Khảo sát các chỉ tiêu vi sinh vật trong một số mẫu sữa và các sản phẩm từ sữa

nhăl ng Listeria monocytogenes .... nh tính Salmonella spp .... nhăl ng Bacillus cereus ..... coli, Citrobacter, Klebsiella và Enterobacter.ă Tínhă ch tă sinhă hoáă đ că tr ngă c aănhómă

BÁO CÁO KHÓA LU N T T NGHI P

Tên đ tài

KH O SÁT CÁC CH TIÊU VI SINH V T

TRONG M T S M U S A VÀ CÁC S N

PH M T S A

KHOA CÔNG NGH SINH H C

CBHD: ThS Nguy n V n Hòa

SVTH: Nguy n Uyên Vy MSSV: 1053012976 Khóa: 2010 ậ 2014

Tp H Chí Minh, tháng 05 n m 2014

L I C M N

u tiên, em xin g i l i c m n sâu s c đ n Th y Nguy n V n Hòa, Th y

Nguy n V n Minh, Cô D ng Nh t Linh, ch Tr n Th Ánh Nguy t, Cô Ph m

Vân An, ng i đã truy n đ t ki n th c, kinh nghi m và h t s c giúp đ em

hoàn thành t t đ tài khóa lu n t t nghi p c a mình

Em c ng xin c m n Nhà tr ng, Quý Th y Cô, cùng b n bè Khoa Công ngh

sinh h c tr ng i h c M TP.HCM đã t o m i đi u ki n cho em h c t p,

ti p c n chuyên sâu ki n th c chuyên môn c ng nh hi u bi t v m t xã h i

ng th i, em xin chân thành c m n Quý Trung tâm K thu t Tiêu chu n o

l ng Ch t l ng 3 và các Anh Ch trong phòng ki m nghi m Vi sinh – GMO

c bi t là ch inh Th Thu H ng đã t n tình giúp đ , ch b o em trong su t

quá trình th c t p

Cu i cùng, con xin g i l i c m n đ n B M cùng gia đình, ng i đã luôn

ng h , theo sát và c v con trong su t quãng đ ng v a qua

M t l n n a xin c m n t t c !

Sinh viên th c hi n

Nguy n Uyên Vy

DANH M C B NG

B ng 1.1:ăQuyăđ nh c a b y t v gi i h n vi sinh v t trong s n ph m s a 10

B ng 3.1.1 :ăK tăqu ăth căhi năki mătraăm tăs ăch ătiêuăviăsinh

trên 20 m uăs aăb tă 43

B ngă3.1.2:ăK tăqu ăth căhi năki mătra m tăs ăch ătiêuăviăsinhă

trên 20 m uăs aăt iăti tătrùng 44

B ngă3.1.3:ăK tăqu ăth căhi năki mătra m tăs ăch ătiêuăviăsinhă

trên 15 m uăs aăchua 45

B ngă3.1.4:ăK tăqu ăth căhi năki mătraăm tăs ăch ătiêuăviăsinhă

trên 30 m uăphô mai 46

M C L C

T V Nă 6

PH N 1: T NG QUAN 7

1.1 GI I THI U V TRUNG TÂM K THU T TIÊU CHU Nă OăL NG CH TăL NG 3 (QUATEST 3) 7

1.2 T NG QUAN V S A VÀ VI SINH V T C N KI M TRA TRONG S A 9

1.1.1 T ng quan v s a và các s n ph m t s a 9

1.1.2 Vi sinh v t c n ki m tra trong s a 10

PH N 2: V T LI U VẨ PH NG PHÁP NGHIểN C U 2.1 N I DUNG CHÍNH 18

2.1.1 THAO TÁC THU, B O QU N, CHU N B M U TH C PH M 18

2.1.2 K THU T KI M TRA CH TIÊU VI SINH TRONG TH C PH M 20

2.2 V T LI U VÀ PH NGăPHÁPăNGHIểN C U 2.2.1 V T LI U ậ D NG C - MÔIăTR NG 20

2.2.2 PH NGăPHÁPăNGHIểNăC U 21

2.2.2.1 nhăl ng Listeria monocytogenes 21

2.2.2.2 nhăl ng E.coli 24

2.2.2.3 nh tính Salmonella spp 26

2.2.2.4 Staphylococci ph n ngăd ngătínhăv i coagulase 29

2.2.2.5 nhăl ng t ng s vi sinh v t hi u khí 31

2.2.2.6 nhăl ng Coliform 33

2.2.2.7 nhăl ng n m men và n m m c 35

2.2.2.8 nhăl ng Bacillus cereus 36

PH N 3: K T QU NGHIÊN C U VÀ TH O LU N 3.1 K t qu 37

3.2 Th o lu n 44

PH N 4: K T LU N VÀ KI N NGH

4.1 K T LU N 44

4.2 KI N NGH 44

TÀI LI U THAM KH O 46

PH L C 48

M T S HÌNH NH MINH H A 58

T V N

Theo báo cáo g năđơyăc a T ch c Y t Th gi iă(WHO),ăh nă1/3ădơnăs cácăn c

phát tri n b nhăh ng c a các b nh do th c ph m gây ra m iăn m.ă i v i các

n căđangăphátătri n, tình tr ng l i càng tr m tr ngăh nănhi u,ăhƠngăn măgơyăt vongăh nă2,2ătri uăng i Các v ng đ căcóăxuăh ng ngƠyăcƠngăt ng.ăTrongăđó,ă

có kho ngăh nă50%ăcácăv ng đ c th c ph m là do tác nhân vi sinh v t.[14]

Trong cu c s ng b n r năngƠyănay,ăconăng iăđòiăh i s d ng lo i th c ph m v a

nhanh, tiên l i,ăđ ng th iăc ngăph iăđápă ng nhu c u v m tădinhăd ng Và nhóm

th c ph m t s a chính là s l a ch năhƠngăđ u

S a và các s n ph m t s a là lo i th c ph m có giá tr dinhăd ngăcaoăvƠăđ yăđ

ch tădinhăd ngănh ăprotein,ăglucid,ălipid,ăch tăkhoáng,ăvitamin,ầăM t s n ph m

không th thi u trong cu căconăng i Nh ngăcâu h iăđ căđ t ra đơyălƠăcácăs n

ph m này có nhi m vi sinh v t gây b nh?ăNóiăcáchăkhác,ăchúngăcóăđ m b o ch t

l ng v sinh an toàn th c ph m hay không?

