phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng steinernema sp.tđ3 ở tam đảo, vĩnh phúc có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm

Các vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng ký sinh gây bệnh với côn trùng Entomopathogenic Nematodes - EPN đang là đối tượng nghiên cứu mới của các nhà khoa học về khả năng diệt côn trùng gâ

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

………… o0o…………

HOÀNG THỊ BÍCH

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN CỘNG SINH VỚI

TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY BỆNH CÔN TRÙNG

STENERNEMA SP.TĐ3 Ở TAM ĐẢO, VĨNH PHÚC CÓ KHẢ NĂNG

KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM

LUẬN ÁN THẠC SỸ SINH HỌC

………… o0o…………

HOÀNG THỊ BÍCH

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN CỘNG SINH VỚI

TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY BỆNH CÔN TRÙNG

STENERNEMA SP.TĐ3 Ở TAM ĐẢO, VĨNH PHÚC CÓ KHẢ NĂNG

KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM

LUẬN ÁN THẠC SỸ SINH HỌC

Hà Nội, 2010

MỞ ĐẦU

Ngày nay, nhờ sự có mặt của nhiều kháng sinh có tác dụng diệt khuẩn mạnh nên đã góp phần giải quyết được nhiều bệnh nhiễm trùng mắc phải Tuy nhiên tỷ lệ đề kháng kháng sinh của vi khuẩn đang ngày càng tăng cao (ở Mỹ: khoảng 70%) Theo ước tính của các Trung tâm kiểm soát bệnh (Centers for Disease Control - CDC) của Mỹ, hàng năm ở Mỹ có khoảng 90 000 ca tử vong/ 2 triệu ca mắc bệnh nhiễm trùng [1]

Sự kháng thuốc của nhiều loại vi khuẩn ngày càng gia tăng đang là mối

lo ngại mang tính toàn cầu Nhiều kháng sinh mà con người tìm ra nay không còn công hiệu trong việc điều trị Nhiều kháng sinh chỉ xuất hiện và sử dụng trong một thời gian ngắn bị kháng, trong khi việc nghiên cứu tìm ra những loại kháng sinh mới không thể thực hiện trong thời gian ngắn, nhất là tìm ra những loại kháng sinh điều trị vi khuẩn kháng kháng sinh Vì vậy, nhu cầu khẩn cấp là cần có những thuốc kháng vi sinh vật mới để kiểm soát những căn bệnh một cách có hiệu quả [2] Chính vì vậy, ngoài những kháng sinh tổng hợp, kháng sinh bán tổng hợp, kháng sinh tự nhiên đang có mặt trên thị trường thì ngành công nghiệp dược phẩm đang tìm kiếm những chất kháng vi sinh vật từ những nguồn gốc khác vừa có hiệu lực cao, vừa có hoạt phổ rộng

mà lại thân thiện với môi trường

Các vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng ký sinh gây bệnh với côn trùng (Entomopathogenic Nematodes - EPN) đang là đối tượng nghiên cứu mới của các nhà khoa học về khả năng diệt côn trùng gây hại và khả năng sinh kháng sinh khi chúng có khả năng ngăn chặn các vi sinh vật khác xâm nhập vào xác chết côn trùng vật chủ Nhiều nghiên cứu đã cho thấy sản phẩm trao đổi chất thứ cấp của các vi khuẩn cộng sinh có khả năng kháng vi sinh vật hoạt phổ rộng, ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn, nấm và các tế bào ung thư [6,15]

Việt Nam là đất nước có vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ấm, mưa nhiều nên tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng có tính đa dạng khá

cao Hiện nay, khoảng hơn 40 chủng EPN đã được phân lập từ các vùng sinh thái khác nhau của Việt Nam [3,8] và đây cũng là nguồn cung cấp vi khuẩn cộng sinh có ý nghĩa khoa học không chỉ ở Việt Nam mà còn có ý nghĩa trên thế giới trong việc nghiên cứu các chất kháng sinh mới phục vụ cho con người, động vật, thực vật

Ở Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu về tuyến trùng rất có giá trị v à có

ý nghĩa khoa học trong xác định hình thái , đa dạng loài nhưng chưa có nhiều nghiên cứu về vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng và các sản phẩm trao đổi chất của chúng Chính vì vậy, chúng tôi lựa chọn đề tài

Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng ký

sinh gây bệnh côn trùng Steinernema sp.TĐ3 ở Tam Đảo, Vĩnh Phúc có

- Tách chiết hoạt chất và thử khả năng kháng vi sinh vật kiểm định

- Định loại vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng Steinernema sp.TĐ3 bằng

phương pháp sinh học phân tử trên cơ sở phân tích đoạn gen 16S rDNA

Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Khái quát chung về tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng

Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng là loài giun tròn (Nematodes)

có ích, ký sinh ở một số loài côn trùng có hại- làm suy yếu hoặc giết chết những côn trùng này, nhưng lại rất an toàn đối với người, động vật và thực vật [3]

Trong số hàng nghìn loài tuyến trùng ký sinh ở côn trùng thì chỉ có nhóm Entomopathogenic nematodes (EPN) có khả năng vừa ký sinh vừa gây

bệnh cho côn trùng, gồm 2 giống Steinernema và Heterorhabditis (giống Steinernema thuộc họ Steinernematidae và Heterorhabditis thuộc họ

Heterorhabditidae của ngành giun tròn

Mặc dù các loài tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng thuộc giống

Steinernema và Heterorhabditis là những loài ký sinh bắt buộc ở côn trùng

nhưng chúng lại có một pha chuyên hóa tồn tại bên ngoài vật chủ côn trùng, (thường là môi trường đất) Đó là ấu trùng tuổi 3, còn gọi là ấu trùng xâm nhiễm (infective juveniles - IJs), là giai đoạn đặc biệt trong vòng đời phát triển của nhóm tuyến trùng này Ở giai đoạn này, IJs không cần dinh dưỡng nhưng chúng lại có khả năng tồn tại lâu dài trong môi trường đất, khi chưa gặp vật chủ Đây là giai đoạn ấu trùng nằm chờ trong đất và sẵn sàng xâm nhập vào vật chủ thích hợp để ký sinh, gây bệnh

Khi tìm được vật chủ thích hợp, IJs xâm nhập vào cơ thể côn trùng qua các lỗ mở tự nhiên như miệng, hậu môn hoặc lỗ thở hoặc một số dạng IJs được trang bị mấu kitin dạng sừng có thể đục thủng thành cơ thể côn trùng tại một nơi xung yếu là ranh giới giữa các đốt cơ thể để xâm nhập Sau khi vào

cơ thể vật chủ, IJs nhanh chóng xâm nhập vào xoang máu, tại đây vi khuẩn cộng sinh được giải phóng Nhờ môi trường thích hợp là huyết tương vật chủ,

vi khuẩn cộng sinh nhân nhanh số lượng và tạo ra độc tố gây chết vật chủ trong vòng 24 -48h [3]

1.1.1 Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Steinernema

Tuyến trùng Steinernema sinh sản theo kiểu phân tính nhờ giao phối

giữa đực và cái, trứng con cái được thụ tinh bởi tinh trùng của con đực Điều này cũng có nghĩa là để sinh sản được trong cơ thể côn trùng vật chủ, tuyến trùng cần xâm nhập cả IJs đực và IJs cái, để chúng phát triển thành cả đực và cái trưởng thành, cho phép chúng có điều kiện ghép đôi trong vật chủ

Ở giai đoạn đầu, con cái đẻ trứng vào cơ thể côn trùng và trứng nở thành ấu trùng thế hệ 1 Các ấu trùng của thế hệ 1 không phát tán ra ngoài mà

