Đánh giá mức độ Methyl hóa tại các đảo CpG thuộc vùng Promoter gen APC trên các bệnh ung thư

Các ph ng pháp ch n đoán ung th.. Các ph ng pháp ch n đoán ung th vú... Các xét nghi m khác VIA, HPV, khoét chóp sinh thi t CTC..... quá trình phân bào nh các enzyme methyltransferases D

T V N

Theo th ng kê c a T Ch c Y T Th Gi i (WHO), trên th gi i có kho ng 14,1 tri u tr ng h p ung th m i và 8,2 tri u tr ng h p t vong x y ra trong

n m 2012, so v i 12,7 tri u tr ng h p m i m c b nh và 7,6 tri u tr ng h p t vong trong n m 2008 c tính cho th y, n m 2012, có 32,6 tri u ng i (trên đ

tu i 15 n m) còn s ng, mà đư đ c ch n đoán m c ung th trong n m n m tr c

đó Ung th vú và ung th c t cung là hai lo i ung th th ng g p và gây t vong cao ph n [64]

Gen APC là gen c ch kh i u đa ch c n ng n m t i v trí 5q21-q22 trên nhi m

s c th s 5 c a b gen ng i Gen APC bao g m 15 exon n m trong m t locus 98-kilobase [83] S methyl hóa x y ra t i các đ o CpG xung quanh vùng promoter gen APC, d n đ n c ch s bi u hi n c a gen, là nguyên nhân d n t i ung th [30]

S methyl hóa DNA là s bi n đ i phân t g n nhóm -CH3 vào v trí Cytosin trong các đ o CpG c a trình t DNA Nhi u báo cáo khoa h c trên th gi i cho th y s methyl hóa vùng promoter c a gen APC (Adenomatous polyposis coli gene) là d u

ch ng sinh h c ti m n ng trong vi c tiên l ng và ch n đoán b nh ung th [37] [55] [30]

Trên th gi i, vi c nghiên c u đánh giá t n s methyl hóa c a gen APC đ c

th c hi n nhi u lo i ung th nh : ung th đ i tr c tràng [29][51], ung th ph i

[53][89], ung th vú [9][55][86][89], ung th bàng quang [31], ung th c t cung [21] Tuy nhiên, d li u v s methyl hóa vùng promoter gen APC đ i v i b nh ung th

Vi t Nam ch a đ c công b nhi u Do v y, chúng tôi th c hi n chuyên đ khóa

lu n t t nghi p: " ÁNH GIÁ M C METHYL HÓA T I CÁC O CpG THU C VÙNG PROMOTER GEN APC TRÊN CÁC B NH UNG TH " v i

m c tiêu h ng đ n tìm d u ch ng sinh h c ti m n ng trong tiên l ng, ch n đoán

b nh ung th nói chung và ung th vú, ung th c t cung nói riêng N i dung nghiên c u bao g m:

 Kh o sát in silico

- Thu th p thông tin v đ c đi m, c u trúc c a gen APC và m i t ng quan v

s methyl hóa trên gen APC v i các b nh ung th , đ c bi t là ung th vú và ung

 Kh o sát th c nghi m

- Kh o sát đ đ c hi u, nhi t đ lai t i u cho c p m i methyl và unmethyl

- Th c hi n quy trình ph n ng MSP đ đánh giá m c đ methyl hóa vùng promoter gen APC v i các m u sinh thi t mô vú t nh ng b nh nhân m c ung th

vú (kèm theo thông tin m u và các ch tiêu lâm sàng) và các m u mô vú lành tính,

đ c cung c p t b nh vi n i h c Y D c TP H Chí Minh; m u máu ho c

d ch ph t t bào âm đ o đ c xác đ nh nhi m HPV ki u gen nguy c cao và nguy

c th p, m u máu ho c d ch ph t t bào âm đ o lành tính (kèm theo các ch tiêu lâm sàng) đ c công ty c ph n công ngh Vi t Á cung c p

Ph n I:

T NG QUAN

I.1 Ung th

I.1.1 nh ngh a ung th

Ung th là thu t ng mô t m t nhóm các b nh lỦ ác tính c a t bào mà khi b kích thích b i các tác nhân sinh ung th , t bào t ng sinh vô h n, không tuân theo các c ch ki m soát v phát tri n c a c th , xâm l n c c b (xâm l n các mô g n) hay di c n qua h th ng b ch huy t hay m ch máu Quá trình di c n là nguyên nhân gây t vong chính c a ung th (WHO) [92]

a s các lo i ung th đ u hình thành các kh i u ác tính và kh i u lành tính U lành tính ch phát tri n t i ch và th ng phát tri n r t ch m, không xâm l n, không

di c n, khi đ c ph u thu t c t b , kh i u s không tái phát U ác tính th ng phát tri n nhanh, u th ng không có ranh gi i rõ, xâm l n ra xung quanh và th ng di

c n xa theo đ ng máu và h ch b ch huy t [106]

I.1.2 Phân lo i ung th

Ung th có th đ c phân lo i d a theo tính ch t gi i ph u b nh ho c theo c quan b t n th ng Các t bào ung th trong m t kh i u (bao g m c t bào đư di

c n) đ u xu t phát t m t t bào duy nh t phân chia mà thành Do đó m t b nh ung th có th đ c phân lo i theo lo i t bào kh i phát và theo v trí c a t bào

đó Tuy nhiên, trong nhi u tr ng h p, ng i ta không xác đ nh đ c kh i u nguyên phát [97] Ung th xu t phát t t bào g c đa n ng, th ng hi n di n tinh hoàn ho c bu ng tr ng [100][102]

 Ung th bi u mô (carcinoma)

Ung th bi u mô dùng đ ch m t kh i u ác tính có ngu n g c t t bào bi u

mô và niêm m c bên trong ho c bên ngoài c a c th nh ng tiêu hóa hay các tuy n tiêu hoá Ung th bi u mô, chi m 80-90% c a t t c các tr ng h p ung th Ung th bi u mô nh h ng đ n các c quan ho c các tuy n có kh n ng bài ti t,

nh tuy n vú s n xu t s a, ph i ti t ch t nh y, đ i tràng, tuy n ti n li t ho c bàng quang

 B nh lý huy t h c ác tính (hematological malignancy) nh b nh b ch c u

(leukemia) và u lympho bào (lymphoma), xu t phát t máu và t y x ng

B nh b ch c u th ng liên quan đ n vi c s n xu t quá m c các t bào b ch c u

ch a tr ng thành, các t bào này không đ y đ các ch c n ng mi n d ch, do đó

b nh nhân th ng d b nhi m trùng B nh b ch c u c ng nh h ng đ n các t bào h ng c u, có th gây đông máu và m t m i do thi u máu