Các s n ph m t s aăđ c làm ra là c m t quá trình thu nh n ,ch bi n,ăđóngăgói,ă

phân ph i,ăl uătr , b o qu n Ch c n m t ho c nhi uăgiaiăđo n này ch a vi sinh v t

gây b nh,ăđ c t c a chúng s gây ra hi năt ng ng đ c th c ph m, nhăh ng x u

đ n s c kh e c aăng i tiêu dùng Chính vì th , vi c ki m tra m t s ch tiêu v vi

sinh v t c a các s n ph m t s aătr căkhiăđ nătayăng i tiêu dùng là c c k quan

tr ng

V i m căđíchăđó,ătôiăđưăth c hi năđ tài “Kh o sát các ch tiêu vi sinh v t trong

s a và các s n ph m t s a (t ngày 5/11 đ n ngày 17/05/2014)”

QUATEST 3 là t ch c khoa h c công ngh thu c T ng c c Tiêu chu nă oă

l ng Ch tăl ng ậ B Khoa h c và Công ngh ,ăđ c thành l p t thángă5ăn mă1976ătrênăc ăs Vi nă nh chu n Qu căgiaătr căđơy.ă

QUATEST 3 áp d ng h th ng qu n lý ch tă l ng theo tiêu chu n ISO

9001; l nhă v c thí nghi m đ c công nh n phù h p v i tiêu chu n ISO/IEC

17025, l nhăv căgiámăđ nh hàng hóa đ c công nh n phù h p v i ISO/IEC 17020,

l nhăv c ch ng nh n s n ph măđ c công nh n phù h p v i ISO/IEC Guide 65 và

l nhăv căt ăv n, đƠoăt oăđ c ch ng nh n phù h p v i ISO 9001

Quaă30ăn măho tăđ ng,ăQUATESTă3ăđưăđ c bi tăđ nănh ăm tăđ năv hƠngăđ u t i

Vi tăNamătrongăl nhăv c cung c p d ch v k thu t v tiêu chu n,ăđoăl ng và ch t

l ng QUATESTă3ăcóăđ iăng ăchuyênăviên,ăk thu t viênăđ căđƠoăt o chuyên sâu

và có nhi u kinh nghi m, h th ng phòng thí nghi m v i trang thi t b hi năđ i theo

- Ch ng nh n s phù h p c a s n ph m v i tiêu chu n và qui chu n k thu t

- Ki măđ nhăvƠăđánhăgiáăanătoƠnăcôngănghi p

- Kh o sát, quan tr c,ăphơnătích,ăđánhăgiáăth c tr ng công ngh , chuy n giao

công ngh

- Ơoăt oăvƠăt ăv năn ngăsu t ch tăl ng, ng d ng k thu t mã s - mã v ch

- Ơoă t o nghi p v , chuyên môn và k thu t v tiêu chu nă đoă l ng ch t

l ng

- Nghiên c u, ch t o và cung c p các chu nă đoă l ng, m u chu n và các

ph ngăti năđo.ăTrangăb và cung c p d ch v b oătrì,ăbáoăd ng và s a ch a cácăph ngăti năđoăl ng, th nghi m, thi t b k thu t

 Vi sinh - sinh v t bi năđ i gen (GMO)

1.1.4 Phòng vi sinh & GMO

1.1.4.1 N ng l c k thu t chính

 Phân tích vi sinh trong th c ph m, nông s n, m ph m,ăn c, th că năch nănuôi,ăđ u ng, phân vi sinh, ch ph m sinh h c và các s n ph m tiêu dùng

 Phơnătíchăđ nhătínhăvƠăđ nhăl ng sinh v t bi năđ i gen (GMO) có trong các

lo i s n ph m có ngu n g c t th c v t, các lo i h t gi ng, các lo i th că nădƠnhăchoăgiaăsúcầ

1.1.4.2 Ph ng pháp th nghi m

1.1.4.3 Thi t b chính

Các thi t b viăsinhănh ăt c y vô trùng, n i h p, t m, kính hi n vi, t đôngăsơuầă

Các thi t b đ th nghi m th c ph m bi năđ iăgenănh ăPCRăRealăTime,ămáyălyătơmă

l nh,ămáyăđi n di ngang, thi t b nhân gen, t l c n nhi t, h th ng gi i trình t

gen, h th ngăELISA,ầ

TRONG S A 1.2.1 T ng quan v s a và các s n ph m t s a [3]

- Là nhóm s n ph m có giá tr dinhăd ng cao, không ch th hi năquaătínhăđ c

hi u c a các ch tădinhăd ng và t l gi aăchúngămƠăcònăđ c th hi n qua tínhăđ c hi u c a các thành ph nădinhăd ngăđó.ăCácăs n ph m t s aăđápă

ng nhu c uădinhăd ng c aăc th v acid amin không thay th , acid béo khôngăno,ăkhoángă(đ c bi t là Ca và P) và các vitamin Các thành ph n ch

y u c a s a và các s n ph m t s a:

1.2.1.1 N c

- Là m t thành ph năđóngăvaiătròăquanătr ng, là dung môi hòa tan các ch t h u

c ăvƠăvôăc ,ălƠămôiătr ng cho các ph n ng sinh hóa

1.2.1.2 Lipid

- Ch t béo là m t trong nh ng thành ph n quan tr ng nh t trong các s n ph m

t s a.ăHƠmăl ng ch t béo c aăchúngăthayăđ i trong m t ph m vi khá r ng

Trong thành ph n ch t béo c a s a có t i 20 lo i acid khác nhau, trong đóă

2/3 là acid béo no và còn l iălƠăacidăch aăno.ăNhi u acid béo trong s a d hòa tanătrongăn c Ch t béo trong s aăc ngăd x y ra nh ng quá trình phân h y

lƠmă thayă đ i thành ph n và tính ch t s a d nă đ n gi m ch tă l ngă vƠă h ă

phân t glucose và m t phân t galactose.ăD i tác d ng c a vi khu n lactic,

lactose b lên men thành acid lactic g i là quá trình lên men lactic

1.2.2 Vi sinh v t c n ki m tra trong s a [1,4]

B ng 1.1: Quy đ nh c a b y t v gi i h n vi sinh v t trong s n ph m s a

- Là nhóm vsv ch t ngătr ng và hình thành khu n l c trongăđi u ki n có O2

S l ng vsv hi u khí có m t trong m u th c ph m bi u th m căđ v sinh

th c ph m

- T ng s VSV hi uăkhíăđ căxácăđ nh b ngăph ngăphápăđ m khu n l c trên th ch

đ a.ăT m tăl ng m uăxácăđ nh,ătrênăc ăs xem m t khu n l c là sinh kh i phát

tri n t m t t bào hi n di n trong m u.ăđ năv bi u di n Colony forming unit CFU:

đ năv hình thành khu n l c

- M t s tên g i khác :

 T ng s đ mătrênăđ a:ăTotalăPlateăCountă(TPC)

 S vi sinh v t hi u khí: Aerobic Plate Count (APC)

 T ng s vi sinh v t s ng: Total Vable Count (TVC)

 S đ măđ cătrênăđ aăchu n: Standard Plate Count (SPC)

1.2.2.2 Coliform

- Là nhóm nh ng tr c khu năđ ng ru t gram âm, không sinh bào t , hi u khí

ho c k khí tùy nghi, có kh n ngăsinhăacid,ăsinhăh iădoălênămenălactoseă

37oC trong 24ăh.ă ơyălƠăănhómăvsvăch th : s l ng hi n di n c a chúng

trong th c ph m,ăn c hay các lo i m uămôiătr ngăđ cădùngăđ ch th kh

n ngăhi n di n c a các vsv gây b nh khác

- Nhóm Coliforms g mă4ăgi ngălƠ: Escherichia v iă1ăloƠiăduyănh tălà E coli,

Citrobacter, Klebsiella và Enterobacter.ă Tínhă ch tă sinhă hoáă đ că tr ngă c aănhómănƠyăđ căth ăhi năquaăcácăth ănghi măIndolă(I),ăMethylăRedă(MR),ă

Voges-Proskaueră (VP)ă vƠă Citrateă (iC)ă th ngă đ că g iă tómă t tă chungă lƠă

IMViC

1.2.2.3 Salmonella

- Salmonella là tr c khu năGramăơm,ădiăđ ng, s ng

hi u khí hay k khí tùy nghi, không t o bào t ,

không t oăgiápămô,ădiăđ ng nh tiêm mao

- Salmonella m c trên XLD cho khu n l c có ho c

khôngăcóătơmăđen,ăcóăqu ngătrongăsáng,ăh iăđ

Trên HE : khu n l cămƠuăxanhăd ngăđ n xanh

lá, có ho c không có tâm Trên BS khu n l c có

Indol (-), Ure (-), H2Să(+),ăLDCă(+),ăTSIăđ /vàng, VP (-), chuy n hóa O.N.P.G(-)

Salmonella có kh n ngălênămenăglucose,ămanitolănh ngăkhôngălênămenăsaccharoseă

và lactose

Kháng nguyên: Salmonella có trên 60 kháng nguyên O, kháng nguyên H có 1 hay 2

d ng và kháng nguyên Vi

c t :có 2 lo iăđ c t :ăăđ c t ru t và th n kinh

- c t ru t g m n iăđ c t và ngo iăđ c t N iăđ c t g m LT không ch u nhi t và

ST ch u nhi t

- Ngo iăđ c t th năkinh:ătácăđ ng lên th n kinh

Li u nhi m trùng: li u có th gơyă đ că đ i v iă ng i kh e m nhă th ng 106 vi khu n/1g th c ph m.ăNh ngăđ i v i tr emăvƠăng i già thì li u gây ng đ c s

c t : g m n iăđ c t và ngo iăđ c t

N iăđ c t nh ăleukocidinădi t b ch c u, exfoliative t o n t m năn c trên da

Ngo iăđ c t nh ă -toxinăvƠă -toxin làm tan h ng c u.Ngo iăđ c t ru t enterotoxin gơyătrúngăđ c th c ph m

Tính gây b nh:

Hình 1.2: Staphylococcus aureus

Gây b nh viêm m nhi mătrùngănh ăuănh t, apxe, viêm kh p, viêm ph i Vi khu n

còn gây nhi m trùng máu có th d năđ n viêm não, viêm tim d năđ n t vong Gơyătrúngăđ c th c ph m, li u t i thi uăđ s n xu tăraăđ c t là 108 vi khu n/1 g

th c ph m

1.2.2.5 Escherichia coli

E.coli là m t loài vi khu n trong ru t c aăconăng iăvƠăđ ng v t máu nóng S

l ng E Coli phơnăng iăkhiăđiăđ i ti n t 100 t đ n 10000 t vi khu n E Coli

S l ng E Coli trongăconăng i quá nhi u, s gây b nhăchoăconăng i ch ng h n

nh ătiêuăch y

Tính ch t nuôi c y và sinh hóa: KIA

vàng/vàng; IMViC ++ ; ONPG (+);

LDCă (+);ă lênă menă sinhă h iă đ ng

glucose, lactose, galactose; không lên

men dextrin và có 2 lo i enzyme

-D-Glucuronidaseă (GLUC)ă vƠă -D

Galactosidase (GAL)

Kháng nguyên: E.coli có kho ng 150

y u t O, 100 y u t K và 50 y u t H

c t :

D a vào tính ch t gây b nh E.coli đ căchiaălƠmă5ănhómăđ c t :