ở lại bên trong xác chết cơ thể vật chủ để dinh dưỡng bằng chính các mô của côn trùng vật chủ và phát triển nhanh chóng đạt đến giai đoạn trưởng thành thế hệ 2 Trong trường hợp xác chết vật chủ vẫn còn nguồn thức ăn, thế hệ 2 tiếp tục giao phối và tiếp tục phát triển qua thế hệ 3, thậm chí cả thế hệ 4 bên trong cơ thể vật chủ Cuối cùng, khi nguồn dinh dưỡng đã hết, thế hệ cuối cùng trong xác chết côn trùng dừng lại ở pha ấu trùng tuổi 2 Các ấu trùng này bắt đầu chui ra khỏi xác chết côn trùng và phát tán ra môi trường bên ngoài và trở thành IJs (tuổi 3) và từ đây chúng tiếp tục một chu kỳ phát triển mới với côn trùng vật chủ mới

1.1.2 Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Heterorhabditis

Không giống với các loài Steineinema, ở các loài tuyến trùng Heterorhabditis, IJs khi xâm nhập vào cơ thể côn trùng phát triển thành con

cái lưỡng tính (Hermaphroditis) Con cái này có khả năng sản sinh ra tinh trùng cùng với trứng và tự thụ tinh để sinh sản Từ thế hệ 2 trở về sau, IJs mới phát triển thành con trưởng thành phân tính đực cái và sinh sản bằng hình thức giao phối Giai đoạn đầu của con cái cả lưỡng tính và phân tính, chúng

đẻ trứng (oviparous) nhưng ở giai đoạn sau khi con cái về già chúng đẻ trứng

thai (oviviparous); lúc này ấu trùng nở ra bên trong cơ thể con mẹ và sử dụng

cơ thể mẹ làm nguồn thức ăn để phát triển thành ấu trùng tuổi 2, biến con cái thành bọc chứa ấu trùng tuổi 2 Khi phá vỡ thành cơ thể con mẹ chui ra ngoài trở thành ấu trùng cảm nhiễm (tuổi 3) chúng vẫn giữ lại vỏ cutin của ấu trùng tuổi 2 [3]

1.2 Vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng EPN

Mỗi ấu trùng xâm nhiễm của tuyến trùng EPN (infective juveniles –IJs) mang trong ruột của chúng một loài vi khuẩn cộng sinh chuyên hóa và chúng đều gây bệnh cho côn trùng khi xâm nhập vào máu Các nghiên cứu trong 20

năm qua từ tuyến trùng EPN cho thấy vi khuẩn Xenorhabdus cộng sinh trong ruột của ấu trùng cảm nhiễm của Steinernema, còn với các loài giống Heterorhabditis thì vi khuẩn cộng sinh thuộc giống Photorhabdus [15]

1.2.1 Vi khuẩn Xenorhabdus

Xenorhabdus là trực khuẩn Gram âm, không sinh bào tử, hình que, kỵ khí

không bắt buộc Chúng sinh trưởng ở nhiệt độ tối ưu là 280C; một số chủng có khả năng phát triển ở 400

C

Xenorhabdus khác với các chi khác của họ Enterobacteriaceae là có

kích thước tế bào lớn 0,3 – 2 x 2 – 10 μm Lên men đường glucose sinh acid (không sinh khí) và một số đường khác ít lên men Phản ứng catalase âm tính

và không có khả năng chuyển nitrat thành nitrit Đa số các chủng có

deoxyribonuclease (DNase) và protease dương tính Xenorhabdus có mối

quan hệ mật thiết với tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng giống

Steinernema và có đặc tính miễn dịch

Ở IJs của các loài Steinernema spp., VKCS nằm trong một cái bọc ở

phần trước của ruột , phía sau thực quản Các tổ hợp tuyến trùng và vi khuẩn này có tính chuyên hóa khá cao: mỗi loại tuyến trùng có thể tổ hợp với một số

loài vi khuẩn, nhưng mỗi loài vi khuẩn chỉ tổ hợp với một loài tuyến trùng nhất định (bảng 1.1) [33]

Bảng 1.1 Mối quan hệ giữa tuyến trùng và vi khuẩn cộng sinh

1 Steinernema

abbasi

Flavimonas oryzihabitans

Elawad et al., 1998

2 S affine X bovienii Akhurst & Boemare, 1990

3 S apuliae X kozodoii Tailliez et al., 2006

4 S arenarium X kozodoii Tailliez et al., 2006

5 S bicornutum X budapestensis Tailliez et al., 2006

6 S carpocapsae X nematophila Akhurst & Boemare, 1990

7 S ceratophorum X budapestensis Tailliez et al., 2006

8 S cubanum X poinarii Tailliez et al., 2006

9 S diaprepesi X doucetiae Fischer-Le Saux et al., 1998

12 S hermaphroditum X griffiniae Tailliez et al., 2006

17 S longicaudum X ehlershii Tailliez et al., 2006

18 S monticolum X hominickii Fischer-Le Saux et al., 1998

19 S puertiricense X romanii Tailliez et al., 2006

21 S riobravis X cabanillasii Tailliez et al., 2006

22 S scapterisci X innexi Fischer-Le Saux et al., 1998

23 S scarabaei X koppenhoeferi Tailliez et al., 2006

27 Heterorhabditis

bacteriophora

Photorhabdus luminescens

Poinar, 1990

28 H megidis P luminescens Poinar et al., 1987

Bảng 1.1 cho thấy X bovienii có quan hệ cộng sinh với 4 loài Steinernema, trong khi X poinarii với 2 loài, còn 3 loài vi khuẩn Xenorhabdus khác chỉ có quan hệ cộng sinh với duy nhất 1 loài Steinernema

Điều đó cho thấy tính chuyên hóa của tổ hợp tuyến trùng - vi khuẩn nhưng cũng có tính đa dạng khá cao

1.2.2 Vi khuẩn Photorhabdus

Photorhabdus có kích thước 0,5 -2 x 1- 10 μm, Gram âm, không sinh

bảo tử và di động bằng lông rung Hô hấp kị khí không bắt buộc, nhiệt độ tối

ưu là 280C; một số chủng phát triển ở 37- 380

C Photorhabdus có phản ứng

catalase dương tính nhưng không khử nitrat (chủ yếu âm tính với một số loài

thuộc họ Enterobacteriaceae) Photorhabdus lên men glucose sinh axit, không

sinh khí và cũng có khả năng lên men đường Fructose, D- mannose, maltose, ribose, và N – acetylglucosamine sinh axit, lên men glycerol yếu

IJs của các loài tuyến trùng Heterorhabditis spp., thì vi khuẩn cộng

sinh nằm dải rác theo chiều dài của ruột , nhưng chủ yếu vẫn là ở nửa trước

của ống ruột Hầu hết các loài vi khuẩn giống Photorhabdus có khả năng tạo

sáng huỳnh quang sinh học [8]

1.2.3 Sự chuyển pha của vi khuẩn cộng sinh

Sự biến đổi pha là một đặc điểm phổ biến của vi khuẩn, đó là sự thay đổi đảo nghịch cho phép vi khuẩn tránh được hàng rào miễn dịch của côn trùng vật chủ hoặc sự nhiễm của thực khuẩn thể Sự biến đổi pha cũng xuất

hiện ở các loài vi khuẩn giống Xenorhabdus và Photorhabdus

Sự biến đổi pha trong Xenorhabdus được mô tả như là sự dị hình 2

dạng khuẩn lạc trên môi trường agar, các khuẩn lạc này khác nhau về màu viền khuẩn lạc của chúng [22,26,31]

Sự biến đổi pha trong Xenorhabdus đã được nghiên cứu khá đầy đủ ở

X nematophilus và xác định được các đặc trưng chính của sự biến đổi pha

trong loài này [19] Đặc trưng của pha I là nhuộm màu đường viền xanh (xanh bromothymol và đỏ congo) và sản sinh các chất kháng sinh, lecithinese [26], thể vùi protein và tua viền [16] Ở pha II hoặc không có những đặc trưng như

ở pha I hoặc có những biểu hiện rất yếu Các tế bào pha I lớn hơn và đa hình hơn ở pha II [26]