U lympho có xu h ng phát tri n trong h b ch huy t (lá lách, amidan, và tuy n c)

 Ung th mô liên k t (sarcoma) là nhóm ung th xu t phát t mô liên k t,

x ng hay c , gân, s n, và ch t béo

 U h c t do r i lo n c a t bào s c t

 U quái b t ngu n t các t bào m m

I.1.3 B nh ung th vú

Ung th vú là nguyên nhân gây t vong ph bi n nh t trong các b nh ung th

ph n B nh ung th vú liên quan đ n s phát tri n b t th ng c a các t bào có ngu n g c t các mô vú [49] Ung th vú không ch x y ra ph n mà còn c nam gi i, t l m c b nh nam gi i chi m kho ng 1% c a t t c các tr ng h p ung th vú [91]

 Các y u t nguy c d n đ n ung th vú:

Các y u t nguy c chính đ i v i b nh ung th vú là gi i tính n và ng i l n

tu i Y u t nguy c khác bao g m: Ti n s gia đình, n i ti t t , l i s ng và ch đ

n u ng thi u khoa h c, môi tr ng s ng b ô nhi m

 Tu i và gi i tính

Nguy c phát tri n ung th vú t ng theo tu i tác H u h t các tr ng h p ung

th vú ti n tri n đ c tìm th y ph n trên 50 tu i Ph n có nguy c b ung

th vú cao h n 100 l n so v i đàn ông [68]

 Ti n s gia đình

N u m t vài thành viên c a gia đình b nh nhân đư b ung th (ung th vú, ung

th t cung, ung th bu ng tr ng, ho c ung th ru t k t ) b nh nhân có th có nguy c phát tri n ung th vú [44]

M t s ng i có nh ng đ t bi n di truy n d n

đ n nhi u kh n ng phát tri n ung th vú, ph bi n nh t đ c tìm th y trong các gen BRCA1, BRCA2 và m t s gen khác ít ph bi n nh p53, CHEK2, ATM, BRIP, PALB2, PTEN, và STK11 [17]

 N i ti t t

Thay đ i m c đ hormon nh estrogen, progesterone trong c th có th kích thích phát tri n ung th vú N i ti t t b nh h ng trong giai đo n b t đ u và k t thúc c a chu k kinh nguy t, mang thai s m, li u pháp thay th hormon, s d ng thu c u ng [68]

 L i s ng và ch đ n u ng

C th ít đ c v n đ ng, ch đ n u ng nhi u ch t béo b nh nhân béo phì

và đ c bi t là ph n mãn kinh có th gây ra ung th vú S d ng r u, đ u ng

có c n, hút thu c c ng là y u t nguy c gây ra ung th vú [25][58]

 Y u t môi tr ng

Y u t môi tr ng có th làm t ng nguy c ung th ng i nh ti p xúc v i hóa ch t, tia b c x [25][58]

I.1.4 Ung th c t cung:

Ung th c t cung là ung th đ ng th hai trong s các lo i ung th th ng

g p ph n trên toàn th gi i và là nguyên nhân chính gây t vong do ung th

ph n thu c các n c đang phát tri n

 Các y u t nguy c d n đ n ung th c t cung:

H u nh t t c các tr ng h p ung th c t cung đ u có liên quan đ n HPV (Human Papiloma Virus), m t lo i vi rút có DNA đ c thù theo mô, d lây lan và lây lan r ng rãi HPV là vi rút d lây nhi m qua đ ng tình d c nh t Không có thu c đi u tr đ c hi u cho nhi m HPV [81]

HPV là m t t h p các ch ng vi rút khác nhau [62] Trên th gi i đư bi t t i h n

100 ch ng HPV Vi rút HPV đ c chia làm 2 nhóm: nhóm nguy c cao và nhóm nguy c th p (v tính gây ung th ) Các nhóm nguy c cao gây ra h u h t các b nh ung th vùng h u môn - sinh d c, trong khi các nhóm nguy c th p có th gây sùi mào gà sinh d c, t bào c t cung b t th ng, b nh u nhú đ ng hô h p tái phát,

ho c ph bi n nh t là các viêm nhi m không có tri u ch ng và không phát hi n qua th m khám lâm sàng [80] H u h t các tr ng h p ung th c t cung đ u phát

hi n có nhi m HPV nguy c cao; trái l i nhóm HPV nguy c th p thì hi m khi

g p[1]

Có ít nh t 13 ki u gen HPV có nguy c cao Hai ki u gen HPV có nguy c cao liên quan t i kho ng 70% t t c các tr ng h p ung th c t cung là HPV-16 và HPV-18 Bên c nh đó, HPV-45 và HPV-31 c ng có liên quan đ n ung th c t cung, chi m kho ng 4% s ca m i ki u gen [23][78]

H u h t các viêm nhi m c t cung đ u t bi n m t mà không đ l i tri u

ch ng, nh ng viêm nhi m kéo dài v i các ki u gen HPV có nguy c cao có th gây nên các t n th ng trong bi u mô c t cung Trong s các ph n nhi m các

lo i HPV nguy c cao, kho ng t 5-10% s chuy n thành viêm nhi m HPV kéo dài, d n đ n t ng nguy c xu t hi n các t n th ng ti n ung th c t cung N u không đ c đi u tr , các t n th ng ti n ung th này s ti n tri n thành ung th c

t cung xâm l n [78][79]

I.1.5. Các ph ng pháp ch n đoán ung th

I.1.5.1 Các ph ng pháp ch n đoán ung th vú

Theo t ch c y th th gi i (WHO), ch n đoán s m là chi n l c đ đi u tr thành công ung th vú, đ c bi t là các n c có thu nh p th p và trung bình, n i

b nh ung th vú th ng ch đ c ch n đoán giai đo n cu i [104]

 Ch p c ng h ng t MRI

MRI s d ng t tr ng đ quan hình nh chi ti t và cho phép phân bi t m c đ

t n th ng c a các mô trong c th MRI c ng có th đ c s d ng đ sàng l c ung th vú nh ng ph n có nguy c m c b nh cao

