Nghiên cứu bệnh xoăn vàng lá cà chua vụ thu đông năm 2010 tại hà nội và vùng phụ cận

Xác định phổ ký chủ của bệnh xoăn vàng lá cà chua và giám định virus gây bệnh bằng phương pháp cây chỉ thị.... Do đó, việc tiến hành các nghiên cứu về virus xoăn vàng lá cà chua và biện

Bộ giáo dục và đào tạo trường đại học nông nghiệp hà nội

-

Nguyễn thị liễu

Nghiên cứu bệnh xoăn vàng lá cà chua

vụ thu đông năm 2010 tại hà nội và

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng, toàn bộ số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chưa từng được sử dụng để bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn này đã được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày 20 tháng 11 năm 2011

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Liễu

đỡ tôi được tiếp cận với những kiến thức trong thời gian học tập tại trường

Trong suốt quá trình học tập, ngoài sự nỗ lực của bản thân, tôi còn nhận được sự giúp đỡ của các tập thể, cá nhân trong và ngoài trường

Để hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô trong Viện nghiên cứu rau quả Hà Nội, Trung tâm bệnh cây nhiệt đới, Bộ môn Bệnh cây trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, mà trực tiếp là

cô giáo PGS.TS Ngô Bích Hảo

Sau khi hoàn thành luận văn, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới nhà trường, các thầy cô giáo, các cơ quan, bạn bè đồng nghiệp cùng người thân đã động viên và tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và nghiên cứu thực hiện đề tài

Hà Nội, ngày 20 tháng 11 năm 2011

Tác giả

Nguyễn Thị Liễu

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC HÌNH viii

DANH MỤC BIỂU ĐỒ ix

PHẦN I: MỞ ĐẦU 1

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.2 MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU CỦA ĐỀ TÀI 3

1.2.1 Mục đích 3

1.2.2 Yêu cầu 4

PHẦN II: TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 5

2.1 NHỮNG NGHIÊN CỨU Ở NƯỚC NGOÀI 5

2.1.1 Tình hình nghiên cứu bệnh virus hại cà chua trên thế giới 5

2.1.2 Những nghiên cứu về TYLCV (Tomato yellow leaf curl virus) 5

2.1.3 Những nghiên cứu về ToMV (Tomato mosaic virus) 11

2.2 NHỮNG NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC 13

PHẦN III: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

3.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu 17

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 17

3.1.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 17

3.2 Vật liệu nghiên cứu 17

3.3 Nội dung nghiên cứu 18

3.4 Phương pháp nghiên cứu 18

3.4.1 Phương pháp điều tra diễn biến tỷ lệ bệnh và mật độ bọ phấn trên đồng ruộng 18

3.4.2 Phương pháp thu mẫu nghiên cứu 19

3.4.3 Xác định phổ ký chủ của bệnh xoăn vàng lá cà chua và giám định virus

gây bệnh bằng phương pháp cây chỉ thị 19

3.4.4 Khảo sát hiệu quả của sử dụng bẫy dính màu vàng đối với phòng trừ bệnh xoăn vàng lá cà chua 22

3.4.5 Khảo sát hiệu quả của sử dụng thuốc hóa học đối với phòng trừ bệnh xoăn vàng lá cà chua 22

3.4.6 Phương pháp bố trí thí nghiệm đồng ruộng 23

3.4.7 Giám định virus gây bệnh bằng phương pháp PCR 23

3.4.7.1 Chiết DNA tổng số từ mẫu mô thực vật 24

3.4.7.2 Tiến hành phản ứng PCR 25

3.4.7.3 Điện di sản phẩm PCR: 26

PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

4.1 Kết quả điều tra trên đồng ruộng 27

4.1.1 Mô tả triệu chứng ngoài đồng ruộng 27

4.1.2 Kết quả điều tra tình hình bệnh xoăn vàng lá cà chua và mật độ bọ phấn trên đồng ruộng hại cà chua vụ thu đông năm 2010 tại Hà Nội và phụ cận 34

4.1.2.1 Tình hình bệnh xoăn vàng lá cà chua thu đông 2010 tại Hà Nội và vùng phụ cận 34

4.1.2.2 Diễn biến bệnh xoăn vàng lá và mật độ bọ phấn trên giống cà chua HT25 và VL2000 vụ cà chua thu đông năm 2010 tại xã Đa Tốn – Gia Lâm – Hà Nội 36

4.1.2.3 Diễn biến của bệnh xoăn vàng lá và mật độ bọ phấn trên giống cà chua lai F1 và Mec 89 vụ cà chua thu đông năm 2010 tại xã Dương Xá – Gia Lâm – Hà Nội 38

4.1.2.4 Diễn biến bệnh xoăn vàng lá và mật độ bọ phấn trên giống cà chua P375 và Hồng Châu vụ cà chua thu đông năm 2010 tại xã Đặng Xá – Gia Lâm – Hà Nội 41

4.1.2.5 Diễn biến bệnh xoăn vàng lá cà chua trên tập đoàn giống cà chua năng suất cao tại khoa Nông học – Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội vụ cà chua thu đông năm 2010 44

4.1.2.6 Diễn biến bệnh xoăn vàng lá trên tập đoàn giống cà chua quả nhỏ tại khoa Nông học – Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội vụ cà chua thu đông

năm 2010 47

4.1.2.7 Diễn biến bệnh xoăn vàng lá trên tập đoàn giống cà chua tại Viện nghiên cứu rau quả - Gia Lâm - Hà Nội vụ cà chua thu đông năm 2010 49

4.2 Kết quả phòng trừ bệnh xoăn vàng lá cà chua bằng bẫy dính màu vàng và biện pháp hoá học 51

4.2.1 Diễn biến mật độ bọ phấn vào bẫy dính màu vàng trên giống cà chua HT156 tại Viện nghiên cứu rau quả - Gia Lâm – Hà Nội vụ cà chua thu đông năm 2010 51

4.2.2 Kết quả phòng trừ bệnh xoăn vàng lá cà chua bằng biện pháp hoá học và bẫy dính màu vàng trên giống cà chua P375 vụ thu đông năm 2010 55

4.2.2.1 Diễn biến mật độ bọ phấn vào bẫy dính màu vàng trên giống cà Chua P375 tại khu trồng rau Quảng An- Tây Hồ – Hà Nội vụ cà chua thu đông năm 2010 55

4.2.2.2 Diễn biến bệnh xoăn vàng lá và mật độ bọ phấn giữa các công thức phòng trừ bệnh trên giống cà chua P375 tại Quảng An – Tây Hồ – Hà Nội vụ thu đông năm 2010 59

4.2.2.3 Thành phần côn trùng vào bẫy dính màu vàng tại ruộng cà chua giống P375 tại Quảng An – Tây Hồ – Hà Nội vụ thu đông năm 2010 64

4.3 Kết quả lây nhiễm nhân tạo xác định ký chủ phụ của bệnh xoăn vàng lá cà chua 65

4.4 Kết quả kiểm tra PCR các mẫu cà chua thu thập ngoài đồng ruộng năm 2010 69

PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 74

5.1 Kết luận 74

5.2 Đề nghị 75

TÀI LIỆU THAM KHẢO 76

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 Đặc điểm triệu chứng bệnh virus gây hại cà chuavụ thu đông 2010 tại

Hà Nội và vùng phụ cận 28 Bảng 2 Tỷ lệ các loại hình triệu chứng bệnh virus gây hại cà chua vụ thu đông 2010 tại Hà Nội và vùng phụ cận 31 Bảng 3 Tỷ lệ bệnh xoăn vàng lá cà chua vụ thu đông 2010 tại Hà Nội và vùng phụ cận 35 Bảng 4: Diễn biến bệnh xoăn vàng lá và mật độ bọ phấn trên giống cà chua HT25

và VL2000 vụ thu đông năm 2010 tại xã Đa Tốn – Gia Lâm – Hà Nội 36 Bảng 5: Diễn biến bệnh xoăn vàng lá và mật độ bọ phấn trên giống cà chua lai F1 và giống Mec – 89 vụ thu đông năm 2010 tại xã Dương Xá – Gia Lâm –