Các nghiên cứu gần đây cho thấy vai trò của pha I là sản sinh các chất kháng khuẩn, kháng nấm nhằm ức chế các vi sinh vật khác xâm nhập vào xác chết côn trùng, do đó hạn chế sự cạnh tranh các chất dinh dưỡng, dành nguồn dinh dưỡng cho tuyến trùng Ngoài ra, bằng cách thủy phân côn trùng bằng hệ enzyme protease, lipase,… pha I có khả năng chuyển hóa cơ chất thành các sản phẩm phù hợp hơn cho tuyến trùng tăng trưởng và sinh sản Sự xuất hiện của hiện tượng này trong các vi khuẩn cộng sinh của tuyến trùng EPN rất mạnh mẽ cho thấy rằng nó là một yếu tố quan trọng trong mối tương quan giữa tuyến trùng, vi khuẩn và côn trùng vật chủ Tuy nhiên, giai đoạn biến thể (pha II) chưa có những nghiên cứu rõ ràng về chức năng của chúng trong tổ hợp tuyến trùng - vi khuẩn - côn trùng vật chủ [3]

Pha I và pha II có thể được duy trì như những dòng thuần chủng bằng

kỹ thuật nhân dòng thông thường [16]

1.3 Mối quan hệ tương tác giữa tuyến trùng và vi khuẩn cộng sinh

Quan hệ cộng sinh là một mối quan hệ sinh thái cực kỳ phổ biến trong các quần xã sinh vật trong sinh giới Nó đóng vai trò quan trọng trong việc hợp thành các dạng sống chính trên Trái đất và tạo ra sự đa dạng sinh học vô cùng phong phú này

Tổ hợp tuyến trùng – vi khuẩn cộng sinh tương tác với nhau, mỗi bên đều thực hiện những nhiệm vụ, chức năng riêng để sinh tồn và phát triển nhưng lại giúp bên kia để tồn tại, tổ hợp này không thể tách rời và tồn tại độc lập trong môi trường tự nhiên được

1.3.1 Vai trò của tuyến trùng

* Tuyến trùng làm vector vận chuyển vi khuẩn cộng sinh:

Khi xâm nhập vào vật chủ côn trùng các IJs đóng vai trò như vector vận chuyển vi khuẩn cộng sinh vào bên trong vật chủ côn trùng, sau đó tuyến trùng

di chuyển thẳng vào xoang máu côn trùng và giải phóng vi khuẩn cộng sinh

* Tuyến trùng bảo vệ vi khuẩn cộng sinh:

- Bảo vệ vi khuẩn cộng sinh ở môi trường ngoài côn trùng vật chủ, bằng cách để vi khuẩn cộng sinh trong bọc chứa nằm trong ruột chúng do vi khuẩn cộng sinh không thể tự tồn tại ở ngoài môi trường (đất, nước)

- Bảo vệ vi khuẩn cộng sinh ở trong cơ thể côn trùng: khi vi khuẩn cộng sinh được giải phóng từ cơ thể tuyến trùng vào xoang máu của côn trùng, thì theo phản ứng tự nhiên, côn trùng thường tiết ra một số chất kháng thể (dạng protein) để hạn chế hoặc loại bỏ vi khuẩn cộng sinh , trong khi đó nhờ tuyến trùng cũng có khả năng tiết ra một số chất làm trung hòa là làm mất tác dụng kháng thể của các chất này Nhờ vậy, tuyến trùng bảo vệ cho vi khuẩn cộng sinh phát triển bình thường trong cơ thể côn trùng [3]

1.3.2 Vai trò của vi khuẩn cộng sinh

* Vi khuẩn cộng sinh sản sinh độc tố giết chết côn trùng bị nhiễm:

Độc tố do vi khuẩn cộng sinh tiết ra một số protein độc có khả năng nhiễm cho xoang máu côn trùng vật chủ và làm cho côn trùng vật chủ chết một cách nhanh chóng trong vòng 24 – 48h Như vậy, thời gian chết côn trùng vật chủ khác nhau tùy loại tổ hợp tuyến trùng – vi khuẩn và cũng phụ thuộc vào loại côn trùng vật chủ nhưng thường không chậm hơn 48h

* Vi khuẩn cộng sinh cung cấp nguồn thức ăn cho tuyến trùng:

Khi mới bắt đầu xâm nhập vào cơ thể côn trùng, tuyến trùng đã sử dụng vi khuẩn cộng sinh vừa được giải phóng từ cơ thể chúng và sinh sôi trong xoang máu côn trùng như nguồn dinh dưỡng của chúng Nhờ đó, các IJs cũng nhanh chóng phát triển sang tuổi 4 và đạt đến trưởng thành Từ thế hệ

thứ hai tuyến trùng chuyển sang dinh dưỡng bằng mô côn trùng đã được vi khuẩn hoạt hóa [8]

* Vi khuẩn cộng sinh hoạt hóa xác chết côn trùng:

Nhờ các enzyme do vi khuẩn sinh ra, các mô cơ thể côn trùng vật chủ được hoạt hóa thành nguồn thức ăn thích hợp đối với tuyến trùng Nhờ đó, từ thế hệ 2 tuyến trùng sử dụng chính xác chết côn trùng đã được hoạt hóa như nguồn thức ăn để tiếp tục phát triển, sinh sôi nảy nở các thế hệ tiếp theo Thông thường trong cơ thể côn trùng vật chủ, tuyến trùng có thể phát triển 2 đến 4 thế hệ, phụ thuộc vào sinh khối côn trùng vật chủ làm nguồn thức ăn cho chúng

* Vi khuẩn cộng sinh ngăn cản các vi khuẩn khác xâm nhập vào xác chết côn trùng:

Vi khuẩn cộng sinh có khả năng sinh ra các hoạt chất kháng sinh để ngăn cản tác nhân sinh học khác như nấm hoặc vi khuẩn xâm nhập và phát triển trên xác chết côn trùng Điều này có ý nghĩa là chúng có khả năng bảo

vệ nguồn thức ăn nguyên vẹn dành cho tuyến trùng cộng sinh với chúng

Như vậy, có thể nói đây là một trong những mô hình cộng sinh hoàn hảo giữa hai loài sinh vật trong tự nhiên Mô hình cộng sinh này vừa chuyên hóa cao đến mức sự tồn tại của loài này bắt buộc phải có sự hiện diện và cộng sinh của loài kia và ngược lại

1.4 Sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn cộng sinh

Sau khi xâm nhập vào huyết tương vật chủ, vi khuẩn cộng sinh sinh trưởng và phát triển được là nhờ hệ enzyme như proteinase, lypase, có tác dụng vừa gây độc đối với côn trùng vật chủ, vừa thuỷ phân nguồn dinh dưỡng từ côn trùng tạo các sản phẩm trao đổi chất đơn giản, dễ hấp cho tuyến trùng [3]

Cùng với đó, các chất trao đổi thứ cấp của vi khuẩn cộng sinh mang hoạt tính kháng khuẩn, ngăn cản các vi sinh vật khác xâm nhập vào xác chết côn trùng, bảo vệ nguồn thức ăn cho tuyến trùng

1.4.1 Hoạt tính kháng vi sinh vật

Sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn cộng sinh là những dẫn xuất indol, xenorhabdin và xenocoumacins

Xenorhabdin có hoạt tính kháng khuẩn [35], Xenorhabdin I, II, III, IV

và V là những chất kháng sinh và thuốc trừ sâu Các chất này được tổng hợp

từ X nematophila hay X luminesce Trong đó, xenorhabdin I và III được phân lập từ X bovienii ATCC 39497 nhờ sử dụng sắc ký cột Những hợp chất

hoá học này tương ứng với xenomides I và III là đều có hoạt tính kháng

khuẩn và kháng nấm khi chúng lần lượt kháng lại Bacillus subtillis và Botrytis cinerea [41,42]

