, ñể ñảm bảo hiệu quả lên men cao ñồng thời tránh lãng phí cho quá trình lên men thì chủng lên men cần ñược nuôi cấy tối ưu trước khi ñưa vào hệ thống lên men Bioflo 110

2.4 Hệ thống tinh chế protein HPLC

HPLC (high-performance liquid chromatography) là hệ thống sắc ký hiện ñại ñược dùng phổ biến trong phân tích, ñịnh lượng và tinh sạch các thành phần riêng biệt trong hỗn hợp ðây là hệ thống tinh sạch protein tự ñộng, ñược kiểm soát bởi máy tính

và có thể thực hiện ñược với nhiều phương pháp sắc ký khác nhau như sắc ký trao ñổi ion, sắc ký ái lực và sắc ký ñảo pha [13] Cơ chế hoạt ñộng của sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp phân tách trong ñó pha ñộng là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn ñã ñược phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang ñã ñược biến ñổi bằng liên kết hoá học với các nhóm chức hữu cơ Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết ñịnh bản chất của quá trình sắc ký và loại sắc ký Nguyên lý hoạt ñộng của sắc ký, nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ pha thuận hoặc pha ñảo Nếu pha tĩnh là chất trao ñổi ion thì ta có sắc ký trao ñổi ion, còn nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc ký phân bố hay sắc ký chiết

Với sắc ký ñảo pha trong HPLC hoạt ñộng dựa vào ñộ mạnh của các tương tác

kỵ nước của mỗi thành phần trong hỗn hợp với bề mặt kị nước của chất giá trong cột Thu mẫu dựa vào ñộ mạnh của dung môi hữu cơ ở pha ñộng [40] Tùy từng loại protein mà lựa chọn cột tinh sạch trong sắc ký ñảo pha, thông thường với các peptide

và protein thì thường sử dụng cột là các pha có gắn C3, C4, phenyl, C8 và C18 Với các peptide có nguồn gốc từ sự thủy phân enzyme hay các protein có khối lượng phân tử cao thì thường sử dụng cột có gắn các gốc C8 hoặc C18 Sử dụng sắc ký ñảo pha cho tinh sạch protein có một số hạn chế là làm biến tính protein và phá hủy hoạt tính sinh học của chúng Tuy nhiên, trong một vài trường hợp ñây vẫn là phương pháp lí tưởng

cho tinh sạch các protein từ E coli

2.5 Thử hoạt tính sinh học của interleukin-2 trên dòng tế bào CTLL2

Nuôi cấy tế bào ñộng vật ñã ñược thực hiện từ những năm ñầu của thế kỷ 19 và trở thành các kỹ thuật thường quy trong phòng thí nghiệm cho các nghiên cứu khoa học ðến nay công nghệ tế bào ñộng vật có rất nhiều ứng dụng có ý nghĩa khoa học và thực tiễn Một trong những ứng dụng quan trọng của nó là trong lĩnh vực ung thư học, các

tế bào ñộng vật nuôi cấy in vitro, ñặc biệt là các dòng tế bào ung thư liên tục là mô

hình hiệu quả cho các thử nghiệm sinh học (bioassay) nhằm tìm kiếm hoạt chất phòng

Hình 7 Hệ thống tinh chế protein HPLC

chống (chemoprevention) và chữa trị ung thư (chemotherapy) [3] Hiện nay có rất nhiều dòng tế bào, mỗi dòng ñược sử dụng cho các phép thử sinh học khác nhau Dòng

tế bào CTLL2 là một dòng tế bào Tc của chuột nhắt có sinh trưởng phụ thuộc vào interleukin-2 Vì vậy, dòng tế bào này thường ñược sử dụng ñể ñánh giá hoạt tính sinh học của interleukin-2 [3] Nguyên lý của phương pháp này là khi môi trường nuôi cấy dòng tế bào CTLL2 khi không ñược bổ sung IL-2 thì tế bào sẽ chết trong khoảng 24-