Hà Nội 39 Bảng 6: Diễn biến bệnh xoăn vàng lá và mật độ bọ phấn trên giống cà chua P375 và Hồng Châu vụ thu đông năm 2010 tại xã Đặng Xá – Gia Lâm – Hà Nội 42 Bảng 7: Diễn biến bệnh xoăn vàng lá trên tập đoàn giống cà chua năng suất cao tại khoa Nông học – Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội vụ cà chua thu đông năm 2010 45 Bảng 8: Diễn biến bệnh xoăn vàng lá trên tập đoàn giống cà chua quả nhỏ tại khoa Nông học – Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội vụ cà chua thu đông năm 2010 48 Bảng 9: Diễn biến bệnh xoăn vàng lá trên tập đoàn giống cà chua trồng tại Viện Nghiên cứu Rau quả vụ thu đông năm 2010 50 Bảng 10: Diễn biến mật độ bọ phấn vào bẫy dính màu vàng và tỷ lệ bệnh trên giống cà chua HT156 tại Viện nghiên cứu rau quả - Gia Lâm – Hà Nội vụ thu đông năm 2010 52 Bảng 11: Diễn biến mật độ bọ phấn vào bẫy dính màu vàng và tỷ lệ bệnh trên giống cà chua P375 tại Quảng An – Tây Hồ– Hà Nội vụ cà chua thu đông năm 2010 56

Bảng 12: Diễn biến bệnh xoăn vàng lá và mật độ bọ phấn giữa các công thức phòng trừ bệnh trên giống cà chua P375 tại Quảng An – Tây Hồ – Hà Nội vụ thu đông năm 2010 61 Bảng 13: Thành phần côn trùng vào bẫy dính màu vàng 65 Bảng 14: Kết quả lây nhiễm nhân tạo xác định ký chủ phụ của bệnh xoăn vàng lá cà chua 66 Bảng 15: Kết quả kiểm tra PCR phát hiện begomovirus trên cà chua thu thập ngoài đồng ruộng năm 2010 69

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1: Triệu chứng trên giống P375 taị Quảng An – Tây Hồ – Hà Nội 29 Hình 2: Triệu chứng trên giống Méc 89 tại xã Dương Xá – Gia Lâm – Hà Nội 29 Hình 3: Triệu chứng trên giống HT25 tại xã Đa Tốn – Gia Lâm – Hà Nội 30 Hình 4 :Triệu chứng trên giống Hồng Châu tại Đặng Xá- Gia Lâm – Hà Nội 30 Hình 5: Treo bẫy vàng trong nhà lưới số 4 – Viện nghiên cứu rau quả 55 Hình 6 Treo bẫy vàng ngoài ruộng trồng cà chua P375 tại Quảng An–Tây Hồ– Hà Nội 58 Hình 7 Bố trí thí nghiệm trồng các loại cây lây bệnh 68 Hình 8 Lây bệnh nhân tạo cho cây cà chua bằng phương pháp Agronilation68 Hình 9 Lây bệnh nhân tạo cho cây cà chua bằng bọ phấn 68 Hình 10: Kết quả xác định Begomovirus bằng cặp mồi BegoAFor1/BegoARev1 giếng số 1 đến giếng số 24 tương ứng là các mẫu theo thứ tự trong bảng 15 .71 Hình 11 : Kết quả kiểm tra PCR bằng cặp mồi TYF1/TYR1 (đặc hiệu TYLCVNV 72 Hình 12: cặp mồi ToF2/ToR2 (đặc hiệu ToLCVV) M là thang DNA (GeneRuler 1 kb, Fermentas) 72

Đồ thị 4: Diễn biến bệnh xoăn vàng lá và mật độ bọ phấn trên giống cà chua P375 và giống Hồng Châu vụ thu đông năm 2010 tại xã Đặng Xá – Gia Lâm – Hà Nội 43

Đồ thị 5: Diễn biến mật độ bọ phấn vào bẫy dính màu vàng và tỷ lệ bệnh trên giống cà chua HT156 tại Viện nghiên cứu rau quả - Gia Lâm – Hà Nội vụ thu đông năm 2010 53

Đồ thị 6: Diễn biến mật độ bọ phấn vào bẫy dính màu vàng và tỷ lệ bệnh trên giống cà chua P375 tại Quảng An – Tây Hồ – Hà Nội vụ thu đông năm 2010 57

Đồ thị 7: Diễn biến bệnh xoăn vàng lá và mật độ bọ phấn giữa các công thức phòng trừ bệnh trên giống cà chua P375 tại Quảng An – Tây Hồ – Hà Nội vụ thu đông năm 2010 62

PHẦN I

MỞ ĐẦU

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây cà chua (Lycopersion esculentum Mill.), thuộc họ cà (Solanaceae)

có nguồn gốc ở Trung Mỹ và Nam Châu Mỹ Cây cà chua được phát hiện vào thế kỷ thứ XVI Cà chua là cây có giá trị dinh dưỡng, giá trị kinh tế cao, được nhiều nước xếp vào loại cây chiếm vị trí hàng đầu trong ngành sản xuất rau Hiện nay, cà chua là loại rau ăn quả được trồng và sử dụng phổ biến trên thế giới Về sản lượng, cà chua chiếm 1/ 6 sản lượng rau hàng năm trên thế giới [30] Diện tích trồng cà chua hàng năm trung bình 2,5 triệu ha, đứng ở vị trí thứ hai sau khoai tây Châu Á đứng đầu về sản lượng cà chua, sau đó là Châu

Âu, riêng ở Mỹ đứng đầu về cả năng suất và sản lượng Hy Lạp là nước đứng thứ hai về năng suất, Italia đứng vị trí thứ ba [7]

Cà chua là nguồn cung cấp vitamin A và vitamin C quan trọng, là loại rau được sử dụng ở nhiều phương thức như ăn tươi, nấu chín, làm salat Đặc biệt, cà chua chế biến dạng bột, cà chua cô đặc, tương cà chua, nước uống cà chua là các mặt hàng có giá trị dinh dưỡng, mang lại hiệu quả kinh tế cao Ngoài giá trị về dinh dưỡng, cà chua còn có giá trị kinh tế và giá trị sử dụng cao so với nhiều loại rau như: cải bắp, su hào, các loại rau họ thập tự khác Theo Wane G.W và Mc Collin (1997), bình quân thu nhập trên 1ha ở

Mỹ như sau: cà chua là 4610 USD, lúa mỳ là 174 USD, lúa nước là 1027 USD và các loại rau khác là 2537 USD

Ở Việt Nam, cà chua được trồng cách đây trên một trăm năm, diện tích

cà chua hàng năm biến động từ 12 – 13 nghìn ha Ở miền Bắc, cà chua được trồng phổ biến ở các tỉnh thuộc đồng bằng sông Hồng như Hải Dương, Hưng Yên, Hà Nội Khu vực đồng bằng Bắc Bộ hình thành ba vụ trồng cà chua,

bao gồm các vụ: vụ Hè thu, vụ Đông xuân, vụ Xuân hè [7] Từ năm 1996 –

2001, diện tích cà chua của nước ta tăng nhanh từ 7.500 ha lên 17.834 ha nhưng năng suất lại thấp và không ổn định từ 151,4 tạ/ ha xuống 151,17 tạ/

ha, so với năng suất trung bình trên thế giới còn thấp chỉ đạt 60 – 65% [1] Theo báo cáo của Cục Nông nghiệp (2005), các tỉnh đồng bằng sông Hồng trồng cà chua cho thu nhập từ 1 – 2 triệu đồng/ sào, trồng cà chua xuân

hè bằng các giống chịu nóng cho thu nhập 4 – 5 triệu đồng/ sào Như vậy cà chua cho thu nhập 120 -140 triệu đồng/ ha gieo trồng Đặc biệt, trong những năm gần đây, nhu cầu rau quả cho tiêu dùng ngày càng tăng, bình quân một người Việt Nam tiêu thụ 71 kg/ người/ năm Các vùng thành thị như Hà Nội, thành phố Hồ Chí Minh mức tiêu thụ lên đến 159 kg/ người/ năm Nhu cầu xuất khẩu các loại rau quả cũng ngày một gia tăng, chỉ tính từ năm 1996 đến năm 2001 Việt Nam đạt tốc độ xuất khẩu tăng tới 30% Năm 2001 đạt 330 triệu USD, gấp 3,6 lần so với năm 1996 Mục tiêu kim ngạch xuất khẩu rau quả của Việt Nam đạt 1 tỷ USD vào năm 2010, trong đó một trong các trọng tâm xuất khẩu là cà chua [2]

