Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong xác định đột biến trên gen KRAS Đích nhắm phân tử gián tiếp trong điều trị ung thư đại trực tràng

PCR : Polymerase Chain Reaction... 11 m mμ Bortezomib, Carfizomib, Pralatrexate.. m mμ Rituximab, Alemtuzumab, Ofatumumab, Ipilimumab.. m mμ Tositumomab, tositumomab, Ibritumomab tiuxet

R N I H C M THÀNH PH H CHÍ MINH ỌN N N

NG D NG K THU T SINH H C PHÂN T R N X NH T BI N TRÊN GEN K-RAS: Í N M PHÂN T GIÁN TI P R N U TR UN I TR C TRÀNG

μ

μ

μ

μ

MSSV: 1053012873 μ – 2014

m 4

N

m

gian

m

m μ m -

m m

Ủ Ủ

m m m

m m

m m

m Ủ m m

m m Ủ

m

m m m

m

m

DANH M C HÌNH:

Hình 1.1 Th hi n t l m c b nh và t l t vong trên toàn th gi i [13] 04

05

Hình 1.3 T l m c các b bi i tr c tràng (màu vàng) nam gi i trên th gi i [13] 06

Hình 1.4 T l m c các b bi i tr c tràng (màu vàng) n gi i trên th gi i [13] 06

Hình 1.5 T l m c các b bi i tr c tràng (màu vàng) nam gi i t i Vi t Nam [13] 07

Hình 1.6 T l m c các b bi i tr c tràng (màu vàng) n gi i t i Vi t Nam [13] 07

Hình 1.7 Các lo i thu u tr nh m th EGFR [20] …… 12

Hình 1.8 EGFR 7 13

Hình 1.9 C u trúc th th EGFR [37] 14

Hình 1.10 V trí gen K-Ras trên NST s 12 15

Hình 1.11 F [4] 17

Hình 3.1 T l t bi n c a b y v trí ph bi n trên gen K-ras

ng s 34

Hình 3.2. m K-ras t bi n trên gen (B) 36

Hình 3.3 V trí c p m i ph n ng PCR khu i exon 1 gen K-ras 42

Hình 3.4 V trí b t c p c a các m i (trong ph n ng AS-PCR) và các m i/m u dò (trong ph n ng AS Real-time PCR) 42

K t qu m PCR v i c p m i K-ras trên 2 m u b nh ph m 9 và 16 Thang chu n 100 bp 46

Hình 3.6 K t qu m m DNA và n m i K-ras Thang chu n 100 bp 47

Hình 3.7 K t qu m m m p m i K-ras

Thang chu n 100 bp 48

Hình 3.8 M t s t bi n phát hi c b i

trình t 49

Hình 3.9 K t qu gi i trình t codon 12 và 13 trên các m u 51

Hình 3.10 M u 33 v i tín hi u n n b nhi u 51

Hình 3.11 K t qu m -PCR trên ba m u 18, 20 và 16 55

Hình 3.12 K t qu m -PCR trên ba m 4 7 n ng 75 V, th i gian 30 phút) 56

Hình 3.13 K t qu m -PCR trên ba m 4 7 n d ng 75 V, th i gian 50 phút) 56

Hình 3.14 K t qu AS Real-time PCR phát hi t bi n G12A âm tính trên t t c các m u th nghi m 57

Hình 3.15 K t qu AS Real- m m u 1 và 16 57

DANH M C B NG:

B ng 2.1 Thành ph n ph n ng PCR v i K-ras 24

B ng 2.2 Chu k nhi t cho ph n ng PCR v i K-ras 25

B ng 2.3 Thành ph n ph n ng Real time PCR v i m t bi n 27

B ng 2.4 Chu k nhi t cho ph n ng Real time PCR v i m t bi n 27

B ng 3.1 T l t bi n gen K-ras trên i tr c tràng 28

B ng 3.2 T l t bi n gen EGFR trên các lo 30

B ng 3.3 Các lo i m c s d ng trong các tài li u tham kh o 31

B ng 3.4 T l t bi n b y v trí ph bi n trên gen K-ras 31

B ng 3.5 S c g ch i) codon 12 và 13 d t bi n 34

B ng 3.6. m

7 trên gen K-ras 35

B ng 3.7 Trình t và các thông s m i c a IDT cho ph n ng PCR khu i exon 1 gen K-ras 39