 Nhóm EPEC (Enteropathogenic E.coli): là nguyên nhân gây b nh tiêu ch y

m tăn c tr d i 2 tu i

 Nhóm ETEC (Enterotoxigenic E.coli): ti tăđ c t ru t enterotoxin gây tiêu

ch y cho tr emă vƠă ng i l n g m 2 lo i LT (Thermolabiles) và ST

(Thermostable)

Hình 1.3: Escherichia coli qua kính hi n

viăđi n t

 Nhóm EIEC ( Enteroinvasine E.coli): đơyă lƠă nhómă E.coliă xơmă l n Chúng

gây loét niêm m căđ i tràng, tiêu ch y l năđƠm,ămáu.ăCácăch ng này có ph n ng

LDC (-)

 Nhóm EHEC (Enterohemorhagic E.coli): gây xu t huy t ru t và h i ch ng

tan máu-urê huy t,ăngoƠiăraăchúngăcònălƠănguyênănhơnăgơyăviêmăđ i tràng xu t

huy t

 Nhóm EAEC (Enteroaggretive E.coli): vi khu n nhóm này có y u t bám

dính ph kín b m t ngoài c a niêm m c ru t góp ph n t o nên s xâm l n dai

d ng và gây tiêu ch y kéo dài d năđ n s kém h p thu các ch tădinhăd ng

Li u nhi m trùng: li u gây nhi măquaăđ ng tiêu hóa là 106-108 vi khu n /ml (g)

h uă c ă đ cung c pă n ngă l ng

t môiătr ng bên ngoài

- N m m c là vi n m d ng s i, sinh

s n b ng bào t hay khu n ty

- N m men là nh ng t bƠoă đ nă tínhă phátă tri n theo ki u n y ch i, th nh

tho ng có th t n t i d ng khu n ty gi trongăđóăcácăt bào k t nhau thành

chu i

- năv hình thành khu n l c c a n m m c và n m men là m măđ t o nên 1

khu n l c khi nuôi c yătrongămôiătr ng M m có th là 1 bào t , 1 t bào hayă1ăđo n c a khu n ty

c đi m nuôi c y:

PDA

H u h t n m m c, n mămenăđ u thu c nhóm vi sinh v tă aămát,ănhi tăđ thích h p

cho s phát tri n c a chúng trong kho ng (20 ậ 28)oC, m t s ít trong s nƠyă aă

l nhăhayă aănóng.ă

c t c a vi n m

- Nhi măđ c c pătính:ăkhiă năph iăl ngăđ c t l n s gây ng đ c c p tính và

gây t vong.ăThôngăth ng m ra th y gan to, màu s c nh t nh t, có ho i t

nhu mô gan và ch yămáuầ

- Nhi măđ c m nătính:ăgơyăungăth ăgan.ăTr ng h p b nhi m s l ng ít có

tri u ch ngăkémă n,ăch m l n, có khi t t cân, gan có vùng t máu, ho i t t bƠoănhuămôăgan.ă năm tăl ng nh lâu ngày có th gây quái thaiăvƠăđ t bi n

gen ng iăvƠăđ ng v t

1.2.2.7 Listeria monocytogenes

L.monocytogenes là vi khu n có hình g y ng n, m nh,ăgramăd ngăsauăkhiănuôiăc y

20 gi , là tác nhân gây b nh nguy hi m (nhi m trùng máu, s y thai ph n , viêm màng não, gây t vong thai nhi) loƠiănƠyăth ngăđ c phát hi n trong th că năgiaăsúc,ăn c,ăn c th i,ălƠăloƠiăđ c bi t nguy hi m trong các lo i th c ph m đưăquaăgiaă

nhi t

c đi m sinh hóa

Catalase (+), oxidase (-), chuy năđ ng xoay tròn t ngăđ t trong tiêu b n gi t treo,

có kh n ngăth y gi i esculin và làm tan huy tătrênămôiătr ng th ch máu, sinh acid

t rhamnoseănh ngăkhôngăxylose,ăph n ng CAMP (+) v i Staphylococcus aureus

và (-)ăđ i v i Rhodococcus equi

1.2.2.8 Bacillus cereus

Là nh ng tr c khu năgramăd ng,ăhi u khí và k khí tùy ý LoƠiănƠyăt ngătr ng

trong nhi tăđ t 5 ậ 50oC, t iă uă 35 ậ 40oC;ăpHădaoăđ ng t 4,5 ậ 9,3, d t o bào

t và bào t n y m m r t d dƠng.Trênămôiătr ng ch n l c loài này t o khu n l c

r t to, m călan,ărìaănh n.ăViăkhu n này di n hi nătrongăđ t, b i, các lo i th c ph m