Tuy nhiên, thực tế sản xuất cà chua còn gặp rất nhiều khó khăn do chịu tác động của nhiều yếu tố bất lợi, trong đó vấn đề sâu bệnh là nguyên nhân chính làm giảm năng suất, gây thiệt hại về kinh tế cho người nông dân Sâu bệnh hại trên cà chua rất phong phú và phức tạp, cà chua là ký chủ của 499 loài dịch hại khác nhau, trong đó có 52 loài cỏ dại, 10 loài nhện, 203 loài côn trùng, 109 loài nấm, 37 loài vi khuẩn/ phytoplasma 43 loài virus/ viroid 42 loài tuyến trùng, 2 loài nhuyễn thể và 1 loài động vật có xương sống [35] Theo nghiên cứu tình hình bệnh hại cà chua trong nhà lưới và ngoài đồng ruộng năm 2003 – 2005 tại Hà Nội đã tìm ra được 19 loài gây hại, trong

đó có 2 bệnh do virus, 3 bệnh do vi khuẩn, 11 bệnh nấm, 2 bệnh sinh lý và tuyến trùng Theo thống kê của nghiên cứu trên: bệnh hại do virus chiếm số lượng nhỏ nhất nhưng tỷ lệ lại lên tới 29.38% đối với bệnh xoăn vàng lá cà

chua (Tomato yellow leaf curl virus) [27] Bệnh xoăn vàng lá cà chua là một

trong các bệnh hại chính trên cây cà chua, gây tổn thất lớn về năng suất và phẩm chất cà chua Bệnh làm cho lá cà chua xoăn nhỏ lại, cây gần như không

có quả Thiệt hại 60-70% năng suất, thâm chí thất thu hoàn toàn Bệnh xoăn vàng lá cà chua thường phát sinh và gây hại nặng vào mùa khô, một số vùng như Hà Nội, Hưng Yên, Hải Phòng , đôi khi vẫn thấy bệnh xuất hiện trong mùa mưa nhưng không đại trà như mùa khô Bệnh xoăn vàng lá cà chua ở nước ta không truyền qua hạt giống và sát thương cơ học, bệnh chỉ lan truyền

được duy nhất qua bọ phấn Bemisia spp với tỷ lệ phát bệnh rất cao [20] Bọ phấn (Bemisia spp.) là loài đa thực gây hại trên nhiều loại cây trồng và cỏ dại,

ở nước ta chúng phát triển quanh năm trên đồng ruộng Điều này đã làm cho việc phòng trừ bọ phấn truyền bệnh gặp nhiều khó khăn Viêc sử dụng thuốc hóa học một cách tùy tiện đã làm tăng tính chống thuốc của bọ phấn và gây hại đến sức khỏe của người tiêu dùng cũng như làm ô nhiễm môi trường

Do đó, việc tiến hành các nghiên cứu về virus xoăn vàng lá cà chua và biện pháp phòng trừ bệnh trên đồng ruộng để đảm bảo năng suất và phẩm chất cà chua là cần thiết

Xuất phát từ thực tế và nhu cầu sản xuất, được sự phân công của Bộ môn Bệnh cây, khoa Nông học – trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Ngô Bích Hảo chúng tôi tiến hành đề tài:

“ Nghiên cứu bệnh xoăn vàng lá cà chua vụ thu đông năm 2010 tại Hà Nội và vùng phụ cận”

1.2 MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU CỦA ĐỀ TÀI

1.2.1 Mục đích

Nghiên cứu bệnh xoăn vàng lá cà chua (Tomato yellow leaf curl virus) vụ

thu đông 2010 tại Hà Nội và vùng phụ cận và khảo sát biện pháp phòng trừ

- Xác định ảnh hưởng của bệnh xoăn vàng lá đến năng suất cà chua

- Tìm hiểu phương thức lan truyền và phạm vi ký chủ của bệnh xoăn vàng lá cà chua

- Thử nghiệm biện pháp phòng trừ môi giới bằng thuốc hóa học và bẫy dính màu vàng

PHẦN II TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU

2.1 NHỮNG NGHIÊN CỨU Ở NƯỚC NGOÀI

2.1.1 Tình hình nghiên cứu bệnh virus hại cà chua trên thế giới

Theo nghiên cứu trên thế giới hiện nay đã phát hiện được 977 loài virus khác nhau xếp trong 70 giống [58] Theo Georgen N Agrios [45] tổng số các loài virus phát hiện được khoảng 2000 loài Một phần tư trong tổng số các loài virus phát hiện được có khả năng tấn công và gây hại cho thực vật

Cây cà chua bị nhiều loài dịch hại tấn công, theo số liệu thống kê của CABI, 2005, hiện có 499 loài dịch hại gây hại trên cà chua, trong đó virus có

41 loài Mặc dù chỉ chiếm một phần nhỏ trong tổng số tất cả các loài dịch hại trên cà chua nhưng bệnh hại do virus gây thiệt hại rất lớn cho các vùng trồng

cà chua trên thế giới Chính vì vậy, bệnh virus hại cà chua đã và đang được rất nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm, nghiên cứu về đặc điểm sinh học, sinh thái học cũng như phương thức lan truyền để đưa ra biện pháp phòng trừ hiệu quả nhất

2.1.2 Những nghiên cứu về TYLCV (Tomato yellow leaf curl virus)

+ Vị trí phân loại

Virus có tên khoa học là Tomato yellow leaf curl virus, thuộc họ

Geminiviridae, giống Begomovirus Ngoài ra nó còn có tên khoa học khác là

Tomato yellow leaf curl bigeminivirus, Tomato leaf curl virus, Tobacco leaf curl virus

Tên Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) được đặt ra vào những

năm đầu của thập niên 60 để mô tả một loài virus gây hại trên khoai truyền

qua bọ phấn (Bemisia tabaci) ở Israel [38] Bệnh virus này trở thành một vấn

đề nghiêm trọng về kinh tế khi chúng thường xuyên gây thiệt hại 100% năng

suất của những cánh đồng cà chua vào đầu những năm 70 ở Trung Đông [38] TYLCV được phát hiện ở Đông Nam Á trong những năm đầu của thập niên

80 [37]

Phương pháp phân tích trình tự DNA trở thành phương pháp giám định hiệu quả, cho phép xác định chính xác virus và đánh giá được mối quan hệ của chúng với Isolate TYLCV khác Những virus có trên 90% đồng phân (homology) trong trình tự nucleotide được coi là các chủng của một virus, số đồng phân ít hơn 90% được coi là các loài virus khác nhau [59] Năm 2000,

Ủy ban phân loại virus quốc tế (ICTV) xác định virus TYLCV thuộc giống Begomovirus, họ Geminiviridae

cà đều là ký chủ của virus gây bệnh [38] Giống cà chua thuần (Lycopersicon

esculentum) là ký chủ chính của TYLCV Hầu hết các loài cà chua hoang dại

như Lycopersicon chilense, Lycopersicon hirsutum, Lycopersico peruvianum

và Lycopersicon Pimpinellifolium không có triệu chứng [69] hay miễn dịch

với virus [68] Một số loài cây trồng là phổ ký chủ của virus và có biểu hiện

triệu chứng nghiêm trọng như: cây đậu (Phaseolus vulgaris), cây dã yên thảo (Petunia hybrida), cà độc dược (Datura stramonium) [34] Những loài thực

vật dùng để nuôi bọ phấn như bông và cà tím miễn dịch với virus Một số loài

cây không nhiễm được bằng bọ phấn như Nicotiana benthamiana và

Nicotiana tabacum có thể lây nhiễm bằng cách tiêm các dòng DNA của virus

sử dụng [52]

+ Môi giới truyền bệnh

Theo Cohen S và Harpaz I (1964) thì TYLCV được truyền qua bọ phấn [37], loài côn trùng này xuất hiện rất phổ biến ở vùng nhiệt đới và bán

nhiệt đới Tác giả Limma và cộng sự (2002) cho biết bọ phấn (Besmisia

tabaci) là trung gian truyền bệnh của hơn 60 loài virus thuộc các giống

Geminivirus, Closterovirus, Nepovirus, Calarvirus trong đó Geminivirus là giống virus gây hại nghiêm trọng nhất cho cây trồng [38]

Bọ phấn Besmisia tabaci Genn thuộc họ rầy phấn (Aleyrodidae), bộ

cánh đều (Homoptera)

Theo Gerling và cộng sự (1996) bọ phấn Besmisia tabaci hoàn thành

một vòng đời khoảng 20 – 30 ngày ở điều kiện thích hợp Trung bình có khoảng 11 – 15 lứa/ năm [42] Bọ phấn phát triển mạnh trong điều kiện khô

và nóng, mưa nhiều làm giảm mật độ bọ phấn

Ở Tây Ban Nha, mật độ bọ phấn trên cánh đồng cà chua có 2 đỉnh cao: khoảng tháng 7 – 8 và tháng 1 – 2 năm sau [61]

