Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình thủy phân cá tạp để sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng làm thức ăn cho cá lóc bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm

BOD Biochemical oxygen Demand CFU Colony forming unit COD Chemical oxygen Demand... Cá lóc đen Channa striata..... Bacillus subtilis .... Bacillus polyfermenticus ..... Cá lóc đen Channa

KHOA CÔNG NGH SINH H C

Chuyên ngành: Vi sinh – Sinh h c phân t

GVHD: Ths Nguy n V n Minh SVTH: ng Hoàng Nhân MSSV: 1053010516 Khóa: 2010 - 2014

Bình D ng, tháng 5, 2014

L I C M N

L i đ u tiên, con bày t lòng bi t n sâu s c nh t cho ba m đã nuôi n ng, d y d con cho đ n ngày hôm nay và đã đ ng viên, giúp đ con r t nhi u trong th i gian con th c hi n đ tài th c t p này Em xin c m n anh đã giúp đ em trong su t th i gian th c t p

Em xin c m n th y cô Khoa Công ngh Sinh h c, tr ng i h c M Thành ph

H Chí Minh đã t n tâm gi ng d y cho em gi ng d y cho em trong su t nh ng n m

h c v a qua

Em xin g i l i c m n chân thành nh t đ n th y Nguy n V n Minh, cô D ng

Nh t Linh Ng i đã t n tình giúp đ , đ ng vi n, t o m i đi n ki n t t nh t đ em hoàn thành đ tài th c t p này

Em xin g i l i c m n đ n anh an Duy Pháp, ch Võ Ng c Y n Nhi, ch Nguy n Th M Linh và các anh ch trong phòng thí nghi m Công ngh Vi sinh đã giúp đ và cho em nh ng kinh nghi m quý báu

Tôi xin c m n các b n cùng th c hi n đ tài th c t p c ng nh các em h c vi c

t i phòng thí nghi m Công ngh Vi sinh đã giúp đ tôi r t nhi u trong quá trình th c

t p

Tôi xin c m n nh ng ng i b n c a tôi đã giúp đ , quan tâm, đ ng viên tinh

th n trong th i gian qua

Tôi xin chân thành c m n

Bình D ng, tháng 5 n m 2014

ng Hoàng Nhân

BOD Biochemical oxygen Demand

CFU Colony forming unit

COD Chemical oxygen Demand

DANH M C HÌNH

Hình 1.1 Cá lóc đen Channa striata 5

Hình 1.2 Bacillus d i kính hi n vi đi n t 17

Hình 1.3 Thi t k CCD v i 4 đi m góc (cube point), 4 đi m d c tr c và 5 l n l p l i t i đi m thí nghi m trung tâm (0, 0) 32

Hình 1.4 Ma tr n b trí thí nghi m theo thi t k Box – Behnken 33

Hình 1.5 Màn hình làm vi c c a ph n m m Minitab 16 35

Hình 3.1 i th (a) và vi th (×100) (b) c a ch ng B polyfermenticus F27 60

Hình 3.2 i th (a) và vi th (×100) (b) c a ch ng Bacillus subtilis Q111 61

Hình 3.3 K t qu th nghi m kh n ng sinh protease c a ch ng B polyfermenticus F27 (a) và B subtilis Q111(b) 61

Hình 3.4 K t qu thí nghi m đ i kháng vi khu n gây b nh Pseudomonas c a 2 ch ng thí nghi m 62

Hình 3.5 K t qu thí nghi m đ i kháng vi khu n gây b nh Streptococcus c a 2 ch ng thí nghi m 63

Hình 3.6 K t qu thí nghi m t ng thích gi a 2 ch ng thí nghi m 64

Hình 3.7 K t qu t i u hóa quá trình th y phân nguyên li u cá b ng công c t u hóa c a ph n m m Minitab 16 81

Hình 3.8 K t qu t i u hóa m t đ VSV sau quá trình th y phân nguyên li u cá b ng công c t u hóa c a ph n m m Minitab 16 83

Hình 3.9 K t qu t i u hóa đa m c tiêu hi u qu th y phân và m t đ VSV sau quá trình th y phân nguyên li u cá b ng công c t u hóa c a ph n m m Minitab 16 84

Hình ph l c 2a K t qu x lý th ng kê ANOVA m t y u t v m t đ VSV c a các nghi m th c trong thí nghi m kh o sát nhi t đ kh trùng nguyên li u cá t p 95 Hình ph l c 2b K t qu x lý th ng kê ANOVA m t y u t v ch s đ m nit t ng s c a các nghi m th c trong thí nghi m kh o sát nhi t đ kh trùng nguyên li u cá t p 96

Hình ph l c 2c K t qu x lý th ng kê ANOVA m t y u t v ch s đ m axit amin ngày 0 c a các nghi m th c trong thí nghi m kh o sát nhi t đ kh trùng nguyên li u cá t p 97

Hình ph l c 2d K t qu x lý th ng kê ANOVA m t y u t v ch s đ m axit amin ngày 5 c a các nghi m th c trong thí nghi m kh o sát nhi t đ kh trùng nguyên li u cá t p 98 Hình ph l c 4a Thông tin mô hình h i quy c a thí nghi m xác đ nh y u t nh

h ng 100 Hình ph l c 4b K t qu phân tích ph ng sai c a thí nghi m xác đ nh y u t

nh h ng 100 Hình ph l c 6a Thông tin mô hình h i quy c a thí nghi m kh i d u 102Hình ph l c 6b K t qu phân tích ph ng sai c a thí nghi m kh i d u 102 Hình ph l c 7a Thông tin mô hình h i quy c a thí nghi m b m t ch tiêu cho hàm đ m axit amin 103 Hình ph l c 7b K t qu phân tích ph ng sai c a thí nghi m b m t ch tiêu cho hàm đ m axit amin 103 Hình ph l c 8a Thông tin mô hình h i quy c a thí nghi m b m t ch tiêu cho hàm m t đ VSV 104 Hình ph l c 8b K t qu phân tích ph ng sai c a thí nghi m b m t ch tiêu cho hàm m t đ VSV 104

B ng 3.1 c đi m đ i th và vi th c a 2 ch ng vi khu n th nghi m 60

B ng 3.2 So sánh m t đ vi sinh v t các nghi m th c trong thí nghi m kh o sát nhi t đ kh trùng 65

B ng 3.3 K t qu ki m tra các ch s đ m c a thí nghi m kh o sát nhi t đ kh trùng 66

B ng 3.4 B trí và k t qu thí nghi m xác đ nh y u t nh h ng theo thi t k Plackett - Burmen 69

B ng 3.5 Giá tr bi n s c a thí nghi m kh i đ u theo thi t k Plackett – Burman 72

B ng 3.6 B trí và k t qu thí nghi m kh i đ u t i u hóa các y u t nh h ng 73

B ng 3.7 B trí và k t qu thí nghi m b m t ch tiêu t i u hóa các y u t nh

h ng 76

Bi u đ 3.3 So sánh ch s đ m axit amin c a các nghi m th c trong thí nghi m

kh o sát nhi t đ kh trùng t i th i đi m ngày 0 67

Bi u đ 3.4 So sánh ch s đ m axit amin c a các nghi m th c trong thí nghi m

kh o sát nhi t đ kh trùng t i th i đi m ngày 5 67

th 3.9 ng m c (bên trái) và b m t đáp ng (bên ph i) c a t ng c p y u

t nh h ng đ n quá trình th y phân 80

th 3.10 ng m c (bên trái) và b m t đáp ng (bên ph i) c a t ng c p y u

t nh h ng đ n m t đ VSV sau quá trình th y phân 82

th ph l c 3a nh h ng chu n hóa c a 4 y u t kh o sát đ i v i n ng đ

đ m axit amin c a thí nghi m xác đ nh y u t nh h ng 99

th ph l c 3b Pareto c a 4 y u t kh o sát đ i v i n ng đ đ m axit amin

c a thí nghi m xác đ nh y u t nh h ng 99

th ph l c 5a nh h ng chu n hóa c a 3 y u t kh o sát đ i v i n ng đ

đ m axit amin c a thí nghi m kh i đ u 101

th ph l c 5b Pareto c a 3 y u t kh o sát đ i v i n ng đ đ m axit amin

c a thí nghi m kh i đ u 101

M C L C

T V N 1

PH N 1 T NG QUAN TÀI LI U 4

1.1 Tình hình nuôi cá lóc t i Vi t Nam 5

1.1.1 Gi i thi u cá lóc Channa striata 5

1.1.2 L ch s ngh nuôi cá lóc 8

1.2 Các v n đ hi n nay 9

1.2.1 Thi u h t ngu n th c n t nhiên 9

1.2.2 V n đ c a ngu n th c n công nghi p 9

1.2.3 Ô nhi m môi tr ng n c 10

1.2.4 D ch b nh 11

1.3 Các ph ng pháp gi i quy t 12

1.3.1 Ch t d n d 12

1.3.2 Probiotic 13

1.4 Bacillus 17

1.5.1 Bacillus subtilis 18

1.5.2 Bacillus polyfermenticus 19

1.5.3 Kh n ng sinh enzym c a Bacillus 19

1.5.4 Các y u t nh h ng đ n quá trình sinh enzym t Bacillus 20

1.5.5 ng d ng c a vi khu n Bacillus trong nuôi tr ng th y s n 21

1.6 Tình hình nghiên c u hi n nay 23

1.6.1 Ngoài n c 23

1.6.2 Trong n c 23

1.7 T i u hóa b ng ph ng pháp quy ho ch th c nghi m 24

1.7.1 Ph ng pháp quy ho ch th c nghi m 24

1.7.2 Thi t k tìm y u t nh h ng c a Plackett – Burman 26

1.7.3 T i u hóa b ng ph ng pháp b m t ch tiêu 28

1.7.4 Ph n m m Minitab 34

PH N 2 V T LI U VÀ PH NG PHÁP NGHIÊN C U 36

2.1 Th i gian và đ a đi m nghiên c u 37

2.2 V t li u nghiên c u 37

2.2.1 Nguyên li u 37

2.2.2 Môi tr ng – Hóa ch t 37

2.3 Thi t b - D ng c 38

2.3.1 Thi t b 38

2.3.2 D ng c 38

2.4 S đ thí nghi m 39

2.5 Ph ng pháp xác đ nh m t đ vi sinh v t 40

2.5.1 Xác đ nh tr c ti p m t đ b ng ph ng pháp đ m trên bu ng đ m h ng c u 40

2.5.2 Xác đ nh gián ti p s l ng t bào b ng cách đ m s l ng khu n l c 41

2.6 Các ph ng pháp đ nh l ng đ m 42

2.6.1 nh l ng nit t ng s b ng ph ng pháp Kjeldahl 42

2.6.2 nh l ng đ m formol ph ng pháp chu n đ formol (Ph ng pháp Sörensen) 44

2.6.3 nh l ng đ m amoniac b ng ph ng pháp c t kéo h i n c 45

2.6.4 nh l ng đ m axit amin 47

2.7 Quan sát đ i th và vi th c a 2 ch ng vi khu n th nghi m 47

2.7.1 Quan sát đ i th 47

2.7.2 Quan sát vi th b ng ph ng pháp nhu m Gram 47

2.8 Thí nghi m kh n ng sinh protease c a 2 ch ng th nghi m 48

2.8.1 Nguyên lý 48

2.8.2 Chu n b 49

2.8.3 Ti n hành 49

2.8.4 c k t qu 49

2.9 Thí nghi m kh n ng đ i kháng v i vi khu n gây b nh trên cá lóc c a 2 ch ng th nghi m 50

2.9.1 Nguyên lý 50

2.9.2 Chu n b 50

2.9.3 Ti n hành 50

2.9.4 c k t qu 50

2.10 Thí nghi m kh n ng t ng thích gi a 2 ch ng th nghi m 51

2.10.1 Nguyên lý 51

2.10.2 Chu n b 51

2.10.3 Ti n hành 51

2.10.4 c k t qu 52

2.11 S ch nguyên li u cá t p 52

2.12 Thí nghi m kh o sát nhi t đ kh trùng nguyên li u cá t p 52

2.12.1 Chu n b thí nghi m 52

2.12.2 Ti n hành thí nghi m 53

2.12.3 c k t qu 53

2.13 Thí nghi m xác đ nh y u t nh h ng 53

2.13.1 Thi t k thí nghi m 53

2.13.2 Ti n hành thí nghi m 54

2.13.3 c k t qu 55

2.14 Thí nghi m kh i đ u 55

2.14.1 Thi t k thí nghi m 55

2.14.2 Ti n hành thí nghi m 56

2.14.3 c k t qu 56

2.15 Tìm kho ng t i u c a các y u t nh h ng chính b ng ph ng pháp leo d c 56

2.15.1 Thi t k thí nghi m 56

2.15.2 Ti n hành thí nghi m 57

2.15.3 c k t qu 57

2.16 Thí nghi m b m t ch tiêu 57

2.16.1 Thi t k thí nghi m 57

2.16.2 Ti n hành thí nghi m 58

2.16.3 c k t qu 58

PH N 3 K T QU VÀ TH O LU N 59

3.1 i th và vi th c a 2 ch ng vi khu n th nghi m 60

3.2 Thí nghi m kh n ng sinh enzym protease c a 2 ch ng vi khu n thí nghi m 61

3.3 Thí nghi m kh n ng đ i kháng v i vi khu n gây b nh trên cá lóc c a 2 ch ng vi khu n th nghi m 62

3.4 Thí nghi m t ng thích gi a 2 ch ng vi khu n thí nghi m 63

3.5 Thí nghi m kh o sát nhi t đ kh trùng nguyên li u cá t p 64

3.6 Thí nghi m xác đ nh y u t nh h ng 68

3.7 Thí nghi m kh i đ u 72

3.8 Thí nghi m b m t ch tiêu 76

3.8.1 K t qu thí nghi m b m t ch tiêu 76

3.8.2 T i u hóa 79

PH N 4 K T LU N VÀ NGH 86

4.1 K t lu n 87

4.2 ngh 87

TÀI LI U THAM KH O 88

PH L C 94

T V N

Cá lóc là loài cá đ c tr ng n c ta và đ c nuôi nhi u đ ng b ng sông C u Long ( BSCL) ây là loài cá n t p, s c s ng m nh, thích nghi đ c nhi u đi u

ki n môi tr ng khác nhau H n n a, cá lóc là loài cá đ c a chu ng tiêu th hàng

đ u Vi t Nam (Lê Xuân Sinh và c ng s , 1998) Vì v y, ngh nuôi cá lóc vùng BSCL phát tri n, đ t s n l ng t i 40.000 t n/n m, ch x p sau cá tra, tôm sú (H u

c, 2011)

Ngh nuôi cá lóc phát tri n r m r d n đ n ngu n th c n t nhiên cho cá b thi u

h t T i BSCL, lúc kh i phát th ng d a vào l i th mùa l , t n d ng ngu n th c

n cung c p ch y u t các loài cá t p D n d n, ngh nuôi phát tri n nhi u nên gây

ra không ít lo ng i r ng ngh nuôi cá lóc có th d n t i đe d a các gi ng loài th y

s n khác Ng i nuôi mu n thu 1 kg cá lóc c n tiêu t n t i 4 – 4,5 kg cá t p V i

t ng s n l ng cá lóc nuôi trong vùng 30.000 t n/n m thì ph i s d ng t i 50.000

t n cá t p n c ng t và 75.000 t n cá t p bi n, t ng ng v i 30% s n l ng khai thác n i đ a và chi m 12% s n l ng khai thác h i s n hàng n m c a BSCL ó

th t s là v n đ l n đáng lo ng i đ i v i ngu n l i th y s n và an ninh th c ph m cho c ng đ ng (H u c, 2011) kh c ph c tình tr ng này, ng i dân đã chuy n sang ngu n th c n công nghi p d i dào và n đ nh Nh ng cá lóc nuôi b ng th c n công nghi p có s c đ kháng kém h n và xu t hi n nhi u d t t Khi nuôi cá b ng

th c n công nghi p l i x y ra hi n t ng cá lóc b gù l ng do ngu n th c n thi u khoáng ch t, ngu n n c b ô nhi m Th c tr ng trên đã làm nhi u h nuôi cá lóc

ph i b ngh vì thua l (Nguy n Kim Ki u, 2012) M t v n đ khác là l ng th c n

th a và ch t th i c a cá lóc trong quá trình nuôi gây ô nhi m Cách gi i quy t truy n

th ng là hút b và thay n c cho c b cá hàng tu n th m chí hàng ngày, đi u này

d n đ n t ng chi phí, gi m l i nhu n c a ng i dân (Ph m Th Tuy t Ngân, 2011)

Vi c áp d ng ch ph m sinh h c có ch a vi sinh v t v i vai trò probiotic cho cá

có th giúp gi i quy t các v n đ trên D ch cá t p sau khi đ c phân h y b ng vi sinh v t đ c cho vào th c n công nghi p nh m b sung đ m và các ch t khoáng t nhiên c n thi t t ng t nh vi c nuôi b ng cá t p s h n ch xu t hi n d t t cá

Vi sinh v t khi vào môi tr ng n c ao nuôi và h tiêu hóa c a cá s đóng vai trò probiotic giúp t ng c ng h mi n d ch cho cá, c nh tranh vi sinh v t có h i và x lý

n c ao nuôi (Ph m Th Tuy t Ngân, 2011) H n n a d ch cá th y phân còn có kh

n ng kích thích s thèm n và b t m i c a cá (Tr n Th Bé, 2011)

Ngu n ph ph m, cá th i ra t các ch , xí nghi p ch bi n th y s n r t d i dào, giá thành r , giàu dinh d ng đã đ c nghiên c u và ng d ng nhi u đ s n xu t

d ch đ m, b t đ m làm th c n th y s n, gia súc, phân bón và n c m m (Tr n Th

H ng Nghi và c ng s , 2009) Ph ng pháp x lý ngu n ph ph m này b ng các

bi n pháp sinh h c c ng đang r t đ c quan tâm, đ c bi t là s d ng enzym th y phân đ thu h i protein t o ra nh ng s n ph m có nhi u công d ng và giá tr dinh

d ng cao (Gao và c ng s , 2005)

Nh v y vi c dùng vi sinh v t đ th y phân ngu n ph ph m ch bi n th y s n có nhi u ti m n ng ng d ng và l i đi m nh trên Do đó, chúng tôi quy t đ nh th c

hi n đ tài “Nghiên c u t i u hóa quy trình th y phân cá t p đ s n xu t ch

ph m sinh h c s d ng làm th c n cho cá lóc b ng ph ng pháp quy ho ch

th c nghi m”

 N i dung đ tài

- nh tính kh n ng sinh enzyme protease c a 2 ch ng Bacillus subtilis Q111 và

Bacillus polyfermenticus F27 cung c p t PTN Công ngh vi sinh tr ng i h c

PH N 1

T NG QUAN TÀI LI U

bông) (Tr ng Th Khoa và Tr n Th Thu H ng, 1993)

Nh ng ch có 2 loài cá lóc đen và cá lóc bông hi n là các đ i t ng nuôi chính BSCL So v i cá lóc bông thì cá lóc đen đ c nuôi c ng nh tiêu th nhi u h n

Vì v y, cá lóc đen đ c ch n làm đ i t ng nghiên c u chính c a đ tài (Lê Xuân Sinh và Minh Chung, 2009)

1.1.1.2 Phân lo i c á lóc đen

Theo d li u c a NCBI, cá lóc đen có tên ti ng Anh là Snakehead murrel, m t s

tên khác là Ophiocephalus striatus, Ophiocephalus vagus, Snakehead fish và có

Hình 1.1 Cá lóc đen Channa striata (Bloch, 1793)

1.1.1.3 Phân b

Trên th gi i: chúng tìm th y các khu v c nhi t đ i châu Á tr i dài t Pakistan

đ n mi n nam Trung Qu c, đ c bi t là Trung Qu c, Tri u Tiên, Sri Lanka, Vi t Nam

T i Vi t Nam: cá lóc đen phân b trên c ba mi n (S Nông nghi p và Phát tri n nông thôn t nh Th a Thiên Hu , 2011)

1.1.1.4 c đi m hình thái

C th hình l ng tr , đ u d p, đuôi tròn u b t so v i thân, t ng đ i nh n và dài gi ng nh đ u r n, gãy khúc, mi ng có đ r ng, v y r t l n Vây l ng có 40 – 46 vây, vây h u môn có 28 – 30 tia vây, v y đ ng bên 41 – 55 cái V y t o vân màu nâu xám xen l n v i nh ng ch màu xám nh t L ng và hai bên hông s m màu đen ánh nâu v i nh ng đ m đen và màu g ch, b ng màu tr ng L c mang d ng hình núm Th c qu n ng n, vách dày, bên trong th c qu n có nhi u n p nh n D dày to hình ch Y (D ng Nh t Long, 2003)

1.1.1.5 c đi m sinh h c

Cá lóc là loài cá s ng trong môi tr ng n c ng t nh ng có th thích nghi v i môi tr ng n c l sâu sinh s ng t 0 đ n 30 m trong các sông, su i, ao, h , vùng ng p l , các con kênh ch y ch m và trong các ao nuôi nhân t o Cá thích nghi

v i vùng n c t nh có đ pH 7 – 8, đ c ng: 20, nhi t đ : 23 – 27 O

C Chúng sinh

s ng t ng n c gi a và th p, hay tìm th y trong các ao h có nhi u rong c và

n c đ c Chúng có th s ng trong các môi tr ng n c thi u oxy (S Nông nghi p

và Phát tri n nông thôn t nh Th a Thiên Hu , 2011)

Tính thích nghi c a cá lóc v i môi tr ng xung quanh r t m nh nh có c quan

hô h p ph nên có th hít th đ c O2 trong không khí, ch c n da và mang cá có đ

m nh t đ nh v n có th s ng đ c th i gian khá lâu (D ng Nh t Long, 2003)

1.1.1.6 T p tính

Cá thích s ng vùng n c đ c có rong, c , đám bèo, vì n i đây cá d n mình rình m i Vào mùa hè cá th ng ho t đ ng và b t m i t ng n c m t Mùa đông

cá ho t đ ng t ng n c sâu h n (D ng Nh t Long, 2003)

Cá lóc di c t sông Mekong vào các vùng n c xung quanh, xâm nh p vào vùng

ng p l theo mùa và tr v n i c trú khi mùa khô đ n Cá s ng sót qua mùa khô

b ng cách t chôn mình vào bùn đáy h , kênh và đ m l y đ gi m cho ph i và tiêu th ch t béo d tr trong c th (S Nông nghi p và Phát tri n nông thôn t nh

• Trong ao nuôi, có th c n đ y đ và ch m sóc t t thì t l s ng c a cá cao và

đ t tr ng l ng trung bình 0,5 – 0,8 kg/con sau 6 – 8 tháng

1.1.1.8 c đi m sinh s n

Cá lóc 1 – 2 tu i b t đ u đ tr ng, mùa v sinh s n t tháng 4 – 8, t p trung vào tháng 4 – 5 Cá th ng đ vào sáng s m sau nh ng tr n m a rào m t hai ngày n i yên t nh có nhi u th c v t th y sinh nhi t đ 20 – 35 O

C, sau 3 ngày tr ng n thành cá b t, kho ng 3 ngày sau cá tiêu h t noãn hoàng và b t đ u n đ c th c n

t nhiên bên ngoài, luân trùng Brachionus plicatilis đ c xem là th c n đ u tiên t t

nh t c a cá b t Ngoài ra, có th cho cá b t n n m men, lòng đ tr ng hay th c n

t ng h p d ng b t Giai đo n k ti p cá n tr ng n c (Moina – Daphnia), trùng ch

ho c u trùng mu i đ giai đo n cá gi ng, sâu g o và dòi là th c n a thích c a

cá M t s thí nghi m trên cá b t cho th y cá có kh n ng s d ng th c n tr ng

n c k t h p v i đ m đ n bào Tr ng n c v n là th c n t t nh t đ i v i cá b t trong 3 tu n l đ u Rhizopus arrhizus hay đ m đ n bào (125 m) đ c s n xu t t

k thu t lên men s d ng d u c làm ngu n carbon chính Giai đo n cá l n th ng cho n cá t p, ph ph m t các nhà máy ch bi n đ u tép, tôm, ch, cá hay th c n

ch bi n và th c n viên Cá l n nhanh vào mùa xuân - hè (D ng Nh t Long, 2003)

1.1.2 L ch s ngh nuôi cá lóc

BSCL, t lâu ngh nuôi cá n c ng t trong ao hay l ng bè đã r t ph bi n Vào nh ng n m 1960, ngh nuôi cá lóc trong l ng bè đã xu t hi n huy n Châu

c (An Giang) và huy n H ng Ng ( ng Tháp) Lúc kh i phát th ng d a vào

l i th mùa l mang theo cá v đ ng ru ng, sông r ch n náu sinh đ , ng i dân t n

d ng ngu n th c n đ i dào này đ nuôi cá lóc Cá lóc nuôi t ng đ i d có th nuôi

d ng bán thâm canh, thâm canh v i nhi u hình th c đ n gi n nh nuôi trong ao

đ t, trong l ng bè, trong m ng hay trên ru ng lúa Ngoài ra, cá lóc nuôi là s n

ph m có kh n ng thay th cá lóc đ ng t nhiên, do l ng cá lóc đ ng ngày càng

gi m T n m 1990 đ n nay, ngh nuôi cá lóc đen vùng nh h ng l tr nên ph

bi n T ng h p c a các t nh thu c BSCL n m 2009 cho th y s n l ng cá lóc nuôi cho toàn vùng đ t h n 40.000 t n, t ng h n 1.000 t n so v i n m 2008, trong đó cá lóc đen chi m g n 80% ( Minh Chung và Lê Xuân Sinh, 2010)

T c đ phát tri n c a ngh nuôi cá lóc ngày càng m nh m N m 2013, ch riêng

t i H u Giang, toàn t nh d ki n có kho ng 5 ha nuôi cá lóc theo hình th c thâm canh trong ao và nuôi vèo v i s l ng 2000 cái D ki n n m 2013 đ t t ng s n

l ng th y s n kho ng 90.810 t n; trong đó, s n l ng khai thác 2.910 t n, s n

l ng nuôi tr ng 87.900 t n (S NN & PTNT H u Giang, 2013)

1.2 Các v n đ hi n nay

1.2.1 Thi u h t ngu n th c n t nhiên

Ngh nuôi cá lóc phát tri n r m r d n đ n ngu n th c n t nhiên cho cá b thi u

h t T i BSCL, lúc kh i phát th ng d a vào l i th mùa l , t n d ng ngu n th c

n cung c p ch y u t các loài cá t p D n d n ngh nuôi phát tri n nhi u nên gây

ra không ít lo ng i nuôi cá lóc d n t i đe d a các gi ng loài th y s n khác Ng i nuôi mu n thu 1 kg cá lóc c n tiêu t n t i 4 – 4,5 kg cá t p V i t ng s n l ng cá lóc nuôi trong vùng 30.000 t n/n m thì ph i s d ng t i 50.000 t n cá t p n c ng t

và 75.000 t n cá t p bi n, t ng ng v i 30% s n l ng khai thác n i đ a và chi m 12% s n l ng khai thác h i s n h ng n m c a BSCL ó th t s là v n đ l n đáng lo ng i đ i v i ngu n l i th y s n và an ninh th c ph m cho c ng đ ng (H u

c, 2011)

1.2.2 V n đ c a ngu n th c n công nghi p

kh c ph c tình tr ng thi u ngu n th c n t nhiên, ng i dân đã chuy n sang ngu n th c n công nghi p d i dào và n đ nh Nh ng cá lóc nuôi b ng th c n công nghi p có s c đ kháng kém h n và xu t hi n nhi u d t t Khi nuôi b ng th c

n công nghi p, l i x y ra hi n t ng cá lóc b gù l ng do ngu n th c n thi u khoáng ch t, ngu n n c b ô nhi m Th c tr ng trên đã làm nhi u h nuôi cá lóc

ph i b ngh vì thua l (Nguy n Kim Ki u, 2012)

Hi n t i trên th tr ng ch a có lo i th c n công nghi p chuyên dùng cho nuôi

cá lóc, nh ng vì cá lóc là loài n th c n thiên v đ ng v t, nên nông dân th ng mua lo i th c n có hàm l ng đ m kho ng 40% cho cá lóc n, hy v ng đáp ng

đ y đ nhu c u dinh d ng cho cá Theo kinh nghi m c a nông dân An Giang, nuôi

cá lóc giai đo n gi ng thì s d ng th c n viên công nghi p có đ đ m kho ng 43%, sau hai tháng thì hàm l ng đ m gi m d n Cá đ c 3 – 4 tháng tu i thì cho cá

n th c n có đ đ m ch ng 40% là c ng đ cho sinh tr ng và phát tri n Lo i cám

có đ đ m cao có giá thành cao h n nhi u so v i các lo i cám khác d n đ n gi m

hi u qu kinh t D ng cá lóc b gù l ng do thi u d ng ch t, theo anh Hu nh Thanh Nhu n (Ch c s s n xu t cá lóc gi ng, p C n Thu n, xã C n ng, huy n Châu Thành), cá lóc nuôi b ng th c n công nghi p, tuy hàm l ng đ m có đ y đ , nh ng

có th v n còn thi u nhi u lo i khoáng ch t thi t y u và vitamin, đ c bi t là vitamin

C N u cung c p đ y đ khoáng ch t và vitamin C cho cá thì hi n t ng gù l ng trong t ng đàn là không đáng k (Ng c Di p, 2011)

C ng theo kinh nghi m c a ng i dân, cá lóc do là loài cá s n m i nên khi chuy n sang th c n công nghi p thì s c n gi m, b n Mu n h n ch thì c n ph i

có quá trình thay đ i thành ph n th c n d n t cá t p sang th c n viên ph c t p

1.2.3 Ô nhi m môi tr ng n c

Tác đ ng c a các ho t đ ng kinh t và xã h i làm ô nhi m ngu n n c c a ngành thu s n:

Hi n nay, môi tr ng nông thôn đã b suy thoái và đang b ô nhi m do các đi u

ki n v sinh, s d ng quá nhi u thu c tr sâu, c s h t ng y u kém, hoá ch t đã theo h th ng kênh m ng thu l i tiêu thoát ra các sông và có th theo dòng ch y

t i vùng khác, gây nguy h i cho môi tr ng thu s n N c th i sinh ho t, công nghi p x tr c ti p vào kênh m ng, sông h là ngu n n c cung c p cho nuôi

tr ng thu s n và n i sinh s ng c a các thu sinh v t K t qu đi u tra nghiên c u

nh ng n m g n đây c a Vi n nghiên c u nuôi tr ng th y s n 1 cho th y hàm l ng BOD, COD, NO2 trong n c c a nh ng thu v c đ u cao h n tiêu chu n cho phép

đ i v i đ i s ng thu sinh v t (Tr nh Ng c Tu n, 2005)

Hi n nay, có r t nhi u lo i s n ph m thu c, hoá ch t và ch ph m sinh h c đ c dùng r ng rãi trong nuôi tr ng thu s n trên th gi i Nh ng hoá ch t trên có vai trò quan tr ng trong vi c b o v s c kho đ ng v t th y s n n u nh s d ng đúng,

nh ng khi l m d ng d n đ n nh ng h u qu khôn l ng, gây r i ro cho ng i lao

đ ng, t n d các ch t đ c trong s n ph m thu s n gây h i cho ng i tiêu dùng, làm

gi m giá tr th ng ph m và còn t o các ch ng vi khu n kháng thu c làm gi m hi u

qu trong đi u tr b nh (Tr nh Ng c Tu n, 2005)

Thành ph n l p bùn trong các đ m, ao NTTS ch y u là các ch t h u c nh protein, lipid, axit béo v i công th c chung CH3(CH2)nCOOH , photpholipid, sterol - vitamin D3, các hormone, carbohydrate, ch t khoáng và vitamin, v tôm l t xác,

L p bùn này luôn trong tình tr ng ng p n c, y m khí, các vi sinh v t y m khí phát tri n m nh phân hu các h p ch t trên t o thành các s n ph m là hydrosulphua

(H2S), amoniac (NH3), metan (CH4), r t có h i cho thu sinh v t, ví d n ng đ 1,3 ppm c a H2S có th gây s c, tê li t và th m chí gây ch t tôm Khí amoniac (NH3) c ng đ c sinh ra t quá trình phân hu y m khí th c n t n d gây đ c tr c

ti p cho tôm cá, làm nh h ng đ n đ pH c a n c và kìm hãm s phát tri n c a

th c v t phù du (Tr nh Ng c Tu n, 2005)

Tóm l i, theo Tr nh Ng c Tu n (2005) các ch t ô nhi m ch y u trong n c th i NTTS bao g m:

• Cacbon h u c (g m th c n, phân bón, ch ph m sinh h c )

• Nit đ c phân hu t các protein

• Phospho phân hu t các protein

1.2.4 D ch b nh

K t qu kh o sát c a Lê Xuân Sinh và Minh Chung (2009) cho th y, b nh ký sinh trùng xu t hi n nhi u nh t (85,9%) trên cá lóc nuôi, k đ n là b nh xu t huy t (55,9%) và m t s b nh khác nh tu t nh t (11,8%), tr ng mang (8,5%), gan th n (7,8%),…

Còn theo k t qu kh o sát c a Ph m Minh c và c ng s (2012) có 4 m m b nh

vi n m nhi m trên cá lóc nuôi thâm canh là Acremonium (35,7%), Geotrichum (28,6%), Achlya (21,4%), Fusarium (14,3%) K t qu kh o sát m m b nh vi khu n xác đ nh đ c 4 gi ng v i t n su t xu t hi n c a các gi ng vi khu n Aeromonas, Edwardsiella, Streptococcus và Pseudomonas l n l t là 54,3%, 17,3%, 14,8% và 13,6%

Theo Nguy n Quang Minh (2013) thì b nh cá do nh ng nguyên nhân sau:

- N c ao kém ch t l ng do qu n lý không đúng k thu t ho c ngu n n c c p

b ô nhi m hoá ch t đ c, vi khu n, virus

 Ch t l ng th c n kém

Ch t l ng th c n kém (th c n công nghi p và th c n t i s ng) không đ m

b o dinh d ng cho cá s t o môi tr ng thu n l i cho các tác nhân gây b nh phát tri n và d l ng th c n l u t n n n đáy s làm ô nhi m n c ao

 Thi u c n th n khi ch m sóc cá

Các d ng c cho n không đ c v sinh th ng xuyên là n i n ch a m m b nh Các d ng c v n chuy n, b t cá nh l i v t, thùng… có th làm xây xát cá trong quá trình thao tác và vì th m m b nh có đi u ki n xâm nh p vào cá nuôi

 Ngu n gi ng th kém ch t l ng

Cá có th đã b m c b nh t ngu n gi ng th nuôi, ch a đ c c quan chuyên môn ki m tra ch t l ng, con v t mang s n m m b nh mà ch a đ c x lý di t trùng, khi cá th xu ng nuôi sau m t th i gian g p th i ti t thay đ i s thu n l i cho

m m b nh phát tri n

Khi ngu n th c n cá t p t nhiên ngày càng khan hi m cùng v i nh n th c v

nh ng h qu có th x y qua khi khai thác quá m c ngu n th c n này, th c n công nghi p tr thành ngu n dinh d ng chính cho cá lóc Tuy nhiên, vì nh ng khuy t

đi m c a th c n công nghi p đã nêu trên nên c n ph i có m t lo i ch ph m b sung vào đ vi c nuôi cá lóc đ t hi u qu và kinh t Ch ph m này s đóng vai trò làm ngu n dinh d ng, ngu n khoáng ch t b sung, ch t d n d kích thích b t m i

đ ng th i ph i góp ph n c i thi n môi tr ng ao nuôi và t ng s c đ kháng cho cá

1.3.1 Ch t d n d

1.3.1.1 Axit amin t do

Nhi u nghiên c u s d ng h n h p các axit amin riêng l ho c k t h p đ kích thích s b t m i c a cá Taurine, glycine, methionine, glutamine, leucine đ c s

d ng đ kích thích quá trình b t m i c a tôm, cá Nhi u nghiên c u khoa h c cho

th y các axit amin này tác đ ng lên các c quan c m giác c a tôm, cá làm kích thích

s b t m i (Tr n Th Bé, 2011)

1.3.1.2 D ch cá th y phân

Hi n nay, d ch cá th y phân đ c s d ng ph bi n trong ch bi n th c n th y

s n đ kích thích tôm cá n th c n nhi u h n D ch cá th y phân là ph ph m c a công nghi p ch bi n b t cá, màu vàng nâu, ch a đ y đ các axit amin t do và các peptide nên đ c xem là ch t d n d B sung d ch cá th y phân v i li u l ng 1,5% vào th c n c a cá lóc Channa striata có th thay th đ m b t đ u nành cho

đ m b t cá trong công th c th c n t ng thêm 20% (Tr n Th Thanh Hi n, 2010)

1.3.1.3 B t nhuy n th , b t gan m c

B t nhuy n th và b t gan m c ch a nhi u axit amin t do nên d n d tôm cá r t

t t khi b sung vào th c n Trong s n xu t th c n tôm, b t nhuy n th và b t gan

m c đ c s d ng v i t l 3 – 5% đ kích thích s b t m i c a tôm (Lê Thanh Hùng, 2008)

Tóm l i, t các k t qu nghiên c u trên cho th y vai trò c a ch t d n d có ý ngh a quan tr ng trong nuôi tr ng th y s n Nh có nh ng ch t này kích thích cho tôm, cá b t m i và s d ng th c n t t h n t đó t ng tr ng c a tôm, cá đ c c i thi n, mang l i l i ích kinh t cho ng i nuôi (Tr n Th Bé, 2011)

Các lo i ch t d n d này đ c s n xu t theo ph ng pháp c , dùng bi n pháp v t

lí, hóa ch t ho c enzym protease đ th y phân ngu n nguyên li u giàu đ m Tuy có đáp ng đ c dinh d ng, khoáng ch t, kích thích b t m i c a tôm cá nh ng ch a

gi i quy t đ c v n đ môi tr ng ao nuôi và b nh cá M t khác, các ph ng pháp

ch bi n này khá t n kém nên giá thành còn cao Trong khi đó, probiotic có th gi i quy t t t c các v n đ c a ngành NTTS hi n nay v i nh ng l i ích v t tr i, hi u

qu kinh t , thân thi n v i s c kh e con ng i và môi tr ng

1.3.2 Probiotic

1.3.2.1 nh ngh a probiotic

T “Probiotic” xu t phát t ti ng Hy l p, có ngh a là “cho s s ng” Lilley và Stillwell (1965) đã dùng thu t ng này đ mô t nh ng ch t đ c bài ti t ra t m t sinh v t nào đó mà có tác d ng kích thích t ng tr ng cho m t sinh v t khác N m

1974, Paker đã đ nh ngh a probiotic là các sinh v t và các h p ch t góp ph n vào s cân b ng vi sinh h trong h th ng tiêu hóa Sau đó Fuller (1989) đã ch nh s a và

đ nh ngh a l i v i probiotic là s b sung m t lo i th c n vi sinh v t s ng mà có tác d ng có l i cho v t ch qua vi c c i ti n s cân b ng vi sinh h trong đ ng ru t

c a v t ch M c đích c a vi c áp d ng probiotic là nh m đ thi t l p l i m i quan

h gi a các vi sinh v t có l i và c h i c u thành h vi sinh v t trong đ ng ru t

M t lo i probiotic có hi u qu là ph i có kh n ng t n t i và ho t đ ng trong m t môi tr ng đa d ng d i nhi u hình th c khác nhau Theo Fuller (1989) thì nó c n

ph i có nh ng kh n ng nh sau:

 Là m t s n ph m s ng quy mô k ngh

 Không mang m m b nh và đ c t

 T o ra tác d ng có l i trên v t ch

 Có kh n ng t n t i và phát tri n trong môi tr ng ru t c a v t ch

 Duy trì n đ nh và t n t i lâu dài đ đ c s d ng sau này trong đi u ki n l u

tr và đi u ki n ngoài hi n tr ng

1.3.2.2 Vai trò c a probiotic trong nuôi tr ng th y s n

 Vai trò c i thi n ch t l ng n c trong nuôi tr ng th y s n

Probiotic giúp c i thi n ch t l ng n c trong ao nuôi th y s n, nh kh n ng tham gia chuy n hóa các ch t h u c trong ao c a các vi khu n trong probiotic Trong m t s nghiên c u, ch t l ng n c đã đ c c i thi n khi b sung probiotic,

đ c bi t là Bacillus sp Vì Bacillus sp hi u qu h n trong vi c chuy n đ i các ch t

h u c t i CO2 h n so v i vi khu n Gram âm, s chuy n đ i m t t l l n carbon

h u c đ t o sinh kh i (Verschuere và c ng s , 2000) ng th i chúng còn có kh

n ng làm cân b ng sinh h c NH3/ NO2/ NO3, ho t tính này thu c nhóm vi khu n nitrat hóa (Sahu và c ng s , 2008)

 Vai trò t ng s c đ kháng, gi m b nh

Theo Ph m V n Ty và c ng s (2009), vi c s d ng probiotic có th gia t ng

qu n th các sinh v t làm th c n, c i thi n m c dinh d ng c a các loài th y s n nuôi và t ng c ng kh n ng mi n d ch c a v t nuôi v i m m b nh Nh v y, đ nh ngh a c a probiotic đ i v i nuôi tr ng th y s n đ c m r ng, nó bao g m c vi c

b sung vi khu n s ng vào ao nuôi, nh ng vi khu n có l i này s c i thi n thành

ph n vi sinh v t c a n c và n n đáy nh m c i thi n ch t l ng n c Các c ch tác đ ng c a probiotic:

b nh cho tôm cá nuôi (Ph m V n Ty và c ng s , 2009)

1.3.2.3 Hi u qu v kinh t

 Ngu n nguyên li u s n có

H ng ngày, các ch đ u m i th y s n và các công ty ch bi n th y s n th i ra r t nhi u các lo i ph ph m cá (đ u, vây, đuôi, v y, n i t ng…) c ng nh các lo i cá

t p kém ph m ch t không đ tiêu chu n làm th c n ng i

Trong quá trình ch bi n cá tra phi lê xu t kh u, l ng ph ph m g m th t v n,

đ u, x ng s ng, da, ru t, m … c tính kho ng 62,7% t ng kh i l ng cá nguyên

li u Trong đó đ u x ng chi m 23,1%, da 10,9%, ph t ng 8%, th t v n 10,4%, m 10,3% Các nhà máy t i BSCL h ng ngày t o ra kho ng 710 t n ph ph m Trong

đó 53% đ c ch bi n thành th c n ch n nuôi, 42% đ c s d ng d ng t i và 5% làm th c n cho ng i B t cá tra có hàm l ng béo (10 – 33% EE) và canxi cao (4 – 13% Ca), hàm l ng protein thay đ i theo nguyên li u (Nguyen Thi Thuy và

ây là ngu n nguyên li u t nhiên giàu đ m và khoáng ch t giá thành th p v i s

l ng l n r t phù h p cho quy mô s n xu t công nghi p Vi c x lý ngu n ph

ph m này b ng các bi n pháp sinh h c đang r t đ c quan tâm, đ c bi t là s d ng enzym th y phân đ thu h i protein t o ra nh ng s n ph m có nhi u công d ng và giá tr dinh d ng cao (Gao và c ng s , 2005)

 Ph ng pháp x lý kinh t

Vi c s d ng Bacillus subtilis, m t lo i vi khu n có kh n ng thích nghi cao, có

th t ng h p đ c nhi u lo i enzym c n thi t cho quá trình th y phân nh : amylase, hemicellulase, glucanase, xylanase, protease…(Mayday và c ng s , 1989) cho vi c

th y phân ph ph m cá đang đ c quan tâm nghiên c u và có nhi u tri n v ng đ

ng d ng trong s n xu t trên th c t

B ng cách s d ng tr c ti p enzym protease t vi khu n v i nhi u u đi m là có

th t o ra m t l ng protease l n t m t l ng vi khu n nh ban đ u, b ng cách t o

đi u ki n thích h p cho vi khu n gia t ng v m t s đ t ng l ng protease sinh ra,

đ ng th i s d ng enzym protease tr c ti p không c n ph i qua khâu tinh s ch enzym góp ph n gi m chi phí s n xu t d ch đ m (Tr n Thanh D ng, 2007)

H n n a, sinh kh i vi khu n có l i c ng đ c s d ng nh probiotic giúp t ng

c ng h mi n d ch th y s n, h tr tiêu hóa và c i thi n môi tr ng n c ao nuôi (Hammoumi và c ng s , 1998)

Hình 1.2 Bacillus d i kính hi n vi đi n t (Kim và c ng s , 2009)

VC (vegetative cell): t bào sinh d ng

SC (spore coat): áo bào t

ES (endospore): n i bào t

Bacillus là nh ng vi khu n Gram d ng, catalase d ng tính, nhóm vi khu n này

th ng tìm th y trong môi tr ng có đ pH bi n đ ng cao, sinh tr ng d i đi u

ki n hi u khí ho c k khí không b t bu c, s d ng khí oxy làm ch t nh n electron

khi trao đ i khí trong quá trình trao đ i ch t Thu c h Bacillaceae, đ ng riêng r

ho c k t thành chu i hay thành s i Chúng có kh n ng t o ra bào t khi x y ra các

đi u ki n kh c nghi t nh thi u ch t dinh d ng, nhi t đ cao, ph n l n t bào này

có bào t trong, hình oval có khuynh h ng phình ra m t đ u Bào t có tính kháng nhi t cao, kháng b c x , kháng hóa ch t, kháng áp su t th m th u Khi g p

đi u ki n thu n l i có th n y m m, phát tri n thành t bào sinh d ng Qua kính

hi n vi Bacillus đ n l có hình d ng gi ng nh ng chi c que, ph n l n nh ng chi c

que này có bào t trong hình oval có khuynh h ng phình ra m t đ u Th ng thì

ng i ta quan sát th y t p đoàn c a gi ng sinh v t này r t r ng l n, có hình d ng b t

đ nh và đang phát tri n lan r ng M t đ c đi m n a c a vi khu n Bacillus là có bao

nh y (giác m c) c u t o polypeptit Vi c hình thành bao nh y giúp cho vi khu n

Bacillus có kh n ng ch u đ c các đi u ki n kh c nghi t là do bao nh y có kh

n ng d tr th c n và b o v vi khu n tránh b t n th ng khi g p khô h n (Tr n

Bacillus subtilis là vi khu n Gram d ng, đôi khi các t bào n i l i v i nhau

t o thành chu i dài, ng n khác nhau ho c các t bào đ ng riêng r

• i th : khu n l c khô, không màu ho c màu xám tr ng, ho c t o ra l p màng m n, lan trên b m t th ch, có mép nh n ho c mép l i lõm nhi u hay ít, bám ch t vào môi tr ng th ch

Bacillus subtilis có l p màng nhày giúp vi khu n có kh n ng ch u đ c đi u ki n

kh c nghi t Nhi t đ thích h p cho s sinh tr ng c a Bacillus subtilis là 36 – 50

O

C, t i đa kho ng 60 OC, là loài a nhi t cao Bào t c a Bacillus subtilis c ng ch u

đ c nhi t khá cao (Nguy n Lân D ng, 1983)

Bào t có hình b u d c, kích th c 0,6 µm - 0,9 µm Phân b không theo nguyên

t c ch t ch nào, l ch tâm, g n tâm nh ng không chính tâm Chúng là m t hình th c thích nghi giúp vi khu n v t qua các đi u ki n s ng b t l i Bào t có th s ng t vài n m đ n vài ch c n m Khi g p đi u ki n thu n l i nh ng bào t này s ph c h i

và ti p t c chu k s ng c a mình (Nguy n Th Tr n Th y, 2009)

Bacillus subtilis Q111 đ c Nguy n V n Minh và c ng s phân l p t n c và bùn đáy ao nuôi cá tra, đ c xác đ nh là có ho t tính probiotic cao, sinh đ ng th i 3

lo i enzym ngo i bào (amylase, protease, cellulase), có kh n ng ch u mu i, pH môi

tr g nuôi, ch u pH acid d dày và mu i m t, không sinh enzym hemolysin, không

đ kháng v i kháng sinh và có kh n ng đ i kháng v i vi khu n gây b nh E Ictaluri (Nguy n Hoàng Tu n Duy và c ng s , 2013; Nguy n V n Minh và c ng

s , 2013)

1.5.2 Bacillus polyfermenticus

Ch ng Bacillus polyfermenticus, th ng đ c g i là ch ng “Bispan”, đã đ c dùng đ đi u tr dài h n b nh r i lo n đ ng ru t v i kh n ng sinh n i bào t giúp

B Polyfermenticus có th s ng sót t i ru t B polyfermenticus là tr c khu n sinh n i

bào t , đ c phát hi n l n đ u tiên b i ti n s Terakado n m 1933, có kh n ng

kháng Salmonella typhi, Salmonella paratyphi, Shigella và V cholera Nhi u nghiên

c u cho th y là các B polyfermenticus gi ng h t B subtilis v c hình thái h c và sinh hóa Tuy nhiên, B polyfermenticus v n khác bi t so v i các dòng B subtilis,

b i kh n ng chuy n hóa lactose và s n sinh m t l ng axit acetic và axit lactic

t ng ng t glucose và lactose l n h n các dòng khác (Lee và c ng s , 2000)

Ch ng Bacillus polyfermenticus F27 đ c Nguy n V n Minh và c ng s phân l p

trùn qu và đ c xác đ nh là có ho t tính probiotic cao, có kh n ng đ i kháng v i nhi u vi khu n th ng gây b nh cho đ ng v t th y s n, có kh n ng sinh emzym ngo i bào, kho ng pH t ng tr ng và ch u mu i r ng, t l s ng cao pH axit d y dày và mu i m t, không sinh enzym hemolysin và không đ kháng kháng sinh (Nguy n V n Minh và c ng s , 2010)

1.5.3 Kh n ng sinh enzym c a Bacillus

Theo Nguy n Tr ng C n (1998), các ch ng Bacillus có kh n ng t ng h p m nh

protease là Bacillus subtilis, B mesentericus, B thermorpoteoliticus Các vi khu n

th ng t ng h p các protease ho t đ ng thích h p vùng pH trung tính và ki m

y u

- Các protease trung tính c a vi khu n ho t đ ng kho ng pH h p (pH 5 – 8) và

có kh n ng ch u nhi t th p Các protease trung tính t o ra d ch th y phân protein

th c ph m ít đ ng h n so v i protease đ ng v t và t ng giá tr dinh d ng Chúng còn có kh n ng ái l c cao đ i v i các axit amin a béo (Nguy n Tr ng C n, 1998)

- Protease c a Bacillus a ki m có đi m đ ng đi n b ng 11, kh i l ng phân t t 20.000 – 30.000 dalton n đ nh trong kho ng pH 6 – 12 và ho t đ ng trong kho ng

pH r ng 7 – 12 Protease thu nh n t vi khu n Bacillus a ki m h u h t là enzym ngo i bào chu đ c nhi t đ và pH cao trong th i gian dài, ho t đ ng có hi u qu trong các đi u ki n b t l i nh môi tr ng ch a dung môi, ch t oxy hóa (Nguy n

V n Hi u, 2012)

Trong các ch ng Bacillus thì sinh protease m nh nh t là Bacillus subtilis H enzym c a Bacillus subtilis r t phong phú và đa d ng g m protease (Rappaport, 1965), amylase (Konsoula và c ng s , 2005), glucoamylase, glucanase, cellulase,

dextranase, pectinase (Kashyap và c ng s , 2000) Bacillus subtilis đã đ c ng

d ng khá nhi u trong các ngành công nghi p đ c bi t là công nghi p s n xu t enzym

nh protease, amylase… ã có nhi u công trình nghiên c u v ng d ng c a

Bacillus subtilis trong ch bi n th c ph m, trích ly các ch t t th c v t, t cây

thu c… (Nguy n Tr ng C n, 1998)

1.5.4 Các y u t nh h ng đ n quá trình sinh enzym t Bacillus

H u h t các ch ng vi khu n Bacillus đ u t ng hi u su t t ng h p protease khi có

m t m t s lo i đ ng: glucose, lactose, maltose Tuy nhiên, quá trình t ng h p protease b c ch khi trong môi tr ng nuôi có ch a các đ ng n ng đ cao

Nh ng kim lo i nh : Ca2+

, Co2+, Mg2+ là nh ng y u t c n thi t cho quá trình sinh

t ng h p protease ki m Mu i kali phosphat đ c s d ng làm ngu n cung c p phospho, đi u ch nh tính đ m c a môi tr ng v i n ng đ t i u là 2 g/L, n u v t quá n ng đ 2 g/L có th gây c ch cho quá trình t ng h p protease ki m (Nguy n

V n Hi u, 2012)

S phát tri n c a t bào và quá trình sinh enzym c a h u h t các vi sinh v t đ u

ph thu c vào giá tr pH môi tr ng t ng hi u su t sinh t ng h p c a protease

ki m, môi tr ng c n đ c duy trì pH > 7,5 trong su t quá trình lên men Nhi t đ

c ng là m t y u t quan tr ng đ đánh giá kh n ng phát tri n và sinh t ng h p protease c a vi sinh v t Theo nghiên c u c a Frankence khi đi u ch nh nhi t đ nuôi và n ng đ oxy s nh h ng m nh t i qu trình sinh t ng h p enzym và trao

đ i n ng l ng c a nhóm vi khu n Bacillus Nhi t đ còn nh h ng đ n n ng đ

oxy có trong môi tr ng Khi nhi t đ môi tr ng cao nh h ng đ n đ hòa tan c a oxy Nhi t đ t i u cho quá trình t ng h p protease ki m ph thu c vào đ c tính sinh tr ng c a t ng ch ng vi sinh v t Các ch ng vi khu n Bacillus có nhi t đ thích h p cho quá trình sinh t ng h p protease là 28 – 45 °C (Nguy n V n Hi u, 2012)

Trong su t quá trình lên men, s c khí gián ti p và tr c ti p s cung c p l ng oxy hòa tan ph c v quá trình sinh tr ng và sinh t ng h p protease c a vi sinh v t

N ng đ oxy hòa tan ch u nh h ng b i l u l ng dòng khi đ c cung c p trong thi t b lên men, nhu c u s d ng oxy c a vi sinh v t và thành ph n môi tr ng lên

men Ch ng Bacillus sp B21-2 sinh t ng h p protease t i u t c đ khu y 600 vòng/phút, c p khí 3 vvm, nhi t đ 30 °C, khi t c đ s c khí th p 0,5 vvm, quá trình

sinh tr ng gi m d n đ n hi u su t sinh t ng h p protease gi m i u này ch ng t oxy là y u t h t s c quan tr ng trong s sinh tr ng và phát tri n c ng nh t ng

h p protease c a vi sinh v t (Nguy n V n Hi u, 2012)

1.5.5 ng d ng c a vi khu n Bacillus trong nuôi tr ng th y s n

Theo Ph m Th Tuy t Ngân (2011), ng d ng các dòng Bacillus sp vào nuôi

tr ng th y s n có nh ng l i ích:

 C i thi n s c kh e

- Cung c p dinh d ng tr c ti p: m t s nghiên c u trên các đ i t ng nuôi th y

s n nh : luân trùng, Artemia, nhuy n th , u trùng giáp xác, cá… cho

th y Bacillus đã tr c ti p cung c p ch t dinh d ng cho v t nuôi đ c bi t là axit béo

và vitamin

- H tr tiêu hóa: vài loài vi khu n đã đ c nghiên c u trên đ ng v t hai mãnh v cho th y vi khu n còn góp ph n h tr tiêu hóa do chúng s n sinh các enzym nh protease, lipase, giúp cho quá trình tiêu hóa c a v t ch t t h n

- T ng c ng các ph n ng mi n d ch: vi khu n có th làm t ng đáp ng mi n

dch không đ c hi u Trên cá h i làm t ng s đ kháng v i vi khu n gây

b nh Vibrio Trên đ i t ng tôm sú làm t ng đáp ng c mi n d ch t bào l n mi n

d ch d ch th Trên tôm th kh ng ch V harveyi và virus đ m tr ng, làm tôm t ng

tr ng nhanh và t l s ng cao h n

 C i thi n môi tr ng

- Phân h y các ch t th i: Bacillus ti t ra enzym phân h y các ch t nh carbonhydrate, ch t béo và đ m thành nh ng đ n v nh h n Chúng c ng có kh

n ng phân h y các ch t h u c tích l y trong n n đáy ao nuôi tôm Bacillus có tác

d ng làm gi m COD, H2S trong ao tôm làm t ng n ng su t nuôi

- Gi m ch t đ c NH3, H2S: trong đi u ki n k khí, các axit amin không đ c vô

c hóa hoàn toàn, bên c nh NH3 và CO2còn tích l y nhi u lo i h p ch t h u c khác nh axit h u c , r u, H2S và nh ng d n su t c a nó nh mecaptan, các ch t

đ c nh diamin và tomain, indon và scaton ng d ng Bacillus trong tr ng h p

này làm t ng quá trình phân h y h u c , làm gi m các ch t d th a tích t đáy ao,

gi m phát sinh khí đ c, mùi hôi đáy ao

 c ch tác nhân gây b nh

- Ti t ra kháng sinh: có r t nhi u nghiên c u ch ng minh vi khu n có th ti t vào môi tr ng ch t có tính sát khu n ho c kìm hãm khu n gây nh h ng đ n qu n th

vi sinh khác Hi n nay tác gi đã t ng k t có vài tr m dòng vi khu n B subtilis có

kh n ng ti t ra h n 20 ch t kháng sinh v i c u trúc khác nhau, bao g m: subtilin, ericin, mersacidtin, sublancin, subtilosin, surfactin, iturin, bacillibactin, bacillmycin, mycosubtilin, fengycin, plipastatin, corynebactin, bacilysin, difficidin, oxydifficicin, bacilysocin, rhizocticin, amicoumacin, mysobaccillin làm rào c n s nhân lên c a

vi khu n c h i, c ch các vi sinh v t gây b nh

- C nh tranh dinh d ng: s c nh tranh ch y u x y ra nhóm vi sinh v t d

d ng, c nh tranh c ch t h u c , là ngu n carbon và n ng l ng

- C nh tranh ch t s t: t t c các vi sinh v t đ u c n ch t s t cho sinh tr ng Hi n

t ng siderophores là hi n t ng vi khu n ti t ra ch t k t t a các ion s t có tr ng

l ng phân t th p trong môi tr ng Các vi sinh v t này s h p thu các phân t Fe

k t t a này và làm m t Fe trong môi tr ng Các vi sinh v t gây b nh c n nhi u s t

đ t ng tr ng, do v y d n đ n hi n t ng c nh tranh Fe c a vi sinh v t trong th y

v c, k t qu làm h n ch m m b nh trong môi tr ng

1.6 Tình hình nghiên c u hi n nay

1.6.1 Ngoài n c

Nghiên c u c a Hammoumi và c ng s n m 1998 s d ng cá mòi làm ngu n

đ m, probiotic cho gia c m b ng cách xay nhuy n, thêm 15% m t r và v i

Lactobacillus plantarum trong 20 ngày 22 OC K t qu cho th y m t s gia t ng

tr ng l ng c a gà đ c cho n th c n chua cá b sung v i b t lúa m ch và cám

N m 2003, nghiên c u c a Kim và c ng s thu h i đ m t phi lê cá b ng các thêm axit (pH 2 – 3) thêm ki m (pH 10,5 – 12) k t qu cho protein thu đ c cao

nh t (80%) pH 12 Ho t l c enzym cao nh t pH 2 và 11

Nghiên c u c a Martone và c ng s n m 2005, t th y phân cá th i nhi t đ 60

OC sau khi đã xay nhuy n và tr n đ u v i n c K t qu cho ra s n ph m có 80% protein, t l axit amin t do th p ng d ng làm c ch t đ nuôi c y vi khu n

Nghiên c u c a Esteban và c ng s n m 2006, ph ph m cá (đ u, x ng, da, n i

t ng, nguyên con) đ c gia nhi t t 65 – 150 O

C trong 12 gi đ gi m đ m xu ng còn 10 - 12% cho ra s n ph m giàu khoáng ch t, 58% protein, 19% ch t béo, không

có ch t đ c ng d ng c a s n ph m là làm ngu n protein thay th trong th c n c a

l n

1.6.2 Trong n c

N m 2007, nghiên c u t i u c a Tr n Thanh D ng t i u đi u ki n th y phân

ph ph m cá Tra tr c ti p b ng Bacillus subtilis th nh h ng trên cây H K t qu

d ch đ m amin thu đ c thích h p cho vi c s d ng làm phân bón đ t cao nh t là 49,88 g/kg ch t khô, đ m amoniac 5,0 g/kg ch t khô ngày th y phân th 10 v i t

l ch ph m vi khu n b sung 1,4%, t l mu i b sung 7% và pH d ch th y phân ban đ u đ c đi u ch nh pH = 5,2 K t qu cây H cho k t qu t t nh t so v i các lo i phân bón khác, đ m b o đ c n ng su t và hàm l ng nitrat t n d trong cây H d i m c cho phép c a tiêu chu n rau s ch

N m 2009, nghiên c u c a Tr n Th H ng Nghi và c ng s ng d ng enzym

protease t Bacillus subtilis đ th y phân ph ph m cá tra B c đ u nghiên c u t n

d ng ph ph m c a cá Tra b ng enzym protease t vi khu n Bacillus subtilis cho

th y có nhi u u đi m nh quá trình th y phân t ng đ i đ n gi n, hi u su t cao, có

th thu h i đ c nhi u s n ph m khác nhau và chi phí t ng đ i th p Tuy nhiên còn

m t s v n đ là mùi hôi và nhi u t p ch t làm gi m ch t l ng c a s n ph m cu i cùng

1.7.1 Ph ng pháp quy ho ch th c nghi m

 nh ngh a

Quy ho ch th c nghi m: quy ho ch th c nghi m là t p h p các tác đ ng nh m

đ a ra chi n thu t làm th c nghi m t giai đo n đ u đ n giai đo n k t thúc c a quá trình nghiên c u đ i t ng (t nh n thông tin mô ph ng đ n vi c t o ra mô hình toán, xác đ nh các đi u ki n t i u), trong đi u ki n đã ho c ch a hi u bi t đ y đ

v c ch c a đ i t ng (Giang Th Kim Liên, 2009)

 i t ng

i t ng c a quy ho ch th c nghi m trong các ngành công ngh : là m t quá trình ho c hi n t ng nào đó có nh ng tính ch t, đ c đi m ch a bi t c n nghiên c u

Ng i nghiên c u có th ch a hi u bi t đ y đ v đ i t ng, nh ng đã có m t s thông tin tiên nghi m dù ch là s li t kê s l c nh ng thông tin bi n đ i, nh

h ng đ n tính ch t đ i t ng Có th hình dung chúng nh m t “h p đen” trong h

th ng đi u khi n g m các tín hi u đ u vào và đ u ra, nh hình 1.1

S đ 1.1 i t ng nghiên c u c a ph ng pháp quy ho ch th c nghi m

- Các tín hi u đ u vào đ c chia thành ba nhóm:

1) Các bi n ki m tra đ c và đi u khi n đ c, mà ng i nghiên c u có th đi u

ch nh theo d đ nh, bi u di n b ng vect :

đ c g i là b m t đáp ng (b m t bi u di n) Ph ng pháp toán h c trong x lý s

li u t k ho ch th c nghi m là ph ng pháp th ng kê Vì v y các mô hình bi u

di n hàm m c tiêu chính là các mô hình th ng kê th c nghi m Các mô hình này

nh n đ c khi có công tính nhi u ng u nhiên

Trong t p h p các mô hình th ng kê khác nhau, mô hình đ c quan tâm nhi u

nh t trong th c t là mô hình c a phân tích h i quy Mô hình h i quy đ c bi u di n

Các ph ng pháp quy ho ch th c nghi m :

- Th c nghi m sàng l c: là th c nghi m mà nhi m v c a nó là tách nh ng y u t

nh h ng đáng k ra kh i nh ng y u t đ u vào đ ti p t c nghiên c u chúng trong các th c nghi m c n thi t

- Th c nghi m mô ph ng: là th c nghi m liên quan t i vi c mô ph ng hi n t ng

c n nghiên c u Có nhi u d ng mô ph ng, đây ch quan tâm đ n d ng th c nghi m

đ c hoàn t t b ng mô hình h i quy đa th c

- Th c nghi m c c tr : là th c nghi m đ c phát tri n t th c nghi m mô ph ng Nhi m v c a nó là xây d ng mô hình toán th c nghi m, theo đó xác đ nh giá tr t i

B t ngu n t ma tr n đ y đ (full – factorial matrices), s d ng gi đ nh r ng t t

c các t ng tác không có d u hi u liên quan đáng k so v i các y u t chính, thi t

k Plackett - Burman d a trên ma tr n hai c p cho m i y u t và s a đ i nó đ gi m

th t b i

Y u t tác đ ng chính trong thi t k Plackett – Burman thay th t t c các t ng tác c a m t ma tr n đ y đ Tuy nhiên, đi u này không có ngh a là thông tin v s

t ng tác không th đ c xác đ nh t thi t k Plackett – Burman

V i m t thi t k Plackett – Burman g m n thí nghi m (v i n là b i s c a 4, n ≤

Vi c ch n các ma tr n s ph thu c vào s y u t thí nghi m trên c ng v i các

ph ng pháp l a ch n đ xác đ nh sai s thí nghi m (Plackett và Burman, 1946)

Có nhi u cách đ xác đ nh sai s thí nghi m nh :

• Ch n đi m trung tâm và cho m t s thí nghi m t i đi m đó

• L p l i toàn b ma tr n thí nghi m

• Th c hi n nhi u phép đo đ c l p trong t h p

B ng 1.1 Thi t k thí nghi m Plackett – Burman v i 11 y u t

1.7.3 T i u hóa b ng ph ng pháp b m t ch tiêu

M t trong nh ng m c đích chính y u c a quy ho ch th c nghi m trong k thu t

là tìm giá tr c c tr hay vùng t i u cho m t quá trình hay các đi u ki n t i u đ

v n hành m t h th ng L p các bài toán nghiên c u th c nghi m v v n đ t i u

th ng đ c bi t đ n v i tên g i “ ph ng pháp b m t ch tiêu” (Response Surface Methods – RSM)

N i dung chính c a RSM là s d ng m t chu i các thí nghi m đ c thi t k v i các m c đích:

• Ch ra t p giá tr các bi n đ u vào sao cho t o ra đáp ng c a hàm m c tiêu là

• Mô hình hóa quan h gi a các bi n đ u vào v i đáp ng c a đ i t ng

nghiên c u, dùng làm c s d đoán hay đi u khi n quá trình hay h th ng

T i u hóa b ng RSM th ng g m 3 giai đo n: thí nghi m kh i đ u, leo d c tìm vùng c c tr và thí nghi m b m t ch tiêu (Nguy n V n D và c ng s , 2011)

1.7.3.1 Thí nghi m kh i đ u

Sau khi ti n hành thí nghi m sàng l c, mô hình h i quy b c nh t đ c xây d ng

d a trên các bi n nh h ng chính, các bi n không nh h ng đáng k đ n hàm m c tiêu b lo i b kh i mô hình

Thí nghi m kh i đ u xây d ng m t s thí nghi m v i các bi n nh h ng chính,

b sung thêm m t s đi m thí nghi m trung tâm nh m đánh giá m c đ không phù

h p c a mô hình b c nh t cho phép ta ki m tra đ c vùng kh o sát đã vùng lân

c n c c tr hay không

M c đ không phù h p c a mô hình đ c ki m đ nh d a trên hai gi thuy t th ng kê:

• Gi thuy t đ o: mô hình kh p v i d li u th c nghi m

• Gi thuy t chính: mô hình không kh p v i d li u

có th ki m đ nh v m c đ phù h p c a mô hình, m i bi n trong m t k

ho ch thí nghi m c n nh n 3 m c giá tr D th y n u ch kh o sát 2 giá tr c a bi n,

mô hình b c nh t s luôn t ra là phù h p v i d li u và nh v y, ta không có kh

n ng phát hi n khi nào mô hình này là không phù h p

C ng nh các phép ki m đ nh th ng kê khác, thông s đ ch p nh n hay lo i b

gi thuy t đ o là giá tr p (p – value)

b c leo d c tìm vùng c c tr (Nguy n V n D và c ng s , 2011)

1.7.3.2 Leo d c tìm vùng c c tr

N u k t qu c a b c kh i đ u cho th y có th mô t hàm m c tiêu b ng m t hàm h i quy b c nh t, đi u đó ch ng t vùng thí nghi m kh o sát còn xa vùng c c

tr Ti n hành các thí nghi m nh m tìm nhanh đ n vùng c c tr Ph ng pháp có tên

là Leo d c/ xu ng d c (Steepest Ascent/ Descent Method) tìm vùng c c tr

ti n nhanh đ n vùng ch a c c tr c a hàm m c tiêu, c n xác đ nh đúng h ng

đi u ch nh giá tr các bi n thí nghi m, leo d c n u c n t i đa hóa hàm m c tiêu,

xu ng d c n u c n t i thi u hóa hàm m c tiêu

 Các b c leo d c tìm vùng c c tr :

Ch n b c chuy n đ ng c a m t bi n thí nghi m xj nào đó, thông th ng nên

ch n bi n d đi u khi n ho c bi n ng v i h s h i quy có giá tr tuy t đ i l n nh t