48 giờ Khi ñược bổ sung IL-2 vào môi trường nuôi cấy dòng tế bào CTLL2 thì tùy thuộc vào hoạt tính của IL-2 mà tế bào CTLL2 sẽ duy trì sự sống và ñược kích hoạt ñể phát triển và sinh sản Hoạt tính của IL-2 càng mạnh thì khả năng hoạt hóa sự phát triển và sinh sản của tế bào CTLL2 càng tốt Dựa vào ñặc tính này, chúng tôi ñã lựa chọn dòng tế bào CTLL-2 ñể dùng cho kiểm tra hoạt tính sinh học của protein tái tổ hợp IL-2 sau khi tinh sạch

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu

3.1.1 Các chủng vi sinh vật, plasmid và tế bào CTLL2

- Chủng vi khuẩn E coli DH5α ñược sử dụng làm chủng tách dòng

- Chủng vi khuẩn E coli BL21 ñược sử dụng làm chủng biểu hiện

- Plasmid pJET1/Blunt do hãng Fermentas sản xuất ñược sử dụng làm vector tách

dòng trong tế bào E coli DH5α

- Plasmid pET22b(+) do hãng Novagen sản xuất ñược sử dụng làm vector biểu

hiện trong tế bào E coli BL21 (DE3)

- Nguồn tế bào CTLL2 ñược mua từ ngân hàng tế bào Hoa Kỳ ATCC và ñược sử dụng ñể ñánh giá hoạt tính sinh học của sản phẩm IL-2

3.1.2 Hoá chất, enzym, máy móc và thiết bị

- Hóa chất: SDS, Tris-HCl, EDTA (BioLabs, Mỹ); Phenol, Chloroform, isoamylalcohol, EtBr, Glycerol, Ethanol, Ampicillin, Acrylamide, Temed, APS(amonium per sulfate) (Merck, ðức); Agar (Fluka, ðức); d-NTP (Fermentas, Mỹ);

- Enzyme: Các loại enzyme hạn chế, Vent DNA polymerase (Fermentas, Mỹ);

NotI, NdeI, PstI (BioLabs, Mỹ);

- Máy móc và thiết bị: Máy PCR (MJ Research, Mỹ), máy ly tâm lạnh (Sorvall RC5B, Mỹ); máy ñiện di DNA, máy UV (Bio-Rad, Mỹ); máy lắc ổn nhiệt (New Jersey, Mỹ); tủ ấm 37oC; hệ thống sắc ký lỏng cao áp HPLC; máy lắc nuôi vi sinh vật; bình tam giác các loại; máy ñiện di protein và bổ chuyển màng Westrn blot (BioRad, Mỹ); máy lắc ổn nhiệt (New Jersey, Mỹ); máy quang phổ (Shimadzu, Nhật); máy soi gel; máy ảnh kỹ thuật số; các loại tủ lạnh -80oC; -20oC; tủ mát; máy siêu âm phá tế bào; cột sắc ký HPLC (Amersham Bioscience, Mỹ); hệ thống sắc ký HPLC (Shimadzu, Nhật)

3.1.1 Các dung dịch sử dụng và môi trường nuôi cấy

3.1.1.1 Môi trường nuôi cấy và dung dịch sử dụng trong nuôi cấy chủng E coli biểu

hiện IL-2

- Môi trường Luria-Bertani (LB): Cao nấm men (0,5 %), Bacto trypton (1%), NaCl (1%)

- Môi trường chọn lọc LBA lỏng: Thành phần gồm môi trường LB, bổ sung Ampicillin ñể ñạt nồng ñộ cuối cùng là 100 µg/ml

- Môi trường LB ñặc: Thành phần như môi trường LB bổ sung thêm 1,5% agar

- Môi trường chọn lọc LBA ñặc: Thành phần như môi trường LB ñặc có bổ sung Ampicillin ñến nồng ñộ cuối cùng 100 µg/ml

- Môi trường M9 có thành phần trong bảng dưới ñây

hiện tượng cháy

bởi nhiệt

3.1.1.2 Các dung dịch ñược dùng trong ñiện di protein trên gel polyacrylamide

- Bis-acrylamide 30%: cân 30 g acrylamide 99% và 0,8 g bis-acrylamide, hòa tan trong 100 ml nước cất vô trùng, bảo quản ở 4oC