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của xenorhabdincin

Nematophin đã được phân lập từ X nematophila và phát hiện trong tất

cả các dạng của X nematophilus có hoạt tính mạnh mẽ chống lại một loạt các

loài nấm và vi khuẩn

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của nematophin

Vi khuẩn cộng sinh sản sinh ra những kháng sinh có kích thước phân tử lớn và nhỏ Kháng sinh phân tử nhỏ ức chế sự phát triển của nhiều loài vi khuẩn và nấm, nhiều trong số đó quan trọng đối với nông nghiệp và y dược,

như Escherichia, Staphylococcus, Aspergillus và Botrytis Trái lại, kháng

sinh phân tử lớn như bacteriocin ức chế sự phát triển của nhiều loài và chủng

có quan hệ gần gũi với Xenorhabdus và Photorhabdus [23] Akhurst (1982) cho thấy hoạt tính kháng sinh của Xenorhabdus spp chống lại nhiều vi sinh vật, gồm vi khuẩn gram dương Micrococcus, Staphylococcus và Bacillus, vi khuẩn gram âm như Escherichia, Shigella, Enterobacter, Seratia, Proteus, Erwinia, Flavobacterium và Pseudomonas, và nấm Candida và Saccharomyces Chen et al (1994) quan sát hoạt tính kháng sinh mạnh ở dịch nuôi cấy VKCS đối với nấm gồm Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Mucor piriformis, Pythium coloratum, Pythium ultimum, Penicillium spp., Rhizoctonia solani, Trichoderma pseudokingii và Verticillium dahliae

Sau khi các chất kháng sinh hydroxystilbenes và indoles được tách

chiết từ dịch nuôi cấy Photorhabdus và Xenorhabdus bởi Paul et al (1981),

nhiều chất kháng sinh được thông báo như xenorhabdins [36]; xenocoumacins [40], xenorxides [34], xenomins và nematophin [35] (bảng 1.2)

Bảng 1.2 Danh mục các chất kháng sinh

và hoạt tính sinh học của chúng đƣợc biết từ Xenorhabdus spp

Tên loài Chất kháng sinh Hoạt tính Tài liệu tham khảo

X nematophila Xenocoumacin 1,2,3 McInemey et al., 1991a

Xenorhabdin 1,2,4 McInemey et al., 1991b;

Li et al.,1995

X bovienii Indole derivatives 1,2 Paul et al., 1998;

Li et al.,1995

Xenorhabdins 1,2,4 McInemey et al., 1991b;

Li et al.,1995

X beddingii Bacteriocin 1 Boemare et al., 1992 Xenorhabdus

spp

Xenorcournacin 1,2,3 McInemey et al., 1991b

Ghi chú:

1: Kháng khuẩn 2: Kháng nấm

3: Ngừa u sơ 4: Diệt côn trùng

1.4.2 Hoạt tính diệt côn trùng

Mc Inerney et al., (1991a) xác định 5 chất nguồn gốc từ dithiopyrolone, xenorhabdins, từ dịch nuôi Xenorhabdus spp., và trong số đó xenorhabdin II

cũng có tác dụng diệt côn trùng

Xenorhabdin II gây chết 100% cho ấu trùng Heliothis punctigera ở 150

g/ml với liều LC50 là 59,5 g/ml Nó cũng làm giảm trọng lượng của ấu trùng còn sống sót Ở nồng độ 37,5 g/ml chỉ có 18,8% ấu trùng chết nhưng giảm 64,7% trọng lượng của ấu trùng sống sót so với đối chứng

1.4.3 Hoạt tính diệt tuyến trùng ký sinh thực vật

Hu et al.,(1995) thấy rằng dịch nuôi Xenorhabdus và Photorhabdus

trong môi trường nước thịt (TSB) có độc đối với ấu trùng giai đoạn 2 của giun

tròn ký sinh rễ Meloidogyne incognita, và đối với ấu trùng và con trưởng thành của giun tròn ký sinh ở gỗ thông Bursaphelenchus xylophilus Tác dụng độc tố của dịch nuôi Xenorhandus spp lên ấu trùng giai đoạn 2 và trứng của

M incognita được công bố bởi Grewal et al., (1999) Các nghiên cứu khác

cho thấy indole và 3,5- dihydroxy-4- isopropylstilbene (ST) tách từ dịch nuôi

Photorhabdus luminescens cũng có hiệu lực diệt giun tròn thực vật [25]

Ở liều 100 g/ml, ST gây chết gần 100% cho ấu trùng giai đoạn 4 và

con trưởng thành của giun tròn Aphelenchoides rhytium và Bursaphelenchus spp và những giun tròn ăn vi khuẩn Canorhabditis elegans Tuy nhiên, không

Hình 1.3 Công thức hoá học của 3,5- dihydroxy-4-

isopropylstilbene

gây chết cho ấu trùng giai đoạn 2 của M incognita hoặc ấu trùng cảm nhiễm của giun tròn ký sinh côn trùng H Megidis, thậm chí ở nồng độ 200 g/ml của ST, Inodole gây chết cho một số loài giun tròn ở nồng độ 300 g/ml, và

gây liệt cho Bursaphelenchus spp (300 g/ml), M incognita (100 g/ml) và Heterorhabditis spp (400 g/ml)

Thành phần diệt giun tròn của các chất trao đổi chất thứ cấp được sản

sinh bởi Xenorhabdus và Photorhabdus gây ngạc nhiên về mối quan hệ cộng

sinh gần giữa giun tròn ký sinh thực vật và vi khuẩn cộng sinh Bằng cách giết chết hoặc đẩy lùi các loài giun tròn khác cạnh tranh cả về thức ăn và nơi sống, EPN tăng cơ hội sống sót của chúng Đặc biệt, quanh rễ thực vật mà các loài giun tròn khác và côn trùng hay sinh sống, EPN sống sót sẽ tìm kiếm và sau

đó xâm nhập và phát triển trong côn trùng với ít sự cạnh tranh [11]

1.4.4 Một số hoạt tính khác

Xenocoumacins ngoài tác dụng kháng sinh còn có tác dụng chống độc gây ra bởi stress Hoạt tính dược học của xenocoumacins tương tự như amicoumacins có tác dụng độc cấp tính với chuột [28]

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của xenocoumacins

Dẫn xuất của dithiolopyrrolone, thiolutin có tác dụng chống ung thư ở

tế bào biểu mô khí quản của chuột bình thường Tuy nhiên, chất này không có hiệu quả ở tuyến vú của chuột [41] Gần đây, một số dẫn xuất

dithiolopyrrolone từ Xenorhabdus , cho thấy khả năng chống ung thư như ung

thư phổi, trực tràng, da, tuyến tiền liệt, vú và ung thư vòm họng [39]

1.5 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

1.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Glaser (1929) là người đầu tiên đã phát hiện tuyến trùng ký sinh ở bọ

cánh cứng Nhật Bản (Popillia japonica) ở New Jersey, Mỹ Ông cũng là người đầu tiên nhân nuôi thành công tuyến trùng Steinernema glaseri để

phòng trừ loài sâu hại này Mặc dù vậy, trong thời gian này do sự bành trướng của thuốc hoá học nên thành tựu quan trọng này của ông chưa được đánh giá

và ít được chú ý Chỉ đến đầu những năm 1970, xuất hiện sự kháng thuốc của sâu hại và các hậu quả môi trường do thuốc hoá học gây ra nên các tác nhân sinh học, trong đó có tuyến trùng mới được quan tâm [3]

Ngày nay, các tuyến trùng EPN đang được quan tâm khoa học lớn không chỉ vì chức năng là tác nhân kiểm soát sinh học, mà là vì tầm quan trọng về y tế và nông nghiệp; tiềm năng của các sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn cộng sinh của chúng

Gần đây trên thế giới cũng có nhiều nghiên cứu về các sản phẩm trao đổi chất từ vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng EPN và ứng dụng của chúng như: tìm ra các hợp chất có hoạt tính kháng vi sinh vật, xác định công thức hóa học của chúng, thử khả năng kháng khuẩn, kháng nấm và ngăn ngừa sự tăng sinh của dòng tế bào ung thư [29, 39]