 Sinh thi t t bào

M u b nh ph m có đ c qua sinh thi t b ng m t kim nh thích h p cho vi c

ch n đoán t bào h c Sau đó, m u mô đ c ki m tra d i kính hi n vi đ phân tích tr ng thái c a b nh Tuy nhiên, sinh thi t t bào b ng kim nh có th x y ra

hi n t ng âm tính gi khi m i kim không ch m đ c đ n mô ung th

I.1.5.2.Các ph ng pháp ch n đoán ung th c t cung

Theo t ch c y t th gi i (WHO), ung th c t cung có th đ c đi u tr thành công khi nó đ c phát hi n s m Các xét nghi m Pap’s smear (ph t t bào)

là th nghi m duy nh t đ c s d ng r ng rãi trong ch n đoán và đư đ c ch ng minh là làm gi m t l m c ung th c t cung và t vong Các xét nghi m khác (VIA, HPV, khoét chóp sinh thi t CTC ) c ng h a h n mang l i hi u qu trong

ch n đoán và đi u tr

 Sàng l c t bào h c ậ Pap’s smear

N m 1949, George Papanicolaou đư đ a ra m t ph ng pháp t bào h c phát

hi n nh ng b t th ng c a t bào bi u mô CTC đ phát hi n s m ung th CTC,

đ c g i là Pap’s smear Nguyên lý d a trên tính ch t bong ra m t cách t nhiên, liên t c c a t bào âm đ o, CTC, đ c bi t là các t bào b t th ng có tính ch t bong s m và r t d bong

Phân tích hình thái h c chi ti t, d u hi u c a t bào b nhi m HPV là s b bi n

đ i thành các d ng t bào đa nhân, t bào đa nhân kh ng l , ho c nhân teo l i, hay

có th tìm th y t bào bóng, t bào có vòng sáng quanh nhânầ

Ph ng pháp Pap’s smear có đ nh y 44-78% và đ đ c hi u cao 91-96% Tuy nhiên ph ng pháp này c ng có t l âm tính gi , theo các tác gi giao đ ng t 1,1 -29,7% [4]

 Soi c t cung

Soi c t cung đ c s d ng khi k t qu sàng l c c t cung b t th ng, ho c

có tri u ch ng c a ung th c t cung Soi c t cung s d ng m t kính hi n vi

nh đ tìm b t k b t th ng trong c t cung Trong khi ki m tra c t cung, bác

s ph khoa có th lo i b m t m u mô nh (sinh thi t) đ có th ki m tra d i kính hi n vi cho các t bào ung th [54]

 Khoét chóp sinh thi t c t cung

Khoét chóp sinh thi t c t cung là ph ng pháp chính trong ch n đoán và

đi u tr nh ng b nh nhân ung th c t cung giai đo n s m Trong ph ng pháp này, m u mô hình nón nh c a c t cung s đ c lo i b đ ki m tra d i kính

hi n vi cho các t bào ung th [54]

 Quan sát b ng m t th ng v i acid acetic (VIA)

Ph ng pháp VIA s d ng dung d ch acid acetic 3-5% (d m) x t ho c bôi lên

b m t c t cung và quan sát c t cung b ng m t th ng sau 1 phút N u quan sát th y các vùng b tr ng g n v i khu v c chuy n ti p thì xét nghi m này đ c coi là d ng tính đ i v i các thay đ i t bào ti n ung th ho c ung th xâm l n

s m Ph ng pháp VIA không đòi h i ph i có phòng xét nghi m hay nhân viên

đ c đào t o chuyên sâu K t qu cho th y ngay l p t c, cho phép đi u tr ngay trong l n đ u ki m tra nh y c a VIA t t b ng ho c t t h n đ nh y c a Pap’s smear, nh ng c ng gi ng nh Pap’s smear, ki m tra b ng m t th ng là r t ch quan, và c n ph i giám sát đ ki m soát ch t l ng c a các ph ng pháp ki m tra

b ng m t th ng VIA có th không phù h p l m ph n sau mãn kinh b i vì vùng chuy n ti p d ch chuy n vào ng c t cung khi mãn kinh [26][27][76][74]

 Ph ng pháp Sinh h c phân t HPV-PCR

M u máu ho c m u t bào t c t cung, âm đ o đ c l y và đ c xét nghi m

d a trên k thu t sinh h c phân t đ c bi t là PCR M t u đi m c a xét nghi m DNA HPV là khi đ c th c hi n trong các đi u ki n lỦ t ng, ph ng pháp này không mang tính ch quan nh ph ng pháp sàng l c b ng m t th ng và sàng

l c t bào h c Bên c nh vi c xác đ nh đ c nh ng ng i đang có nguy c cao b

nhi m b nh, ph ng pháp này có th xác đ nh các ph n đư b b nh c t cung

[88]

I.1.6 Tình hình ung th trên th gi i và Vi t Nam:

I.1.6.1 Tình hình ung th trên th gi i

Theo GLOBOCAN 2012, c tính, trên th gi i có kho ng 14,1 tri u tr ng

h p ung th m i và 8,2 tri u tr ng h p t vong x y ra trong n m 2012, so v i 12,7 tri u tr ng h p m i m c b nh và 7,6 tri u tr ng h p t vong trong n m

2008 c tính cho th y, n m 2012, có 32,6 tri u ng i (trên đ tu i 15 n m) còn

s ng, mà đư đ c ch n đoán m c ung th trong n m n m tr c đó [69]

Các lo i ung th ph bi n nh t trên toàn th gi i đ c ch n đoán là ung th

ph i (1,8 tri u tr ng h p, chi m kho ng 13,0% t ng s tr ng h p), ung th vú (1,7 tri u tr ng h p, chi m kho ng 11,9%), và ung th đ i tr c tràng (1,4 tri u

tr ng h p, chi m kho ng 9,7%)[105 ]

Nguyên nhân ph bi n nh t gây t vong do ung th là ung th ph i (1,6 tri u

tr ng h p, chi m kho ng 19,4% t ng s ), ung th gan (0,8 tri u tr ng h p, 9,1%), và ung th d dày (0,7 tri u tr ng h p, chi m kho ng 8,8%)[69]

Theo th ng kê, ung th vú đang gia t ng m nh trên toàn th gi i, c tính

522000 tr ng h p ung th vú đư t vong trong n m 2012 (IARC, 2013) ng

th i c ng trong n m này, 1,7 tri u ph n đ c ch n đoán b ung th vú và có 6,3 tri u ph n còn s ng đư đ c ch n đoán b ung th vú trong n m n m tr c đó

K t n m 2008, c tính, t l m c b nh ung th vú đư t ng h n 20%, trong khi

t l t vong đư t ng lên 14% T l ung th vú cao nh t là trong các n c phát tri n, nh ng t l t vong t ng đ i cao h n nhi u các n c kém phát tri n do thi u đi u ki n phát hi n s m và ti p c n v i c s đi u tr (IARC) [69]

i u c p thi t trong ki m soát ung th là c n có ph ng pháp ti p c n hi u qu

đ phát hi n s m, ch n đoán và đi u tr ung th nh ng ph n s ng các qu c gia kém phát tri n