- ðệm Tris 1,5M (pH 8,8): Tris 0,75 M; 0,2% SDS, dùng HCl ñể chỉnh pH ñến 8,8

- ðệm Tris 0,5M (pH 6,8): Tris 0,25 M; 0,2% SDS, dùng HCl ñể chỉnh pH ñến 6,8

- SDS 10% (100 ml): cân 10 g SDS và bổ sung nước cất tới thể tích 100ml

- ðệm chạy ñiện di: Tris 0,05 M; glycin 0,192 M; 0,1% SDS

- Dung dịch nhuộm gel (100 ml): 0,025 g coomassie brillian blue; 40 ml methanol; 10 ml acetic acid

- Dung dịch rửa gel: 5 ml methanol; 7,5 ml acetic acid; bổ sung nước cất tới thể tích 100 ml

- APS 10%: cân 10 g amonium persulfate hòa vào 100 ml nước cất

- TEMED: sử dụng dung dịch từ công ty hóa chất

- ðệm xử lý mẫu 6x: 7 ml Tris-HCl 1M (pH 6,8); 3 ml glycerol 100%; 1 g SDS; 0,6 ml 2-mercapto-ethanol; 1,2 mg bromophenol

3.1.1.3 Các dung dịch ñược dùng trong western blotting

- Dung dịch blotting 10x (1 lít): cân 30 g Tris; 144,13 g glycine

- Dung dịch blotting 1x (1 lít): 100 ml blotting 10x; 200 ml methanol; 700 ml H2O

- Dung dịch TBS 1x (1 lít): 25 ml Tris-HCl 1 M, pH 7,5; 10 ml NaCl 5 M

- Dung dịch TTBS 1x: sử dụng dung dịch TBS 1x bổ sung 0,01 % Tween-20

- Dung dịch sữa skim milk 5%: cân 5 g sữa skim milk, bổ sung 100 ml TBS 1x

3.1.1.4 Các dung dịch và hóa chất dùng trong biến tính và tinh sạch IL-2

- Nước khử Ion, guanidine hydrochloride (Gnd-HCl) 8M, Tris-HCl 50 mM, pH

8, EDTA 10 mM, pH 8, DTT, ñường succrose 60%, PMSF, TritonX-100

- ðệm biến tính protein: 0,125 M Tris-Cl; 4% SDS; 20% glycerol; 0,2 M DTT; 0,02% bromophenol blue, pH 6,8

- Dung dịch nhuộm protein: 0,025% coomassie brilliant blue R-250; 40% methanol; 7% acetic acid

- Dung dịch rửa gel polyacrylamide: 40% methanol; 7% axit acetic

- ðệm chạy mẫu trên hệ thống HPLC: ñệm A (0.5% Citric acid); ñệm B (0,5% citric acid, 60% isopropanol)

3.2.1 Lên men tạo sản phẩm IL-2 với dòng tế bào E coli

Nguyên lý: Tế bào E coli mang gen tổng hợp IL-2 ñược cấy trên môi trường LB

lỏng có bổ sung kháng sinh ampicillin, nuôi lắc ở 37oC, 200 vòng/phút Dưới hoạt

ñộng của chất cảm ứng IPTG, protein IL-2 ñược tổng hợp sau 5 giờ cảm ứng

- Tiếp theo tiến hành cảm ứng với IPTG có nồng ñộ cuối cùng là 0,1 mM tại 37oC

- Tiến hành thu các mẫu thời ñiểm 5 giờ sau cảm ứng và ñiện di kiểm tra các mẫu này trên gel polyacrylamide 12,6%

3.2.2 Phương pháp ñiện di protein trên gel polyacrylamide – SDS

Nguyên lý:

ðiện di là một quá trình di chuyển của các phân tử tích ñiện qua mạng lưới dưới tác dụng của một ñiện trường Các phân tử di chuyển với tốc ñộ khác nhau tùy