B ng 3.8 Trình t và các thông s m i c a IDT cho ph n ng AS-PCR và AS Real-time AS-PCR phát hi 7 t bi n n i tr i trên exon 1 gen K-ras 40 B ng 3.9 Ch s OD c a 3 m u 5, 16, 17 43

B ng 3.10. m m m

m 45

B ng 3.11 Ký hi t bi n phát hi c 51

B ng 3.12 T ng s t bi n trên các m u 52

DANH M C CH VI T T T

AS-PCR : Allele-specific Polymerase Chain Reaction

AS-Real-Time PCR : Allele-specific Real Time Polymerase Chain Reaction

COLD-PCR : Coamplification at Lower Denaturation temp PCR

ErbB : V-erb-b2 erythroblastic leukemia viral oncogene olog

K-ras : Kirsten-ras/ V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog

PCR : Polymerase Chain Reaction

N P

μ m m λ m 65

μ λ m 67

N

μ 46

N 1

P N N N 1 N N N 3

2 N N N R R N R

CANCER): 4

3 P N P P N N N R R N 8

4 N N R N R N Í R N N

9

4.1.V c a li u pháp nh m μ 9

4.2.V thu u tr : 10

5 N N N: 12

6 N N N EGFR: 12

7 N N N K-ras: 15

8 - P P R -REAL-TIME PCR: 18 P N P N P P 1 V T LI U 19

2 P N P P N ểN U 19

2.1.Khai thác d li u và kh o sát in silico 19

2.2.Kh o sát in vitro 21

PH N N N 1 K T QU KHAI THÁC D LI U VÀ KH O SÁT IN SILICO 28

1.1 Khai thác d li u - Các lo t bi n trên gen K-ras 28

1.2.K t qu kh o sát in silico 36

2 K T QU TH C NGHI M: 42

2.1.Tách chi t DNA và ki m tra DNA b gen sau tách chi t: 42

m u ki n ph n – μ 46

2.3.K t qu m -gi i trình t phát hi t bi n trên gen K-ras

μ 48

2.4.K t qu m Alelle-Specific PCR (AS-PCR) phát hi t bi n trên gen K-ras μ 54

P N N N

1 K T LU N 59

2 N 59 TÀI LI U THAM KH O 60

W m 8 , m m ng 7,6 tri i ch trên toàn th gi ng 70 % các ca t vong x y ra c

có thu nh p th 3 %

n

Nh m i s phát tri n m nh m c a sinh h c phân t , các

b c ch a tr b u tr truy n th u thu t, hóa tr li u ho c x tr li … h ng

d u tr theo m t li u pháp m i hi u qu c h u “ m ” u pháp m i cho th y có nhi m,

c bi t khi b u tr b ng hóa h c tr li u th t b i thì có th dùng li u pháp này, tác d ng ph ít (ch n i ban trên da), khi s d ng k t h p li u pháp

m i v i p c tr li u s giúp kéo dài s s nh nhân

K-ras là thành viên c Ras mã hoá cho protein G v i ho t

ng GTPase n i bào K-ras n m ng truy n tín hi u c a EGFR Protein K-ras ho m t công t c phân t ng truy n tín

hi u n i bào nh các ch ng cho s ti n tri n c a

t bào, bao g m c s bi t hóa, s phát tri n và ch t theo chu trình t

bi n trên gen K-ras t bi m) d n ho ng GTPase c a protein K-ras b suy gi m, GTP không b c t thành GDP ng truy n tính hi u c a protein K-ras s di n ra liên t c mà không c n t i s có