Hình 1.1.1: Th ng kê 10 b nh ung th gây t vong ph bi n nh t trên th

gi i, s li u n m 2012 [105 ]

I.1.6.2 Tình hình ung th Vi t Nam

Theo s li u th ng kê c a Hi p h i Ung th Vi t Nam, m i n m c n c có thêm kho ng 150.000 tr ng h p m c b nh m i và 75.000 tr ng h p t vong do ung

th N u c ng thêm v i s b nh nhân đư m c tính đ n th i đi m hi n t i, c n c có kho ng 240.000 – 250.000 b nh nhân b ung th đang đi u tr Trong đó, ch y u là ung th ph i, d dày, đ i tràng, ung th gan, ung th vú và c t cung Hà N i và TP.HCM c ng là hai n i có t l ph n m c ung th vú cao nh t n c v i t l 30/100.000 ng i t i Hà N i và 20/100.000 ng i t i TP.HCM (n m 2010) [96]

Ngoài ra, theo BS Tr n Nguyên Hà, Tr ng Khoa N i 4, b nh vi n Ung b u thành ph H Chí Minh, trong 15 n m, t n m 1995-2010, t i Vi t Nam, s ph

n m c b nh ung th vú đư v t qua ung th c t cung; hi n tr thành lo i b nh

th ng g p nh t n gi i và s ti p t c t ng cao trong nh ng n m t i; đ ng th i

ph n Vi t Nam th ng có tâm lý e ng i khi đi khám ung th vú, và ung th c

t cung do đó, khó phát hi n b nh s m đ đi u tr hi u qu [96] B nh vi n Ung

b u thành ph H Chí Minh cho bi t, m i tháng n i đây ti p nh n kho ng 300

b nh nhân b ung th vú m c m i đ n th m khám và đi u tr Trong khi đó t i

B nh vi n K Hà N i, m i tháng c ng ti p nh n không d i 200 b nh nhân ung th

vú m c m i đ n đi u tr T i Vi t Nam b nh nhân ung th vú ngày càng tr hóa so

v i các qu c gia khác trên th gi i t i 10 n m, t c là có nhi u ph n d i 40 tu i

đư m c b nh này Theo đi u tra, ph n trong đ tu i 30-34 có t i 11,9 tr ng h p trên t ng s 100.000 ng i m c b nh, trong khi đ tu i 40-44 t l này là 26,6

c bi t, ngay c nh ng ph n đ tu i t 20- 30 c ng có th m c b nh [103]

T i Vi t Nam, m i n m có trên 5.100 ng i m c m i ung th CTC, 2.400

ng i t vong và trung bình có b y ng i ch t/ngày TP.HCM có t l m c ung th CTC cao nh t n c v i t n su t 14-16/100.000 ng i L a tu i phát hi n m c và

t vong nhi u nh t t 40-75 tu i Riêng t i b nh vi n T D , m i n m có 600

ng i đ c phát hi n ung th CTC [99]

I.2 Epigenetic và s methyl hóa DNA

I.2.1 nh ngh a Epigenetics

Epigenetics là nh ng s thay đ i b n ch t di truy n c a DNA và nhi m s c th

mà không làm thay đ i trình t DNA S bi n đ i epigenetics có liên quan đ n s

bi u hi n gen thông qua nh ng c ch riêng bi t nh h ng đ n s n đ nh, g p

cu n, đ nh v , và t ch c c a DNA [43]

Epigenetics bao g m nhi u hi n t ng nh : methyl hóa DNA, bi n đ i histone

và microRNAs [18] Trong nghiên c u này chúng tôi ch t p trung vào hi n t ng methyl hóa DNA

I.2.2 S methyl hóa DNA

Methyl hóa DNA là m t trong nh ng bi n đ i phân t ph bi n nh t trong s hình thành kh i u ng i và s t ng methyl hóa vùng promoter c a gen là m t trong nh ng c ch th ng x y ra liên quan đ n s m t ch c n ng c a gen [30] Methyl hóa DNA là bi n đ i phân t x y ra do m t nhóm CH3 liên k t c ng hóa tr

v i cacbon s 5 c a Cytosin n m v trí hai nucleotide Cytosin - Guanin (vi t t t

là CpG - v i p là liên k t phosphodiester) C ch g n g c -CH3 vào DNA trong

quá trình phân bào nh các enzyme methyltransferases (DNMTs) DNMTs tìm

th y trong các t bào đ ng v t có vú bao g m DNMT1, DNMT3a, và DNMT3b

[13]

Hình 1.2.1: S b xung nhóm CH 3 vào v trí cacbon s 5 c a Cytosin

Methyl hóa DNA đ c bi t ph bi n trong gen c ch kh i u và gen s a ch a DNA [24] Methyl hóa t i các v trí CpG trong vùng promoter c a các gen c ch

kh i u, s a ch a DNA trong t bào bình th ng có vai trò đi u hòa, ki m soát chu

k t bào, k t dính t bào, ho c s a ch a DNA S methyl hóa DNA b t th ng

nh ng gen p16, INK4A, p14 ARF, p15, CCDN2, DAPK, MGMT, hMLH1, GSTP1,

RAR 2, APC, ER , CDH1, CDH13 và nh ng gen ti n ung th (oncogen) có liên

quan đ n s hình thành và di n ti n c a kh i u [24]

S bi n đ i methyl hóa DNA th ng d n đ n ung th thông qua quá trình methyl hóa d i m c (hypomethylation) ho c methyl hóa v t m c (hypermethylation) [11] Methyl hóa d i m c d n đ n b t n đ nh nhi m s c th

và kích ho t gen ti n ung th (oncogene), trong khi đó, methyl hóa v t m c

th ng g n li n v i b t ho t gen c ch kh i u [Error! Reference source not found.] Tuy nhiên, s bi n đ i epigenetics đ c công b r ng rãi trong các b nh ung th c a con ng i là methyl hóa v t m c t i các đ o CpG c a vùng promoter gen c

ch kh i u nh CDKN2A, CDKN2B, TP73, MLH1, APC, BRCA1, MGMT, VHL, CDH1 và DAPK1 Bên c nh đó, m t s gen c ch kh i u nh TIMP3, SFRP1, SFRP2 , SFRP4 , SFRP5 hi m khi b đ t bi n, ho c đ t bi n c a chúng ch a t ng