Hơn 30 hoạt chất trao đổi thứ cấp thuộc các nhóm khác nhau đã tìm

thấy từ dịch nuôi cấy của Xenorhabdus và Photorhabdus Những sản phẩm

trao đổi chất này không chỉ đa dạng về cấu trúc hóa học mà còn đa dạng về hoạt tính sinh học đối với y học và nông nghiệp, như kháng khuẩn, kháng nấm, côn trùng và giun tròn thực vật, chống viêm, chống ung thư và kháng virus [29]

Các kháng sinh được sản sinh bởi vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng EPN nhằm ngăn chặn các vi khuẩn khác xâm nhập để dành nguồn thức ăn cho tuyến trùng Các kháng sinh đang hoạt động chống lại vi khuẩn gram dương

và gram âm, và đã được thử nghiệm chống viêm vú phân lập từ bò sữa Khả

năng kháng vi sinh vật của các chủng X nematophila, X budapestensis và X szentirmaii đã được thử nghiệm với bệnh viêm vú do Staphylococcus aureus, Escherichia coli và Klebsiella pneumoniae [39]

1.5.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Nghiên cứu về tuyến trùng ở Việt Nam được bắt đầu từ năm 1997 và đến nay đã đạt được một số thành tựu đáng kể Các nhà khoa học đã điều tra, phân lập, mô tả đặc điểm hình thái và sinh học, cơ chế xâm nhập và phát triển của tuyến trùng EPN Nghiên cứu phát triển công nghệ sản xuất tuyến trùng EPN, bước đầu sản xuất chế phẩm sinh học tuyến trùng- thuốc trừ sâu sinh học đáp ứng cho nền nông nghiệp nước nhà

Cho đến nay ở Việt Nam đã phân lập được khoảng hơn 40 chủng từ các vùng sinh thái khác nhau, một số loài đã được nghiên cứu về khả năng diệt sâu hại để ứng dụng trong thực tiễn phòng trừ sinh học Từ năm 1999, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã bắt đầu sản xuất chế phẩm sinh học tuyến trùng Cho tới nay, đã sản xuất được 7 chế phẩm sinh học tuyến trùng và kết quả thử nghiệm cho thấy những chế phẩm này có thể diệt được gần 30 loài sâu hại khác nhau [8]

Tuy nhiên, những nghiên cứu về vi khuẩn cộng sinh và hoạt chất của chúng ở Việt Nam còn rất ít Nhóm nghiên cứu của Trịnh Hồng Thái và cs đã

nghiên cứu về proteinase do vi khuẩn Xenorhabdus sp XS4 và Xenorhabdus

sp CA Kết quả cho thấy các vi khuẩn này đã tiết ra môi trường nuôi cấy các proteinase, hoạt độ proteinase mạnh nhất ở pH 8 [12,13]

Dự án: “Genomic approaches to metabolite exploitation from Xenorhabdus / Photorhabdus - GAME XP” là dự án giữa Việt Nam, Thái Lan,

CHLB Đức và Anh do EC tài trợ với mục đích nghiên cứu các hợp chất tự nhiên từ chất tiết của vi khuẩn Xenorhabdus/Photorhabdus cộng sinh với

tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Steinernema và Heterorhabditis phục

vụ trong y dược Ở Việt Nam, dự án sẽ tập trung phân lập, phân loại tuyến trùng cùng với vi khuẩn cộng sinh và tách chiết các hoạt chất sinh học Trong khuôn khổ của dự án, Phan Kế Long & cs (2009) đã phân lập được một số loài tuyến trùng, vi khuẩn cộng sinh ở một số vùng ở Việt Nam và cũng đã xác định được hợp chất Diketopiperazin từ sản phẩm trao đổi chất thứ cấp của

vi khuẩn Xenorhabdus sp cộng sinh với tuyến trùng Steinernema robustispiculum TN 21[10]

Chính vì vậy, nghiên cứu về vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng và hoạt chất sinh học của chúng có thể sẽ là hướng nghiên cứu mới có ý nghĩa khoa học và thực tiễn trong y học và nông nghiệp

Chương II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

2.1.1 Tuyến trùng

Tuyến trùng Steinernema sp.TĐ3 ở Tam Đảo, Vĩnh Phúc do phòng

Tuyến trùng học – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật cung cấp

Hình 2.1: Tuyến trùng (IJs) Steinernema sp.TĐ3 2.1.2 Ấu trùng Bướm sáp lớn

Ấu trùng Bướm sáp lớn (Galleria mellonella) được nhân nuôi tại

phòng thí nghiệm Tuyến trùng học – Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật

Hình 2.2 Ấu trùng bướm sáp lớn Galleria mellonella

2.1.3 Vi sinh vật kiểm định (VSVKĐ)

Các chủng vi sinh vật kiểm định được cung cấp từ phòng Vật liệu sinh học - Viện Công nghệ sinh học , Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Vi khuẩn Gram (-): Escherichia coli ATCC 25922

Pseudomonas aeruginosa ATCC 25923

- Vi khuẩn Gram (+): Bacillus subtilis ATCC 27212

Staphilococcus aureus ATCC 12222

- Nấm sợi : Aspergillus niger (439)

Fusarium oxysporum (M42)

- Nấm men : Candida albicans (SH 20)

Saccharomyces cerevisiae (ATCC 7754)

2.1.4 Dụng cụ, hóa chất và thiết bị nghiên cứu

* Hóa chất và dụng cụ

- Các hóa chất, dụng cụ được sử dụng trong nghiên cứu của các hãng Merck (Đức), Biomedicals Inc (Mỹ), guangzhou Jinhuda Chemical (Trung Quốc), Himedial Labiratiries Ltd (Ấn Độ), BDH Chemicals Ltd (Anh)

- Bộ sinh phẩm DNeasy Blood and Tissue Kit của hãng QIAgen dùng

để tách chiết DNA tổng số từ dịch chứa vi khuẩn

- Bộ sinh phẩm MinElute của hãng QIAgen để tinh sạch sản phẩm PCR

* Thiết bị

Nghiên cứu có sử dụng các thiết bị của phòng Khai thác chế biến tài nguyên thiên nhiên, phòng Hóa sinh biển- Viện Hóa học các HCTN; phòng Tuyến trùng học- Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật và phòng

Hệ thống học phân tử và di truyền học bảo tồn - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

- Bể ổn nhiệt

- Bộ điện di (Advance Tech, Nhật Bản)

- Cân phân tích 10-4g (Mettler Toledo)

- Kính hiển vi

- Kính hiển vi soi nổi

- Lò vi sóng

- Máy cô quay chân không

- Máy khuấy trộn Vortex (RotoLap, OSI)

- Máy lắc điều nhiệt

- Máy li tâm lạnh (Sorvall Biofuge Fresco)

- Máy ly tâm (Microcentrifuge- Sorvall, Mỹ)

2.2.1 Môi trường phân lập vi khuẩn cộng sinh (Môi trường NBTA) [3]

Tryptone 1%, Cao nấm men 0,5%, NaCl 0,5%, Bromothymon Blue (BTB) 0,0025%, Triphenyltetrazolium Chloride (TTC) 0,004%, Agar 1,5%, pH7 Khử trùng ở 1atm/30 phút, để nguội môi trường < 500C mới bổ sung TTC

2.2.2.Môi trường nuôi cấy vi khuẩn cộng sinh (Môi trường LB)

Tryptone 1%, Cao nấm men 0,5%, NaCl 0,5%, Agar 1,5%, pH 7

Khử trùng ở 1atm/30 phút

2.2.3 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật kiểm định (VSVKĐ)

* Môi trường thử hoạt tính vi sinh vật trên đĩa thạch [5]

- Môi trường thạch- thịt- pepton (MPA) (đối với vi khuẩn)

Cao thịt 0,3%, Pepton 1%, NaCl 0,5%, Agar 1,5%, pH 7

Khử trùng ở 1atm trong 30 phút

- Môi trường Sabouraud (đối với nấm)

Glucose 3%, Pepton 1%; Agar 1,5%; pH 5– 6

Khử trùng ở 0,8 atm trong 30 phút

* Môi trường thử hoạt tính vi sinh vật theo phương pháp pha loãng liên tục trên phiến vi lượng 96 giêng

