Sàng lọc vi sinh vật nội sinh cây lúa có hoạt tính kích thích tăng trưởng cây trồng và kháng nấm Rhizoctonia sp. gây bệnh trên cây lúa

Nitrogenase là h enzym xúc tác cho ph n ng kh N2 thành NH3... subtilis OSU142, Bacillus RC03, Comamonas acidovorans RC41, B.. lipoferum, Azotospirillum brasilense, Acetobacter diazotropi

L i C m n

 hoàn thành khóa lu n t t nghi p này, bên c nh s c g ng c a b n thân, em

đã nh n đ c s h ng d n vƠ giúp đ nhi t tình c a th y cô, gia đình, b n bè

L i đ u tiên, con xin c m n ba m và các anh ch đã luôn bên c nh ng h

tinh th n, ti p s c cho con trong nh ng lúc khó kh n, luôn t o m i đi u ki n t t

nh t đ con an tâm th c t p

Em xin chân thành c m n th y cô trong Khoa Công ngh Sinh h c, tr ng i

h c M Thành ph H Chí Minh đã truy n đ t nh ng ki n th c n n t ng vô cùng

quý giá, t o ti n đ đ em ti p t c h c t p, nghiên c u Em xin g i l i c m n chơn

thành nh t đ n th y Nguy n Thanh Thu n, th y Nguy n V n Minh, cô D ng Nh t

Linh, c m n th y cô luôn bên c nh đ nh h ng truy n đ t kinh nghi m, đ ng viên

em hoƠn thƠnh đ tài

Em xin c m n th y an Duy Pháp, ch Võ Ng c Y n Nhi, ch Nguy n Th M

Linh, anh Hà Ch Linh và các anh, ch , các b n, các em phòng vi sinh đã ng h , giúp đ em trong su t th i gian em th c hi n đ tài

Cu i cùng em xin chân thành c m n nh ng ng i thơn đã luôn bên c nh ng h

em v m i m t và là ngu n đ ng viên tinh th n r t l n đ em có th yên tâm th c

hi n đ tài

Em xin chân thành c m n

Sinh viên th c hi n

Lê Th H o Tháng 5/2014

DANH M C B NG

B ng 2.1 Xây d ng đ ng chu n phospho 21

B ng 2.2 Xây d ng đ ng chu n IAA 23

B ng 3.1 K t qu quan sát đ i th c a các ch ng đ c phân l p 35

B ng 3.2 K t qu quan sát vi th 37

B ng 3.3 K t qu đ nh l ng phân gi i lân c a các ch ng 41

B ng 3.4 K t qu đ nh l ng sinh IAA c a các ch ng 44

B ng 3.5 K t qu kh o sát ph n tr m c ch 46

B ng 3.6 K t qu quan sát đ i th , vi th c a 2 ch ng vi khu n phân l p t phân Dasvila 48

B ng 3.7 K t qu đ nh danh 2 ch ng vi khu n phân l p t phân Dasvila 48

B ng 3.8 K t qu đ nh l ng kh n ng sinh IAA c a ch ng DV2 50

B ng 3.9 T ng h p các ch ng có kh n ng kích thích t ng tr ng cây tr ng 51

B ng 3.10 K t qu đ nh danh sinh hóa c a vi khu n thu c nhóm Azotobacter 53

B ng 3.11 K t qu đ nh danh sinh hóa c a vi khu n thu c Bacillus 54

B ng 3.12 K t qu chi u dài r , thân lúa, tr ng l ng t i, tr ng l ng khô 58

B ng 1 Giá tr OD c a đ th đ ng chu n phospho 78

B ng 2 K t qu OD600nmxác đ nh phospho trong d ch nuôi c y 78

B ng 3 Giá tr OD c a đ th đ ng chu n IAA 79

B ng 4 K t qu OD530nmxác đ nh IAA trong d ch nuôi c y 80

B ng 5 K t qu OD530nmxác đ nh IAA trong d ch nuôi c y 87

B ng 6 K t qu đo chi u dài r c a các nghi m th c 88

B ng 7 K t qu đo chi u dài thân c a các nghi m th c 90

B ng 8 K t qu cân tr ng l ng t i c a các nghi m th c 92

B ng 9 K t qu cân tr ng l ng khô c a các nghi m th c 94

DANH M CăS ă

S đ 2.1 B trí thí nghi m 19

S đ 2.2 Quy trình đ nh l ng phospho 22

S đ 2.3 Quy trình đ nh l ng IAA 24

DANH M C BI Uă Bi u đ 3.1 th bi u di n n ng đ phospho tan d ch nuôi c y các ch ng 42

Bi u đ 3.2 th bi u di n n ng đ IAA trong d ch nuôi c y các ch ng 45

47

Bi u đ 3.3 th bi u di n ph n tr m c ch n m b nh c a 2 ch ng V5 và D5 47

Bi u đ 3.4 So sánh hƠm l ng IAA sinh ra c a ch ng DV2 so v i các ch ng vi khu n n i sinh 50

Bi u đ 3.5 th chi u dài r c a các nghi m th c 58

Bi u đ 3.6 th bi u di n chi u dài thân c a các nghi m th c 59

Bi u đ 3.7 th bi u di n tr ng l ng t i c a các nghi m th c 59

Bi u đ 3.8 th bi u di n tr ng l ng khô c a các nghi m th c 60

Bi u đ 3.9 đ th bi u di n hi u qu kích thích t ng tr ng GPE (%) 60

Bi u đ 1 th t ng quan gi a m t đ quang và n ng đ phospho chu n 78

Bi u đ 2 th t ng quan gi a m t đ quang và n ng đ IAA chu n 79

DANH M C HÌNH NH

Hình 1.1 C u trúc phân t c a IAA và tryptophan 10

Hình 1.2 Hình thái Bacillus 12

Hình 1.3 Hình thái Azotobacter trên môi tr ng vô đ m và t bào vi khu n Azotobacter 15

Hình 3.1 Hình đ i th c a m t s ch ng vi khu n trên môi tr ng NA 36

Hình 3.2 Phân l p vi khu n n i sinh trên môi tr ng TSA (A) vƠ đ a đ i ch ng ch a n c r a m u cu i cùng (B) 37

Hình 3.3 M t s hình nh quan sát vi th m t s ch ng phân l p đ c (X100) 39

Hình 3.4 Kh n ng phát tri n c a vi khu n V18, B3, V7, B5, V3, D1 trên môi tr ng vô đ m 39

Hình 3.5 Kh n ng phơn gi i lân c a vi khu n trên môi tr ng Pikovskaya 40

Hình 3.6 Ph n ng màu phospho hòa tan c a các ch ng 42

Hình 3.7 Ph n ng màu gi a thu c th FeCl3-H2SO4 và IAA sinh ra b i vi khu n 45 Hình 3.8 Th nghi m kép và kh o sát ph n tr m c ch n m Rhizoctonia sp c a ch ng D5 47

Hình 3.9 S n ph m phân Dasvila và phân l p ch ng vi khu n t phân 49

Hình 3.10 Hình nh vi khu n DV2 và DV1 phát tri n trên môi tr ng vô đ m Ashby 49

Hình 3.11 Hình nh kh n ng sinh IAA c a ch ng DV2 l p l i 3 l n 51

Hình 3.12 K t qu th kh n ng t ng thích gi a các ch ng vi khu n đ c l a ch n 55

Hình 3.13 H t lúa n y m m trên đ a agar 56

Hình 3.14 H t lúa n y m m đ c ngâm trong d ch khu n t ng ng v i t ng nghi m th c 56

Hình 3.15 Giai đo n lúa phát tri n đ c 3 ngày, 7 ngày, 19 ngày sau khi gieo 57

Hình 3.16 Chi u dài r gi a các nghi m th c 61

Hình 3.17 Chi u cao thân gi a các nghi m th c 61

Hình 1 Kh n ng lên men đ ng glucose c a vi khu n 85

Hình 6 Th nghi m catalase Hình 7 Th nghi m oxidase 86 Hình 8 Ph n ng nitrat Hình 9 Ph n ng Indol 86

M C L C

PH N 1: T NG QUAN TÀI LI U 3

1.1 VI KHU N N I SINH 4

1.1.1 S l c v vi khu n n i sinh 4

1.1.2 Tình hình nghiên c u trong n c 5

1.1.3 Tình hình nghiên c u trên th gi i 6

1.2 S C NHăNIT ăPHÂN T C A VI KHU N 6

1.2.1 Quá trình c đ nh nit phơn t 6

1.2.2 C ch quá trình c đ nh nit phơn t 7

1.3 VI KHU N HÒA TAN LÂN 8

1.3.1 Vai trò c a lơn đ i v i cây tr ng 8

1.3.2 Vi sinh v t hòa tan lân h u c 8

1.3.3 Vi sinh v t hòa tan lơn vô c 8

1.4 VI KHU N SINH IAA 9

1.5 B NH KHÔ V N TRÊN LÚA DO N M B NH Rhizoctonia sp GÂY RA 10

1.5.1 Tri u ch ng 10

1.5.2 c đi m phát sinh phát tri n 11

1.6 VI KHU N Bacillus 12

1.7 VI KHU N Azotobacter 14

PH N 2: V T LI UăVẨăPH NGăPHÁPăNGHIểNăC U 16

2.1 TH IăGIANăVẨă Aă I M NGHIÊN C U 17

2.2 V T LI U 17

2.3 THI T B , D NG C ,ăMỌIăTR NG 17

2.3.1 Thi t b 17

2.3.2 D ng c 17

2.3.3 Môi tr ng 17

2.4.1 B trí thí nghi m 19

2.4.2 Ph ng pháp phơn l p 20

2.4.3 nh tính kh n ng sinh NH3 c a vi khu n 20

2.4.4 Xác đ nh kh n ng hòa tan lơn 21

2.4.5 Xác đ nh kh n ng sinh IAA 23

2.4.6 Th kh n ng đ i kháng n m b nh và kh o sát ph n tr m c ch 25

2.4.7 nh danh ch ng đ c l a ch n 26

2.4.8 Thí nghi m th kh n ng t ng thích gi a các ch ng đ c l a ch n 31 2.4.9 Thí nghi m tr ng lúa 32

PH N 3: K T QU NGHIÊN C U VÀ TH O LU N 34

3.1 K T QU QUANăSÁTă I TH 35

3.2 K T QU QUAN SÁT VI TH 37

3.3 KH N NGăC NHăNIT ăPHỂNăT 39

3.4 KH N NGăHọAăTANăLỂN 40

3.4.1 nh tính kh n ng hòa tan lơn 40

3.4.2 nh l ng kh n ng phơn gi i lân c a các ch ng 40

3.5 KH N NGăSINHăIAA 43

3.6 K T QU KI M TRA KH N NGă I KHÁNG N M 46

3.7 K T QU PHÂN L P,ăXÁCă NH HO T TÍNH KÍCH THÍCH T NGăTR NG TH C V T C A VI KHU N TRONG PHÂN VI SINH DASVILA 48

3.7.1 K t qu quan sát đ i th , vi th , đ nh danh 48

3.7.2 K t qu kh o sát kh n ng c đ nh đ m 49

3.7.3 K t qu kh o sát kh n ng sinh IAA t 2 ch ng vi khu n phân l p t phân Dasvila 49

3.8 K T QU NH DANH M T S CH NG VI KHU Nă C L A CH N 51

3.8.1 K t qu đ nh danh s b 53

3.8.2 K t qu đ nh danh ch ng d ng tr c, Gram (-), không bào t 53

3.8.3 Ch ng d ng tr c, Gram (+), có bào t 54

3.9 K T QU TH KH N NGăT NGăTHệCHăGI A CÁC CH NG

VI KHU Nă C L A CH N 55

3.10 K T QU TR NG LÚA 55

3.10.1 Ch n gi ng, m h t gi ng n y m m, ti n hành tr ng lúa 55

3.10.2 K t qu m t s đ c tính nông h c 57

PH N 4: K T LU NăVẨă NGH 65

4.1 K T LU N 66

4.2 NGH 66

T V Nă

Lúa (Oryza sativa L.), thu c h Hòa B n lƠ cơy ng c c quan tr ng nh t trong

s phát tri n th gi i vƠ lƠ l ng th c chính c a h n n a dân s th gi i

(FAOSTAT: http://faostat3.fao.org) Ngày nay, Thái Lan và Vi t Nam lƠ hai n c

xu t g o hƠng đ u trong th tr ng lúa g o th gi i Theo FAOSTAT, t ng s n

l ng lúa g o n m 2012 c a Vi t Nam là 43.661.569,64 t n (FAOSTAT:

http://faostat3.fao.org)

Có nhi u ph ng pháp đ t ng n ng su t c ng nh ki m soát n m gây b nh, trong đó có bi n pháp s d ng hóa ch t nông nghi p Phân bón và thu c hóa h c ngƠy cƠng đ c nông dơn a chu ng và s d ng đ n m c d th a i u này ch ng

nh ng làm tiêu t n ti n b c mà còn gây tác h i đ n đ t tr ng, ngu n n c, làm cho môi tr ng b ô nhi m vƠ đ c bi t, nh h ng tr c ti p đ n cu c s ng con

ng i c ng nh nh ng sinh v t s ng trong môi tr ng S d ng phơn bón vi sinh đ

thay th cho phân bón hóa h c là v n đ đang quan tâm và chú ý vì phân bón vi sinh

không nh ng giúp nơng cao n ng su t cây tr ng mà còn thân thi n v i môi tr ng

(Nguy n Th Hu nh Nh và cs., 2013)

M t s nghiên c u cho th y r ng, vi khu n n i sinh phân l p t đ t tr ng ho c r

cây lúa có kh n ng thúc đ y t ng tr ng b ng kh n ng c đ nh nit t do, hòa tan

lân, sinh hormon t ng tr ng nh acit indol acetic (IAA)… vƠ c ch các b nh trên

cây tr ng (Cao Ng c i p và cs., 2009; Verma và cs., 2011; Wang và cs., 2009) Kích thích t ng tr ng th c v t do vi sinh v t có th thông qua c ch tr c ti p và

gián ti p Kích thích tr c ti p là cung c p ch t dinh d ng thông qua các c ch nh

c đ nh nit phơn t , hòa tan lân và các ch t dinh d ng khác, đ ng th i s n sinh

các hormon IAA, axit gibberellic, cytokinin Kích thích gián ti p mà các vi sinh v t

có l i c ch các vi sinh v t gây b nh có h i cho s t ng tr ng và phát tri n c a

th c v t (Raddadi và cs., 2008), đ ng th i t ng kh n ng đ i kháng n m b nh cho

cây tr ng

D a trên c s l i ích c a vi sinh v t n i sinh, chúng tôi mong mu n th c hi n đ

tài: ”SƠng l c vi sinh v t n i sinh cây lúa có ho t tính kích thích t ng tr ng cây

tr ng và kháng n m Rhizoctonia sp gây b nh trên cây lúa.” t i t nh Bình D ng,

ng Nai, V ng TƠu nh m sàng l c ch ng có ho t tính cao đ a vƠo s n xu t phân

sinh h c chuyên dùng cho cơy lúa giúp t ng kh n ng c đ nh đ m cho cây, kích thích t ng tr ng, t ng nh ng tính n ng t t nh hòa tan lơn khó tan, t ng h p nhi u

kích thích t th c v t, kháng n m và góp ph n phát tri n n n nông nghi p b n v ng

 M c tiêu t ng quát:

Phân l p vi khu n n i sinh cây lúa nh m sàng l c ch ng có kh n ng c đ nh nit

phân t , hòa tan lân, sinh IAA và kháng n m có kh n ng kích thích t ng tr ng

cây tr ng

 N i dung th c hi n

 Phơn l p vƠ sƠng l c vi khu n n i sinh cơy lúa có kh n ng c đ nh nit phơn

t , hòa tan lơn, sinh IAA, kháng n m Rhizoctonia sp gơy b nh trên cây lúa

 Phơn l p vƠ đ nh danh s b các ch ng vi khu n t s n ph m phơn vi sinh

th ng m i So sánh các ch ng nƠy v i các ch ng tuy n ch n đ c t cơy lúa d a trên kh n ng c đ nh đ m vƠ sinh IAA

 nh danh ch ng có ho t tính cao

 Thí nghi m th c t

PH Nă1:

T NG QUAN TÀI LI U

1.1 VI KHU N N I SINH

1.1.1 S l c v vi khu n n i sinh

Thu t ng vi sinh v t n i sinh bao g m t t c các sinh v t có toàn b ho c m t

ph n th i gian chu k s ng c a chúng bên trong mô th c v t mà không t o ra b t k tri u ch ng nào (Khan, 2007)

Cơy th ng xuyên tham gia vƠo t ng tác v i m t lo t các vi khu n Vùng r là

n i ti p giáp gi a r th c v t vƠ đ t, lƠ n i l ng đ ng các ch t h u c , vƠ lƠ n i xu t

phát c a các môi tr ng s ng và các ngu n s ng khác nhau cho các vi sinh v t đ t

Th c v t có th thay đ i vùng r c a chúng nh s h p thu các ch t dinh d ng, đ

m và oxy t vùng r ; và các ch t do r ti t ra (El-Shatnawi và cs., 2001) Vùng r

lƠ n i xu t phát nhi u vi khu n n i sinh chui vào r , thơn, lá đ s ng n i sinh; sau

khi xâm nh p vào cây ch có th t p trung t i v trí xâm nh p ho c di chuy n đi

kh p n i trong cơy đ n các h m ch c a r , thân, lá, hoa (Zinniel và cs., 2006), thúc

đ y các quá trình chuy n hóa trong cây, s phát tri n lông r m t cách m nh m và

gi m s kéo dài r (Harari và cs., 1988)

Vi khu n n i sinh thúc đ y th c v t t ng tr ng, t ng n ng su t vƠ đóng vai trò lƠ

m t tác nhơn đi u hòa sinh h c (Ryan và cs., 2007) Vi khu n n i sinh không gây

h i cho cây ch c ng nh c u trúc bên ngoài c a th c v t, đ c phân l p t hoa, trái

cây, lá, thân, r và h t gi ng loài th c v t khác nhau (Ahmad và cs., 2006), h u h t

chúng đ u có kh n ng c đ nh đ m nh : Azospirillum, Gluconacetobacter

diazotrophicus, Herbaspirillum, Klebsiella, Azoarcus, Enterobacter, Burkholderia, Pseudomonas, Azotobacter (Ph m Th Khánh Vân và cs.) Chúng th ng có kh

n ng t ng h p kích thích t auxin (Barbieri và cs., 1986), giúp lo i b các ch t gây

ô nhi m môi tr ng (Kobayashi và cs., 2000), t ng hƠm l ng các ch t khoáng,

t ng kh n ng kháng b nh (Fahey và cs., 1991), hòa tan lân khó tan cho cây tr ng

h p th t t ch t dinh d ng (L ng Ng c D u và cs., 2007) Vi khu n n i sinh s n

xu t hƠng lo t các s n ph m t nhiên có l i cho th c v t kỦ ch mƠ ta có th khai thác nh ng tác nhơn đó đ ng d ng trong y h c, nông nghi p hay công nghi p

vi c phơn gi i lơn vƠ c đ nh đ m NgƠy cƠng có nhi u quan tơm trong vi c phát tri n các ng d ng ti m n ng công ngh sinh h c c a vi khu n n i sinh đ phát tri n các gi ng cơy tr ng có kh n ng kh đ c đ ng th i có kh n ng s n xu t sinh kh i

vƠ nhiên li u sinh h c (Ryan và cs., 2007)

1.1.2 Tình hình nghiên c u trong n c

n c ta, vi c nghiên c u các vi khu n n i sinh có kh n ng c đ nh đ m, hòa

tan lân, t ng h p kích thích t IAA các cây nông nghi p đã đ c ti n hành khá

nhi u trong nh ng n m g n đơy T i vi n nghiên c u và phát tri n sinh h c ậ i

h c C n Th , Nguy n Th Hu nh Nh và cs (2013) phân l p các dòng vi khu n n i

sinh có kh n ng t ng h p IAA và c đ nh đ m trên c y chu i; Nghiên c u c a

L ng Th H ng Hi p và cs (2011) phân l p và nh n di n vi khu n n i sinh trong

cây Cúc Xuyên Chi Nguy n H u Hi p và cs (2008) đã phân l p các dòng vi khu n

n i sinh đ s n xu t phân bón quy mô phòng thí nghi m cho cây mía t i t nh Sóc

Tr ng

Ph m Th Khánh Vân và cs phát hi n vi khu n Azospirillum lipoferum n i sinh

trong cơy lúa mùa đ c s n (Oryza sativa L.) tr ng vùng đ ng b ng sông C u

Long Nghiên c u c a Nguy n Th Ng c Bích, Cao Ng c i p (2009) nh n di n vi

khu n n t r n i sinh trong cây lúa b ng k thu t PCR- ARDRA IGS, k t qu cho

th y r ng các dòng vi khu n n t r , không phân bi t là lên nhanh hay lên ch m, đ u

có th n i sinh cây không ph i thu c h đ u nh cơy lúa Khi vi khu n n t r n i

sinh cây lúa cao s n cho th y tính tích c c nh gia t ng n ng su t lúa, r m lúa vƠ

đ c bi t lƠ gia t ng hƠm l ng nit trong lá lúa t s ng d ng k thu t 15N đ ng

v thông qua s tích l y nit t s c đ nh nit sinh h c Vi khu n n t r còn giúp

cây lúa h p thu nhi u lân, kali và s t so v i cây không b sung vi khu n n t r

ng th i v i nh ng thí nghi m ch ng minh các dòng vi khu n n t r này t ng h p

và phóng thích các ch t sinh tr ng giúp cho cây m c ng cáp đ n khi cây lúa

tr ng thành v i nh ng h p ch t IAA và c đ nh đ m sinh h c

1.1.3 Tình hình nghiên c u trên th gi i

N m 2002, Lodewyck và cs nêu lên ph ng pháp phơn l p và mô t đ c đi m vi

khu n n i sinh t các loài th c v t khác nhau Rosenblueth và cs (2006) đã công b

m t danh sách toàn di n c a vi khu n n i sinh đ c phân l p t m t lo t các b

ph n c a cây N m 2002, Zinniel và cs đã phơn l p vi khu n n i sinh t cây c

Theo nghiên c u c a Fahey và cs (1991) cho th y r ng vi khu n n i sinh có kh

n ng ki m soát sinh h c Nhi u nghiên c u c a Sturz và Matheson (1996), Duijff và

cs., (1997), Krishnamurthy và Gnanamanickam (1997) đã ch ra r ng vi khu n n i

sinh có kh n ng ki m soát đ c m m b nh trên th c v t; nghiên c u c a Azevedo

và cs., (2000), vi khu n n i sinh có kh n ng ki m soát đ c m m b nh côn trùng

và nghiên c u c a Hallmann và cs (1997, 1998) c ng đã ch ra r ng vi khu n n i

sinh có kh n ng ki m soát đ c m m b nh c tuy n trùng Nghiên c u c a

Nghiên c u c a Sun và cs (2008), v s đa d ng c a vi khu n n i sinh vùng r

lúa b ng k thu t phân tích trình t 16S rDNA Nhi u tác gi c ng phát hi n m i

quan h gi a vi khu n n t r và cây lúa, chúng xâm nhi m vào r lúa theo nghiên

c u c a Terouchi và Syono, 1990 nghiên c u c a Plazinski và cs 1985 đã cho th y

s hình thành n t gi (c u trúc nh n t r ) cây lúa.Thí nghi m nghiên c u c a Biswas và cs (2000a), ch ng vi khu n n t r cho cơy lúa lƠm gia t ng l ng quang

h p, l ng sinh kh i, l ng nit trong lá vƠ cu i cùng lƠ n ng su t h t t ng so v i

đ i ch ng

1.2 S C NHăNIT ăPHỂNăT C A VI KHU N

1.2.1 Quá trình c đ nh nit phân t

M t trong nh ng quá trình vi sinh v t h c có Ủ ngh a l n đ i v i nông nghi p là

đ c nit d ng phân t này Cây tr ng trên toƠn trái đ t m i n m s d ng kho ng

100-110 tri u t n nit , trong khi đó phơn đ m hóa h c c a t t c các n c trên th

gi i ch b sung kho ng 30 % s l ng nit b l y đi Mu n phá v ba liên k t trong

phân t nit (N=N) đ d t o ra các lo i phân hóa h c, c n ph i s d ng các đi u

ki n k thu t r t ph c t p (nhi t đ cao, áp su t cao, ch t xúc tác đ t ti n) (B ch Lan Ph ng, 2011)

1.2.2 C ch quá trình c đ nh nit phân t

C đ nh đ m sinh h c là quá trình kh N2 thành NH3 d i s xúc tác c a h

enzym nitrogenase Sau đó, NH3 có th k t h p v i các acid h u c đ t o thành

protein Trong không khí, N2 d ng r t b n và s l ng r t phong phú, chi m 78,16

% theo th tích và 75,5 % theo kh i l ng Cây tr ng c ng nh các loƠi đ ng v t và

ng i không có kh n ng đ ng hóa tr c ti p ngu n N2 t do t không khí Quá trình

c đ nh đ m x y ra trong t bào vi khu n và vi khu n lam đ u gi ng nhau là nh

chúng có h th ng gen nif (ni là ch vi t t t c a nitrogen-nit vƠ f lƠ fixing-c đ nh)

đi u khi n quá trình t ng h p enzym nitrogenase Nitrogenase là h enzym xúc tác

cho ph n ng kh N2 thành NH3 Nh v y, h th ng gen nif đ c xem là h th ng gen đi u khi n cho quá trình c đ nh đ m sinh h c (B ch Lan Ph ng, 2011)

Ngày nay nhi u nhà nghiên c u khoa h c đã ch ng minh NH3 v a là s n ph m

c a quá trình c đ nh nit phơn t v a là nhân t đi u hoà ho t tính c a enzym

nitrogenase Khi NH3 tích l y đ n m t n ng đ nh t đ nh thì nó lƠm đình ch t c

kh c ho t đ ng c a nitrogenase Ki u đi u hoƠ nh v y g i lƠ “ i u hoà liên h

ng c” Tuy nhiên NH3 không tham gia đi u hoà tr c ti p mà thông qua m t

protein khác là enzym glutamin synthetase Khi môi tr ng có nhi u NH3 thì enzym này b adenin hoá nên tr ng thái b t ho t Ng c l i môi tr ng v i n ng đ NH3

th p ho c không có thì không b adenin hoá và enzym s d ng ho t đ ng Khi

tr ng thái ho t đ ng nó s ho t hóa h gen ch u trách nhi m t ng h p nitrogenase

(B ch Lan Ph ng, 2011)

1.3 VI KHU N HÒA TAN LÂN

1.3.1 Vai trò c a lân đ i v i cây tr ng

Lân gi vai trò quan tr ng trong đ i s ng cây tr ng vì nó có thành ph n c a

protit t o nên nhân t bào, c n cho vi c t o ra các b ph n m i cho cây, tham gia

t ng h p acid amin Nh v y lân gi vai trò r t quan tr ng trong đ i s ng c a t bƠo Khi cơy t ng tr ng, hình thành nên nhi u t bào m i thì c n ph i có thêm

nucleo-protit và cây ph i hút thêm c đ m l n lân N u trong đ t có lân mà không

có đ m cơy c ng không phát tri n đ c

Nhi u h p ch t ph c t p khác nhau tham gia vào quá trình hô h p và quang h p

c a cơy đ u ch a lân Trong r t nhi u quá trình sinh hóa x y ra trong cây luôn có s

tham gia c a lân

Vi sinh v t s bi n đ i lân thành d ng mu i c a acid phosphoric D i d ng này

m t ph n đ c cây s d ng, m t ph n đ c c đ nh d i d ng khó tan nh

Ca3(PO4)2 Nh ng d ng khó tan nƠy trong môi tr ng có pH thích h p s chuy n

hóa và bi n thành d ng d tan Trong quá trình này vi sinh v t gi vai trò quan tr ng (B ch Lan Ph ng, 2011)

1.3.2 Vi sinh v t hòa tan lân h u c

Vi sinh v t hòa tan lân h u c ch y u g m Bacillus và Pseudomonas áng chú

ý là B megaterium var phosphatsum có kh n ng hòa tan lơn h u c cao, đ ng th i

B megaterium còn có kh n ng hình thƠnh bƠo t nên s c s ng r t m nh

Phân gi i xác đ ng v t, th c v t acid nucleic, nucleotid, phospholipid, s n ph m

phân gi i cu i cùng là H3PO4 Quá trình phân gi i c n s tham gia c a nhi u nhóm

vi sinh v t thu c các gi ng Bacillus và Pseudomonas (B ch Lan Ph ng, 2011)

Quá trình có th bi u di n t ng quát theo s đ sau:

Nucleoprotein nuclein acid nucleic nucleotide H3PO4

Leucithin Glycero phosphat H3PO4

1.3.3 Vi sinh v t hòa tan lân vô c

Nhi u vi khu n nh Bacillus megaterium, Bacillus mycoides, Bacillus butyricus,

trình s ng c a vi sinh v t Tác d ng v i m t trong b n lo i acid: H3PO4, H2CO3, HNO3, H2SO4, trong đó H2CO3 r t quan tr ng Chính H2CO3đã lƠm cho Ca3(PO4)2

phân gi i (B ch Lan Ph ng, 2011) Quá trình phân gi i nh sau :

Ca3(PO4)2 + 4H2CO3 + H2O Ca(HPO4)2.H2O + Ca(HCO3)2

1.4 VI KHU N SINH IAA

IAA là m t hormon quan tr ng đ c s n xu t b i m t s PGPR, có r t nhi u

nghiên c u đã ch ng minh r ng khi cây tr ng đ c x lý v i IAA do PGPR s n

xu t s gia t ng s phát tri n Vi c vi khu n Bacillus RC23, Paenibacillus

polymyxa RC05, B subtilis OSU142, Bacillus RC03, Comamonas acidovorans RC41, B megaterium RC01, B simplex RC19 v i trƠ đã lƠm gia t ng t l r so v i

đ i ch ng do vi khu n có kh n ng sinh IAA (Maheshwari K, 2011) M t nghiên

c u khác cho th y Azospirillum không ch có kh n ng c đ nh đ m mà còn có kh

n ng s n xu t IAA Các ch ng Azospirillum đ c nghiên c u cho th y r ng s n

ph m IAA ph thu c vƠo môi tr ng nuôi c y và ti n ch t tryptophan

Cytokinins là m t nhóm hormon hi n di n v i l ng r t nh trong sinh v t và

th ng gơy khó kh n cho vi c phát hi n vƠ đ nh l ng Cytokinins đ c s n xu t

b i m t s vi khu n nh Azospirillum và Pseudomonas spp Ngoài ra, m t vài vi

khu n PGPR đ c báo cáo là có kh n ng s n sinh cytokinins nh Rhizobium

leguminosarum, Paenibacillus polymyxa, Pseudomonas fluorescens (Maheshwari

K, 2011)

Trong m t vài nghiên c u, các PGPR nh R phaseoli, A lipoferum,

Azotospirillum brasilense, Acetobacter diazotropicus, Herbospirillum seropedicae, Bacillus licheniformis, B pumilus, Bacillus cereus MJ-1, Bacillus macroides CJ-29

đã đ c báo cáo là có kh n ng s n xu t GAs, nh ng đi u nƠy ch a đ c ch ng

minh m t cách rõ ràng Tuy nhiên, trong nh ng nghiên c u g n đơy,

Gutierrez-Manero và c ng s (2001) đã cung c p ch ng c v b n lo i GAs đ c s n xu t b i

Bacillus pumilus và Bacillus licheniformis

Acid indoleacetic (IAA) Tryptophan (Trp)

Hình 1.1 C u trúc phân t c a IAA và tryptophan (http://vietsciences1.free.fr)

1.5 B NH KHÔ V N TRÊN LÚA DO N M B NH Rhizoctonia

V t b nh lá t ng t nh b lá, th ng v t b nh lan r ng ra r t nhanh chi m

h t c b r ng phi n lá t o ra t ng m ng vơn mơy ho c d ng v t v n da h Các lá giƠ d i ho c lá sát m t n c lƠ n i b nh phát sinh tr c sau đó lan lên các lá

1.5.2 c đi m phát sinh phát tri n

B nh khô v n phát sinh m nh trong đi u ki n nhi t đ cao vƠ đ m cao Nhi t

đ kho ng 24-32oC vƠ m đ bão hoƠ ho c l ng m a cao thì b nh phát sinh phát tri n m nh, t c đ lơy lan nhanh B nh th ng phát sinh tr c tiên các b vƠ lá giƠ sát m t n c ho c d i g c T c đ lơy lan lên các lá phía trên ph thu c r t nhi u vƠ th i ti t m a nhi u, l ng n c trên đ ng ru ng quá cao, đ c bi t các

ru ng nhi u n c, c y quá dƠy

S phát tri n c a b nh khô v n th i k đ u t cơy m đ n đ nhánh có m c đ

b nh ít Giai đo n đòng tr đ n chín sáp lƠ th i k nhi m b nh n ng mi n B c

n c ta b nh khô v n gơy h i trong v mùa l n h n v đông xuơn

S phát sinh phát tri n c a b nh có liên quan nhi u t i ch đ n c trên đ ng

ru ng vƠ ch đ phơn bón Bón phơn đ m nhi u, bón đ m mu n thúc đòng b nh s phát sinh phát tri n m nh h n Bón nhi u l n c ng lƠm cho m c đ b b nh cao Bón Kali có tác d ng lƠ gi m m c đ nhi m b nh c a cơy

Ngu n b nh ch y u lƠ h ch n m t n t i trên đ t ru ng vƠ s i n m g c r vƠ

lá b b nh còn sót l i sau thu ho ch H ch n m có th s ng m t th i gian dƠi sau thu

ho ch lúa th m chí trong đi u ki n ng p n c ng n h n v n có t i 30 % s h ch gi

đ c s c s ng, n y m m thƠnh s i vƠ xơm nhi m gơy b nh cho v sau Quá trình xơm nhi m l p l i th ng x y ra qua ti p xúc gi a h ch vƠ b lá úa (V Tri u Mân,

1.6 VI KHU N Bacillus

Theo Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (Gibson T và cs., 1975), Bacillus phân lo i nh sau:

Gi i: Bacteria Ngành: Firmicutes

L p: Bacilli

B : Bacillales

H : Bacillaceae Chi: Bacillus

Hình 1.2 Hình thái Bacillus (http://lib.jiangnan.edu.cn)

Bacillus h u h t lƠ các vi khu n hình que, Gram d ng, hi u khí, t o n i bƠo t , các t bƠo t n t i riêng l hay dính nhau thƠnh chu i ng n N i bƠo t đ c mô t

đ u tiên b i Cohn khi nghiên c u v B subtilis vƠ sau đó lƠ Koch trong các nghiên

c u v các loƠi gơy b nh nh B anthracis vƠo n m 1976 S t o thƠnh n i bƠo t sau đó đ c ch p nh n nh lƠ m t đ c tính c n b n đ phơn lo i vƠ xác đ nh các thƠnh viên c a chi (Gibson và cs., 1975)

Tuy nhiên, c ng có m t s loƠi Bacillus không t o bƠo t nh B

vƠo đó, khi phơn lo i d a vƠo gi i trình t ADN - ARN, d ng vi khu n không t o bƠo t , k khí b t bu c c ng thu c nhóm Bacillus nh B infernus

T bƠo sinh d ng Bacillus th ng, có đ u tròn hay vuông, kích th c t

0,5-1,2x2,5-10 m, d ng đ n l hay chu i ng n ho c dƠi i v i Bacillus có n i bƠo

t thì bƠo t hình tr , oval, tròn, th nh tho ng có hình b u d c Tùy theo loƠi, bƠo t

có th n m gi a, g n cu i ho c cu i, vƠ túi bƠo t ph ng ho c không ph ng

Tr B anthracis và B mycoides, h u h t các loƠi Bacillus đ u di đ ng, m c dù có

s khác bi t r t l n v kh n ng di đ ng trong m i loƠi a s các loài có catalase

d ng tính (Nguy n c Qu nh Nh vƠ cs, 2009; Nguy n V n Thanh và cs.,

2009)

Ph n l n các chi Bacillus phát tri n t t trên các môi tr ng dinh d ng th ng

m i g m các thƠnh ph n c b n nh : pepton, cao th t, glucose, lactose, ch t khoáng,…, m c dù trong m t s tr ng h p đ c bi t, các môi tr ng nƠy c n đ c

đi u ch nh pH ho c n ng đ mu i (pH t 2 ậ 11, vƠ n ng đ mu i t d i 2 ậ 25

%) Trong phòng thí nghi m, d i đi u ki n phát tri n t i u, th i gian th h c a

Bacillus kho ng 25 phút Trong môi tr ng nuôi c y l ng chúng t o váng trên b

m t Trên môi tr ng th ch t o khu n l c to, tròn hay hình d ng b t th ng, có mƠu xám ng vƠng nh t, b m t khóm s n sùi, h i nh n ho c t o mƠng m n lan trên b

m t th ch (Gibson và cs., 1975)

Hình d ng khu n l c thay đ i tùy theo đ tu i, vƠ các đ a nuôi c y riêng l có th

t o ra các d ng khu n l c khác nhau B larvae và B popilliae trong môi tr ng nuôi c y c n có thêm thiamine Chúng th ng phát tri n trên môi tr ng J ch a

trypton, glucose, d ch chi t n m men B pasteuri c n b sung 0,5 ậ 1 % urea vƠo t t

c môi tr ng nuôi c y B stearothermophilus phát tri n trên môi tr ng dinh

d ng có b sung calci vƠ s t (Gibson và cs., 1975)

Ph n l n các ch ng Bacillus a nhi t trung tính Các loƠi a nhi t nh B

stearothermophilus phát tri n t 55 đ n 70oC, th ng lƠ kho ng 60oC Các loài này

a nhi t b t bu c vƠ không th phát tri n 37oC LoƠi a nhi t trung bình nh B

coagulans phát tri n t t t i 45 ậ 50oC LoƠi gơy b nh cho côn trùng nh B larvae

và B popilliae phát tri n nhi t đ t 25-30oC T ng t nh v y đ i v i B

thuringiensis và B cereus (Gibson và cs., 1975)

1.7 VI KHU N Azotobacter

Vi khu n Azotobacter đ c phân l p l n đ u tiên n m 1901 (M.W.Beijerrinck, 1901) ó lƠ loƠi Azotobacter chroococum V sau ng i ta tìm th y nhi u loài khác

trong chi Azotobacter

Vi khu n thu c chi Azotobacter có t bào t hình c u đ n hình que Khi còn non

t bƠo th ng có hình que v i kích th c kho ng 2,0-7,0 x 1,0-2,5 µm ôi khi

chi u dƠi đ t đ n 10-12 µm Di đ ng nh tiên mao m c quanh kh p c th

Trên môi tr ng không ch a nit khu n l c c a Azotobacter có d ng nh y, l i, đôi khi nh n nheo Khi nuôi c y lơu trên môi tr ng đ c, khu n l c có màu vàng

l c, màu h ng ho c mƠu nơu đen (tùy loƠi Azotobacter) (Nguy n Lân D ng và cs.)

Quan sát kính hi n vi khi t bào già, nh n th y Azotobacter đ c bao b c b i

m t l p v nh y khá dày V nh y ch a kho ng 75 % là ch t hidrit c a axit uronic

và ch ch a kho ng 0,023 % nit Theo khoá phân lo i Bergey’s, Azotobacter ch

y u có 6 loài (Breed Robert và cs.):

- Azotobacter chroocuccum: khi còn non có kh n ng di đ ng, không sinh s c

t

- Azotobactera beijerincki: không di đ ng, không sinh s c t

- Azotobacter paspali: khi còn non có kh n ng di đ ng, khi giƠ có s c t mƠu

vƠng t i mƠu xanh l c, sinh s c t phát hu nh quang

- Azotobacter nigricans: không di đ ng, khi giƠ có s c t mƠu nơu đen, cho t i

mƠu tím đ

- Azotobacter vinelandi: có kh n ng di đ ng, s c t mƠu vƠng l c đ n hu nh

quang, khuy ch tán vƠo môi tr ng

- Azotobacter armeniacus: có kh n ng di đ ng, s c t mƠu nơu đen cho t i

mƠu tím đ

Azotobacter thu c lo i vi khu n hi u khí nh ng có th phát tri n đ c trong các

Azotobacter thu c lo i vi khu n có kh n ng ch u đ c nh ng n ng đ mu i khá

cao, có th phát tri n đ c ngay c trong nh ng môi tr ng ch a 2,5-3 % NaCl

Vi khu n Azotobacter có kh n ng t túc v các ch t sinh tr ng khác nhau:

tiamin (vitamin B1), riboflavin (vitamin B2), xianocobalamin (vitamin B12), acid pantotenic, acid folic, biotin, gibberellins

M t s nghiên c u còn xác đ nh r ng Azotobacter có kh n ng t ng h p ra m t

s ch t kháng n m, kh n ng nƠy không gi ng nhau các ch ng Azotobacter M t

s ch ng Azotobacter chroococcum có kh n ng sinh ra m t s ch t kháng n m có

ph tác d ng khá r ng c ch Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Alternaria,…

S phát tri n và c đ nh nit c a Azotobacter trong đ t ch u nh h ng m t thi t

c a khu h vi sinh v t đ t Bên c nh nh ng nhóm vi sinh v t có nh h ng t t đ i

v i s phát tri n c a Azotobacter (t ng h p các ch t ho t đ ng sinh h c, phân gi i

PH Nă2:

PHÁP NGHIÊN C U

2.1 TH IăGIANăVẨă Aă I M NGHIÊN C U

N m b nh Rhizoctonia sp đ c cung c p t phòng thí nghi m công ngh vi sinh

Khoa Công Ngh Sinh H c tr ng i H c M Tp HCM

Phân vi sinh Dasvila c a Công ty DASCO ng Tháp

- Môi tr ng nutrient Broth (NB)

- Môi tr ng Nutrient Agar (NA)

- Môi tr ng Minimal Salt ( MS )

- Dung d ch L-tryptophan

- Môi tr ng Trypticase soya Agar (TSA)

- Môi tr ng Potato Dextrose Agar

- Môi tr ng YEM (Yeast Extract Mannitol)

- Môi tr ng Clark ậLubs

- Môi tr ng k khí (Wilson Blair Agar Base)

Dung d ch thi c ậacid clohydric g c: hòa tan 10 g tinh th SnCl2.2H2O vào 25

mL HCl đ m đ c b o qu n trong bình kín Dung d ch pha loãng: l y 1mL dung d ch

g c hòa đ u vƠo 132 mL n c c t Dung d ch này ph i th ng xuyên pha l i cho

m i l n thí nghi m

Dung d ch phospho chu n: cân chính xác 0,4390 g KH2PO4 khô khan cho vào

400 mL n c c t, b sung 25 mL H2SO4 7 N vƠ cho thêm n c c t v a đ đ có

1000 mL dung dch phospho 100 ppm Dùng n c c t pha loãng ti p, có các dung

d ch phospho v i n ng đ th p h n (1ppm, 2 ppm, 3 ppm, 4 ppm, 10 ppm, 15 ppm)

2.4.2 Ph ng pháp phân l p

2.4.2.1 L y m u

M u đ c l y, t t nh t là ti n hành ngay quá trình phân l p tuy n ch n N u m u

đ c l y theo d ng lô, lu ng hay khu v c nh t đ nh thì ph i ti n hành l y m u sao

cho m u đ i di n cho toàn b m u chung

M u lúa đ c ch n nh ng cây kh e m nh, thân cây c ng ch c, r phát tri n t t,

không sâu b nh, t ng tr ng t t so v i các cây lúa khác trên cùng m t đ ng ru ng

2.4.2.2 X lý m u

M u mô r và thân lúa sau khi thu th p đ c r a s ch d i vòi n c m nh và c t

thành nh ng đo n nh 1-2 cm

- B m t m u đ c kh trùng qua các b c:

- R a trong ethanol 70 % trong 5 phút

- Ngâm trong dung d ch natri hypoclorit (2 %) trong 5 phút

- Ethanol 70 % trong 30 giây

- Cu i cùng r a l i 5 l n v i n c c t vô trùng C y trang 0,1 mL n c r a

m u l n cu i trên môi tr ng TSA, 28°C trong 24 gi

N u kh trùng b m t đ t yêu c u, trên các đ a môi tr ng không có s xu t hi n

c a vi khu n hay vi n m Dùng d ng c vô trùng nghi n nát m u r , thơn vƠ đ t lên

đ a môi tr ng TSA, 28°C trong 3 ngƠy đ cho s phát tri n c a vi khu n n i

sinh (Ph m Th Khánh Vân và cs.; Sun và cs., 2008)

Ti n hƠnh xác đ nh kh n ng c đ nh nit phơn t trên đ a môi tr ng vô đ m

Ashby Nh ng ch ng vi khu n có kh n ng c đ nh nit phơn t s t ng tr ng trên môi tr ng vô đ m này (Phan Th Huy n và cs., 2003)

2.4.4 Xác đ nh kh n ng hòa tan lân

2.4.4.1 Nguyên t c

Khi c y vi khu n lên môi tr ng ch a h p ch t phospho khó tan là

Ca3(PO4)2, vi khu n có kh n ng hòa tan Ca3(PO4)2 s t o ra vòng trong xung quanh khu n l c (Farah và cs., 2006)

2.4.4.2 nh tính kh n ng hòa tan lân

Ti n hƠnh xác đ nh ho t tính hòa tan lân trên môi tr ng Pikovskaya b ng

ph ng pháp c y đi m 37oC vƠ đ c k t qu sau 24 gi trong 5-7 ngày Ch ng

có vòng phân gi i xung quanh khu n l c trên môi tr ng Pikovskaya là ch ng có

kh n ng hòa tan lơn (Tiêu chu n ngành 10 TCN 298-97; Ahmad và cs., 2006)

2.4.4.3 nh l ng kh n ng hòa tan lân

Xây d ng đ ng chu n phân gi i lân theo b ng 2.1

B ng 2.1 Xây d ngăđ ng chu n phospho

Cho vào t ng bình đ nh m c 10 mL l ng dung d ch phospho chu n nh trên

t ng ng v i n ng đ 10-100 ppm B sung 10 mL dung d ch acid ậclo molybdic

vào L c đ u, thêm n c c t đ t 40 mL Nh 0,25 mL dung d ch thi c acid

clohydric pha loãng Tr n đ u dung d ch vƠ đo trên máy so mƠu b c sóng 600

nm Xác đ nh m t đ quang c a m i dung d ch

Quy trình đ nh l ng kh n ng hòa tan lơn đ c th c hi n theo s đ 2.2

10 mL

10 mL acid ậclo molybdic

30 mL n c c t

0,25 mL thi c acidHút 1mL

Hút 13 mL

Hút 200 µL đo OD b c sóng 600 nm dung d ch đ c chu n b K t qu đ c

so v i đ ng chu n đ đ nh l ng kh n ng hòa tan lơn c a các ch ng vi khu n

2.4.5 Xác đ nh kh n ng sinh IAA

2.4.5.1 Nguyên t c

IAA đ c t ng h p t vi khu n, khi tác d ng v i thu c th Salkowski R2 (FeCl3

-H2SO4) s t o ra ph c h p có màu h ng nh t đ n đ m tùy theo n ng đ IAA

nh l ng IAA trong d ch nuôi c y vi khu n

Xây d ng đ ng chu n IAA theo b ng 2.2

B ng 2.2 Xây d ngăđ ng chu n IAA

N ng đ IAA 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Dung d ch g c

hành pha loãng n ng đ IAA Ti p theo hút 1 mL các dung d ch có ch a IAA đã

pha loãng cho thêm 4 mL thu c th FeCl3-H2SO4 l c đ u đ trong t i 15 phút (khi mƠu đ t đ đ m t i đa) Ti n hƠnh đo OD b c sóng 530 nm các n ng đ IAA

Xác đ nh m t đ quang c a m i dung d ch (Glickmann và cs., 1994; Kaga và cs.,

2009; Gordon và cs., 1950)

Quy trình đ nh l ng kh n ng sinh IAA đ c th c hi n theo s đ 2.3

S ăđ 2.3 Quyătrìnhăđ nhăl ng IAA

Ti n hành:

Pha d ch khu n đ t 3×108 CFU/ mL, hút 100 µL d ch khu n t ng sinh trong 3 mL môi tr ng NB, nuôi l c 200 vòng/ phút trong 24 gi Ti n hành hút 100 µL d ch

khu n t ng sinh vƠo 5 mL môi tr ng MS 5 mM Tryptophan, nuôi l c 200 vòng/

phút trong 48 gi Sau đó đem ly tơm 6000 vòng/ phút, thu d ch khu n, l y 1 mL

d ch khu n thêm 4 mL thu c th FeCl3-H2SO4, l c đ u đ yên trong 15 phút, hút

200 µL đo OD K t qu đ c so v i đ ng chu n đ đ nh l ng kh n ng sinh IAA

c a các ch ng vi khu n

2.4.6 Th kh n ng đ i kháng n m b nh và kh o sát ph n tr m c ch

2.4.6.1 Th kh n ng đ i kháng n m

S d ng ph ng pháp th nghi m kép, n m và vi khu n đ c nuôi cách nhau 3

cm trên đ a môi tr ng PDA (đ ng kính 90 mm) 37oC trong 3 ngày (John và cs., 2010)

Dùng pipetmen hút 10 L d ch n m và d ch vi khu n vào 2 v trí cách nhau 3 cm trên đ a petri ch a môi tr ng PDA

N u vi khu n có kh n ng c ch s phát tri n c a n m b nh thì s th y vùng

n m nƠy không sinh tr ng Và n u vi khu n không có kh n ng c ch s phát

tri n c a n m b nh thì s th y n m phát tri n bình th ng

2.4.6.2 Kh o sát ph n tr m c ch

Tính kháng n m m nh hay y u c a vi khu n đ c th hi n qua ph n tr m c ch

 Vi khu n đ c nuôi t ng sinh trong 8 mL môi tr ng PD, l c 150 vòng/

ngày

 Ly tâm 5100 vòng/ 10 phút

 L c d ch n i sau ly tơm, s d ng mƠng l c 0,45 m

 Pha bƠo t n m Rhizoctonia sp trong NaCl 0,85 %, đ t m t đ 106 bào

t / mL (đ m b ng bu ng đ m h ng c u)

 Môi tr ng PDA sau khi h p vô trùng, đ t b n nhi t 50oC

 T l d ch l c vi khu n vƠ môi tr ng PDA lƠ 1: 1, ti n hƠnh đ đ a

 Hút 20 L d ch n m b m vƠo gi a đ a petri đã chu n b trên, s d ng

đ a môi tr ng PDA không b sung d ch l c vi khu n lƠm đ a đ i ch ng

nhi t đ phòng trong 6 ngƠy vƠ xác đ nh ph n tr m c ch theo công

th c:

I C E

I: ph n tr m c ch C: đ ng kính n m m c trên đ a đ i ch ng E: đ ng kính n m m c trên đ a ch a d ch l c vi khu n

Vi khu n đ c xem nh có kh n ng c ch n m khi I > 20 % N u I < 20 %, vi

khu n không có giá tr trong kh n ng kháng n m (Gong và cs., 2004; Lokesha và

cs., 2007)

2.4.7 nh danh ch ng đ c l a ch n

Chúng tôi ti n hƠnh đ nh danh các ch ng vi khu n trên nh m đ m b o đ an toàn

khi s d ng vi khu n đ th nghi m in vivo và làm ch ph m vi sinh v t V i m c

tiêu này chúng tôi ti n hƠnh đ nh danh vi khu n thu c nhóm Azotobacter theo khóa

phân lo i Bergey’s (Breed Robert và cs) nh danh vi khu n thu c nhóm Bacillus

theo Cowan and Steel (Barrow và cs) M t s th nghi m sinh hóa đ đ nh danh vi

khu n

2.4.7.1 Nhu m Gram

Nh m xác đ nh hình d ng t bào vi khu n, d ng c u hay tr c, quan sát cách

s p x p d ng đ n l , d ng chu i hay chùm, và phân bi t tính ch t b t màu Gram (ậ)

ho c Gram (+)

- t tiêu b n đã ph t kính và c đ nh m u lên thanh th y tinh ch U

- Nhu m b ng dung d ch crystal violet trong 1 phút, r a n c, th m khô

- Nhu m l i b ng dung d ch lugol trong 1 phút, r a n c, th m khô

- T y màu b ng c n 96o, kho ng 15-20 giơy (cho đ n khi v a th y m t

màu), r a n c, th m khô

- Nhu m b sung b ng dung d ch safranin trong 30 giây, r a n c, th m khô

- Quan sát b ng v t kính d u, đ phóng đ i 1.000 l n

Vi khu n Gram (+) b t màu tím crystal violet, vi khu n Gram (-) b t màu h ng safranin (MacFaddin, 1980)

2.4.7.2 Th catalase

 Nguyên t c:

Xác đ nh kh n ng ti t enzym catalase c a vi khu n hi u khí tuy t đ i ho c

hi u khí tùy nghi Enzym catalase có kh n ng phơn gi i peroxyt t o thành CO2 và

H2O

 Ti n hƠnh:

Thu c th : n c oxy già (H2O2)

Th c hi n: nh vài gi t n c oxy già lên m t mi ng lame s ch Dùng que c y

vòng, b ng thao tác vô trùng, l y m t ít sinh kh i c a khu n l c nghi ng và dàn

Th nghi m ch u đ ng mu i s d ng môi tr ng TSB (Trypticase Soy Broth),

b sung NaCl đ t o ra môi tr ng có n ng đ mu i 10 % Môi tr ng nƠy dùng đ

th nghi m kh n ng t n t i c a vi sinh v t trong môi tr ng có n ng đ mu i cao

M t s ch ng Bacillus có kh n ng phát tri n đi u ki n 10 % NaCl, do đó, th nghi m nƠy góp ph n đ nh danh vi khu n

 Ti n hƠnh

C y vi khu n v a đ c ho t hóa kho ng 18 ậ 24 gi vƠo môi tr ng TSB b

sung 10 % NaCl, nuôi c y 37oC/ 24 gi Kh n ng phát tri n th hi n qua kh

n ng m c đ c, lƠm đ c môi tr ng nuôi c y (MacFaddin, 1980)

2.4.7.4 Kh n ng phát tri n 55oC

 Nguyên t c

Ph n l n Bacillus lƠ các vi khu n a m v i nhi t đ sinh tr ng t i u t

30oC đ n 45oC, m t s loƠi có th sinh tr ng 65oC M t s loƠi a l nh có th sinh tr ng vƠ hình thƠnh n i bƠo t 0oC Kh n ng phát tri n các đi u ki n nhi t đ khác nhau góp ph n đ nh danh vi khu n Bacillus

 Ti n hƠnh:

Môi tr ng và thu c th : đ a môi tr ng Sabouraud, b sung 1 % tinh b t,

thu c th dung d ch iod hay lugol

Thao tác: sau khi đã chu n b xong môi tr ng, c y vi sinh v t theo t ng khóm trên đ a, 37oC/ 24 gi ậ 48 gi , l y ra nh 1-2 mL dung d ch iod 0,02 N hay

thu c th lugol (MacFaddin, 1980)

2.4.7.6 Th kh n ng di đ ng

 Nguyên t c:

M t s vi khu n có kh n ng di đ ng nh tiên mao, trong môi tr ng bán

l ng và lƠm đ c môi tr ng hay m c gi ng nh r cơy xung quanh đ ng c y

 Ti n hƠnh:

Môi tr ng: Môi tr ng bán l ng NA đ đ ng Dùng que c y th ng l y vi

khu n trong ng gi ng c y sang ng nghi m th ch bán l ng, trích th ng t trên

xu ng d i ngay gi a ng môi tr ng Cho vào t m 37oC/ 24 gi

 K t qu :

Ph n ng di đ ng d ng (+): vi khu n m c lan ra kh i đu ng c y, xa hay

g n tu theo kh n ng di đ ng c a vi khu n m nh hay y u

Ph n ng di đ ng âm (-): vi khu n ch m c trên đ ng c y (MacFaddin,

Môi tr ng: canh YEM không đ ng b sung 0,15 % benzoat natri

Thao tác: c y vi khu n vào các ng nghi m môi tr ng, sau khi nhi t đ

Vi sinh v t có các enzyme phân gi i các lo i đ ng glucose, lactose, manitol,

galactose, fructose, saccharose, rhamnose, maltose,… t o các axit h u c , lƠm pH

c a môi tr ng nuôi c y gi m, và có th t o m t s ch t khí nh H2, CO2, pH c a

môi tr ng gi m, làm ch th màu phenol red chuy n t đ sang vàng Các ch t khí

sinh ra s tích t vào ng durham, phát hi n đ c b ng m t th ng (MacFaddin,

1980)

 Ti n hƠnh:

Môi tr ng: canh dinh d ng (NB) b sung 1 % đ ng, pH ả 7 Ch th màu

phenol red C y vi khu n vƠo môi tr ng lên men đ ng, sau khi nhi t đ 37oC/

24 gi l y ra đ c k t qu

 K t qu :

(+): lên men có sinh h i ho c không sinh h i, phenol red trong ng môi

tr ng chuy n t đ sang vàng, ng durham không có h i

(-): phenol red v n gi nguyên mƠu đ , ng Durham không có h i

2.4.7.9 Ph n ng v i thu c th Nessler

Nh m xác đ nh s hi n đi n c a nit trong môi tr ng vô đ m sau khi nuôi

c y vi khu n có kh n ng c đ nh nit

 Nguyên t c:

Khi cho m t dung d ch mu i ammonium (NH4+) v i thu c th Nessler (dung

d ch mu i c a Hg và K v i Iodur) s t o thành ph c ch t Iodur thu ngân ammonium có màu vàng Vi khu n c đ nh nit sau khi nuôi c y trên môi tr ng

th ch vô đ m s c đ nh m t l ng nit trên b m t môi tr ng D a vào tính ch t nƠy đ nh n bi t vi khu n c đ nh đ m (MacFaddin, 1980)

2K2(HgI4) + NH4OH + 3KOH [ Hg2ONH2]I- + 7KI + 3H2O

 Th c hi n:

Dùng các ch ng vi khu n đã đ c t ng sinh 24 gi đem c y trên môi tr ng

th ch Ashby không có thành ph n nit nhi t đ phòng Sau 24 gi đem th

ph n ng màu v i thu c th Nessler

 K t qu :

(+): các vi sinh v t có kh n ng phát tri n trên môi tr ng vô đ m và t o ra

N s cho ph n ng v i thu c th Nessler cho ph c ch t có mƠu vƠng t i

(-): không cho màu vàng

2.4.7.10 Th nghi m VP (Voges – Proskauer)

Vi sinh v t chuy n hóa glucose thành acid pyruvic R i ti p t c chuy n hoá

trong môi tr ng ki m t o thành diacetyl Diacetyl ph n ng v i nhân guanidine

(arginine) có trong peptone đ cho h p ch t màu h ng đ

Môi tr ng: môi tr ng Clark-lubs pH=7 ã c y vi khu n 37oC/ 24 gi Thu c th là NaOH 40 % (KOH 10 %) và -napthol trong c n (MacFaddin, 1980)

 Cách th c hi n:

ng đã c y vi khu n 37oC/ 24 gi , l y ra nh vào kho ng 10 gi t NaOH

40 %, h nóng nh , nh ti p kho ng 15 gi t -napthol, l c đ u, đ yên 5-10 phút

 c k t qu :

Ph n ng d ng: môi tr ng chuy n sang mƠu đ cam

Ph n ng ơm: môi tr ng có màu vàng ho c mƠu nơu đ t

2.4.8 Thí nghi m th kh n ng t ng thích gi a các ch ng đ c l a ch n

2.4.8.1 Nguyên t c

Nh m chu n b cho s k t h p các vi khu n trong thí nghi m kh o sát kh n ng

n y m m và kh n ng kích thích t ng tr ng trên cây lúa, chúng tôi ti n hành thí

nghi m nh m kh ng đ nh các vi khu n nƠy không đ i kháng nhau

Nhi u vi khu n có kh n ng sinh ra m t s ch t có tính ch t kháng khu n có kh

n ng c ch s phát tri n c a vi khu n khác Khi c y v ch vuông góc gi a hai vi

khu n N u t i v trí giao nhau, có m t ho c c hai vi khu n không m c đ c ch ng

t hai vi khu n nƠy đ i kháng nhau (Shafiqur và cs., 2009)

2.4.8.2 Cách ti n hành

T ng sinh vi khu n trong môi tr ng NB, đ t m t đ 108 t bào/ mL

Chu n b môi tr ng th nghi m lƠ đ a NA

B c 1: dùng t m bông l y vi khu n 1 t ng đã t ng sinh, c y m t đ ng th ng

vi khu n ngay chính gi a đ a, không ch m mép đ a petri

B c 2: khi đ ng c y vi khu n 1 đã khô, ti p t c l y t m bông nhúng vƠo ng

vi khu n 2 đã t ng sinh, th m v a t t m bông, v ch m t đ ng c y vuông góc v i

đ ng c y c a vi khu n 1 (Watchariya và cs., 2007)