đ c báo cáo trong ung th ng i [87][85] Vì v y, vi c ki m tra m c đ methyl hóa trên các gen c ch kh i u có th là d u ch ng sinh h c ti m n ng trong h tr

ch n đoán và đi u tr ung th

Trong nhi u nghiên c u, các tác gi đ u có chung nh n đ nh r ng, trong t ng lai các d u ch ng d a trên thông tin methyl hóa DNA, s đ c s d ng ngày càng nhi u trong ch n đoán ung th nh m t công c sàng l c, m t d u hi u có th phát

và im l ng th ng d n đ n r i lo n đi u hòa trong các t bào kh i u [16][46] Nh

v y, s methyl hóa t i các đ o CpG thu c vùng promoter c a gen nh h ng đ n

s bi u hi n c a gen c ch kh i u, làm cho gen không th phiên mã và d n đ n ung th

I.3 Gen APC

I.3.1 C u trúc gen APC và protein APC

Gen APC (Adenomatous Polyposis Coli) là gen c ch kh i u đư đ c Goss K.H và cs xác đ nh n m 2000 thông qua liên k t c a nó v i m t h i ch ng di truy n c a ung th đ i tr c tràng đ c g i là đa polyp tuy n có tính ch t gia đình (vi t t t là FAP) [37] Gen APC n m v trí 5q21-q22, g m 15 exon[49][66]

Gen APC mã hóa cho m t protein có tên là protein APC g m 2.843 acid amin,

tr ng l ng phân t là 311646 Da [77], có kh n ng g n v i nhi u lo i protein khác nhau nh ß-catenin, Axin, CtBP, Asef, IQGAP1, EB1 và c u trúc vi ng

Hình 1.3.1: C u trúc protein APC Protein APC g m 6 vùng ch c n ng chính: vùng Armadillo, vùng l p l i 15 acid amin, vùng l p l i 20 acid amin, vùng c b n, vùng g n Axin và vùng g n EB1 [98]

I.3.2 Ch c n ng gen APC và protein APC

Gen APC là m t gen c ch kh i u có vai trò ng n ch n con đ ng tín hi u Wnt kinh đi n - con đ ng c n thi t cho s hình thành kh i u Ch c n ng c a gen APC đ c th hi n qua ch c n ng c a s n ph m sinh t ng h p c a nó là protein APC Protein APC là m t protein c ch kh i u đa ch c n ng, có vai trò trong m t

s quá trình c b n c a t bào nh quá trình bám dính và di c c a t bào, c u t o

m ng l i actin và các vi ng, phân chia nhi m s c th và đ c bi t là kìm hãm con

đ ng truy n tín hi u Wnt kinh đi n [63][37]

 Kìm hãm con đ ng tín hi u Wnt kinh đi n (Canonical)

M t trong nh ng v n đ quan tr ng nh t trong nghiên c u v gen APC là xác

đ nh con đ ng ch u trách nhi m v sinh b nh h c ung th (tumorigenesis) c a nó Protein APC là y u t trung tâm trong con đ ng truy n tín hi u Wnt/ -catenin -

ki m soát t ng sinh và bi t hóa t bào [8]

Protein APC là m t ph n c a ph c h p Axin gây phosphoryl hóa -catenin, c

ch s dephosphory hóa c a -catenin, thúc đ y lo i b -catenin t nhân, làm

gi m ph c h p -catenin/TCF trong nhân [40][65][72] Bên c nh đó, protein APC

gi i cho r ng protein APC kích thích s bám dính t bào b ng cách g n -catenin

t i các vùng l p l i Armadillo, các vùng l p l i 15 ho c 20 acid amin, đ ki m soát

s phân b c a -catenin gi a nhân t bào/ bào t ng t bào và màng bào t ng

c a t bào, đ ng th i làm t ng m c đ E-cadherin màng bào t ng c a t bào

[48][60][14][15]

 Kích thích s phân c c vƠ di c c a t bào

Protein APC đi u hòa s phân c c và s di c c a t bào thông qua s ki m soát c a b khung actin (actin cytoskeleton) [47]

Protein APC kích thích s di c c a t bào b ng cách g n vào Acef1 và Acef2 các vùng l p l i Armadillo đ ho t hóa chúng và ho t hóa Cdc42; g n vào IQGAP1 t i các vùng l p l i Armadillo đ thu th p IQGAP1 và CLIP170, t o nên

m t ph c h p v i IQGAP1, CLIP170, Rac1 và Cdc42 đư đ c ho t hóa, hình thành m ng l i actin; g n v i EB1 t i vùng g n EB1 t o đi u ki n d dàng cho

ho t đ ng c a Rho và mDia, làm n đ nh và polymer hóa các vi ng, giúp cho vi c phân chia nhi m s c th chính xác [34][47][6][56][67][90]

 n đ nh m ng l i các vi ng

Protein APC đ c tìm th y cu i c a các vi ng (microtubules), nó có th bám vào và n đ nh các vi ng Các k t qu này ch ra r ng APC đi u hòa m ng

l i vi ng và có th đóng vai trò trong các quá trình trung gian c a các vi ng

nh s di c t bào và s hình thành tr c chính c a con thoi (spindle) [64]

 Phân chia nhi m s c th chính xác

S m t n đ nh nhi m s c th (chromosome instability: CIN) đ c xem là m t trong nh ng c ch kích thích s hình thành kh i u thông qua s phân chia sai

l ch (mis-segregation) c a nhi m s c th (Aoki và cs., 2007) [7]

T nh ng k t qu nghiên c u thu đ c [7][39][84], protein APC giúp s phân chia chính xác nhi m s c th b ng cách g n vào các vi ng t i vùng c b n (basic domain) đ đi u hòa các ch c n ng c a kinetochore - m t c u trúc protein nhi m

s c th , n i các s i tr c chính đính kèm trong quá trình phân chia t bào - đ đ y các nhi m s c th xa ra

 c ch s ch t theo ch ng trình c a t bào (apoptosis)

Protein APC c ch s ch t t bào theo ch ng trình (apoptosis) c a t bào

b ng cách g n vào -catenin t i các vùng l p l i Armadillo, các vùng l p l i 15

ho c 20 acid amin, đ c ch s ch t t bào theo ch ng trình giai đo n G2/M trong chu trình t bào qua con đ ng tín hi u kinh đi n Wnt, đi u này c ng giúp cho s phân chia nhi m s c th đ c chính xác h n [28]

I.3.3 S methyl hóa gen APC trong ung th

S methyl hóa b t th ng vùng promoter gen APC x y ra r t nhi u lo i ung

th nh ung th đ i tr c tràng [29][51], ung th ph i [53[89], ung th vú [45][89][30]