m t các kích thích c ng truy n tính hi u EGFR/th th HE [42] Vì v y,

b t bi n gen K-ras có ph n ng kém khi u tr v i các thu c c

ch ch F t bi n K-ras c cho là m ng h p xu t hi n s m

2

trong CRC và chi m kho ng 30-40 % [4] Nh t bi n ph bi n nh c

nh trong CRC x y ra trong exon 1 Nh ng kh i u mà có m t bi n exon 1 (codon 12 và/ho c 13) c a gen K-ras s ng v

u tr s d ng ch t c ch EGFR, bao g m cetuximab ho c tumumab

pani-Nh ng thành t u trong nghiên c u k thu t sinh h c phân t m ra kh

m i trong ch n m nh t là ng d ng c t PCR c hi u alen (Allele Specific PCR – AS PCR), PCR k t

h p gi i trình t C c th gi i công b qua nh ng áp

d i tr c tràng nh m xác nh các lo t bi m v i m c tiêu ng t i áp d ng li u pháp ng m u tr b nh này

3

1 T N N N :

W μ m m m

m m

m [44]

Ung phát sinh m bào m bào bình thành bào u là m quá trình giai là m

m ung các u ác tính thay này là tác các di và các tác nhân bên ngoài [44], bao mμ

Tác nhân v t lý, ch ng h n b c x t ngo i và b c x ion hóa

Tác nhân hóa h c, ch ng h n amiang, các thành ph n c a khói thu c lá, aflatoxin (ch t gây ô nhi m th c ph m) và th ch tín (m t ch t gây ô nhi m c

4

Kho ng 70% c a t t c các ca t vong do ung x y ra các c có thu

nh p th p và trung bình ng h p t vong t b nh ung trên toàn th gi i

c WHO d s ti p t c lên 13,1 tri u vào m 2030

Hình 1.1 T l m c các b nh u g t và t l t vong trên toàn th

th tr m t th H u h t các ung

5

i tr u xu t phát t i tràng và tr c tràng (g i tr c tràng) có th xâm l n và gây t n h i mô và

n nh

th i hay gan) S lan tràng c n nh i là , tuy nhiên nó v c g i tr c tràng m c dù kh i u x y ra b ph n khác c M u tr i

tr c tràng là r t h n ch [17] t t g 8

m m %

m λ 4% .2 và 1.3 n 60% m

m 8

m / w Z Â

m m- 6 8

m 8%

8 m m

4 m ,6 % m

6 m 7,6 %) (Hình 1.4 và 1.5)

7

Hình 1.5 T l m c T l m c các b u g t p bi , t o g ó có

u g t i tr c tràng (màu vàng) nam gi i t i Vi t Nam [13]

Hình 1.6 T l m c các b nh ung th p bi , t o g ó có u g t i

tr c tràng (màu vàng) n gi i t i Vi t Nam [13] Các nguyên nhân

μ - μ m

é m [33]

- μ m

m [14]

- Polyp:

c tính [17, 33] - m é μ

m m é m 3

8

- 6 -70, trong khi cá

Xét nghi m máu phân: khi m c b i tràng ng s rò r máu

ch ng phân và th i ra Xét nghi m máu trong phân có th s phát hi n

c m ng nh các thành ph n máu, liên t c nhi u l n ki m tra n u cho th y

k t qu ng t ch y máu mãn tính h th ng tiêu hóa, c n ph i

ki m tra có hay không s t n t i c a các kh ng tiêu hóa

Ch p X quang: Có th quan sát hình nh c i tràng, có xu t hi n kh i u hay polyp không

N i soi: ng h m i ti n, k t qu

ki m tra tr c tràng không th y thông s b ng, nên th c hi n n i soi Không nh ng có th phát hi c các lo i b i tràng bi n ch ng mà còn

có th th c hi n sinh thi t các mô

V i s phát tri n c a ngành sinh h c phân t pháp ch ng d ng sinh h c phân t c phát tri n C

th t bi n trên các gen liên quan b ng PCR [5], gi i trình t [19, 29] … m tra phát hi n kháng nguyên b ng hóa mô mi n d … nh chính xác cao

c giúp cho vi c phát hi n s m i

tr c tràng

9

4 N N R N R N Í R N

N :