Murugan (2001) đã đặt bẫy dính bọ phấn theo dõi mật độ bọ phấn trên cánh đồng bông ở Ấn Độ cho thấy đỉnh cao của mật độ bọ phấn khoảng tháng

11 đến tháng 1 năm sau [13]

Bọ phấn có ký chủ rất rộng, ít nhất là 6 họ thực vật [36]

Theo Cuodiet và cộng sự (1985) trên thế giới có khoảng 500 loài cây là

ký chủ của bọ phấn [13]

Cho đến nay trên thế giới có 2 loài bọ phấn được công nhận đó là

Besmisia tabaci và Besmisia argentifolii Loài Besmisia argentifolii được tìm

thấy nhiều ở Mỹ, Nhật, Pháp, Colombia, Israel, Ai Cập, Trung Quốc Sự

khác nhau giữa hai loài B tabaci và B argentifolii được thể hiện là loài B

argentifolii ăn tạp, mắn đẻ hơn, gây rối loạn độc tố cho cây trồng (bạc lá),

đồng thời có dải enzym không đặc hiệu [13]

+ Mối quan hệ giữa Vectơ và virus

TYLCV được truyền qua bọ phấn theo phương thức bền vững Khoảng thời gian truyền hiệu quả từ 15 – 30 phút, giai đoạn tiềm ẩn từ 8 – 24 giờ (thời gian để virus nâng cao nồng độ trong cơ thể bọ phấn) và thời gian nhiễm hiệu quả ít nhất là 15 phút [68] Thời gian chích hút của bọ phấn dài hơn thời gian truyền dịch virus sang cây khoẻ và thời kì tiềm ẩn là 21 giờ [50] Virus có thể phát hiện ở mọi giai đoạn phát triển của vectơ trừ giai đoạn trứng [46] và không truyền lại virus cho đời sau [50] Con cái truyền hiệu quả hơn con đực, khả năng truyền của vectơ giảm đi theo tuổi của chúng Sau khi chích cây cà chua nhiễm bệnh khoảng 48 giờ, DNA của TYLCV sẽ tồn tại cùng với bọ phấn trong suốt vòng đời của chúng [61] Thời gian tồn tại tối đa của virus là

8 ngày từ khi kết thúc giai đoạn chích nạp Triệu chứng phát triển trên cây con

bị nhiễm từ 2 – 3 tuần sau khi bị bọ phấn chích Tỷ lệ bệnh tăng nhanh và có thể đến 100% khi thu hoạch

TYLCV không truyền bằng cơ học [50] Cho đến nay chưa có một công trình nghiên cứu nào về sự lan truyền qua hạt của TYLCV

Mặc dù TYLCV có phổ ký chủ rộng nhưng chúng chủ yếu gây hại trên cây cà chua Bệnh làm giảm một số lượng lớn quả tạo ra Đã có nhiều nghiên cứu về ảnh hưởng của TYLCV đến năng suất của cà chua Lây nhiễm bệnh cho cây sau khi trồng được 3 tuần trên đồng ruộng ở Libăng cho thấy năng suất giảm 63% so với cây khoẻ [56] Những nghiên cứu trong nhà kính ở Jordan chỉ ra rằng khi lây nhiễm TYLCV 10 tuần sau khi gieo năng suất giảm 63%, trong khi đó công thức lây nhiễm sau 15 tuần, năng suất giảm không đáng kể Thí nghiệm trên giống mẫn cảm, lây bệnh khi cây có một lá thật thì năng suất giảm tới 99% so với công thức không lây nhiễm [30]

+ Hình thái của virus

Tomato yellow leaf curl virus thuộc giống Begomovirus, có hình chầy

nhỏ, kích thước 20 x 30 nm Sợi DNA của virus có dạng sợi đơn gồm 2800

nucleotide chứa trong 6 gen Ở dạng sợi đôi gồm 2 phân tử DNA: DNA A và DNA B Mỗi phân tử có khoảng 2600 nucleotide, sợi DNA A cơ bản như sợi đơn còn sợi DNA B chỉ gồm 2 gen [43]

+ Biện pháp phòng trừ

TYLCV có phổ ký chủ rất rộng, phân bố rộng khắp trên thế giới nên việc phòng trừ là rất khó khăn Nhiều nhà khoa học đã và đang nghiên cứu để tìm ra cách phòng trừ hiệu quả nhất

Cohen S (1982) đã đề xuất các biện pháp hóa học để trừ bọ phấn, biện pháp canh tác và sản xuất giống kháng bệnh [37]

TYLCV chỉ truyền qua bọ phấn vì vậy biện pháp phòng trừ tốt nhất là

điều khiển môi giới truyền bệnh Besmisia tabaci thông qua các loài thiên địch

bắt mồi hay ký sinh, sử dụng hàng rào tự nhiên để cách li bọ phấn với nguồn bệnh và cây trồng, chọn tạo các giống cà chua có đặc điểm không ưa thích đối với bọ phấn

Theo Ryvany và Gerling (1987), 2 loài ong Encasia ruteola và

Eretmocerus đã đưa vào phòng trừ bọ phấn trên cây bông ở Israel [62]

Hoddle MS (1998) thì loài ong Encasia formora được sử dụng rộng rãi trên

thế giới để phòng trừ bọ phấn trên rau và cây cảnh trong điều kiện nhà lưới [48] Biện pháp phòng trừ bọ phấn bằng biện pháp sinh học có rất nhiều ưu điểm, cần được các nhà khoa học tiếp tục nghiên cứu để mở rộng

Biện pháp canh tác nhằm cách ly bọ phấn là phương pháp dễ thực hiện

và có chi phí đầu tư thấp Có thể luân canh cây cà chua với cây không ưa thích của bọ phấn như lúa nước, ngô [51] Ngoài ra còn có thể kết hợp biện pháp canh tác với nhổ bỏ cây cà chua bị bệnh nhằm hạn chế nguồn bệnh trên đồng ruộng Năm 1982, Al – Musa cho biết nên tránh xen canh cà chua với những cây là ký chủ của bo phấn như bí ngô, dưa chuột bởi vì chúng là nguồn thu hút bọ phấn đến ruộng cà chua [34]

Biện pháp dùng thuốc hóa học để tiêu diệt bọ phấn là biện pháp được

sử dụng rộng rãi và phổ biến, cho hiệu quả phòng trừ bệnh khá cao Vào những năm 90 của thế kỷ XX thì một số loại thuốc hóa học được sử dụng trừ

bọ phấn rất hiệu quả như Applaud, Sumilarv, Pegasus, Armir [57] Tuy nhiên việc lạm dụng biện pháp hóa học gây ra một số nguy cơ như: ngộ độc cho người tiêu dùng, tăng tính chống thuốc của bọ phấn và đặc biệt là nguy cơ ô nhiễm môi trường Năm 1990, Elbert đã thông báo về tính kháng thuốc của bọ phấn với thuốc Imidaclopoid chỉ sau một vài năm sử dụng Ngoài việc sử dụng thuốc hóa học thì dầu khoáng cũng được dùng để trừ bọ phấn (Smith và cộng sự 1973) N S Butter và cộng sự (1973) đã sự dụng dầu khoáng sữa 0,37 – 2% để trừ bọ phấn cho kết quả tốt [34]

Dựa vào xu tính của bọ phấn Besmisia tabaci, các nhà khoa học đã

nghiên cứu phương pháp bẫy mầu vàng nhằm làm giảm mật độ của chúng trên đồng ruộng D Shuter và cộng sự (1989) đã tiến hành nghiên cứu biện pháp che phủ đất bằng nilon có mầu sắc khác nhau nhằm hạn chế mật độ bọ phấn trên cà chua Kết quả cho thấy năng suất cà chua cao nhất ở công thức che phủ lynon vàng (62.3 tấn/ ha), sau đó là da cam (54.8 tấn/ ha), rồi đến mầu ánh bạc (52.7 tấn/ ha) [9] Ở Ai Cập, các thí nghiệm đồng ruộng từ năm

1988 – 1990 cho thấy khi che phủ vườn ươm cà chua bằng vải muslin trắng

để bảo vệ cây con không bị bọ phấn xâm nhập đã làm giảm sự truyền lan của bệnh xoăn vàng lá, vườn ươm được che phủ vải đã làm tăng năng suất từ 413 – 490% (M F Haydar) [34]

Những năm gần đây, cùng với tiến bộ của khoa học kỹ thuật, các nhà khoa học đã tạo ra những giống cà chua kháng bệnh xoăn vàng lá cà chua Khả năng kháng bệnh của cây là chống chịu bọ phấn hoặc chống lại sự xâm nhiễm, tái tổ hợp của virus trong tế bào cây Theo Nakhla và cộng sự (1998),

cơ sở khoa học của sử dụng giống cà chua chống chịu bọ phấn là sử dụng những giống có nhiều túm lông tơ ngăn cản bọ phấn chích hút dịch cây,

những giống có lông tiết ra nhựa dính giống như bẫy dính hoặc cây trồng có tuyến tiết dịch để xua đuổi bọ phấn Trong các giống cà chua thì các giống có

nguồn gốc hoang dại như L Hirsutum L Glabratum, L Penellii có những

đặc điểm trên [57] Trung tâm nghiên cứu và phát triển rau châu Á (AVRDC)

đã lai tạo ra những dòng cà chua có tính kháng rất cao với bọ phấn Besmisia tabaci cũng như bệnh xoăn vàng lá cà chua như: LA 1777, LA 1418, LA 407,

LA 716, LA 171418, PI 344818 [57]

2.1.3 Những nghiên cứu về ToMV (Tomato mosaic virus)

+ Vị trí phân loại

Virus có tên khoa học là Tomato mosaic virus, thuộc giống Tobamovirus

gồm 12 loài chính thức và 2 loài không chính thức [31] Ngoài ra nó còn có tên

khoa học khác là Lycopersicum virus 1 (Rev appl 36:303)

Virus khảm lá cà chua ToMV được phát hiện và mô tả lần đầu bởi Clinton (1909)

+ Phân bố địa lý

ToMV phân bố rộng khắp trên thế giới, do sự phát tán một cách vô ý thức của con người thông qua buôn bán hạt giống nhiễm bệnh mà ngày nay loại virus này đã xuất hiện khắp các vùng trồng cà chua trên thế giới [33]

tuberosum), cây tử đinh hương (Syringa vulgaris)

- Cây ký chủ cỏ dại: Cây rau muối (Chenopodium murale), cây Physalis

+ Sự lan truyền của virus

ToMV có thể tồn tại trên hạt giống Chúng tồn tại ở bên ngoài chất nhầy, trên vỏ hạt và trong nội nhũ nhưng không nằm trong phôi của hạt thu thập ở cây mẹ bị nhiễm bệnh [67] Tỷ lệ bị nhiễm rất khác nhau, trung bình khoảng 50% nhưng cũng có khi lên đến 94% [33] Các giống cà chua khác nhau thì tỷ lệ virus truyền qua hạt là khác nhau [55] Virus nhiễm vào hạt khi quả bắt đầu chín Tỷ lệ truyền qua hạt cao nhất là chủng gây triệu chứng khảm xanh Khi xâm nhiễm cùng Potato virus X và virus CMV làm tăng tỷ lệ truyền qua hạt của ToMV

Sự lây nhiễm cũng ảnh hưởng đến chất lượng của hạt giống Những hạt không bị nhiễm nẩy mầm nhanh hơn những hạt bị nhiễm ToMV [55]

ToMV không lan truyền qua con đường côn trùng môi giới mà chủ yếu qua con đường tiếp xúc cơ học từ cây, gốc ghép, cành ghép, dụng cụ gieo trồng bị nhiễm virus (Boradley, 1972) ToMV cũng truyền qua đất Lanter và cộng sự (1982) đã phát hiện thấy ToMV trong tàn dư cây bệnh và đất thu từ cánh đồng trồng cà chua bị nhiễm trong những năm trước [53]

+ Hình thái và cấu trúc

ToMV có hình gậy, kích thước 18 x 300 nm, điểm đẳng điện pH 4.5, hệ

số kết tủa 195 s, tỷ trọng 1.325 g/ cm3 và trọng lượng phân tử 40.000.000 [33]

Bộ genome là RNA, sợi đơn, hình xoắn ốc

+ Biện pháp phòng trừ

- Xử lý hạt giống khi mới thu hoạch bằng dung dịch axit hydrochloric

sẽ làm mất hoạt tính của virus bám trên vỏ hạt

- Xử lý nhiệt khô ở 70ºC trong 2 – 4 ngày [54]

- Ngâm hạt trong dung dịch tri – sodium photphat 10% trong 20 phút cũng có thể loại bỏ virus bám trên bề mặt hạt [33]

- Sử dụng hạt giống sạch bệnh, bón phân xanh đã ủ hoai mục, vô trùng các dụng cụ khi tiến hành chăm sóc cây có thể làm giảm và thậm chí ngăn chặn sự xâm nhiễm [33]

2.2 NHỮNG NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC

Bệnh virus đầu tiên được ghi nhận ở Việt Nam là bệnh lúa vàng lụi ở Tây Bắc hại trên lúa nếp vào năm 1910 và Lạng Sơn năm 1920 [19] Đến nay, bệnh virus hại thực vật đã được chú trọng nghiên cứu từ nhiều tác giả: Nguyễn Thơ, Nguyễn Hữu Thụy, Vũ Triệu Mân, Hà Minh Trung, Ngô Bích Hảo

- Ở Việt Nam, đã có 2 loài begomovirus được phát hiện gây ra bệnh xoăn vàng lá cà chua Loài thứ nhất là Tomato leaf curl Vietnam virus

(ToLCVV), được phân lập từ cây cà chua bị bệnh xoăn vàng lá ở miền Bắc

vào năm 2001 (Green et al., 2001) Loài thứ hai là Tomato yellow leaf curl

Kanchanaburi (TYLCKaV), được phân lập đầu tiên ở tỉnh Kanchanaburi

(Thái Lan) vào năm 2002 (Green et al., 2002) và được phát hiện trên cây cà

chua tại Việt Nam vào năm 2005 (mã số Genbank của mẫu Việt Nam là DQ169054, -55)

- Gần đây, từ một mẫu cà chua bị bệnh xoăn vàng lá thu thập tại Hà Nội,

cùng với ToLCVV, một loài begomovirus thứ ba cũng đã được phân lập Loài này được đặt tên là Tomato yellow leaf curl Vietnam virus (TYLCVNV) Trên mẫu cà chua này, một phân tử DNA -β mới cũng đã được phát hiện (Ha et al., 2007)

Phân tử DNA - β là một phân tử DNA vòng đơn, có kích thước khoảng

1,35 kb Các phân tử DNA - β phụ thuộc vào begomovirus để nhân lên và được xem là các phân tử vệ tinh của begomovirus Vai trò của phân tử DNA -

β trong hình thành triệu chứng bệnh không thống nhất, một số loài

begomovirus chỉ có thể tạo triệu chứng cùng với sự có mặt của phân tử DNA -

β trong khi đó một số loài khác lại không cần

- Nguyễn Thơ và Bùi Văn Ích (1968) đã xác định được bệnh xoăn vàng

lá cà chua (TYLCV) ở Việt Nam là khá phổ biến và gây thiệt hại lớn trên cà

chua Bệnh lan truyền qua bọ phấn (Bemisia tabaci) từ 3 – 4 bọ phấn tiếp xúc

cây bệnh và lây lên cây khỏe đã có khả năng truyền bệnh tốt [15]

- Bùi Văn Ích và cộng sự (1970) bước đầu nghiên cứu nguyên nhân gây bệnh và vectơ truyền bệnh xoăn vàng lá cà chua [15]

- Nguyễn Thơ (1967 – 1969) cho biết mức độ phát sinh bệnh xoăn vàng

lá cà chua có quan hệ rất chặt với mật độ bọ phấn Tác giả cho biết tỷ lệ bệnh

vụ hè thu và vụ xuân hè cao hơn nhiều so với vụ đông Nguyên nhân là do nhiệt độ hai vụ này cao hơn, thích hợp cho bọ phấn phát triển cũng như tăng khả năng truyền bệnh [20]

- Nguyễn Thơ (1984) cho biết bệnh xoăn vàng lá cà chua gây thiệt hại

đến 80 – 90% năng suất Cũng theo tác giả, khi mật độ bọ phấn (Besmisia

tabaci) từ 56 – 58 con/ cây cà chua thì tỷ lệ bệnh xoăn vàng lên tới 99,44%

Khi ghép cây mang mầm bệnh với gốc cây khỏe thì tỷ lệ bệnh là 100% [20]

- Nguyễn Văn Viên (1999) cho biết bệnh xoăn vàng lá là phổ biến, tỷ lệ bệnh cao hơn nhiều so với bệnh khảm lá dương xỉ và khảm vàng lá Vụ xuân hè,

vụ đông sớm, đông chính tỷ lệ bệnh cao, vụ đông xuân tỷ lệ bệnh thấp nhất trong

4 vụ Tác giả đã đề xuất biện pháp phòng trừ là nhổ bỏ cây bệnh kết hợp phun thuốc hóa học trừ bọ phấn là biện pháp cho hiệu quả tốt [26]

- Viện BVTV (1970) đã khẳng định bệnh xoăn vàng lá truyền bằng bọ phấn, cây thuốc lá và cây lu lu là ký chủ của bệnh Trên đồng ruộng có hai đỉnh về mật độ bọ phấn là tháng 3 – 6 và tháng 9 – 11 Khi mưa to, rét đậm thì mật độ bọ phấn giảm [26]

- Bộ môn côn trùng – trường ĐHNN Hà Nội (2004) khẳng định tác hại lớn của bọ phấn là làm môi giới truyền bệnh xoăn vàng lá cà chua Tỷ lệ bệnh xoăn lá cà chua trên đồng ruộng tăng khi mật độ bọ phấn tăng cao [4]

- Theo Lê Thị Liễu (2004) trên cây cà chua ở giai đoạn còn non có 2 con bọ phấn có thể truyền được bệnh xoăn lá, với số lượng bọ phấn 5 con/ cây tiếp xúc liên tục trong 6 giờ đồng hồ thì bắt đầu truyền được bệnh và tiếp xúc lâu hơn thì khả năng truyền bệnh lớn hơn [13]

- Theo Nguyễn Văn Viên (1994) thì tỷ lệ bệnh xoăn vàng lá ở nước ta cao hơn nhiều so với bệnh khảm lá dương xỉ và bệnh khảm vàng lá [25] Tác giả còn cho biết

sử dụng thuốc Bi 58 50EC nồng độ 0,1% phun bốn lần, mỗi lần cách nhau 14 ngày kề

từ sau khi trồng và dừng phun thuốc trước khi thu hoạch một tháng sẽ cho hiệu quả tốt

- Để phòng trừ bệnh xoăn vàng lá cà chua, Bùi Văn Ích, Lê Trường, Nguyễn Thơ (1971) đã sử dụng thuốc Bi 58 diệt bọ phấn bằng cách phun định

kỳ và tưới đã có hiệu quả

- Theo Lê Trường và ctv (1971) dùng thuốc Wofatox hoặc Bi58 nồng

độ 0.1% phun mỗi tuần từ khi trồng đến khi cây ra 5 chùm hoa đã hạn chế được tác hại của bọ phấn và bệnh xoăn lá [22]

- Vũ Triệu Mân và cộng sự (1993) đã sử dụng biện pháp tổng hợp là phun thuốc kết hợp với nhỏ bỏ cây bệnh để phòng trừ bọ phấn và bệnh virus trên cà chua có hiệu quả rất cao [16]

- Trần Khắc Thi (1999) cho biết có thể sử dụng Mornitor và Nuvacron

- Theo Vũ Triệu Mân (1981) thì virus khoai tây hại trên cà chua với tỷ

lệ 20% trong vụ đông và trong vụ xuân hè gần 25% tổng số cây bệnh Các chủng PVX 1, PVX 2 đều có mặt trên cà chua [17]

- Vũ Triệu Mân (1984) khi nghiên cứu bệnh virus hại khoai tây giống Ackersegen trồng ở miền Bắc Việt Nam đã xác định được hai chủng PVX 1

và PVX 2 PVX còn gây hại trên các cây họ cà như cà chua, ớt, thuốc lá Tác giả phân thành 5 loại triệu chứng của virus khoai tây trên cà chua là: xoăn xanh lá, xoăn vàng lá, xoăn lùn, xoăn cuốn lá và khảm lá [18]

- Ngô Bích Hảo (2001) khi nghiên cứu bệnh virus truyền qua hạt giống của một số cây rau và họ đậu (Fabaceae) đã tím thấy 14 loại virus trên hạt giống Trong đó virus khảm lá cà chua ToMV là một trong những virus truyền qua hạt giống đã được xác định ở miền Bắc Việt Nam [10]

- Theo Ngô Bích Hảo (2002) ngoài các bệnh virus trên cà chua còn bị các virus khác gây hại như là CMV, ToMV, PVV [11]

- Theo Ngô Bích Hảo và S.V Albrechtsen (2002) thì trong 41 mẫu hạt giống đã được xác định cơ bản của cây cà chua, cà tím, cà pháo, ớt thì có tới 24% mẫu hạt nhiễm virus ToMV [11]

- Năm 1996: Lê Sơn Hà, Hoàng Hải Vũ, Trung tâm kiểm dịch thực vật sau nhập khẩu I đã sử dụng phương pháp DAS – ELISA để chuẩn đoán các bệnh ẩn trên các giống cây trồng nhập nội ở miền Bắc Kết quả kiểm tra trên 9 giống khoai tây và cà chua đã xác định được 7 giống nhiễm virus Virus PRLV: 12,5% đến 15,0% mẫu khoai tây giống, trên các giống IHD 130 (Úc) , 8% – 10% trên giống IHD (Úc), 14% trên giống Lệ Hoa (Trung Quốc), 6% trên giống Diamant và 4% trên giống Nicolas Virus PVA: 18% trên giống Lệ Hoa, 14% trên giống Nicolas Đặc biệt, giống khoai tây Xuyên Vụ cũng xuất hiện PVX với tỷ lệ 4% tổng số mẫu kiểm tra Các mẫu cà chua chưa thấy xuất hiện bệnh virus trong mẫu

- Ngô Bích Hảo (2003) khi kiểm tra cho thấy 10/ 15 mẫu hạt giống cà chua thu thập ở một số tỉnh phía Bắc bị nhiễm ToMV

PHẦN III ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

* Bệnh xoăn vàng lá cà chua do Begomovirus

* Bọ phấn Bemisia tabaci Genn

3.1.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

* Thời gian thực hiện đề tài: từ 01/07/2010 – 25/12/2010

* Địa điểm thực hiện đề tài:

- Trung tâm bệnh cây nhiệt đới - Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội

- Viện nghiên cứu rau quả - Gia Lâm – Hà Nội

* Cây thí nghiệm lây bệnh nhân tạo:

- Thuốc lá: Nicotiana benthamiana, N tabacum cv Samsun

- Ớt cay: Capsicum annum L

- Cà tím: Solanum esculenta var Esculentum

- Cà pháo: Solananum album

- Đậu đen: Vigna unguiculata

* Côn trùng môi giới: bọ phấn (Bemisia tabaci)

* Mẫu bệnh xoăn vàng lá cà chua thu thập ở Hà Nội và một số tỉnh khác như: Hưng Yên, Phú thọ, Hải Dương, Bắc Ninh, Thái Bình

* Nhà lưới trồng cây cách li, phòng lây bệnh bằng côn trùng, hộp lồng nuôi bọ phấn

* Các hóa chất, dụng cụ, máy móc dùng trong phương pháp PCR

* Thuốc Actara 25WG SL do công ty Syngenta cung ứng, thuốc SuperMil 20SL do công ty cổ phần VT BVTV Hà Nội cung ứng

* Bẫy dính mầu vàng chuyên dụng do Đài Loan sản xuất

3.3 Nội dung nghiên cứu

1 Điều tra diễn biến, thời gian xuất hiện của bệnh virus xoăn vàng lá cà chua trên ruộng cà chua vụ thu đông 2010 tại Hà Nội và các vùng phụ cận

2 Khảo sát tình hình bệnh xoăn vàng lá cà chua trên tập đoàn giống cà chua tại trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội

3 Lây nhiễm nhân tạo bằng côn trùng môi giới nhằm xác định phổ ký chủ của bệnh xoăn vàng lá cà chua

4 Mô tả triệu chứng và giám định bệnh virus gây bệnh xoăn vàng lá trên cây cà chua bằng phương pháp PCR

5 Thử nghiệm một số biện pháp phòng trừ bệnh virus hại cà chua:

- Biện pháp phòng trừ côn trùng môi giới truyền bệnh - bọ phấn

(Bemisia tabaci Genn) bằng bẫy dính mầu vàng

- Biện pháp phòng trừ côn trùng môi giới truyền bệnh bằng thuốc hoá học: Actara 25WG, SuperMil 20SL

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Phương pháp điều tra diễn biến tỷ lệ bệnh và mật độ bọ phấn trên đồng ruộng

* Tiến hành điều tra theo TC10 TCN – 224 – 95 Hà Nội của Cục Bảo vệ thực vật [3] Điều tra định kỳ 7 ngày/lần, trên mỗi giống điều tra theo phương

pháp 5 điểm chéo góc, mỗi điểm điều tra 50 cây đối với ruộng lớn (trên 1 sào)

và toàn bộ số cây đối với ruộng nhỏ (dưới 1 sào)

* Điều tra diễn biến mật độ bọ phấn: tiến hành điều tra theo 5 điểm chéo góc, mỗi điểm cố định 5 cây, điều tra ngẫu nhiên 20 lá/điểm dải đều ở 3 tầng lá

* Chỉ tiêu theo dõi:

Số lá điều tra

3.4.2 Phương pháp thu mẫu nghiên cứu

* Phương pháp thu mẫu: mẫu đựng riêng trong từng túi nilon có ghi các thông tin: tên mẫu, địa điểm thu mẫu, thời gian thu mẫu, triệu chứng bệnh

* Phương pháp bảo quản mẫu: có hai phương pháp bảo quản mẫu

- Phương pháp 1: Bảo quản mẫu khô

+ Bước 1: Sấy mẫu ở nhiệt độ 40oC cho đến khi mẫu khá khô

+ Bước 2: Mẫu được gói trong giấy mỏng nhằm cách hạt Silicagen và mẫu sau đó để trong các lọ thuỷ tinh nhỏ

- Phương pháp 2: Bảo quản tươi

Mẫu thu về được để nguyên trong túi giữ lạnh ở tủ -20oC Chú ý

không đưa mẫu ra ngoài khi chưa sử dụng

3.4.3 Xác định phổ ký chủ của bệnh xoăn vàng lá cà chua và giám định virus gây bệnh bằng phương pháp cây chỉ thị

* Nguồn bệnh: cây cà chua bị nhiễm bệnh xoăn vàng lá với triệu chứng bệnh điển hình được kiểm tra ELISA cho kết quả dương tính

* Cây thí nghiệm:

+ Thuốc lá: Nicotiana benthamiana, N tabacum cv Samsun

+ Ớt cay: Capsicum annum L

+ Cà tím: Solanum esculenta var Esculentum

+ Cà pháo: Solananum album

+ Đậu đen: Vigna unguiculata

Các cây dùng để lây nhiễm được gieo hạt và chăm sóc trong nhà lưới để cách li nguồn bệnh Tiến hành lây nhiễm khi cây lây bệnh đạt 3 - 4 lá thật trở lên

* Dụng cụ cần thiết: Nhà lưới cách li, phòng lây bệnh bằng côn trùng, hộp lồng nuôi bọ phấn, chậu vại dùng để trồng cây lây nhiễm và cây nguồn bệnh, dụng cụ bắt bọ phấn và các thiết bị khác

* Vectơ truyền bệnh: Bọ phấn (Bemisia tabaci) được thu bắt trên đồng

ruộng sau đó nuôi trên cây sạch bệnh cho chúng chích hút và đẻ trứng, thu bắt

bọ phấn trưởng thành ở thế hệ thứ hai để lây nhiễm

* Phương pháp lây nhiễm bằng bọ phần:

Bọ phấn được thả trên cây nguồn bệnh cho chúng chích hút một ngày sau đó chuyển sang cây khỏe được trồng trong nhà lưới dùng để lây nhiễm, mỗi giống 10 cây , mỗi cây đặt trong một hộp Ở mỗi hộp thả 10 con bọ phấn cho chúng truyền virus một ngày sau đó đưa ra khỏi hộp và tiến hành phun thuốc Actara 25WG nồng độ 0,01% trừ bọ phấn Các cây đối chứng đều không thả bọ phấn

* Phương pháp Agroinoculation:

Phương pháp : Tiêm trực tiếp vi khuẩn vào mô (Navot et al., 1991 & Kheyr-Pour et al Nucleic acid research vol19,No 24 , 6763-6769)

* Nguồn: Vi khuẩn Agrobacterium chứa cấu trúc virus TYLCV (28/5/09), T01PEG (28/5/09), T02PEG (28/5/09), T0Ca1(28/5/09)

* Chuẩn bị môi trường

* Trình tự

+ Bước 1: Lấy 1 tube Agroniculation (có chứa cấu trúc virus giữ trong

tủ - 80o) Để trên khay đá khoảng 15 – 30 phút cho tan đông

+ Bước 2: Dùng que cấy vi khuẩn, cấy vi khuẩn lên môi trường LB đặc

đã cho 3 loại kháng sinh: Kanamycion, Rifampicin, Steptomycin Ủ qua đêm

ở 28oC

+ Bước 3: Cấy độ 4-5 khuẩn lạc Agroniculation vào bình chứa 100ml

LB lỏng chứa 3 loại kháng sinh: Kanamycin, Rifampicin, Steptomycin Ủ tube qua đêm ở 28oC có lắc (250 rpm / 28°C/ 2 ngày)

+ Bước 4 : Cho dung dịch LB lỏng (bước 3) vào tube 2ml bảo quản trong glyxerol 80% (tỷ lệ 1:1), đảo đều bảo quản ở tủ - 80oC = > giữ làm nguồn

+ Bước 5: Ly tâm vi khuẩn (3000 g/ 5 phút)

+ Bước 6 : Hòa cặn vi khuẩn với 10 ml môi trường LB lỏng chứa 1 kháng sinh (Kanamycion)

♦ Tiêm trực tiếp : Tiêm dịch vi khuẩn dùng kim tiêm 18 gauge vào cây

cà chua ở giai đoạn 3- 4 lá hoặc 8-10 lá Vị trí tiêm :

• Thân • Cuống lá

• Nách lá • Chồi

♦ Tiêm gián tiếp : Bơm dịch vi khuẩn qua khí khổng ở mặt dưới của lá

- Chỉ tiêu theo dõi:

+Quan sát mô tả triệu chứng

+ Thời kì tiềm dục (TKTD): tính từ lúc lây nhiễm cho tới khi cây biểu hiện triệu chứng (ngày)

3.4.4 Khảo sát hiệu quả của sử dụng bẫy dính màu vàng đối với phòng trừ bệnh xoăn vàng lá cà chua

Thí nghiệm nhằm đánh giá hiệu quả sử dụng bây vàng trong việc phòng trừ bệnh xoăn vàng lá cà chua

* Địa điểm thí nghiệm: Thí nghiệm được thực hiện tại nhà lưới số 4 - Viện nghiên cứu Rau - Hoa -Quả Gia Lâm - Hà Nội trên giống cà chua R7

* Thí nghiệm gồm 2 công thức:

- Công thức 1: treo bẫy dính màu vàng

- Công thức 2: không treo bẫy

* Chỉ tiêu theo dõi:

- Điều tra tỷ lệ bệnh xoăn vàng lá cà chua và mật độ bọ phấn trên cây 7 ngày/ lần

- Mật độ bọ phấn vào bẫy dính màu vàng 5 ngày/ lần

3.4.5 Khảo sát hiệu quả của sử dụng thuốc hóa học đối với phòng trừ bệnh xoăn vàng lá cà chua

Thí nghiệm được bố trí nhằm đánh giá khả năng phòng trừ bọ phấn của bẫy dính màu vàng, thuốc kích kháng Super mil 20SL và thuốc hóa học Actara 25WG

* Địa điểm thí nghiệm: Khu trồng rau Quảng An – Tây Hồ – Hà Nội

* Giống cà chua: P375

* Thí nghiệm được bố trí theo kiểu khối ngẫu nhiên đầy đủ (RCB), gồm

5 công thức, 1 giống, 3 lần nhắclại

- Công thức 1: đối chứng

- Công thức 2: treo bẫy dính màu vàng

- Công thức 3: phun thuốc Actara 25WG 0,01%

- Công thức 4: phun chất kích kháng SuperMil 20SL + treo bẫy vàng

- Công thức 5: phun chất kích kháng SuperMil 20SL

* Chỉ tiêu theo dõi:

- Mật độ bọ phấn vào bẫy (con/bẫy) định kỳ 5 ngày/lần

- Mật độ bọ phấn trên cây cà chua định kì 7 ngày/lần

- Điều tra tỷ lệ bệnh bệnh xoăn vàng lá cà chua 7 ngày/lần

3.4.6 Phương pháp bố trí thí nghiệm đồng ruộng

Thí nghiệm được bố trí nhằm nghiên cứu hiệu quả phòng trừ của bẫy vàng đối với bệnh xoăn vàng lá cà chua

* Địa điểm thí nghiệm: Quảng An – Tây Hồ - Hà Nội

* Giống cà chua: P375

* Thí nghiệm gồm 2 công thức:

- Công thức 1: treo bẫy dính màu vàng

- Công thức 2: không treo bẫy

* Chỉ tiêu theo dõi:

- Điều tra tỷ lệ bệnh 7 ngày/lần

- Điều tra mật độ bọ phấn vào bẫy vàng 5 ngày/lần

- Điều tra mật độ bọ phấn trên cây 7 ngày/ lần

- Thành phần côn trùng vào bẫy dính màu vàng 7 ngày/lần

3.4.7 Giám định virus gây bệnh bằng phương pháp PCR

Qua quá trình điều tra thu thập mẫu bệnh trên đồng ruộng, chúng tôi đã

sử dụng phương pháp PCR (Polymenraza Chain Reaction) để chẩn đoán virus Phương pháp PCR giám định virus gây bệnh xoăn vàng lá gồm các bước sau:

3.4.7.1 Chiết DNA tổng số từ mẫu mô thực vật

Có hai phương pháp chiết DNA:

* Phương pháp 1: DNA tổng số từ mô lá được chiết nhanh bằng kiềm

(NaOH) theo phương pháp của Wang et al (1993) như sau:

- Bước 1: Cho khoảng 50 mg mô lá vào tube 1,5 ml tiếp tục cho 0,5 ml

dung dịch NaOH 0,5M vào tube Dùng chày nhựa nghiền nhuyễn mẫu lá

- Bước 2: Hòa loãng dịch nghiền 50 lần với đệm Tris 0,1M, pH 8 (5 µl

dịch nghiền hòa loãng với 245 µl đệm Tris)

- Bước 3: Lưu trữ mẫu trong tủ lạnh -20oC

* Phương pháp 2: Chiết tách DNA tổng số bằng CTAB

+ Bước 1:

- Cho 0,1 g mô lá tươi hoặc 0,02 g mô lá khô vào tube 1,5 ml

- Cho 0,5 ml đệm CTAB + βME đã ủ ở 60oC trong 10 phút vào tube Dùng chày nhựa nghiền nhuyễn

- Ủ 10 phút ở 65oC sau đó để nguội ở nhiệt độ phòng

+ Bước 2:

- Cho 0,5 ml hỗn hợp (Chlorofom : isoamyl alcohol 24:1) vào tube lắc đều

- Sau đó ly tâm 12.000/phút trong 10 phút, hút dịch trên của tủa sang một tube mới (0,35ml)

+ Bước 5, 6:

Rửa cặn hai lần Etol 70o (0,7 ml/lần), đảo nhẹ, đổ hết Etol Sau đó, spin

và dùng pipet hút hết etol thừa

+ Cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR

- Cặp mồi chung DNA-A của begomovirus là BegoAReV1 &

BegoAFor1 (Ha et al., 2006)

BegoAReV1: 5’- ATHCCMDCHATCKTBCTiTGCAATCC*- 3’

BegoAFor1: 5’- TGYGARGGiCCiTGYAARGTYCARTC* - 3’

* Y (C/T), R (G/A), H (A/C/T), M (A/C), B (C/G/T), D(A/G/T), K (G/T)

và i = inosine

- Cặp mồi đặc hiệu ToLCVV (sản phẩm = 454 bp)

Mồi xuôi dòng là ToLCVV-sp-F2 có trình tự: (vị trí 1245) 5’ GACCAGTCTGAAGGTGTGAGTTC 3’ (vị trí 1276)

Mồi ngược dòng là ToLCVV-sp-R2 có trình tự: (vị trí 1683) 5’ ACTCAAGCTATAAAGAATACCTAGAC 3’ (vị trí 1708)

- Cặp mồi đặc hiệu TYLCVNV (sản phẩm = 1386 bp)

Mồi xuôi dòng là TYLCVNV-sp-F1 có trình tự : (vị trí 1094) 5’ TGTGTTACATATTCTGTGTTTTCC 3’ (vị trí 1117)

Mồi ngược dòng là TYLCVNV-sp-R1 có trình tự: (vị trí 2456) 5’ AAATACATCAAAATCTGCAGAGAGC 3’ (vị trí 2480)

PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả điều tra trên đồng ruộng

4.1.1 Mô tả triệu chứng ngoài đồng ruộng

Bệnh xoăn vàng lá cà chua hay còn gọi là bệnh xoăn vàng ngọn cà chua được coi là tác nhân gây hại nghiêm trọng trên cà chua ở tất cả các vụ trong năm: xuân hè, đông sớm, đông chính vụ, đông xuân, hè thu đặc biệt vụ xuân hè và vụ đông sớm bệnh có chiều hướng hại nặng hơn, tỷ lệ bệnh cao hơn [27]

Chẩn đoán và phát hiện triệu chứng bệnh là cơ sở cần thiết trong nghiên cứu cũng như trong công tác bảo vệ thực vật Chẩn đoán bệnh cây nói chung và chẩn đoán bệnh virus xoăn vàng lá cà chua (TYLCV) nói riêng có nhiều phương pháp khác nhau, trong đó phương pháp đơn giản nhất có thể tiến hành ngay trên đồng ruộng là phương pháp quan sát triệu chứng bệnh

Cây cà chua bị nhiều loài côn trùng, bệnh hại tấn công trên đồng ruộng Những triệu chứng gây hại do côn trùng tạo ra như vết gặm, cắn, đục lá, đục thân thường dễ nhận biết Những triệu chứng do bệnh hại khó nhận biết hơn đặc biệt với các tác nhân gây bệnh có triệu chứng không điển hình, dễ nhầm với bệnh không truyền nhiễm (bệnh do môi trường không thuận lợi gây ra) Bệnh có triệu chứng điển hình: xoăn lá lá, làm cho lá co quắp, cây thấp nhỏ, hoa phát triển kém, dễ bị rụng Nhiễm bệnh lúc cây còn nhỏ cây sẽ bị xoăn lá nhanh và không thể phát triển, không có hoa cây dẫn đến tàn lụi (Nguyễn Thơ, 1984)[23]

Căn cứ vào triệu chứng biểu hiện của bệnh xoăn vàng lá được mô tả trong các tài liệu về loại virus này, chúng tôi tiến hành quan sát, chẩn đoán và thu thập một số mẫu bệnh tại Hà Nội (huyện Đông Anh, huyện Gia Lâm, huyện Long Biên) và một số tỉnh khác (Hải Dương, Phú Thọ, Bắc Ninh, Hưng Yên)

Bảng 1 Đặc điểm triệu chứng bệnh virus gây hại cà chuavụ thu đông

2010 tại Hà Nội và vùng phụ cận

TT Loại hình

Mức phổ biến

1 Khảm vàng

Lá bánh tẻ, lá gần lá bị bệnh thường có vết khảm xanh vàng xen kẽ Lá bị bệnh thường vàng từ gốc lá, lá hơi cong xuống, bề mặt lá gồ ghề Quả trên cây bị bệnh nhỏ, bị khảm vàng loang lổ hoặc bị biến vàng đôi khi có vết đốm

P 375 Hồng châu, Mec 89

+

2 Xoăn vàng

Lá bánh tẻ, lá lá cong lõm và biến vàng từ mép

lá vào trong, lá lá nhỏ, mép lá cong lên và xoăn

có dạng hình thìa, thịt lá vàng, gân lá xanh, sau

đó biến vàng toàn bộ lá Phần lá xoăn vàng, mọc thẳng đứng, hơi giòn dễ gãy Cây cà chua thấp, phân nhiều nhánh, thường không cho hoa, quả hoặc cho ít hoa quả và quả thường nhỏ, chất lượng kém

P 375 Hồng châu, Mec 89 VL2000

P 375 Hồng châu, Mec 89

P 375 Hồng châu, Mec 89 VL2000

Ảnh triệu chứng bệnh xoăn vàng lá trên một số giống cà chua

Hình 1: Triệu chứng trên giống P375 taị Quảng An – Tây Hồ – Hà Nội

Hình 2: Triệu chứng trên giống Méc 89 tại xã Dương Xá – Gia Lâm – Hà Nội

Hình 3: Triệu chứng trên giống HT25 tại xã Đa Tốn – Gia Lâm – Hà Nội

Hình 4 :Triệu chứng trên giống Hồng Châu tại Đặng Xá- Gia Lâm – Hà Nội