(s a, th t, rau qu , h n h p gia v , s n ph măkhô,ầ).ă

c đi m sinh hóa

Diăđ ng, t o n i bào t ,ălênămenăglucoseăsinhăh i,ăph n ng VP (+), có kh n ngăs

d ng nitrate

c t

Vi khu n có th ti t ra 2 lo iă đ c t chính là diarrhoeal toxin gây tiêu ch y và

emetic toxin gây nôn m a

PH N 2

2.1 N I DUNG CHÍNH

2.1.1 Tao tác thu, b o qu n, chu n b m u th c ph m

- Tùy theo yêu c u v m c ch tă l ng mà ta ti nă hƠnhă đ nhă tínhă hayă đ nh

l ng m tăđ vi sinh v t trong m u ki m

2.1.1.1 D ng c thu, ch a m u: thay đ i tùy theo lo i th c ph m

- Dao, thìa, k p,ăkéoầđưăđ căsátătrùngăđ cho m u vào d ng c ch a Kh i

l ng t ng c a m i m u c n thu ít nh t là kho ng (100-250)g và ph iăđ m

b oătínhăđ i di n

- D ng c ch a m uăth ng là các bình nh a có n p b ng nhôm hay b ng ch t

d o, bao nylon ch a m u

2.1.1.2 B o qu n m u

- B o qu n m u th nghi măătrongăđi u ki n sao cho h n ch đ n m c th p

nh tăđ n s thayăđ i s l ng vi sinh v t trong m u

- i v i các m u năđ nh, có th b o qu n nhi t đ phòng là t 18 ậ 27oC

i v i m uăđôngăl nh, ph i b o qu n < -15oC và ph iăđ c phân tích ngay

khi có th ă i v i m u mà không năđ nh nhi tăđ th ng, b o qu n 1 ậ

8o và ph i phân tích ngay khi có th

2.1.1.3 Chu n b m u th [12]

- Các s n ph măđông:ănên đ cărưăđôngăb ngăcáchăđ ngoài nhi tăđ phòng

(18-27)oC/3 h ho c (3± 2)oC/24 h, m u ph i đ c ki m tra càng nhanh càng

t t

- Các s n ph m khô c ng: nghi n m uă nh ngă khôngă quáă 1 phút ho că đ ng

nh t b ng máy stomacher không quá 2,5 phút

- Các s n ph m l ng ho c bán l ng:ă tr c khi phân tích l c b ng tay ho c

máy

- Các s n ph m h n h p: l yă c s c a m i thành ph năđ i di n cho m u th

c a s n ph măbanăđ u

2.1.1.4 Cách ti n hành

2.1.1.4.1 S a và các s n ph m t s a

- Tr n m u th nghi m và l c nhanh bình ch a m u, không quá 3 phút, tránh t o

b t ho c cho b tăv ngăra

- ng nh t huy năphùăđ đ c dung d ch pha loãng 10-1 Chu n b dãy pha loãng

caoăh năn u c n thi t

Hìnhă2.1:ăDưyăphaăloưngăm ă10

2.1.1.4.2 S a b t, whey d ng b t, s aăchua,ăb ăs a và lactose d ng b t

- L c và tr n m u trong bình ch aăch aăm N u m u th nghi măđ ng trong bình

ch aăch aăm vƠăquáăđ y thì c n chuy n m u vào m t bình ch a l năh năsauăđóă

- Chu n b dưyăphaăloưngăcaoăh năn u c n thi t

2.1.1.4.4 S a lên men và kem s a chua

- Cân 10g vào túi vô trùng

- B sung 90 ml dung d ch pha loãng nhi tăđ phòng và l c m u cho tan

- Chu n b dưyăphaăloưngăcaoăh năn u c n thi t

2.1.1.4.5 Th c ph mădinhăd ng cho tr em có ch a s a

- L c và tr n m u trong bình ch a N u m u th nghi măđ ng trong bình ch aăch aă

m và quáăđ y thì c n chuy n m u vào m t bình ch a l năh năsauăđóătr năvƠăđ ng

nh t m u L yăl ng m u yêu c u th nghi m và th c hi nătheoăcácăb căd iăđơy

- Cân 10 g m u vào túi vô trùng, b sung 90 ml dung dchăphaăloưngăchoăcácătr ng

h păthôngăth ng, ho c 90 ml dung d ch pha loãng cho các m u có hàm l ng tinh

b t cao

- cho m u hòa tan hoàn toàn, l c m uăđ t b tăvƠăsauăđóăđ ng nh t m u

2.1.2 K THU T KI M TRA CÁC CH TIÊU VI SINH TRONG TH C

PH M [4]

- Choăphépăxácăđ nh s l ng t bào vi sinh v t còn s ng hi n di n trong m u

T bào s ng có kh n ngăphơnăchiaăt o thành khu n l cătrênămôiătr ng ch n

l c.ăNênăph ngăphápănƠyăcònăg iălƠăđ măđ aă(plateăcount)

- C n th c hi n v i nhi uăđ pha loãng b c 10 liên ti p sao cho xu t hi n các

khu n l c riêng l trên b m t th ch

- ơyălƠăph ngăphápăt t nh tăđ xácăđ nh m tăđ t bào s ng.ă uăđi mălƠăđ

nh yăcao,ăchoăphépăđ nhăl ng vsv m tăđ th p trong m u.ăPh ngăphápănƠyăđ c s d ng ph bi n trong ki m nghi m vi sinh v tătrongăn c, th c

ph m, b nh ph m

- Ph ngăphápăphaăloưngăt i h n hay còn g iălƠăph ngăphápăđ nhăl ng vsv

có xác xu t cao nh t hi n di n trong m tăđ năv th tích m u.ăPh ngăphápă

này d a trên k t qu đ nh tính c a m t lo t thí nghi măđ c l p l i m t s

đ pha loãng khác nhau

2.1.2.3 Ph ng pháp đo đ đ c: t bào vsv là m t th c th khi hi n di n

trongămôiătr ngălƠmămôiătr ng tr nênăđ c.ă đ c c a huy n phù t l

v i m tăđ t bào Do v y có th đ nhăl ng m tăđ t bào m t cách gián ti p thôngăquaăđoăđ đ c b ng máy so màu cácăb c sóng t 510-610 nm

Tôi ti n hành ki m tra m t s ch tiêu trên 85 m u s a và các s n ph m t s a bao

g m 20 m u s a b t, 20 m u s aăt iăti t trùng, 15 m u s a chua và 30 m u phô

mai có s n t i phòng thí nghi m vi sinh c a Quatest 3 (các m uănƠyăđ c nhi u

công ty g i đ n ki mătraăvƠăđ căl uăgi t i phòng thí nghi m công ty)

 T c y vô khu n

2.2.1.2 Môi tr ng (xem thêm thành ph n t i ph l c/p49)

 Th ch PCA, BP, VRBL, VRBG, TBX, REC, PDA, XLD, MYP, TCBS,

th ch máu

 Canh thang BHI, TSB, LT, dung d chăđ m photphate

 Môiătr ng BGBL, BPW, RVS, LDC, Tryptophan, EC broth, Nitrate, MVP,

2.2.2.1.1 Chu n b m u th và huy năphùăbanăđ u

- Thôngăth ng cân 25 g m uăđưăđ căđ ng nh t cho vào bao nylon vô trùng

và b sungă225ămlămôiătr ng LEB

- N u s d ngăl ng m u không ph i 25 g thì b sungămôiătr ng LEB sao

cho dung d ch m uăthuăđ căcóăđ pha loãng là 1/10

2.2.2.1.2 C y và m u

- Dùng pipet vô trùng chuy n 0,1ml huy n phùă bană đ uă vƠoă 2ă đ aă th ch

ALOA Ti p t c th c hi n v i các n ngăđ ti p theo

- i v i nh ng m uăcóăl ng Listeria monocytogenes th p thì có th t ngăg p

10 l n b ng cách hút 1 ml huy năphùăbanăđ uăvƠoă3ăđ aăpetriăcóăch a môi

tr ng ALOA (ví d : 0,4 ml; 0,3 ml; 0,3 ml) chu n b m uăképă(6ăđ a)