S phá v ng c a t bào là trung tâm c a vi c d n b g c tìm hi u

nh i phân t - nguyên nhân d n s phát tri

c ng thông tin tri n v ng v vi c u tr p lý và hi u qu

kh k t h p phát huy tác d ng, khi n cho t tiêu di t m t cách có m m m ch c t bào kh e m nh xung quanh [35]

Li u pháp nh m à li c s d ng r u tr các lo i thu c sinh h khóa s ng và lan tràn c a

p vào các phân t c hi sinh ung và s

ng c a kh u Li u pháp này áp d u tr c FDA công nh m λλ8 nh b ch c u t y m n (FDA công nh n t

10

- é

-

- Không gâ m m

-

m -

…

4.2 t u c u t : Có nhi u lo i thu kìm hãm s phát tri n c a kh i u Tham kh o t ngu n http://www.cancer.gov/cancertopics/factsheet/Therapy/targeted, v i các thu c c phát hi n và nghiên c n nay, chúng ta có th m

ch tác d :

Nhóm 1: ;

m m z m

liê

m mμ Imatinib, Dasatinib, Bosutinib, Trastuzumab, Pertuzumab, Panitumumab, Crizotinib … m μ m m

m mμ Varinostat, Romidep-sin, Bexarotene, Alitretioic m 3μ m m trình apoptosis

11

m mμ Bortezomib, Carfizomib, Pralatrexate

m μ m m

m

m mμ Rituximab, Alemtuzumab, Ofatumumab, Ipilimumab

Nhóm 6μ m m

m mμ Tositumomab, tositumomab, Ibritumomab tiuxetan

131I-M t trong nh “ ” c nh m u tiên trong li u pháp này là th th EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor – th th y u t

ng bi u mô), m t glycoprotein có ho t tính tyrosine kinase, n m trong con

u hòa s t hóa t bào EGFR c tìm

th y có s bi u hi n quá m c trong nhi u lo i kh i

tr c tràng, chính vì v y, li u pháp ch a tr m h m n c ch protein EGFR [10] c l i gen K-ras l i r u tr nh m [4]

ng t c a m t ho c m t s tính tr ng, nh ng bi i này có tính ch t b n v ng

và có th di truy i sau [1] Có hai lo t bi μ t bi n gen

t bi n nhi m s c th , t t bi n nhi m s c th ng làm bi i

l n v t ch t di truy n, n s c s ng c t bi n gen thì làm bi i c u trúc c a gen có th d n bi i c u trúc c a lo i protein

mà nó mã hóa, cu i cùng d n bi i ki u hình (có th Trong các nghiên c u v ng dùng các k thu t bi n gen

c t bi n nhi m s c th [1]

6 N N N EGFR:

m μ http://ghr.nlm.nih.gov/gene/EGFR, gen EGFR

m μ Gen EGFR m w F

13

8 m 7 7 m 8 m EGFR F μ n trong t bào tr ng kho ng 60 kDa là protein kinase v y ra ph n ng t phosphoryl hóa c a EGFR [45]

14

Hình 1.9 C u trúc th th EGFR [37]

Ho t tính tyrosine n i bào c F c ho t hóa khi EGFR liên k t v i các ph i t F m c ho t hóa, vùng n i bào c a EGFR s t phosphoryl hóa, kh u m t dòng thác tín hi u lan t a

kh p t bào gây kích ho μ ng PI3K/Akt, s m m

và c ch quá trình ch u /m ng d n truy n tín hi u phiên mã Trong các t bào kh e m ng tín hi u n c

7 N N N K-ras:

Tham kh o t ngu n: http://ghr.nlm.nih.gov/gene/KRAS, gen K-ras c

mô t μ Gen K-ras (V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene olog/ Kirsten-ras) n m trên NST s 12, v trí 12p12.1, mã hóa cho protein K-ras [46]

hom-Hình 1.10 V trí gen K-Ras trên NST s 12

Nhi u công trình nghiên c u trên th gi c th c hi n nh m phân tích tình tr ng gen K-ras (mã hóa cho protein RAS) các b i

tr u tr b ng cetuximab ho c panitumumab Theo th ng kê gen K-rasb t bi n t 3 n 45 % i tr c tràng [7] Cho n nay

th ng kê cho th y t bi n hay g p nh t bi n thay th nucleotit codon

16

12 (chi m 70 %) và codon 13 (chi m 30 %) exon 1, r t ít k t qu cho th y có

t bi n trên codon 61 và 63 trên gen K-ras [15] t bi n t i codon 12 và 13

m t vai trò quan tr ng trong quá trình ti n tri n b i tr c tràng và nguy c c ch EGFR c a kh i u [9] t bi n t i nh ng

v 19, 22, và 146 c ng ã m t l

r t nh và ng c a nh ng d t bi m c làm sáng t [38]

Gen K-ras mã hóa cho m t protein RAS vai trò truy n tín hi u n i bào xuôi dòng t EGFR Trong t c gi cân b ng thông qua s hình thành 2 ph c h ng v i các tr ng thái c a protein RAS:

Ph c h p RAS- c ho t hóa) và ph c h p RAS-GDP (protein RAS b b t ho c ho t hóa nh y u t chuy n nu-cleotide guanine [guanine nucleotide exchange factors (GEFs)] Vi c truy n tín

hi u c a protein RAS b c ch khi ph c h p RAS-GTP b th y phân thành

ph c h p RAS-GDP nh m t lo i protein có ch t hóa GTPase (GAPs) u ki n sinh lý bình th ng, n RAS-GTP c

ki m soát ch t ch nh s ho ng nh p nhàng c a 2 y u t GEFs và GAPs [4]

ng truy n tín hi u n m xuôi dòng nó b t k có s ho t hóa c a th th EGFR/HER nào hay không [4] phân t lý gi i cho tình

tr ng kháng thu u tr nh ng b nh nhân mang kh i u b t bi n gen

K-ras [9, 21]

18

8 -SPECIFIC P R TIME PCR:

-REAL-AS-PCR là m t bi n th c a PCR (polymerase chain reaction) c s

d khu i m t trong s các alen nh m phát hi m

m t nucleotide - single nucleotide polymorphism (SNP) hay phát hi t

bi n m AS-PCR khác bi t v ng ch AS-PCR cho phép khu i alen m t bi n ho c m t alen c th trong s nhi u alen (c a cùng m t gen) trong m t m u có t l alen c n ki m tra r t th p trong khi PCR

ng không th phân bi c

AS-Real-time PCR là k thu t AS-PCR mà k t qu khu

c hi n th ngay sau m i chu k nhi t c a ph n m này mà

i thí nghi m không c n làm thêm các thí nghi m c và phân tích k t

qu nh có s n ph m khu ch y k thu t AS-Real-time PCR là k thu t nhân b n và phát hi m t bi n ho c

m t alen c th trong nhi u alen (c a cùng m t gen) d a vào các chu k nhi t

và k t qu khu i trong ng ph n c hi n th cùng lúc v i ph n ng khuy i x i làm thí nghi m có th th c

19

1

M u b nh ph m s d c cung c p t b nh vi Tây Ninh Nh ng m m i tr chu n ch n m hi n vi quang h c M tháng 1/2007 t i tháng 5/2011 Các m c b o

qu n nhi -200 c khi ti n hành tách chi t DNA

Tiêu chu n l a ch th ng kê s li u d tin c y c a t p

i và nh m t bi n gen ras, các bài báo ch n th ng kê s li m m không ti n hành th c nghi m d ng

K-V ng kê d li u, s d ng kê t n s trung bình có tr ng s nh m lo i b các y u t có th n k t qu

th n hành th c nghi m khác nhau, ngu n g c m u

b nh nhân khác nhau, th ng th i s d ng phân tích

20

– thi t k m i:

Trong nghiên c u này, m i và m u dò cho ph n t bi n b ng -Real-time PCR nh m m t bi n n i tr i trên gen K-ras ti n hành thi t k Ti t k các m i b ng m t s công c tin sinh h c:

- BatchPrimer 3 (http://probes.pw.usda.gov/batchprimer3/): s d ng thi t k m i phát hi n t bi n cho gen K-ras

G m và g ch i là v trí mà t mang

t bi m ho c G ng, n u b t bi n thì nu G

s b thay th b ng nu khác, ví d y m i s c thi t k v i nu

cu i v i a ng ho i v i alen b t bi n ho c SNP

V μ i ta cho ch y ph n ng, ph n ng s c ti n hành trên nhi u m t bi ng, h n h t bi n và bình

i cùng m t lo i m i (tùy m m n phân bi t alen bình

t bi m i ta dùng m i khác nhau) Sau khi ph n ng x y

ra xong có th ki m tra b ng ch phân bi t

bi n

21

-PCR có h n ch i bi c trình t t bi n ho c SNP thi t k m ng h t bi n m i hay SNP m i thì không s

- BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) v i các thông s m nh

s n trên NCBI: nh m c hi u c a b m i thi t k

(www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/ μ nh các thông s quan tr ng c a m i nh c, thành ph n GC, nhi lai, kh

o hairpin loop, primer-dimer, hetero-dimer,

22

Tris HCl 1 M (pH=8) EDTA 0.5 M (pH=8)

1) C t nh m u b nh ph m cho vào ng eppendorf lo i 1,5 ml

2) Thêm 1 ml xylene, vortex 1 phút, ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút (l p l i 3 l n)

3) Thêm 1 ml Ethanol 100 %, vortex 2 phút, ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút (l p l i 2 l n)

4) Thêm 1 ml Ethanol 80 %, vortex 2 phút, ly tâm 13000 vòng/phút

c sóng 260 nm Giá tr m quang OD260nm (Optical Density 260 nm)

c a các m é nh n DNA trong dung d ch (v i

m i ch ng t trong d ch chi c có ch a DNA b gen và có

th s d ng DNA thu nh c th c nghi m ti p theo

25

2X K-ras F primer (10

S chu

t DNA s di chuy n v phía c ng T di chuy n

ph thu c vào kh ng và c u trúc c a phân t DNA Các acid nucleic trong gel agarose s c ghi l i tia t ngo i (UV) nh ethidium bromide Ch t này có kh n xen vào gi z a acid nucleic và phát quang

26

i tác d ng c a tia t ngo i ( =3 m c c a các acid nucleic s

nh khi so sánh v c c a thang chu n

Thi t b hóa ch t:

Bu n di

20X TAE Buffer Bio Basic mμ 4378 Ethidium bromide Bio Rad

2.2.5 Ph n ng Real time PCR

Sau khi ti n hành ph n ng PCR v i c p m i AS PCR nh m khuy i DNA và ki m tra b c ti p theo ti n hành ph n ng Real time PCR v i các m t bi n (AS real time PCR) nh m phát hi t bi n

m M u DNA dùng cho ph n ng này l y t s n ph m c a ph n ng PCR b ng c p m i AS PCR (pha loãng 50 l n)

u v t bi n trên gen K-ras y / 3 y nghiên c u v K-ras trong li u pháp nh m r t ph bi n trên th gi i, m

F Ủ m

m trên gen K-ras m t bi c kh o sát b i nhi u lo i m

th

S

m u ung

t

S

m u ung

(ME)

12, 13

(LNA-PCR quencing Assay)

Based Genotyp-ing Assays

Vi c th ng kê các bài báo khoa h n th y r ng vai trò

c a gen K-ras u tr nh m i tr c tràng là vô cùng quan tr a EGFR , vì t n s t bi n

Lo i ung

t

S m

Exon 19,

20, 21