, ung

th c t cung [21] Theo các nghiên c u trên th gi i, t n s methyl hóa c a gen APC trong các kh i u vú t ng theo giai đo n và kích th c c a kh i u (Virmani và cs., 2001; Roa và cs., 2004; Chen và cs., 2007; Liu và cs., 2007)

Theo các nghiên c u đ c công b , t i Hoa K , n m 2001, s methyl hóa t i vùng promoter gen APC b nh nhân ung th vú là 44% và ung th ph i là 53% (Virmani AK., 2001) C ng trong n m này, t i Nh t B n, Jin Z và cs công b

m c đ methyl hóa các m u mô ung th vú là 36% và không đ c phát hi n trong các mô ung th lành tính (Jin Z., 2001)

T i Trung Qu c, n m 2007, m c đ methyl hóa là 36,8% các m u mô ung

th vú (Liu Z., 2007), n m 2009, m t l n n a ung th ph i đ c đ a vào nghiên

c u v i m c đ methyl hóa là 39,5% các m u ung th ph i giai đo n I và 7,7% các mô ph i lành tính (Lin Q., 2009) N m 2013, các m u mô c t cung đ c

đ a và nghiên c u và phát hi n m c đ methyl hóa là 56,8% các m u mô ung

th và 10% các m u mô lành (Chen Yong, 2013)

M t nghiên c u k t h p gi a B và Hà Lan n m 2008, c hai ph ng pháp phát

hi n m c đ methyl hóa trên DNA là MSP và qMSP đ c s d ng cho các m u

mô vú V i ph ng pháp MSP, phát hi n m c đ methyl hóa m u mô b nh, mô lành l n l t là 71% và 43% Ph ng pháp qMSP phát hi n 74% và 46% s methyl hóa mô kh i u và mô lành tính (Auwera IV., 2008)

T i Hi L p, n m 2011, m c đ methyl hóa các mô vú ung th đ c phát hi n

là 53,3% (Tserga A., 2012) T i c, n m 2010, các m u huy t thanh c a b nh nhân ung th vú đ c s d ng đ đánh giá và phát hi n m c đ methyl hóa là

20% (Matuschek C., 2010)

Nghiên c u v ung th bi u mô t bào v y th c qu n, n m 2008, Iran và Canada phát hi n m c đ methyl hóa là 44,4% các m u mô ung th (ZareM., 2009) N m 2011, các tác gi Iran th c hi n nghiên c u c mô ung th và mô lành và có phát hi n thú v là: m c đ methyl hóa các m u mô ung th là 71,4%

th p h n các m u mô lành tính là 87,7% (Rigi-Ladiz M., 2011)

T i Vi t Nam, n m 2011, m c đ methyl hóa đ c phát hi n là 87,5% các

m u mô ung th , và 93,8% trên các mô cách v trí kh i u 5cm các b nh nhân ung th vú (Duong Thi Quynh Mai và cs., 201130

) N m 2012, Vi t Nam k t h p

v i Th y i n nghiên c u v methyl hóa các b nh nhân m c b nh ung th đ i

tr c tràng, và phát hi n m c đ methyl hóa các b nh nhân Vi t Nam và Th y

i n l n l t là 44,9% và 53,8% (Dimberg JJ., 2013)

Các nghiên c u v m c đ methyl hóa vùng promoter gen APC đ c th c

hi n nhi u qu c gia trên th gi i và nhi u lo i ung th Tuy nhiên, các nghiên

c u Vi t Nam còn h n ch , bên c nh đó ch a có nghiên c u v ung th c t cung đ c công b , vì v y, nhóm chúng tôi th c hi n đ tài này đ kh o sát m c

đ methyl hóa t i các đ o CpG thu c vùng promoter gen APC các b nh nhân ung th vú và ung th c t cung

I.4 P h ng pháp phát hi n s methyl hóa DNA

Hi n nay, m c đ methyl hóa DNA có th đ c phân tích, đánh giá b ng r t nhi u ph ng pháp nh : gi i trình t tr c ti p Direct sequencing [35], Bisulphite pyrosequencing [59], Q-MSP [18], Ms-SNuPE [41], đ c bi t ph ng pháp MSP là

ph ng pháp đ c s d ng nhi u nh t đ đánh giá t n s methyl hóa đ o CpG

 Ph ng pháp Methylation Specific PCR (MSP)

Ph ng pháp MSP do Herman và c ng s công b vào n m 1996, đ c s

d ng đ phân tích nhanh tình tr ng methyl hóa c a các đ o CpG Vi c l p b n đ chính xác c a mô hình methyl hóa DNA trong các đ o CpG đư tr thành c n thi t cho vi c tìm hi u quá trình sinh h c khác nhau nh in d u DNA, b t ho t nhi m

s c th X, và im l ng gen c ch kh i u trong ung th ng i [42]

Ph ng pháp MSP là ph ng pháp k t h p s bi n đ i DNA b ng natri bisulfit

và ph ng pháp PCR v i hai c p m i methyl và unmethyl, sau quá trình bi n đ i,

t t c cytosines không methyl hóa s đ c chuy n thành uracil, các v trí cytosines unmethyl thì không b bi n đ i [52] MSP ch c n m t l ng nh DNA, nh y c m

v i 0,1% alen methyl hóa c a m t locus đ o CpG nh t đ nh, và có th đ c th c

hi n trên DNA chi t xu t t m u paraffin S n ph m sau khi PCR s đ c ki m tra

b ng cách đi n di trên gel agarose đ c nhu m ethium bromide và quan sát d i tia UV [42]

Hình 1.4.1: S bi n đ i bisulfit và methyl hóa DNA.