- Dàn d ch c y lên b m t th ch,ăđ khô nhi tăđ phòng trong 15 phút

- L tăng căđ a,ă (37 ± 1)oC

- Ki mătraăcácăđ aănghiăng là Listeria.spp sau (24 ± 3) h và ti p (24 ± 3) h

n u khu n l c m c y u ho c không có khu n l c

- Khu n l c L.monocytogenes trênă môiă tr ngă ALOAă mƠuă xanhă đ c bao

quanh b i qu ngăsángăđ c, th m chí không có qu ng sáng

2.2.2.1.3 Kh ngăđ nh Listeria.spp:

 Ch n khu n l căđ th kh ngăđ nh:

- Chuy n 5 khu n l c nghi ng Listeria.spp t m iăđ aămôiătr ng ch n l c lên môiătr ng tryptone soya yeast extract agar (TSYEA) và TSYEB N u có ít

h nă5ăkhu n l căđ cătr ngăthìăl y t t c khu n l căđ cătr ngăđ th kh ng

đ nh

- TSYEA (37 ± 1)oC / (18 ậ 24) h

- TSYEA (25 ± 1)oC/ (8 ậ 24) h đ năkhiăquanăsátămôiătr ngăcóămƠuăđ c

- Trên TSYEA các khu n l căđi năhìnhăcóăđ ng kính t (1 -2) mm, l i, không

màu và toàn b mép m đ c

 Th ph n ng Catalase:

- L y khu n l c t TSYEA lên phi n kính có nh 1 gi t dung d ch H2O2 3%

Ph n ngăd ngătínhăkhi có s xu t hi n c a các bong bóng gas

- Quan sát s phát tri nă xungă quanhăđ ng c y, n u không rõ thêmă đ 5

ngày r i quan sát l iăđ ng c y Listeria.spp diăđ ng hình dù

2.2.2.1.4 Kh ngăđ nh L.monocytogenes: (N uăcácăđ c tính hình thái, sinh lý h c và

ph n ngăcatalaseăđ cătr ngăchoăListeria.spp)

 Ph n ng dung huy t:

- L y khu n l c r i t TSYEA c yăđơmălênămôiătr ng th ch máu C yăđ ng

th i ch ngă đ i ch ngă d ngă (L.monocytogenes) và ch ngă đ i ch ng âm

(L.innocua)

- (37 ± 1)oC / (24 ± 2) h

Quan sát m u th và ch ngăđ i ch ng:

- L.monocytogenes có vùng dung huy tă ăsáng,ătrong,ăh p

- L.innocua không dung huy t quanh v t c y

- L.ivanovii có vùng dung huy tă ăsáng,ătrong,ăr ng

 Ph n ngălênămenăđ ng

- T môiătr ng TSYEB c y vào các ng nghi m có ch a dung d ch purple

carbohydrate broth v i n ng đ cácăđ ng là 0,5% ; rhamnose, và xylose

- (37 ± 1)oC / (24 ậ 120) h

- Ph n ngăd ngă tínhă (lênă menă axit)ă môiă tr ng có màu vàng trong (24 ậ

48)h

 Ph n ng CAMP:

- Trênăđ aăth ch huy t c u, c yă1ăđ ng m ng chúng Staphylococcus aureus

dung huy tă ăsongăsongăvƠăcáchăđ u (kho ng 4cm) so v iăđ ng c y ch ng

Rhodococcus equi

- C y các ch ng Listeria spp (bao g m c m u) gi aăthƠnhăcácăđ ng song

song g nănh ngăkhôngăch măvƠoăđ ng c y ch ng S.aureus vƠăđ ng c y

ch ng equi

- C yă đ ng th i các ch ngă đ i ch ng L.monocytogenes, L.innocua và

L.ivanovii

- (37 ± 1)oC / (18 ậ 24) h

- Quan sát s dung huy tătrênăđ a:

 L monocytogenes có ph n ng dung huy tăđ căt ngăc ng t i vùng giáp

- Pha loãng m u n u c n thi t

- nhanh kho ngă15mlămôiătr ng TBX (v a ngu iăđ n kho ng 44-47oC)

- Tr năđ u m u v iămôiătr ng,ăđ yênăđ năđôngăđ c hoàn toàn

- Th i gian gi a quá trình c y m uăvƠăđ môiătr ng không quá 15 phút

- L tăng căđ aăđưăc y m u và đ aăpetriă 44oC / (18-24) h

 L u ý: N u vi sinh v t b t năth ngăthìăđ u tiên 37oC / 4h,ăsauăđóă

44oC / (18-24) h

- Khu n l c E.coli d ngătínhă -glucuronidaseăđi n hình trên m iăđ aăcóăch aăítăh nă

150 khu n l căđ cătr ngăvƠăítăh nă300ăt ng khu n l căđ cătr ngăvƠăkhôngăđ cătr ng

2.2.2.2.2 Tính k t qu

 Trongătr ng h p có t (15-150) khu n l căđ cătr ng

X CFU / ml (ho c g)

X ậ t ng s E coli d ngătínhă -glucuronidase

C- t ng s khu n l căđ măđ cătrênăcácăđ aă 2 n ngăđ liên ti p

n1 ậ s đ aăđ m n ngăđ pha loãng th nh t

n2ậ s đ aăđ m n ngăđ pha loãng th hai

d ậ h s pha loãng ng v iăđ phaăloưngăđ u tiên đ đ m khu n l c

V ậ th tích c y (1 ml)