- Môi trường nuôi vi khuẩn: Môi trường Eurgon Broth (Difco)

- Môi trường nuôi nấm: Môi trường Mycophil (Difco)

2.3 Các phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp xâm nhiễm tuyến trùng vào ấu trùng BSL [3]

Tuyến trùng xâm nhiễm (IJs) thường được bảo quản lạnh ở 12 -140

C nên trước khi nhiễm nên để IJs ấm dần lên tới nhiệt độ phòng (20 – 240

C) Tiến hành gây nhiễm khoảng 50-60 tuyến trùng/ấu trùng BSL Để trong tối ở 25-280C Sau 24, 48h Thu những ấu trùng bướm sáp lớn đã chết để phân lập vi khuẩn cộng sinh và thu tuyến trùng IJs bằng phương pháp Whitetrap để giữ nguồn tuyến trùng cho các nghiên cứu tiếp theo

* Phương pháp whitetrap: Các xác ấu trùng BSL chết được để lên đĩa đồng hồ, quấn parafilm và để trong tủ ấm 280C trong khoảng 10-15 ngày, thu

ấu trùng cảm nhiễm, tinh sạch và bảo quản ở 120

C

2.3.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn cộng sinh

Ấu trùng bướm sáp lớn chết sau 24 -48h được chuyển vào một cốc thủy tinh và rửa bằng cồn 70 trong 5 -10 phút Mổ xác chết bằng panh kẹp lột

nhẹ phần lưng của xác sâu, chú ý không làm vỡ ruột ấu trùng bướm sáp lớn

để tránh nhiễm Dùng que cấy vòng đã vô trùng dưới ngọn lửa đèn cồn lấy một giọt huyết tương rồi cấy zic zăc trên đĩa petri có chứa môi trường NBTA Nuôi cấy trong tủ ấm ở 300

C, sau 24 - 48 h quan sát khuẩn lạc thu được

2.3.4 Xác định hình thái khuẩn lạc, tế bào VKCS

2.3.4.1 Quan sát hình thái khuẩn lạc các biến thể của VKCS [26,31]

Cấy chấm điểm vào giữa đĩa thạch có chứa môi trường NBTA + 0,8% Agar Để trong tủ ấm từ 24 -48h, quan sát sự khác nhau giữa khuẩn lạc pha sơ cấp và pha thứ cấp của vi khuẩn cộng sinh

Vi khuẩn cộng sinh ở pha sơ cấp có tiêm mao, có khả năng di động được nên có khả năng di chuyển trong môi trường thạch (0,8% Agar) còn pha thứ cấp thì không có khả năng này

2.3.4.2 Quan sát hình ảnh tế bào của vi khuẩn cộng sinh [3,5,6]

* Quan sát túi vi khuẩn cộng sinh trong cơ thể tuyến trùng

Tuyến trùng IJs sau khi tinh sạch được xử lý nhiệt bằng nước sôi ở 54-

600C Sau đó được cố định bằng một số hóa chất và làm tiêu bản Quan sát hình ảnh tuyến trùng và túi vi khuẩn dưới kính hiển vi điện tử

* Làm tiêu bản giọt ép để quan sát hình dạng tế bào của vi khuẩn

Nhỏ một giọt nước muối sinh lý lên phiến kính, dùng que cấy lấy vô trùng một khuẩn lạc VKCS và hoà trộn đều Đặt lamen lên và quan sát hình dáng tế bào VKCS dưới kính hiển vi điện tử

* Phương pháp nhuộm Gram (phương pháp Hucker cải tiến)

+ Pha hóa chất:

Dung dịch tím kế

tinh (Crystal

violet)

: 2g tím kết tinh hòa tan trong 20 ml ethanol 95%

0,8 g amomon oxalat hòa tan trong 80 ml nước cất

Trộn 2 dung dịch , giữ 48 h rồi lọc, bảo quản trong lọ tối Dung dịch Iod : Hòa tan 1 g Iod (Iodine) trong 3-5 ml nước cất, thêm 2 g

KI (Kali iodine), khuấy cho tan hết, thêm nước cất cho đủ

300 ml Bảo quản trong lọ tối Dung dịch tẩy

- Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần

- Nhuộm bằng dung dịch Tím kết tinh trong 1 phút, rửa nước, thấm khô

- Nhuộm lại bằng dung dịch Iod trong 1 phút, rửa nước, thấm khô

- Nhỏ dung dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước, thấm khô

- Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranin trong 2-3 phút, rửa nước, để khô trong không khí

- Soi kính: dùng vật kính dầu 100’

Kết quả: Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, Gram (-) bắt màu đỏ

2.3.5 Phương pháp xác định hoạt tính kháng VSVKĐ của chủng VKCS [2,6,7, 14]

2.3.5.1 Phương pháp thỏi thạch (đối với khuẩn lạc)

Môi trường đun cho tan chảy hoàn toàn và để nguội đến 400C, bổ sung 2% dịch vi sinh vật kiểm định đã lên men Phân phối môi trường có chứa vi sinh vật kiểm định vào đĩa petri

Vi khuẩn cộng sinh được cấy ziczăc trên đĩa thạch NBTA, nuôi trong tủ

ấm 300

C, 48-72h Dùng khoan nút chai đục lấy các thỏi thạch chứa VKCS trên bề mặt, đặt chúng vào đĩa petri đã cấy các chủng VSVKĐ Để các đĩa này trong tủ lạnh 12h cho chất kháng sinh khuyếch tán vào môi trường thạch, sau

đó đặt vào tủ ấm 370C đối với vi khuẩn, đọc kết quả sau 24h; tủ ấm 300C đối với nấm và đọc kết quả sau 48h Hoạt tính kháng VSV được xác định theo đường kính vòng vô khuẩn (D-d, mm): D là đường kính vòng vô khuẩn, d là đường kính thỏi thạch

2.3.5.2 Phương pháp đục lỗ thạch (đối với dịch nuôi cấy)

Phân phối môi trường có chứa 2% VSVKĐ vào đĩa petri dầy khoảng 0,8 -1 cm Xấy khô mặt thạch trong box cấy 45 phút Sau đó, dùng que đục lỗ

có đường kính 1cm đục lỗ trong đĩa thạch Bơm dịch nuôi cấy các chủng VKCS tuyến trùng đã ly tâm vào lỗ thạch sao cho dịch không tràn lên miệng

lỗ Để các đĩa thạch vào trong tủ lạnh 40C trong 12h để cho dịch nuôi cấy khuếch tán vào thạch Sau đó, chuyển các đĩa thạch sang tủ ấm 370C/24h với

vi khuẩn và 300C/48h đối với nấm men Quan sát và đo vòng vô khuẩn xung quanh lỗ thạch

Khả năng kháng khuẩn và kháng nấm gây bệnh được xác định bằng hiệu số (D-d) giữa đường kính vòng vô khuẩn tạo thành trên đĩa thạch (D) và đường kính của lỗ thạch (d)

Chủng nào có đường kính vòng vô khuẩn > 17 mm (tương ứng với 20 đơn vị kháng sinh quốc tế UI) thì được chọn để nghiên cứu tiếp

2.3.6 Xác định một số ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng kháng VSVKĐ của VKCS

2.3.6.1 Xác định ảnh hưởng của pH

Cấy 1 vòng que cấy VKCS vào 50 ml môi trường LB có thay đổi các giá trị pH từ 3, 4, 5, 6 ,7, 8 và nuôi cấy trên máy lắc ở 320 vòng/phút trong 48-72h Xác định khả năng kháng VSVKĐ bằng phương pháp đục lỗ thạch,

từ đó tìm được giá trị pH thích hợp cho quá trình sản sinh các chất kháng khuẩn, kháng nấm của VKCS

2.3.6.2 Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ

Tiến hành lên men với điều kiện nhiệt độ thay đổi: 20, 25, 30, 35, 40,

45, 500C trong 48-72h Xác định khả năng kháng VSVKĐ bằng phương pháp đục lỗ thạch, từ đó tìm được giá trị nhiệt độ thích hợp cho quá trình sản sinh các chất kháng khuẩn, kháng nấm của VKCS

2.3.6.3 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy

Nuôi cấy VKCS trong bình có chứa 250 ml môi trường LB + 5% chủng giống đã hoạt hoá sau 24h, lắc ở 320 vòng/phút và ở điều kiện nhiệt độ, pH xác định Tại các thời điểm của quá trình lên men: 0h, 24h, 48h, 72h, hút 5

ml dịch lên men, ly tâm, loại bỏ sinh khối, giữ lại dịch trong và thử khả năng kháng VSVKĐ bằng phương pháp đục lỗ thạch

2.3.7 Phương pháp tách chiết hoạt chất kháng VSV của chủng VKCS [7,38]

2.3.7.1 Thu nhận cặn chiết từ dịch lên men của các chủng VKCS

Dựa vào điều kiện nuôi cấy tối ưu của chủng VKCS, tiến hành lên men

500 ml dịch với 5 % dịch men giống Thu nhận dịch nuôi và chiết 3 lần ở nhiệt độ phòng với dung môi etylaxetat (EtOAc) theo tỷ lệ 1:1 Loại bỏ dung môi để thu được cặn chiết EtOAc nhờ thiết bị cô quay chân không Cặn chiết EtOAc này được dùng để thử hoạt tính các chủng VKCS lựa chọn

Quy trình thu nhận cặn chiết từ dịch lên men của các chủng VKCS được trình bày ở hình 2.3

Hình 2.3 Qui trình thu nhận cặn chiết từ dịch nuôi cấy chủng VKCS

2.3.7.2 Xác định hoạt tính kháng VSVKĐ từ cặn chiết EtOAc

Hoạt tính kháng vi sinh vật của cặn chiết EtOAc được tiến hành trên phiến vi lượng 96 giếng (96- well microtiter plate) theo phương pháp pha loãng liên tục của Vanden Bergher và Vlietlink [38]

- Chứng dương tính:

+ Ampicilin cho vi khuẩn Gr (+)

+ Tetracylin cho vi khuẩn Gr (-)

+ Nystatin hoặc Amphotericin B cho nấm sợi và nấm men

Kháng sinh pha trong DMSO 100% với nồng độ thích hợp: Ampicilin 50nM, Tetracylin 10 mM, Nystatin 0,04 mM

- Chứng âm tính: Vi sinh vật kiểm định không trộn kháng sinh và chất thử

Chiết với EtOAc 1:1 (3 lần)

Loại bỏ dung môi dưới

áp suất giảm Cặn chiết etylaxetat

- Tiến hành thí nghiệm:

Các chủng kiểm định được hoạt hóa và pha loãng tới nồng độ 0,5 đơn

vị Mc Fland rồi tiến hành thí nghiệm trên các phiến thí nghiệm

Chủng có hoạt tính sau sàng lọc ban đầu được pha loãng theo các thang nồng độ thấp dần, từ (5-10) thang nồng độ để tính giá trị nồng độ tối thiểu mà

ở đó vi sinh vật bị ức chế phát triển gần như hoàn toàn

Mẫu thô có MIC ≤ 200 μg/ml; mẫu tinh có MIC ≤ 50 μg/ml là có hoạt tính

2.3.8 Định loại VKCS dựa trên phân tích trình tự đoạn gen 16S rDNA

2.3.8.1 Tách chiết DNA tổng số

Để tách DNA tổng số của VKCS, sử dụng DNeasy Blood and Tissue Kit của hãng QIA gen Các bước tách chiết theo hướng dẫn của nhà sản xuất

và được tóm tắt dưới đây:

- Hút 500 μl dịch sinh khối tế bào nuôi cấy sau 18h cho vào ống eppendorf 1,5 ml và ly tâm loại dịch, thu xác tế bào vi khuẩn

- Rửa 3 lần bằng dung dịch PBS

- Bổ sung thêm hỗn hợp 200 μl dung dịch TE, 400 μl Digestion buffer,

3 μl Proteinase K; ủ ở 550C

- Thêm 260 μl cồn tuyệt đối, hòa trộn

- Chuyển toàn bộ dịch mẫu sang cột DNeasy Mini Spin (gọi tắt là cột) đặt trong ống thu dịch ly tâm (collection tube), ly tâm 10 000 vòng /phút trong

1 phút

- Chuyển cột sang ống thu dịch ly tâm khác, thêm 30 l Elution buffer,

để ấm trong 5 phút, ly tâm 8000 vòng /phút trong 1 phút

- Bỏ cột, bảo quản DNA tổng số thu được trong ống eppendorf 1,5

ml ở -200

C

2.3.8.2 Phương pháp nhân đoạn DNA đích bằng kỹ thuật PCR

Chuẩn bị hỗn hợp cho phản ứng PCR với thành phần như sau:

Trong đó, cặp mồi để nhân bản đoạn DNA đặc hiệu có trình tự sau:

Căn cứ thông số kỹ thuật của mồi do nhà sản xuất cung cấp, thiết lập chu trình nhiệt cho phản ứng như sau:

Bảng 2.2 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR Các giai đoạn PCR Nhiệt độ ( 0

C) Thời gian (giây) Số chu kỳ

25

2.3.8.3 Phương pháp điện di DNA trên gen agarose

- Chuẩn bị gel agarose 1%: Cân 0.4g bột agarose hòa tan trong 40ml dung dịch TBE 1X, đun cho bột agarose tan hết Khi gel hạ nhiệt độ xuống

khoảng 700C, đổ vào khuôn đã đặt sẵn lược điện di có độ dày răng lược thích hợp Để gel đông và ổn định hoàn toàn trong khoảng 1h

- Đặt gel vào bể điện di, đổ dung dịch TBE 1X ngập mặt gel và nhẹ nhàng rút răng lược ra

- Tra mẫu: mẫu DNA được trộn với dung dịch màu loading dye theo tỷ

lệ 5:1 và tra mỗi mẫu vào một giếng điện di theo thứ tự mẫu

- Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với hiệu điện thế 100 V Các phân tử AND sẽ chạy từ cực âm sang cực dương

- Gel sau khi chạy điện di được lấy ra và ngâm vào dung dịch EtBr có nồng độ 0.05 μg/ml trong khoảng 15 phút để nhuộm DNA Băng DNA trong gel có thể nhìn thấy trên máy soi gel bằng tia tử ngoại có bước sóng 302 nm

Kết quả điện di cho các vạch gọn , phân tách rõ ràng nghĩa là DNA trong mẫu đảm bảo độ tinh sạch cho nghiên cứu

Nếu các vạch kéo dài hoặc phân tách không rõ cần xử lý lai từ khâu xử

lý protease K, để đảm bảo đô tinh sạch của mẫu nghiên cứu

2.3.8.4 Tinh sạch sản phẩm PCR

Sử dụng bộ kit MinElute của hãng QIAgen để tinh sạch sản phẩm PCR

- Sau khi chạy điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1%, cắt đoạn gel chứa băng DNA của từng mẫu bằng dao nhỏ, sắc, sạch và cho vào ống eppepdof 1,5 ml

- Cân đoạn gel từng mẫu đã cắt Thêm 3 lần thể tích dung dịch QG theo

trọng lượng từng mẫu (1g gel tương đương 1000 μl dung dịch QG)

- Ủ ở 500C trong 10 phút cho tới khi gel tan hoàn toàn Để làm tan gel tốt, lắc đều các ống eppendorf vài lần trong quá trình ủ, mỗi lần cách nhau 2 -

3 phút Khi gel đã tan hoàn toàn, kiểm tra màu của dung dịch mẫu Màu của dung dich tốt là màu vàng của QG ban đầu

- Hút toàn bộ dung dịch cho vào cột MinElute (gọi tắt là cột) đặt trong ống thu dich ly tâm (collection tube) của Kit và ly tâm 13.000 vòng/phút

- Chuyển cột sang ống thu dịch ly tâm khác, cho 700 μl dung dịch PE vào cột, để mẫu ở nhiệt độ phòng khoảng 5 phút, ly tâm ở 13.000 vòng/phút

- Chuyển cột sang ống thu dịch ly tâm khác và ly tâm 13.000 vòng/phút

- Chuyển cột sang ống eppendorf 1,5ml đã ghi ký hiệu mẫu, cho 10μl

EB vào cột và ly tâm 13.000 vòng/phút

- Bỏ cột, bảo quản sản phẩm PCR trong ống eppendorf ở - 200C

2.3.8.5 Phân tích trình tự DNA

Mẫu sau khi tinh sạch được giải trình tự với thành phần hỗn hợp phản ứng:

C) Thời gian (giây) Số chu kỳ

- Chuyển cột sephadex sang ống eppendorf 1,5 ml

- Chuyển toàn bộ dung dịch của phản ứng giải trình tự của mỗi mẫu vào một cột sephadex và ly tâm 3.000 vòng/phút trong 2 phút

- Bỏ cột sephadex Sấy khô dung dịch của phản ứng giải trình tự trong ống eppendorf bằng máy ly tâm chân không tại 1.500 vòng/phút trong 10 phút ở 450

C

- Sản phẩm sau tinh sạch được gửi tới phòng Trọng điểm Công nghệ gen- Viện Công nghệ sinh học để đọc kết quả trên máy phân tích trình tự tự động ABI 3100 Avant Genetic Analyzer

2.3.8.7 Phân tích trình tự và lập cây phát sinh chủng loại

- Sử dụng chương trình BLAST để tìm kiếm các trình tự tương đồng đã được các tác giả khác công bố trên ngân hàng gen (Genbank)

- Sử dụng phần mềm MEGA 4.0 để phân tích khoảng cách di truyền và xây dựng cây phát sinh chủng loại theo các phương pháp Maximum Parsimony (MP), Minimum Evolution (ME)

Chương III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1 Khả năng gây chết BSL của tuyến trùng Steinernema sp.TĐ3

3.1.1 Gây nhiễm ấu trùng BSL

Ấu trùng cảm nhiễm (IJs) của tuyến trùng Steinernema sp.TĐ3 phân

lập từ Tam Đảo– Vĩnh Phúc được gây nhiễm cho ấu trùng BSL với mật độ 50-60 IJs/sâu Kết quả cho thấy, sau 24h thì sâu bắt đầu chết, xác ấu trùng BSL sẽ có màu vàng nâu, không có mùi thối và mềm nhưng dai khi gắp bằng kẹp và tỷ lệ chết là 100% sau 48h

Hình 3.1 Ấu trùng BSL chết do nhiễm Steinernema sp TĐ3 (bên trái);

và nhiễm Heterorhabditis sp TĐ17 (bên phải)

Tiến hành phân lập vi khuẩn cộng sinh từ xoang máu của ấu trùng vật chủ và thu ấu trùng cảm nhiễm (IJs) bằng phương pháp Whitetrap nhằm lưu giữ nguồn tuyến trùng cho các nghiên cứu tiếp theo

3.1.2 Thu tuyến trùng IJs bằng phương pháp Whitetrap

Các xác ấu trùng BSL sau khi chết tiến hành thu ấu trùng cảm nhiễm bằng phương pháp whitetrap và thu IJs sau 10-15 ngày

Hình 3.2 Thu tuyến trùng Ijs bằng phương pháp Whitetrap

3.1.3 Quan sát hình ảnh của túi VKCS trong cơ thể tuyến trùng Steinernema sp TĐ3

Hình 3.3 Hình ảnh vị trí của túi vi khuẩn cộng sinh

trong cơ thể tuyến trùng Steinernema sp TĐ3

Hình 3.3 cho thấy vi khuẩn cộng sinh nằm trong túi ở dưới thực quản

Túi vi khuẩn cộng

sinh trong cơ thể

tuyến trùng

Steinernema sp.TĐ3

3.2 Phân lập vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng Steinernema sp.TĐ3 3.2.1 Phân lập vi khuẩn cộng sinh

Các xác ấu trùng BSL ngay sau khi chết bởi tuyến trùng Steinernema

sp TĐ3 được sử dụng để phân lập VKCS Nuôi cấy trong tủ ấm ở 300

C trên môi trường NBTA trong 24- 48h Quan sát khuẩn lạc thu được

Hình 3.4 Khuẩn lạc vi khuẩn cộng sinh ở pha sơ cấp

Hình 3.5 Khuẩn lạc vi khuẩn cộng sinh ở pha thứ cấp

Hình 3.4 là hình ảnh khuẩn lạc ở pha sơ cấp có đặc điểm: khuẩn lạc to, tròn lồi, màu xanh đậm còn những khuẩn lạc ở pha thứ cấp (hình 3.5) có kích thước nhỏ hơn, tròn, lồi và màu đỏ nâu xẫm

3.2.2 Quan sát các biến thể của VKCS

Cấy chấm điểm vào giữa đĩa thạch (có chứa môi trường LB + 0,8% Agar) một vòng que cấy chủng vi sinh vật phân lập được, để trong tủ ấm ở

300C, 48-72h Quan sát hình ảnh của khuẩn lạc

Hình 3.6 Pha sơ cấp của VKCS Hình 3.7 Pha thứ cấp của VKCS

Khuẩn lạc của vi khuẩn ở pha sơ cấp có đặc điểm có đặc điểm là khuẩn lạc màu xanh, ở trên môi trường có chứa 0,8%Agar thì các vi khuẩn có khả năng di động nên tạo nhu động (swamming ) xung quanh khuẩn lạc Vùng quanh khuẩn lạc trong, một phần agar bị biến màu (hình 3.6)

Khuẩn lạc của vi khuẩn ở pha thứ cấp có đặc điểm là khuẩn lạc màu đỏ sẫm, không tạo thành vòng vùng trong suốt xung quanh khuẩn lạc (hình 3.7)

Lựa chọn các vi khuẩn ở pha sơ cấp cấy vào ống thạch nghiêng có chứa môi trường NBTA để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo

3.2.3 Quan sát hình ảnh tế bào các chủng vi khuẩn cộng sinh

Làm tiêu bản giọt ép và quan sát hình ảnh tế bào các chủng vi khuẩn cộng sinh ở pha sơ cấp dưới kính hiển vi quang học thì thấy rằng các chủng vi khuẩn phân lập được có dạng hình que, chuyển động được

Hình 3.8 Tế bào vi khuẩn cộng sinh

3 3 Nghiên cứu khả năng kháng VSVKĐ của chủng VKCS

3.3.1 Sàng lọc sơ bộ khả năng kháng VSVKĐ

Các chủng VKCS sau khi xâm nhập vào côn trùng vật chủ có thể tạo ra nhiều các sản phẩm trao đổi chất vừa có tác dụng gây sốc nhiễm trùng huyết vật chủ nhanh chóng, vừa giúp cho tuyến trùng cộng sinh với chúng có thể sử dụng nguồn dinh dưỡng dễ dàng hơn Trong những sản phẩm trao đổi chất (sơ cấp và thứ cấp), các chất kháng khuẩn, kháng nấm do VKCS sinh ra có vai trò ngăn chặn sự xâm nhập bất lợi của các VSV khác trong đất vào xác ấu trùng vật chủ, nhằm bảo vệ nguồn thức ăn cho tuyến trùng Những VKCS này là nguồn VSV mới có thể sẽ hữu ích trong nghiên cứu khả năng sinh các hoạt chất kháng các tác nhân gây bệnh Vì vậy, trong khuôn khổ luận văn thạc sĩ,

sau khi phân lập được các chủng VKCS từ tuyến trùng Steinernema sp TĐ3,

tiếp tục đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật theo phương pháp thỏi thạch để sàng lọc, tuyển chọn các chủng có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm cho các định hướng tiếp theo Kết quả được trình bày ở bảng 3.1