Có th th y r ng, hi n nay, trên th gi i s d ng nhi u ph ng pháp và các lo i

m u b nh ph m khác nhau đ đánh giá m c đ methyl hóa trên các gen, tuy nhiên

nh t đ u 3' Ít nh t m t trong ba nucleotide cu i cùng t i đ u 3' c a m i ph i là

m t CpG "C"

Chi u dài m i là m t y u t quan tr ng trong ph n ng PCR, thông th ng dao

đ ng t 18 bp-25 bp Tuy nhiên trong các tr ng h p c th thì chi u dài có th dài h n ho c ng n h n chi u dài chu n, dao đ ng 15 bp-30 bp Các c p m i chúng tôi s d ng có chi u dài hoàn toàn phù h p yêu c u, xem k t qu b ng 3.2.2 Nhi t đ nóng ch y c a các m i (Tm) c ng là thông s r t quan tr ng D a vào nhi t đ nóng ch y mà ta có th quy t đ nh nhi t đ (b t c p) trong ph n ng PCR Thông th ng nhi t đ nóng ch y c a m i xuôi và m i ng c nên x p x nhau, nhi t đ chênh l ch gi a hai m i này không nên quá 5oC Nhi t đ nóng

ch y c a các m i chúng tôi s d ng có nhi t đ chênh l ch kho ng 2o

C

 C u trúc th c p:

Kh n ng liên k t t o c u trúc th c p c a m i c ng là m t tiêu chí quan tr ng

đ đánh giá m i C u trúc này bao g m: hairpin loop, homo dimer và hetero dimer

N u c u trúc này càng b n v ng thì hi u qu c a ph n ng PCR s càng th p vì nó

s góp ph n c n tr kh n ng b t c p c a các m i vào trình t DNA đích

xác đ nh đ b n v ng c a các liên k t trên, ng i ta dùng m t khái ni m là giá tr bi n đ i n ng l ng t do G (kcal/mole) Theo hưng IDT, giá tr G l n

h n âm 9 kcal/mole thì s không nh h ng đ n ph n ng PCR s d ng các c p

m i khu ch đ i Do đó, các giá tr G nh h n âm 9 kcal/mole c n đ c l u Ủ

C u trúc th c p và c u trúc k p tóc có th đ c lo i b b ng cách t ng chi u dài

m i [10]

S d ng ph n m m tr c tuy n IDT kh o sát thông s này, chúng tôi thu đ c

k t qu th hi n b ng 3.2.3

Ph n 2:

V T LI U VÀ

II.1 V t li u

Nghiên c u s d ng 12 m u sinh thi t mô vú đ c đúc parafin, trong đó có 6

m u sinh thi t t nh ng b nh nhân m c ung th vú và 6 m u lành t nh ng b nh nhân m c b nh lý khác, đ c cung c p b i b nh vi n i h c Y D c TP H Chí Minh; 11 m u b nh ph m d ch ph t t bào âm đ o ho c m u máu, trong đó có 6

m u b nh ph m nhi m HPV ki u gen đ c (nhóm nguy c cao gây ra ung th c t cung nh 16, 18, 58ầ) ho c nhóm nguy c th p và 5 m u lành (kèm theo các ch tiêu lâm sàng) đ c cung c p b i công ty c ph n công ngh Vi t Á

II.2 P h ng pháp

II.2.1 Khai thác d li u và kh o sát in silico

II.2.1.1 Thu th p trình t gen quan tâm, xác đ nh v trí vùng c n tìm

Thu th p trình t nucleotide c a gen APC t ngân hàng gen có Accession number NC_000005.10 Vùng kh o sát kéo dài t promoter 1 đ n exon 1A c a gen S d ng ph n m m tr c tuy n Methprimer (http://www.urogen.org) đ xác

đ nh v trí các đ o CpG trong c vùng gen vì đây là vùng c n quan tâm nh t

II.2.1.2 Ph ng pháp đánh giá, thi t k m i

S d ng ch ng trình tr c tuy n TFSEARCH trên trang web http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html đ xác đ nh v trí nh n bi t c a các nhân t phiên mã trên vùng promoter c a gen APC

Thi t k m i cho ph n ng MSP b ng ch ng trình MethPrimer (www.urogen.org)

Ki m tra kh n ng b t c p b sung, v trí b t c p và kích th c s n ph m t o thành c a các c p m i trên gen b ng ph n m m Annhyb

Xác đ nh đ đ c hi u b m i v i các thông s m c đ nh s n trên NCBI b ng

ch ng trình tr c tuy n BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)

Cu i cùng, chúng tôi phân tích các thông s c a m i: Tm (nhi t đ nóng ch y), chi u dài, t l % GC, kh n ng t o các c u trúc th c p c a m i, bao g m: self dimer, hairpin loop và hetero dimer b ng ph n m m tr c tuy n IDT

www.idtdna.com Qua đó, chúng tôi có th đánh giá s b m c đ t i u trên lỦ thuy t c a các c p m i

II.2.2.Kh o sát in vitro

 N i dung nghiên c u

V i m c tiêu đánh giá m c đ methyl hóa đ o CpG thu c vùng promoter gen APC b ng ph ng pháp MSP, chúng tôi ti n hành nghiên c u theo quy trình th c nghi m sau:

- Tách chi t m u DNA t m u b nh ph m: m u sinh thi t mô (m u mô ung th

và m u mô lành) c a b nh nhân ung th vú, m u DNA tách chi t t m u máu ho c

d ch ph t t bào âm đ o (kèm theo các ch tiêu lâm sàng) đ c xác đ nh nhi m virut HPV ki u gen nguy c cao, nguy c th p và m u lành do công ty Vi t Á cung c p

- Bi n đ i sodium bisulfite b ng EZ DNA METHYLATION-GOLDTM Kit

- Th c hi n quy trình MSP nh m phát hi n s methyl hóa trên đ o CpG thu c vùng promoter c a gen APC

- G i s n ph m đ i di n c a ph n ng MSP đ gi i trình t

II.2.2.1 Tách chi t DNA t m u mô đúc parafin:

 Nguyên t c:

Chúng tôi s d ng ph ng pháp phenol/chloroform đ tách chi t DNA Trong

đó, màng t bào và màng nhân đ c bi n tính b ng ch t t y m nh Sau đó protein

s đ c bi n tính, lo i b b ng phenol/chloroform DNA b gen s đ c t a v i ethanol l nh Tuy nhiên, do đ c thù c a ngu n m u (đ c đúc trong parafin) chúng tôi s d ng xylene đ x lý parafin tr c khi ti n hành tách chi t DNA

 Thi t b vƠ hóa ch t

- Thiêt bi:

+ Máy ly tâm l nh (Hettich)

+ Bê ôn nhiêt (Thermo Final Test)

- Hoá ch t

+ Phenol (TBR)

- Thêm 1 ml Ethanol 100%, vortex 2 phút, ly tâm 13000 vòng/phút, thu c n

- Thêm 1 ml Ethanol 70%, vortex 2 phút, ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút, thu c n

- Thêm 1 ml Ethanol 50%, vortex 2 phút, ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút, thu c n, ph i khô m u trong vòng 30 phút

- Thêm 700 l lysis buffer, vortex nh trong 56 oC/3 ngày

Thành ph n lysis buffer nh sau:

Tris-HCl 1 M, pH 8 14 µl EDTA 0.5M, pH 8 14 µl

- Thêm 0.2 l n th tích NH4OAC 5M; 2,5 l n th tích (750 l) Ethanol 100%

Tr n đ u Gi nhi t đ 4 oC trong 30-60 phút Ly tâm 13000 vòng/15 phút, 4 oC Thu t a

- Thêm 500 l Ethanol 70% Ly tâm 13000 vòng/5 phút, 4oC, l p l i 2 l n

+ Máy ly tâm l nh (Hettich)

+ Bê ôn nhiêt (Thermo Final Test)

- Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút, thu d ch n i

- Thêm 700 µl dung d ch lysis buffer ly trích DNA g m:

Thành ph n lysis buffer nh sau:

Tris-HCl 1 M, pH 8 14 µl EDTA 0.5M, pH 8 14 µl

- 56oC trong 3 gi

- a eppendorf v nhi t đ phòng, thêm 700 µl [phenol(pH8) : chloroform] (t

l 1:1), l c đ u, ly tâm nhi t đ phòng 13000 vòng/phút trong 3 phút, thu d ch n i

- Thêm cùng th tích chloroform, l c đ u, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1,5 phút, thu d ch n i

- Thêm 0.2 l n th tích NH4OAc 5M và 2.5 l n th tích Ethanol 100%, thu c n

- R a l i b ng Ethanol 70%, ly tâm 13000 vòng/5 phút/4oC, b d ch, đ khô t nhiên

- Thêm 40 µl n c c t 2 l n, b o qu n -20oC

II.2.2.3 Xác đ nh n ng đ và đ tinh s ch c a DNA sau tách chi t:

N ng đ DNA sau tách chi t đ c ki m tra b ng máy quang ph b c sóng

260 nm tinh s ch c a DNA đ c xác đ nh thông qua t s A260nm/A280nm N u t

s A260nm/A280nm n m trong kho ng 1,8 - 2,0 là DNA tinh s ch

 Thi t b vƠ hóa ch t

- Thiêt bi: Máy đo quang ph (Bio Rad)

cytosine thành uracil (tr 5mC) s đ c c đ nh trên màng c a c t, sau đó mu i

đ c r a s ch và DNA đ c thu h i l i

 Thi t b vƠ hóa ch t

- CT conversion reagenet (EZ1)

- M-Dilution buffer (EZ2)

- M-Dissolving buffer (EZ3)

- M-Binding buffer (EZ4)

- M-Wash buffer (EZ5)

- M-Desunlphonation buffer (EZ6)

- M-Elution buffer (EZ7)

- Ly tâm 13000 vòng/phút trong 30 giây nhi t đ phòng

- Thêm 100µl EZ5 vào c t C1, ly tâm 13000vòng/phút trong 30 giây nhi t đ phòng

- Thêm 200µl EZ6 vào c t C1, đ nhi t đ phòng 15-20 phút, ly tâm 13000 vòng/ phút trong 30giây

- Thêm 200µl EZ5 vào c t C1, ly tâm 13000vòng/phút trong 30giây nhi t đ phòng

- t c t vào ependorf 1,5ml, thêm 10µl EZ7, ly tâm 3000vòng/phút trong 30giây nhi t đ phòng

- Thu DNA sau khi đ c bi n đ i bisulfite, b o qu n -200C

II.2.2.5 Th c hi n ph n ng PCR

 Nguyên t c:

PCR là ph n ng khu ch đ i m t trình t DNA d a vào đ c tính c a DNA polymerase M t m i xuôi và m i ng c s b t c p b sung v i m t đ u c a m ch khuôn, và DNA prolymerase s n i dài m i đ hình thành m ch m i

 Ph ng pháp ti n hành:

Sau khi tách chi t DNA và bi n đ i b ng sodium bisulfit, chúng tôi ti n hành

t i u hóa ph n ng PCR đ kh o sát m c đ methyl hóa trên gen APC Thành

ph n và chu trình nhi t c a ph n ng đ c li t kê trong b ng

Nucleic acid là nh ng phân t tích đi n âm trên kh p b m t (do g c phosphate

PO43-) Do đó, trong đi n tr ng, các phân t nucleic acid s di chuy n t c c âm sang c c d ng v i t c đ ph thu c vào đi n tích và tr ng l ng phân t c a chúng Các nucleic acid trong gel agarose s đ c quan sát d i tia UV nh ethidium bromide đ c nhu m vào gel có kh n ng g n xen vào gi a các base c a nucleic acid

 Thi t b hóa ch t:

- Thiêt bi:

+ Bu ng đi n di (Bio Rad)

+Máy đ c gel (Bio Rad)

- Hoá ch t:

+ Gel agarose (Bio Basic)

+ 25X TAE Buffer (Bio Basic)

+ Ethidium bromide (Bio Rad)

c n đi n di trên m t hàng mà không ph i trên 4 hàng khác nhau nh tr c đây, h

th ng đi n di th ng là đi n di mao qu n M i khi có m t v ch đi n di đi qua, phân t ddNTP cu i cùng đ u 3’ c a đo n DNA s phát ra m t màu hu nh quang t ng ng, máy s ghi nh n màu s c này và chuy n v máy tính phân tích

D a vào màu hu nh quang mà máy nh n di n đ c là nucleotide nào, t đó bi t

đ c trình t c a DNA đích

Ph n 3:

K T QU

VÀ TH O LU N

III.1 Khai thác d li u

Sau khi ti n hành khai thác d li u trên NCBI b ng các t khóa “APC gene”,

“methylation”, “epigenetics”, “cancer”ầ chúng tôi thu đ c 17 bài báo kh o sát

m c đ methyl hóa trên vùng promoter c a gen APC b nh nhân ung th Nhìn chung, các nghiên c u v đánh giá m c đ methyl hóa t i vùng promoter gen APC

b nh nhân ung th đ c th c hi n nhi u qu c gia trên th gi i và các s li u trên cho th y, có s khác bi t l n v t n s methyl hóa, lo i m u s d ng gi a các nghiên c u (thông tin chi ti t đ c trình bày ph l c 5)

Hình 3.1.1: Các ph ng pháp sinh h c phân t s d ng trong 17 nghiên

c u

Bên c nh đó, sau khi phân tích các d li u tìm đ c, chúng tôi nh n th y, các nghiên c u trên s dùng nhi u k thu t sinh h c phân t khác nhau nh MSP, qMSP, RT-PCR đ đánh giá m c đ methyl hóa t i vùng promoter c a gen APC, tuy nhiên MSP là ph ng pháp ph bi n nh t chi m 79,3% (P<0.05)