 Trongătr ng h p s khu n l căđ cătr ngătrênă2ăđ aă huy năphùăbanăđ uă(đ i

v i m u r n) và n ngăđ nguyênă(đ i v i m u l ng) nh h nă15 CFU, k t

qu đ cătínhănh ăsau:

X = s khu n l c / ml (ho c g)

 Trongătr ng h p s khu n l căđ cătr ngătrênă2ăđ aă huy năphùăbanăđ uă(đ i

v i m u r n và n ngăđ nguyênă(đ i v i m ul ng) không ch a khu n l c,

báo cáo k t qu nh ăsau:

X < 1/d

 Trongătr ng h p s khu n l cămƠuăxanhăvƠăkhôngăđ cătr ngătrênă2ăđ aă

n ng đ phaăloưngăđ u tiên (d1) > 300 CFU và có khu n l c xanh rõ r t và

n uătrênă2ăđ aă n ngăđ ti p theo (d2) có s khu n l cămƠuăxanhăđ căđ m

thì k t qu đ cătínhănh ăsau:

 Trongătr ng h p s khu n l căđ cătr ngăvƠăkhôngăđ cătr ngătrênă2ăđ aă

n ngăđ phaăloưngăđ u tiên (d1) > 300 CFU và không có khu n l c xanh rõ

r t và n uătrênă2ăđ aăn ngăđ ti p theo (d2) có s khu n l cămƠuăxanhăđ c

đ m thì k t qu đ cătínhănh ăsau:

 Trongătr ng h p s khu n l cămƠuăxanhăcaoăh nă150ăchoă2ăđ aă n ngăđ phaăloưngăđ u tiên (d1), v i s khu n l cămƠuăxanhălƠăd iă15ăchoă2ăđ aă

+ N u s khu n l c trên m iăđ aă n ngăđ phaăloưngăđ u tiên (d1)ăcaoăh nă167ă

(kho ng trên gi i h n tin c y c aă150),ăthìăl uăỦăch đ m s khu n l c đ pha

loãng (d2) và tính k t qu theo công th c :

X =

 N u s khu n l că đ că tr ngă đ mă đ c t t c cácă đ pha loãng d u l n

h n150ămƠuăxanhăthìăbáoăcáoănh ăsau:

X > 150 / d

D:ăđ pha loãng cu i cùng

 Trongătr ng h p ch cóă2ăđ aă đ pha loãng th p nh t (n ngăđ cao nh t)

ch a nh h nă 15ă khu n l că đ că tr ng,ă tính k t qu E coli d ngă tínhă

-glucuronidase theo công th c :

X =

2.2.2.3 Salmonella.spp [13]

2.2.2.3.1 Chu n b m u và d ch nuôi c yăbanăđ u

- Thôngăth ng cân 25 g m uăđưăđ căđ ng nh t cho vào bao nylon vô trùng và b sungă225ămlămôiătr ng BPW

- N u s d ngăl ng m u không ph i 25 g thì b sung môi tr ng BPW sao cho

dung d ch m uăthuăđ căcóăđ pha loãng là 1/10

2.2.2.3.2 Ti năt ngăsinh

- dung d ch trên (37 ± 1)oC / (18-24) h

- T canh trùng môiătr ng 2.2.2.3.3 c y phân l p sang 2 môi tr ng sau:

+ Xylose lysine desoxycholate (XLD)

+ Hektoen enteric agar (HE) ho c Bismuth sulfite agar (BS)

- L tăng căcácăđ aătrênăvƠă (37 ± 1)oC / (24 ± 3) h cho XLD; (35 ± 1)oC / (18 ậ

24) h cho HE ho c BS

- Quan sát khu n l căđ cătr ng:ătrênăXLDăSalmonella có ho c không cóătơmăđen,ăcóă

qu ng trong sáng ho căh iăđ (Chú ý: n u lên men lactose (+) khu n l c s có màu

vàng)

- Trên HE: Khu n l căcóămƠuăxanhăd ngăđ n màu xanh lá, có ho c không có tâm

- Trên BS: Khu n l căcóătơmăđen,ăvi n sáng bao quang b i vùng t a có ánh kim

2.2.2.3.5 Ch n khu n l căđ kh ngăđ nh

- L y ít nh t 1 khu n l căđi n hình t môiătr ng phân l p, l y thêm 4 khu n l c

nghi ng khác n u khu n l căđ u tiên âm tính

- N uăcóăítăh nă5ăkhu n l căđ cătr ngăhayănghiăng thì l y t t c khu n l căđ cătr ngă

hay nghi ng đ th kh ngăđ nh

- C y ria các khu n l cătrênăđ aăNAă(đưălƠmăkhôăb m t)ăăsaoă choăthuăđ c các

khu n l c r i

- cácăđ aă (37 ±1)oC / (24 ± 3) h

- Dùng các khu n l c này ti n hành th kh ngăđ nh sinh hóa và huy t thanh

a Kh ngăđ nh sinh hóa

 Trên TSI

- C y các khu n l c nghi ng t NAălênămôiătr ng TSI agar (c y ria ph n nghiêng

và c yăđơmăph năđáy)

Trên TSI Salmonella cho:

+ Ph n ng ki m ph nănghiêngă(mƠuăđ ): lactose và sucrose âm tính

+ Ph n ng acid ph nă đáyă (mƠuă vƠng):ă glucoseă d ngă tính,ă sinhă h iă (kho ng

90%), có ho c không có H2S (th chăcóămƠuăđen)

 L uăỦ:ăKhôngăk t lu n ngay là m u không b nhi m Salmonella n u ph n

nghiêngătrênăTSIăcóămƠuăvƠngă(lactoseăd ngătính)

 Urea agar

- C y ria khu n l c nghi ng trên khu n l c t môiătr ng NA vào ph n nghiêng

ng urea agar

- ng (37 ± 1)oC / (24 ± 3) h

 Salmonella cho ph n ng urease âm:

+ Ph n ngă(+):ămôiătr ng chuy n màu sang màu h ngăt i

+ Ph n ng (-):ăkhôngălƠmăđ iămƠuămôiătr ng

 L-Lysine decarboxylation medium (LDC)

- C y khu n l c nghi ng t NAăvƠoămôiătr ng L-Lysine decarboxylation medium

- Choăđ aăgi y O.N.P.G vào ng

- ng 37oC / 1 h trong b đi u nhi t

 Salmonella s cho ph n ngă -galactosidase (-)

- (37 ± 1)oC / (24 ± 3) h

- Nh vào ng canh khu n 2 gi t dung d ch Creatine, 3 gi t 1-naphtol pha trong c n

và 2 gi t dung d ch KOH 40% L căđ uămôiătr ng sau m i l n b sung thu c th

+ Salomonella cho ph n ng indol (-)ă(môiătr ng có vòng màu vàng trên b m t)

+ N u ph n ngă(+):ămôiătr ngăcóăvòngămƠuăđ trên b m t

b Th ph n ng kháng huy t thanh

 Lo i tr ch ng t ng ngăk t

- Nh 1 gi tăn c mu i sinh lí lên b m t c a 1 phi n kính

- HòaăvƠoăđóă1ăvòngăsinhăkh i vi khu n t o thành 1 d chăđ căvƠăđ ng nh t

- L c phi n kính trong (30 ậ 60) giây

 Quan sát phi n kính:

 N u có s vón c c, không r i nhau (ít ho c nhi u) c a vi khu n, thì ch ng xemănh ăt ng ngăk t Không c n th ph n ng huy t thanh ti p sau

 N u không có s vón c c và vi khu n r iănhau,ăthìăchúngăxemănh ăkhôngăt

ng ngăk t C n ph i ti p t c th ph n ng huy t thanh

 Ki m tra O-antigen

- Nh 1 gi t anti-O serum lên b m t c a 1 phi n kính

- HòaăvƠoăđóă1ăvòngăsinhăkh i vi khu n không t ng ngăk t

- L c phi n kính trong (30 ậ 60) giây

- Ph n ngăd ngătínhăkhiăxu t hi n s vón c c phi n kính

2.2.2.4 Staphylococci ph n ng d ng tính v i coagulase (Staphylococcus aureus và các loài khác) [7]

- Chu n b m u (ph nă2,ăch ngă1,ăI)

- Dùng pipet vô trùng chuy n vào 2ăđ aăth ch m iăđ aă0,1ml.ăTi p t c th c hi n

các n ngăđ ti p theo

- i v i nh ng m uăcóăl ng staphylococci có ph n ngăd ngătínhăv i coagulase

v i s l ng th p có th t ngăg p 10 l n b ng cách hút 1ml m u th choăvƠoă3ăđ aă

petri có ch aămôiătr ng Baird Parker agar (ví d : 0,4ml; 0,3ml; 0,3ml) Chu n b

m uăképă(6ăđ a)

- Dàn m u lên b m t th ch,ăđ khô nhi tăđ phòng trong 15 phút

- L tăng căđ a,ă (35 ± 1)oC / (48 ± 4) h

- Trênămôiătr ng Baird Parker, khu n l căđi năhìnhăcóămƠuăđenăho c xám, bong,

l i, có vòng phân gi i không màu bao quanh Khu n l c S.aureus khôngăđi n hình

có kích c nh ăkhu n l căđi n hình, có ho c không có vi n tr ng h p, ho c khu n

l c có màu xám không có vùng trong

- Ch l yăcácăđ aăcóăch a t iăđaă300ăkhu n l c v i kho ng 150 khu n l căđi n hình

ho căkhôngăđi n hình 2 dung d ch có n ngăđ k ti pănhau.ă m t t c khu n l c

đi n hìnhăvƠăkhôngăđi n hình, ghi nh n s khu n l c cho m i lo i

- Ch n 5 khu n l c cho m iănhómă(đi n hình ho căkhôngăđi n hình) trên m iăđ aăđ

th c hi n ph n ng coagulase

- C y m i khu n l c trên vào canh thang BHI, 35oC / (24 ± 2) h

- Hút 0,1ml canh khu n BHI cho vào 0,3ml huy tăt ngăth (ho cătheoăh ng d n

c a nhà s n xu t)ăđ ng trong ng nghi m

- (35 ± 1)oC và ki m tra ph n ngăđôngăhuy tăt ngăm i 6h trong vòng 24 h

- N u th tích k t dính chi măh nă1ăn a th tíchăbanăđ u c a ch t l ng, thì phép th coagulaseăd ngătính

- Ph n ngăđôngăhuy tăt ngăd ngătínhăxemănh ăcóăS aureus Ki m tra m uăđ i

ch ng âm song song v i m u th b ng cách hút 0,1 ml canh thang BHI vào 0,3ml huy tăt ngăth

2.2.2.4.2 Tính k t qu

Tính s l ng staphylococci có ph n ngăcoagulaseăd ngătínhăb ng công th c

Ac : S khu n l căđi n hình qua th coagulase

Anc : S khu n l căkhôngăđi n hình qua th coagulase

bc : S khu n l căđi n hình cho ph n ngăcoagulaseăd ngătính

bnc : S khu n l căkhôngăđi n hình cho ph n ngăcoagulaseăd ngătính

cc : T ng s khu n l căđi năhìnhăđ măđ cătrênăđ a

cnc : T ng s khu n l căkhôngăđi năhìnhăđ măđ cătrênăđ a

L ng Staphylococci có ph n ngă coagulaseă d ngă tínhă trongă 1 ml hay 1 g s n

ph m khi dùng ph ngăphápăc y trang 0,1 mlăđ cătínhănh ăsau:

X : T ng s vi sinh v t, s khu n l c/g (ml)

ăan : T ng s khu n l căcóăcoagulaseăd ngătính

n1 : S đ aăđ măđ c đ pha loãng th nh t

n2 : S đ aăđ măđ c đ pha loãng th hai

d : H s pha loãng ng v iăđ pha loãng th nh t

L ng Staphylococci có ph n ngăd ngătínhătrongă1 ml hay 1 g s n ph m khi dùng

ph ngăphápăc yătrangă1mlătrênă3ăđ aăđ cătínhănh ăăsau: