Khảo sát tính đề kháng kháng sinh của trực khuẩn Gram âm sinh Men β Lactamase phổ rộng ở bệnh nhân nhiễm khuẩn đường tiết niệu tại bệnh viện nhân dân 115 từ tháng 11 năm 2013 đến tháng 5 năm 2014

- Hình 3.8: Tỷ lệ đề kháng kháng sinh của trực khuẩn Gram âm sinh ESBL trong - Hình 3.9: So sánh tỷ lệ đề kháng kháng sinh của trực khuẩn Gram âm sinh ESBL DANH SÁCH CÁC BẢNG - Bảng 3.1:

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

CỬ NHÂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NIÊN KHOÁ: 2010 – 2014

Đề tài:

Giảng viên hướng dẫn:

Nguyễn Phương Dung

Bác sĩ chuyên khoa I

Sinh viên thực hiện:

Nguyễn Minh Trọng MSSV: 1053012850 Chuyên ngành:

Vi sinh – Sinh học phân tử

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

Giảng viên hướng dẫn (Ký và ghi rõ họ tên)

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành được luận văn tốt nghiệp này, em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến cô Nguyễn Phương Dung, cùng các anh chị cán bộ, nhân viên công tác tại Đơn vị Vi sinh – Sinh học phân tử - Bệnh viện nhân dân 115 đã tận tình chỉ dạy, giúp đỡ và hướng dẫn em trong suốt quá trình thực tập và làm luận văn tại đơn vị

Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy, cô là giảng viên Khoa Công nghệ sinh học – Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình chỉ dạy, cung cấp những kiến thức nền tảng cho em trong suốt thời gian học tập vừa qua

Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, người thân, bạn bè đã quan tâm, ủng hộ, tạo điều kiện và giúp đỡ em rất nhiều trong suốt thời gian thực hiện luận văn tốt nghiệp này

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

- BA: Blood Agar – Môi trường thạch máu

- MC: Môi trường MacConkey

- MHA: Mueller-Hinton Agar – Môi trường thạch Mueller-Hinton

- ESBL: Extended Spectrum Beta Lactamase – Men β-lactamase phổ rộng

- CFU: Colony Forming Unit - Số đơn vị hình thành khuẩn lạc

- S: Sensitive – Nhạy cảm

- I: Intermediate – Trung gian

- R: Resistant – Kháng

- Kbp: kilo – base – pair

- Bảng viết tắt và thông tin về kháng sinh sử dụng trong nghiên cứu này:

STT Tên kháng sinh Kí hiệu Nồng

độ

Giới hạn đường kính vùng ức chế (mm) Phân nhóm

1 Amikacin AN 30 μg ≥ 17 15–16 ≤ 14 Aminoglycoside

2 Tobramycin TOB 10 μg ≥ 15 13–14 ≤ 12 Aminoglycoside

3 Imipenem IPM 10 µg ≥ 23 20-22 ≤ 19 Carbapenem

4 Ertapenem ETP 10 µg ≥ 23 20-22 ≤ 19 Carbapenem

5 Meropenem MEM 10 µg ≥ 23 20-22 ≤ 19 Carbapenem

6 Cefotaxime CTX 30 μg ≥ 26 23-25 ≤ 22 Cephem

7 Ceftazidime CAZ 30 μg ≥ 21 18-20 ≤ 17 Cephem

8 Ceftriaxone CRO 30 μg ≥ 23 20-22 ≤ 19 Cephem

9 Cefepime FEP 30 μg ≥ 18 15-17 ≤ 14 Cephem

10 Cefotaxime + Clavulanic acid CTX + CLA 30/10 μg β-lactam/ức chế β-lactamase

11 Ceftazidime +

Clavulanic acid

CAZ + CLA

30/10

μg

β-lactam/ức chế β-lactamase

13 Moxifloxacin MXF 5 μg ≥ 24 21-23 ≤ 20 Fluoroquinolone

14 Ciprofloxacin CIP 5 µg ≥ 21 16–20 ≤ 15 Fluoroquinolone

15 Nalidixic acid NA 30 µg ≥ 19 14–18 ≤ 13 Quinolone

DANH SÁCH HÌNH ẢNH

- Hình 1.3: Mô phỏng Enterobacteriaceae và hình ảnh nhuộm Gram của E.coli 14

- Hình 1.5: Cấu trúc của một số kháng sinh nhóm β-lactam 17

- Hình 1.6: Sơ đồ mô tả một số đột biến của TEM và SHV theo nghiên cứu của

- Hình 1.7: Cây phát sinh loài các dạng ESBL theo nghiên cứu của Patricia A

- Hình 1.8: Mô tả cơ chế phân giải kháng sinh nhóm β-lactam của ESBL 21

- Hình 2.1: Tủ an toàn sinh học cấp 2 Airstream của ESCO và kính hiển vi CX21

- Hình 2.2: Tủ ấm nuôi cấy vi khuẩn INCUCELL 222 của MMM Group và đèn

- Hình 2.5: Vi khuẩn bắt màu qua mỗi bước nhuộm Gram 30

- Hình 2.7: Kết quả thử nghiệm sinh hoá âm tính của bộ KIT API 10S 33

- Hình 2.8: Kết quả thử nghiệm sinh hoá dương tính của bộ KIT API 10S 33

- Hình 2.9: Kháng sinh đồ của một mẫu bệnh phẩm trong nghiên cứu 35

- Hình 3.1: Biểu đồ tỷ lệ mẫu cấy dương tính và tỷ lệ giới tính bệnh nhân 39

- Hình 3.2: Biểu đồ tỷ lệ các vi khuẩn phân lập và định danh được của mẫu cây

- Hình 3.3: Tỷ lệ các vi khuẩn dương tính trong thử nghiệm sàng lọc ESBL 44

- Hình 3.4: Tỷ lệ các trực khuẩn Gram âm sinh ESBL của toàn bộ nghiên cứu 46

- Hình 3.5: Tỷ lệ đề kháng các kháng sinh của E.coli trong nghiên cứu 48

- Hình 3.6: Tỷ lệ đề kháng các kháng sinh của Acinetobacter baumannii trong

- Hình 3.7: Tỷ lệ đề kháng các kháng sinh của Proteus vulgari, Proteus mirabilis và

- Hình 3.8: Tỷ lệ đề kháng kháng sinh của trực khuẩn Gram âm sinh ESBL trong

- Hình 3.9: So sánh tỷ lệ đề kháng kháng sinh của trực khuẩn Gram âm sinh ESBL

DANH SÁCH CÁC BẢNG

- Bảng 3.1: Kết quả tỷ lệ theo độ tuổi của bệnh nhân có mẫu cấy dương tính 40

- Bảng 3.2: Kết quả phân lập và định danh vi khuẩn 40

- Bảng 3.5: Kết quả trực khuẩn Gram âm sinh ESBL của toàn bộ nghiên cứu 45

- Bảng 3.6: Kháng sinh đồ của vi khuẩn Escherichia coli sinh ESBL trong nghiên

- Bảng 3.10: Kháng sinh đồ của vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa sinh ESBL

- Bảng 3.11: Tình hình đề kháng kháng các kháng sinh của Enterobacter aerogenes, Klebsiella oxytoca, Klebsiella spp trong nghiên cứu 54

- Bảng 3.12: Tình hình đề kháng kháng sinh của trực khuẩn Gram âm sinh ESBL

- Bảng 3.13: So sánh tình hình đề kháng kháng sinh của trực khuẩn Gram âm sinh

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

I ĐẶT VẤN ĐỀ 2

II MỤC TIÊU ĐỀ TÀI 3

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

I TỔNG QUAN HỆ TIẾT NIỆU 5

1 Cấu tạo hệ tiết niệu: 5

2 Tổng quan chức năng sinh lý hệ tiết niệu: 8

II NHIỄM KHUẨN ĐƯỜNG TIẾT NIỆU 5

1 Khái niệm: 8

2 Phân loại: 8

3 Nguyên nhân bệnh sinh: 9

II TRỰC KHUẨN GRAM ÂM SINH MEN β-LACTAMASE PHỔ RỘNG 12

1 Lịch sử: 12

2 Trực khuẩn Gram âm: 13

3 Men β-lactamase phổ rộng: 15

4 Yếu tố nguy cơ nhiễm trực khuẩn Gram âm sinh ESBL ở bệnh nhân nhiễm khuẩn đường tiết niệu: 22

5 Phòng chống và điều trị: 22

PHẦN II: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

I PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 24

1 Địa điểm và thời gian tiến hành thí nghiệm: 24

2 Thiết bị và dụng cụ: 24

3 Hoá chất: 25

4 Nguyên liệu: 28

II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

1 Phương pháp lấy mẫu nước tiểu: 28

2 Khảo sát trực tiếp mẫu nước tiểu: 29

3 Cấy định lượng mẫu nước tiểu: 31

4 Phương pháp phân lập và định danh: 32

5 Kháng sinh đồ và khảo sát khả năng sinh ESBL: 33

PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 39

I MẪU NƯỚC TIỂU VÀ TRỰC KHUẨN GRAM ÂM 39

1 Mẫu nước tiểu: 39

2 Phân lập và định danh vi khuẩn: 40

II TRỰC KHUẨN GRAM ÂM SINH ESBL: 42

1 Thử nghiệm sàng lọc ESBL: 42

2 Thử nghiệm khẳng định ESBL: 44

III TÌNH HÌNH ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA CÁC TRỰC KHUẨN GRAM ÂM SINH ESBL 46

1 Escherichia coli: 46

2 Acinetobacter baumannii: 48

3 Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa: 50

4 Enterobacter aerogenes, Klebsiella oxytoca, Klebsiella spp.: 54

5 Tình hình đề kháng kháng sinh của trực khuẩn Gram âm sinh ESBL trong toàn bộ nghiên cứu: 56

PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63

I KẾT LUẬN 63

II KIẾN NGHỊ 64

TÀI LIỆU THAM KHẢO 65

ĐẶT VẤN ĐỀ

I ĐẶT VẤN ĐỀ [1, 2, 6, 9, 10, 13]

Từ xưa, bệnh nhiễm khuẩn đường tiết niệu đã được người ta biết đến; những mô tả đầu tiên về bệnh này đã được tìm thấy trong cuốn Ebers Papyrus của người Ai Cập cổ đại Cho đến nay, nhiễm khuẩn đường tiết niệu đã trở thành một trong những bệnh phổ biến hàng đầu trên thế giới Đối tượng mắc bệnh bao gồm nam giới, người già, trẻ em và đặc biệt là nữ giới: cứ 2 nữ thì có 1 người và cứ 20 nam thì có 1 người bị nhiễm khuẩn đường tiết niệu ít nhất một lần trong đời Tại Hoa Kỳ, nhiễm trùng đường tiết niệu là nguyên nhân khiến hàng triệu người phải đến khám tại các cơ sở y tế và hàng trăm ngàn

ca phải nhập viện mỗi năm, gây nhiều sự tốn kém về thời gian và chi phí Trong khi đó tại Việt Nam, theo Bộ Y tế, bệnh lý hệ tiết niệu đứng hàng thứ 05 trong mô hình bệnh tật tử vong; với tỷ lệ mắc bệnh là 8,42% dân số và tỷ lệ tử vong là 1,21% dân số [1]

Nhiễm khuẩn đường tiết niệu chỉ tình trạng nhiễm khuẩn của thận và đường tiết niệu Nguyên nhân của bệnh là do các vi khuẩn xâm nhập vào bàng quang và thận gây nhiễm khuẩn cho nước tiểu Bệnh có thể tái đi tái lại nhiều lần nếu không được chẩn đoán đúng và điều trị hiệu quả

Việc điều trị các bệnh nhiễm khuẩn nói chung và nhiễm khuẩn đường tiết niệu nói riêng dựa trên nguyên tắc chung là lựa chọn kháng sinh thích hợp; cùng với điều trị triệu chứng và điều trị hỗ trợ khác Tuy nhiên, ở nước ta, việc sử dụng kháng sinh còn rất nhiều bất cập Các cơ chế quản lý nhà nước về nhập khẩu, kiểm nghiệm, quản lý, phân phối, sử dụng chưa đồng bộ và chặt chẽ Đồng thời, trong một bộ phận cộng đồng, kháng sinh vẫn được sử dụng bừa bãi, không theo bất cứ chỉ định cụ thể nào của bác sĩ có chuyên môn Chưa kể kháng sinh còn có thể dễ dàng mua được ở bất cứ quầy thuốc tây nào trên thị trường Hậu quả của việc sử dụng kháng sinh không đúng của một bộ phận không nhỏ người dân là tình trạng đề kháng kháng sinh liên tục tăng sau mỗi năm

Hiện nay, tình đề kháng kháng sinh của các vi khuẩn nói chung và đặc biệt là trực khuẩn Gram âm sinh men β-lactamase phổ rộng (ESBL: Extended-Spectrum Beta-Lactamases) nói riêng được xem là vấn đề cấp thiết của ngành Y tế toàn cầu Các vi khuẩn Gram âm sinh được ESBL tức là có khả năng kháng lại rất nhiều kháng sinh, đặc biệt là có khả năng ly giải các cephalosporin phổ rộng và monobactam Việc này gây rất nhiều khó khăn trong việc lựa chọn kháng sinh trong quá trình điều trị Đặc biệt trong bệnh nhiễm khuẩn đường tiết niệu, khi mà trực khuẩn Gram âm sinh ESBL thường chiếm

tỷ lệ cao

chính thức nào đi sâu vào tình hình trực khuẩn Gram âm sinh ESBL trong bệnh nhiễm khuẩn đường tiết niệu; đồng thời, tình hình đề kháng kháng sinh của các vi khuẩn này luôn thay đổi sau mỗi năm Do đó, với mong muốn cập nhập thêm thông tin trong lĩnh vực này và tiếp tục phát triển chuyên đề thực tập của mình, tôi quyết định thực hiện đề tài: “Khảo sát tính đề kháng kháng sinh của trực khuẩn Gram âm sinh men β-lactamase phổ rộng ở bệnh nhân nhiễm khuẩn đường tiết niệu tại Bệnh viện nhân dân 115 từ tháng 11 năm 2013 đến tháng 05 năm 2014”

II MỤC TIÊU ĐỀ TÀI

- Xác định tỷ lệ trực khuẩn Gram âm sinh ESBL

- Xác định tỷ lệ loài vi khuẩn trong nhóm trực khuẩn Gram âm sinh ESBL

- Khảo sát đặc tính kháng thuốc của một số chủng này

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

I TỔNG QUAN HỆ TIẾT NIỆU[8, 17]

1 Cấu tạo hệ tiết niệu:

Hình 1.1: Sơ đồ cấu tạo hệ tiết niệu (Nguồn: Internet)

Về tổng quan, hệ tiết niệu của người được cấu tạo gồm: thận (thận trái và thận phải), đường dẫn niệu (niệu quản), bàng quang, niệu đạo và lỗ niệu đạo

1.1 Thận:

Ở cơ thể của một người bình thường, thận gồm hai quả: thận trái và thận phải nằm dọc theo hai bên cột sống, vào khoảng đốt sống thắt lưng số 1 và 3 Thận phải nằm sát xương sườn thứ 12 và hơi thấp hơn so với thận trái Mỗi quả thận có cân nặng khoảng 120g

(mặt trước lồi, mặt sau phẳng), hai bờ (bờ ngoài cong lồi, bờ trong ở giữa lõm sâu có rốn thận), hai đầu là hai cực (cực trên và cực dưới)

Cấu tạo giải phẫu của thận bao gồm: cấu tạo đại thể và cấu tạo vi thể

1.1.1 Cấu tạo đại thể:

Hình 1.2: Cấu tạo đại thể của thận (Nguồn: Internet)

- Xoang thận và bể thận:

Thận khi bổ đôi thấy có hai phần Ở giữa là xoang thận, bao quanh xoang thận là các khối nhu mô thận hình bán nguyệt (vỏ thận và tuỷ thận)

Xoang thận thông ra ngoài ở rốn thận thành xoang có nhiều chỗ lồi lõm Trong khi

đó, nhú thận (cao khoảng 4 – 10 mm) có các đầu nhú có nhiều lỗ của các ống sinh niệu đổ nước tiểu vào bể thận Chỗ lõm úp vào các nhú thận gọi là các đài nhỏ Các đài nhỏ, hợp lại thành hai đài lớn Các đài lớn hợp lại thành bể thận Bể thận thông với niệu quản

- Nhu mô thận:

Nhu mô thận gồm có hai vùng:

+ Vùng trung tâm (vùng tủy thận): màu đỏ sẫm, được cấu tạo gồm nhiều khối hình nón gọi là tháp thận hay tháp Malpighi

+ Vùng ngoại biên (vùng vỏ thận): là vùng có màu vàng đỏ nhạt, gồm có:

o Cột thận là phần nhu mô xen giữa các tháp thận gọi là cột Bertin

o Tiểu thùy vỏ là phần nhu mô từ đáy tháp thận tới bao sợi

- Mạc thận:

Thận và tuyến thượng thận cùng bên được bao bọc bởi một mạc gọi là mạc thận Mạc thận có một trẻ ngang ngăn cách giữa thận và tuyến thượng thận Mạc thận gồm hai lá: một lá trước, một lá sau

1.1.2 Cấu tạo vi thể của thận:

Nhu mô thận được cấu tạo chủ yếu bởi những đơn vị chức năng gọi là nephron Mỗi nephron gồm có:

- Tiểu thể thận gồm có một bao ở ngoài và bên trong là một cuốn mao mạch

- Hệ thống ống sinh niệu gồm: các tiểu quản lượn, ống lượn gần, quai Hèlle, ống lượn xa, các tiểu quản thẳng và ống thu nhập

Tiểu thể thận, ống lượn gần, ống lượn xa nằm trong phần lượn của vỏ thận Trong khi đó quai Helle, ống thẳng, ống thu nhập nằm trong phần tia của vỏ thận và tủy thận Mỗi phần của nephron có một vai trò riêng trong việc bài tiết và hấp thu nước và một số chất trong quá trình thành lập nước tiểu

1.2 Đường dẫn niệu (niệu quản):

Là một ống dẫn nước tiểu từ bể thận xuống bàng quang Có dạng hình trụ (hình ống), dài khoảng 12 cm Niệu quản nằm sau phúc mạc, dọc hai bên cột sống thắt lưng và

Cấu tạo thành bàng quang có ba lớp: niêm mạc, cơ trơn, thanh mạc Ở nam giới, xung quanh cổ bàng quang có thêm tuyến tiền liệt

1.4 Niệu đạo:

Niệu đạo là đoạn cuối của đường dẫn niệu đi từ bàng quang ra ngoài Niệu đạo nam

và nữ khác nhau:

- Ở nam: niệu đạo dài (18 - 20 cm), gấp khúc và còn là đường dẫn tinh

2 Tổng quan chức năng sinh lý hệ tiết niệu:

Chức năng sinh lý của hệ bài tiết gồm các chức năng chính:

- Lọc máu ở cầu thận

- Tái hấp thụ và bài tiết của ống thận

- Các hoạt động nội tiết của thận gồm: bài tiết các hormon, chịu các tác động của hormon, điều hoà và chuyển hoá

- Chức năng bài tiết nước tiểu

II NHIỄM KHUẨN ĐƯỜNG TIẾT NIỆU[1, 4, 7, 10, 13, 14, 15]

1 Khái niệm:

Nhiễm khuẩn đường tiết niệu là khái niệm chỉ sự hiện diện bất thường của vi khuẩn trong nước tiểu Bệnh nhiễm khuẩn đường tiết niệu là bệnh nhiễm khuẩn của thận và đường tiết niệu Bệnh nhân được kết luận nhiễm khuẩn đường tiết niệu khi lượng vi khuẩn lớn hơn 100 000 CFU/ml nước tiểu và viêm đường tiết niệu

2 Phân loại:

2.1 Phân loại theo tác nhân gây bệnh:

- Nhiễm khuẩn đường tiết niệu đặc hiệu: Do một số loại vi khuẩn đặc hiệu gây nên như vi khuẩn lao hoặc nấm (Actinomycosis)

- Nhiễm khuẩn tiết niệu không đặc hiệu: là nhiễm khuẩn thường gặp của đường tiết niệu do các loại trực khuẩn Gram âm hoặc cầu khuẩn Gram dương gây nên

2.2 Phân loại theo bệnh cảnh:

- Nhiễm khuẩn đường tiết niệu không triệu chứng: là nhiễm khuẩn đường tiết niệu không có những triệu chứng lâm sàng Niệu khoa Bệnh chỉ được phát hiện tình cờ khi bệnh nhân đi kiểm tra sức khoẻ hoặc trong các cuộc điều tra dịch tể học

- Viêm bàng quang: là bệnh do nhiễm khuẩn bàng quang

- Viêm bể thận - thận cấp: là bệnh do nhiễm khuẩn đường tiết niệu cấp tính, có tổn thương thận Đặc điểm lâm sàng của bệnh là có sự hiện diện của các dấu hiệu nhiễm khuẩn toàn thân

- Viêm bể thận - thận mạn: là bệnh do viêm bể thận và mô kẽ sau những giai đoạn nhiễm khuẩn đường niệu tái phát nhiều lần hay nhiễm khuẩn đường tiết niệu mạn tính với

xơ hoá mô kẽ, bể thận và tiểu ống thận

- Nhiễm khuẩn đường tiết niệu tái phát: là nhiễm khuẩn đường tiết niệu tái phát do cùng một loại vi khuẩn

- Nhiễm khuẩn đường tiết niệu tái nhiễm: là nhiễm trùng tái phát do các chủng vi khuẩn khác nhau

- Nhiễm khuẩn đường tiết niệu dưới: là nhiễm trùng nước tiểu trong bàng quang

- Nhiễm khuẩn đường tiết niệu trên: là sự hiện diện của các vi khuẩn trong nước tiểu

ở ngay bể thận

3 Nguyên nhân bệnh sinh:

Trong điều kiện bình thường, đường tiết niệu của con người vô khuẩn, ngoại trừ vị trí lỗ niệu đạo Tuy nhiên, nước tiểu có thể vô khuẩn hoặc chứa dưới 1000 vi khuẩn trong

1 ml nước tiểu Nhiễm khuẩn đường tiết niệu xảy ra khi vi khuẩn bằng một cách nào đó xâm nhập vào đường tiết niệu

3.2 Nhiễm khuẩn ngược dòng:

Đây là con đường xâm nhập thường gặp nhất của vi khuẩn vào đường tiết niệu Nhiễm khuẩn đường tiết niệu bởi nguyên nhân này là do các vi khuẩn đi ngược từ lỗ niệu đạo, theo niệu đạo vào bàng quang và lên đến thận

Tại lỗ niệu đạo thường không vô khuẩn và luôn bị xâm nhậm của các chủng vi khuẩn khác nhau Khi gặp các điều kiện thuận lợi chúng sẽ xâm nhập và gây nhiễm khuẩn đường tiết niệu

3.3 Nhiễm khuẩn theo đường máu:

So với nhiễm khuẩn ngược dòng, nhiễm khuẩn theo đường máu chiếm tỷ lệ ít hơn nhưng lại nguy hiểm hơn

Vì đảm nhận chức năng bài tiết nên lượng máu di chuyển qua thận tại bất cứ thời điểm nào đều rất lớn, chiếm đến ¼ lượng máu lưu thông trong tuần hoàn chung Do đó, khi có vi khuẩn xuất phát từ bất kì vị trí bị nhiễm khuẩn nào của cơ thể đều có khả năng dẫn đến nhiễm khuẩn thận

3.4 Nhiễm khuẩn theo các con đường khác:

Một số tài liệu còn ghi nhận các nguyên nhân gây nhiễm khuẩn đường tiết niệu khác: nhiễm khuẩn theo đường bạch huyết, nhiễm khuẩn trực tiếp từ các cơ quan lân cận Tuy nhiên các nguyên nhân này vẫn chưa có các nghiên cứu cụ thể

3.5 Các yếu tố thuận lợi gây nhiễm khuẩn đường tiết niệu:

3.5.1 Tắt nghẽn và ứ đọng nước tiểu:

Bình thường, hệ tiết niệu có sự đề kháng tự nhiên để chống lại sự xâm nhập của vi khuẩn Trong đó, việc bài tiết nước tiểu một cách tự nhiên ra khỏi cơ thể cũng là một cách giúp đào thải các vi khuẩn (nếu có) trong đường tiết niệu Tuy nhiên, do các dị tật bẩm sinh (hẹp bao quy đầu, van niệu đạo sau, niệu quản lạc chỗ,…) hay do bệnh lý (hẹp niệu đạo, khối u đường tiết niệu, sỏi tiết niệu,…) khiến nước tiểu bị tắt nghẽn, ứ đọng Điều này tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn phát triển gây nhiễm khuẩn đường tiết niệu 3.5.2 Trào ngược dòng bàng quang – niệu quản:

Như đã nói ở trên, việc trào ngược dòng bàng quang – niệu quản khiến cho vi khuẩn (nếu có) trong nước tiểu bị ứ đọng và phát triển gây nhiễm khuẩn đường tiết niệu

3.5.3 Các thủ thuật Niệu khoa:

Các thủ thuật Niệu khoa (nong niệu đạo, soi bàng quang, thông tiểu,…) là những nguyên nhân chính của nhiễm trùng niệu Việc sử dụng các thủ thuật này lâu ngày gây nguy cơ nhiễm khuẩn đường tiết niệu cao Sự thâm nhập của vi khuẩn hoặc do các thủ thuật này đã đưa trực tiếp vi khuẩn từ niệu đạo vào bàng quang hoặc do vi khuẩn di chuyển theo các dụng cụ dùng trong thủ thuật đi vào bàng quang

3.5.4 Sự giảm sức đề kháng của cơ thể:

Sự giảm sức đề kháng, suy giảm miễn dịch tự nhiên hay mắc phải cũng là điều kiện thuận lợi để gây nên bệnh nhiễm khuẩn đường tiết niệu nói riêng và các bệnh nhiễm khuẩn khác nói chung

4 Chẩn đoán:

4.1 Chẩn đoán lâm sàng:

Việc chẩn đoán lâm sàng bệnh nhiễm khuẩn đường tiết niệu được thực hiện dựa trên các triệu chứng lâm sàng của bệnh Tuy nhiên, nhiễm khuẩn có thể xảy ra ở bất kì vị trí nào của đường tiết niệu, do đó các triệu chứng lâm sàng cũng rất đa dạng Bệnh nhân có thể có triệu chứng (thể điển hình) hoặc không triệu chứng (thể không điển hình)

4.1.1 Thể điển hình:

- Dấu hiệu tại chỗ: Bệnh có một số dấu hiệu điển hình giúp định hướng và chẩn đoán bệnh bao gồm: viêm bàng quang, tiểu đục, tiểu khó, tiểu có máu, nước tiểu có mùi hôi, khó chịu vùng hạ vị có thể kèm theo co thắt bàng quang

- Dấu hiệu tại chỗ và toàn thân: Bệnh nhân bị sốt không rõ nguyên nhân, lạnh run Việc tiến hành các thử nghiệm một cách có hệ thống: sinh hoá, miễn dịch, tế bào, vi khuẩn là cần thiết trong trường hợp này

4.1.2 Thể không điển hình:

Bệnh nhân không có triệu chứng rõ ràng Bệnh diễn biến âm thầm trong một thời gian dài và thường lành tính Tuy nhiên một số trường hợp có thể xảy ra những biến chứng nghiêm trọng hơn: viêm bể thận cấp, viêm tiền liệt tuyến cấp Bệnh chỉ được phát hiện một cách tình cờ, do đó việc theo dõi vi khuẩn học một cách có hệ thống sẽ giúp phát hiện bệnh sớm, kể cả khi chưa xuất hiện các triệu chứng

Bên cạnh các triêu chứng lâm sàng, việc khám lâm sàng để phát hiện các triệu chứng này là cần thiết Việc điều tra bệnh sử của bệnh nhân cũng như thăm khám cũng là một điều kiện để xác định bệnh

4.2 Chẩn đoán cận lâm sàng:

Việc chẩn đoán lâm sàng thực tế khó xác định chính xác bệnh nhân có bị nhiễm khuẩn đường tiết niệu hay không; bởi vì các triệu chứng lâm sàng nhất là trong giai đoạn đầu của bệnh hoặc ở thể không điển hình thường không rõ ràng, một số triệu chứng có thể trùng lặp với các bệnh lý khác Do đó, việc kết hợp giữa chẩn đoán lâm sàng và cận lâm sàng sẽ giúp xác định và phân biệt được nhiễm khuẩn đường tiết niệu

Các chẩn đoán cận lâm sàng bao gồm: xét nghiệm nước tiểu (bao gồm cấy nước tiểu), xét nghiệm máu, chẩn đoán hình ảnh Trong phạm vi nghiên cứu này chỉ tập trung

đi sâu vào khía cạnh cấy nước tiểu trong các chẩn đoán cận lâm sàng

4.2.1 Xét nghiệm nước tiểu:

Gồm các thông số xét nghiệm sau:

- Xét nghiệm protein niệu

- Xét nghiệm cặn lắng nước tiểu

- Cấy nước tiểu

- Các xét nghiệm khác

4.2.2 Cấy nước tiểu:

Cấy nước tiểu là thuật ngữ chỉ việc nuôi cấy vi khuẩn có trong nước tiểu Cấy nước tiểu được bác sĩ lâm sàng chỉ định cho các trường hợp nghi ngờ nhiễm khuẩn đường tiết niệu có hoặc không có triệu chứng Bệnh nhân được kết luận nhiễm khuẩn đường tiết niệu khi lượng vi khuẩn trong nước tiểu khi lượng vi khuẩn lớn hơn 100 000 CFU/ml nước tiểu Cấy nước tiểu mang ý nghĩa rất quan trọng trong chẩn đoán nhiễm khuẩn đường tiết niệu, là một trong hai điều kiện tiên quyết để kết luận nhiễm khuẩn đường tiết niệu

4.2.3 Xét nghiệm máu:

Khi xét nghiệm máu, các thông số cần quan tâm:

- Bạch cầu tăng, nhất là bạch cầu đa nhân trung tính

- Tốc độ lắng máu cao

- C Reactive Protein tăng

- Định lượng ure, creatinin máu để đánh giá chức năng thận

4.2.4 Chẩn đoán hình ảnh:

Chẩn đoán hình ảnh bao gồm X quang, siêu âm,… các kỹ thuật này có vai trò trong việc phát hiện các dị vật đường tiết niệu, các khối u, giúp phát hiện tình trạng tắc nghẽn đường tiết niệu, hiện tượng trào ngược bàng quang – niệu quản, là các yếu tố thuận lợi cho nhiễm khuẩn đường tiết niệu

II TRỰC KHUẨN GRAM ÂM SINH MEN β-LACTAMASE PHỔ RỘNG [3, 4, 5, 6, 12]

1 Lịch sử:

Sự đề kháng các kháng sinh nhóm β-lactam đã được phát hiện từ rất sớm, ngay trước cả khi penicillin được sử dụng trong ngành Y tế Trong suốt kỷ nguyên của penicillin đã chứng kiến sự gia tăng nhanh chóng của các chủng Staphylococcus aureus sinh men β-lactamase kháng thuốc, và sau đó là hầu hết các chủng tụ cầu khác

Dưới áp lực của chọn lọc tự nhiên, nhiều vi khuẩn Gram âm đã có khả năng sinh men β-lactamase Vi khuẩn Gram âm sinh men β-lactamase đầu tiên, Escherichia coli, được phát hiện tại Hy Lạp, vào những năm 1960, trong một ca cấy máu Chỉ vài năm sau

đó, khả năng sinh men β-lactamase của vi khuẩn Gram âm đã lan rộng khắp thế giới và cho đến nay đã được tìm thấy ở nhiều vi khuẩn khác nhau: Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae và Neisseria gonorrhoeae

Năm 1983, tại Đức, trực khuẩn Gram âm, Klebsiella ozaenae, sinh men β-lactamase phổ rộng (ESBL) đầu tiên được phát hiện Hiện trên thế giới đã phát hiện và mô tả được hơn 150 ESBL khác nhau Các trực khuẩn Gram âm sinh ESBL có thể mắc do lây truyền

từ người này sang người khác hoặc do được chọn lọc qua việc dùng kháng sinh Khi các

vi khuẩn đã sinh được ESBL đồng nghĩa với việc chúng có khả năng kháng lại rất nhiều kháng sinh khác nhau, đặc biệt là nhóm cephaslosporin Đây thực sự là gánh nặng trong việc điều trị nhiễm khuẩn nói chung và nhiễm khuẩn đường tiết niệu do trực khuẩn Gram

âm nói riêng

2 Trực khuẩn Gram âm:

Trực khuẩn Gram âm là các vi khuẩn có dạng hình que (trực) và không giữ được màu tím tinh thể (crystal violet) trong phương pháp nhuộm Gram

Các trực khuẩn Gram âm gồm hai nhóm lớn chủ yếu: Enterobacteriaceae (Họ vi khuẩn đường ruột) và Non-Enterobacteriaceae

- Hiếu khí hay kỵ khí tuỳ nghi

- Mọc dễ trên các môi trường thông thường

- Lên men đường glucose

- Có sinh hơi hoặc không sinh hơi

- Khử nitrate thành nitrite

- Oxidase âm

Đặc điểm hình thể của Enterobacteriaceae là các trực khuẩn Gram âm thường xếp rải rác hay đứng thành từng đôi, có kích thước trung bình khoảng 1-1,5 x 2-6µm Không sinh bào tử, một số di động được nhờ các chiên mao, một số khác thì không

Hình 1.3: Mô phỏng Enterobacteriaceae và hình ảnh nhuộm Gram của E.coli

(Nguồn: Internet) Enterobacteriaceae có thể tăng trưởng trên các môi trường nuôi cấy thông thường như BA và MC

- Trên môi trường BA: Các khuẩn lạc mọc tương đối lớn, bóng xám, có thể có tiêu huyết hoặc không Các loại sinh H2S cho màu xanh lá cây đặc trưng quanh khuẩn lạc dưới mặt thạch

- Môi trường MC: Nếu vi khuẩn lên men được đường lactose, khúm khuẩn sẽ có màu từ hồng đến đỏ Ngược lại, nếu không lên men được lactose vi khuẩn sẽ không màu 2.2 Non-Enterobacteriaceae:

Non-Enterobacteriaceae có đặc điểm chung là không lên men được đường glucose Một số chủng thường gặp như:

- Pseudomonas aeruginosa: là tác nhân gây bệnh nhiểm khuẩn tai, mắt, vết thương, vết bỏng, đường tiểu và đường hô hấp Đôi khi cũng gây nhiễm trùng huyết và viêm màng não Pseudomonas aeruginosa có khả năng di động, không sinh bào tử Thường đứng một mình hay thành đôi hoặc xếp thành chuỗi ngắn Là một vi khuẩn hiếu khí tuyệt đối và có khả năng phát triển tốt trên các môi trường thông thường, có khả năng sinh sắc tố làm môi trường có màu xanh lục hay nâu Lứa cấy toả mùi thơm nhẹ

- Acinetobacte spp.: là vi khuẩn thường trú trong đường hô hấp, gây nhiễm khuẩn đường hô hấp và đôi khi có thể nhiễm trùng huyết Acinetobacte spp là trực khuẩn Gram, hiếu khí, dễ mọc trên các môi trường phân lập thông thường, không lên men hầu hết các loại đường và thử nghiệm sinh hoá hầu hết là âm tính

- Cấu trúc các kháng sinh nhóm β-lactam: Cấu trúc phân tử của các kháng sinh nhóm β-lactam đều mang vòng β-lactam Trong không gian, vòng β-lactam có cấu trúc hoá học gồm bốn cạnh do 3 nguyên tử C liên kết với 1 nguyên tử N tạo thành

Hình 1.4: Sơ đồ mô phỏng cấu trúc vòng β-lactam[3]

- Cơ chế tác dụng của kháng sinh nhóm β-lactam[3, 4]: Các kháng sinh thuộc nhóm β-lactam là các kháng sinh ức chế tổng hợp vách tế bào của vi khuẩn

Vách tế bào có nhiệm vụ giữ hình dạng tế bào được nguyên vẹn trước áp lực thẩm thấu cao ở bên trong tế bào và bảo vệ vi khuẩn trước những tác động có hại Sự bề vững của vách tế bào vi khuẩn có được là nhờ các thành phần quan trong như: mucopeptide, peptidoglycan, murein

Do tác dụng của kháng sinh, tổng hợp vách bị ức chế khiến vi khuẩn Gram dương biến thành hình dạng cầu không có vách; trong khi đó, vi khuẩn Gram âm lại có vách không hoàn chỉnh Kết quả tế bào vi khuẩn bị vỡ ở môi trường có trương lực bình thường

sử dụng kháng sinh nhóm β-lactam, các thuốc này gắn vào các thụ thể PBP (Penicillin binding protein) của tế bào và làm ức chế enzyme transpeptidase khiến vi khuẩn không thể tổng hợp được peptidoglycan Mỗi thụ thể khác nhau sẽ có ái lực với một loại thuốc khác nhau, do đó tác dụng của mỗi loại thuốc là khác nhau Đồng thời, các enzyme tự tiêu của tế bào vi khuẩn cũng được kích hoạt, làm tế bào bị ly giải ở môi trường đẳng trương

- Phân loại kháng sinh nhóm β-lactam[3]: Gồm hai phân nhóm penicillins và cephalosporins

Hình 1.5: Cấu trúc của một số kháng sinh nhóm β-lactam[3] 3.2 Men β-lactamase phổ rộng[3, 6, 12]:

β-sinh khác tạo nên sự đồng kháng Điều này khiến cho các vi khuẩn β-sinh ESBL có khả năng kháng rất nhiều kháng sinh

Hầu hết các ESBL đều là biến thể của TEM (Temoniera – tên của bệnh nhân mang chủng E coli sinh men β-lactamase đầu tiên được phát hiện) và SHV (sulphydryl variable – dùng để chỉ sự thay đổi gốc sulphydryl) Người ta thống kê có hơn 100 biến thể men β-lactamase loại TEM, hơn 50 biến thể loại SHV Cả hai nhóm này đều có một vài đột biến điểm chọn lọc trong trình tự gene giúp chúng xuất hiện các kiểu hình có phổ hoạt động rộng ESBL loại TEM và SHV thường được tìm thấy ở E coli và K pneumoniae, ngoài ra một số ít được tìm thấy ở Proteus spp., Providencia spp và một số chi Enterobacteria-ceae khác Bên cạnh hai nhóm chính kể trên, những năm gần đây người ta còn tìm được một loại ESBL mới và kí hiệu là CTX-M (đặc trưng nhóm này là ưu tiên thuỷ phân cefotaxime) với khoảng 40 biến thể Ngoài ra còn một số loại ESBL khác nhưng số lượng biến thể rất ít và không đáng kể: VEB, PER, OXA,…

Tuỳ vào mỗi biến thể ESBL khác nhau mà khả năng kháng các loại kháng sinh cũng khác nhau Với TEM-3 và hầu hết các SHV đều có hoạt lực mạnh chống lại cefotaxime và ceftazidime Trong khi biến thể TEM-10, TEM-26 lại ít có hoạt lực chống lại cefotaxime

và ceftriaxone thì đa số CTX-M đều có hoạt lực mạnh với hai kháng sinh này

3.2.3 Các dạng của ESBL[12]:

- TEM: Đây là dạng phổ biến nhất ở các vi khuẩn Gram âm Theo thống kê, 90% đột biến kháng ampicillin ở E coli là do TEM-1 Ngoài ra, men này còn giúp kháng ampicillin và penicillin ở chủng H Influenzae và N Gonorrhoeae Các TEM-1 có khả năng thủy phân penicillin và cephalosporin thế hệ đầu như cephalothin và cephaloridine Các biến thể TEM-2 hay TEM-3 được phát sinh từ TEM-1, với TEM-3 (được báo cáo lần đầu năm 1989) là dạng men β-lactamase đầu tiên thể hiện kiểu hình ESBL Kể từ đó, đã

có khoảng hơn 90 biến thể của TEM được mô tả và bổ sung Phần lớn chúng là các ESBL

- SHV: Dạng men SHV-1 được tìm thấy nhiều nhất ở K pneumoniae Trong nhiều chủng K Pneumoniae, gene mã hoá SHV-1 được tích hợp vào trong nhiễm sắc thể của vi khuẩn Không giống như TEM, có rất ít các biến thể của SHV-1 Nguyên nhân là những thay đổi để phát sinh các biến thể này xảy ra ở ít vị trí hơn trong cấu trúc gene mã hoá cho SHV Đa số các biến thể của SHV đều sở hữu một cấu hình ESBL được đặc trưng cho sự thay thế một serine cho glycine tại vị trí 238 Các dư lượng serine ở vị trí 238 này rất quan trọng cho quá trình thủy phân hiệu quả ceftazidime, và dư lượng lysine là rất quan trọng cho thủy phân hiệu quả cefotaxime Cho đến nay hầu hết các biến thể của SHV đều có

cấu hình ESBL Phần lớn các ESBL dạng SHV được tìm thấy trong các chủng K pneumoniae Tuy nhiên, các enzym này cũng được tìm thấy trong Citrobacter diversus, E coli, và P aeruginosa

- CTX-M: Là một dạng ESBL được phát hiện trong những năm gần đây Dạng này

ưu tiên thuỷ phân cefotaxime khi có mặt chúng CTX-M được thấy ở các chủng Salmonella và E coli, nhưng cũng đã được được mô tả trong các loài Enterobacteriaceae khác Các CTX-M này không có mối liên hệ chặt chẽ với các dạng TEM hoặc SHV Nghiên cứu về động học đã chỉ ra rằng CTX-M thủy phân cephalothin hoặc cephaloridine tốt hơn so với benzylpenicillin và chúng ưu tiên thủy phân cefotaxime hơn ceftazidime Bên cạnh đó, các CTX-M còn dễ bị ức chế bởi tazobactam hơn bởi sulbactam và clavulanic acid

- OXA: Các OXA có khả năng kháng ampicillin và cephalothin và được đặc trưng bởi hoạt động thủy phân cao đối với oxacillin và cloxacillin và thực tế là chúng ít bị ức chế bởi clavulanic acid Các OXA nguyên thuỷ được tạo ra như là một dạng nhóm kiểu hình hơn là một nhóm kiểu gene, do đó mức độ tương đồng về trình tự gene của chúng ở mức thấp, chỉ đạt 20%

- Các dạng khác: Phần lớn các ESBL có nguồn gốc từ TEM hoặc SHV, tuy nhiên các công bố gần đây còn ghi nhận được một số dạng khác của men ESBL không có mối liên hệ chặc chẽ nào với các dạng trên Một trong số đó là PER-1, phát hiện được trong chủng P aeruginosa phân lập từ các bệnh nhân tại Thổ Nhĩ Kỳ Đến nay, PER-1 là dạng phổ biến rộng rãi trên khắp Thổ Nhĩ Kỳ và được tìm thấy trong 60% các chủng chống ceftazidime của A baumanii

Một dạng ESBL khác có liên quan đến PER-1 là VEB-1 Dạng này lần đầu tiên được tìm thấy trong một mẫu phân lập duy nhất của E coli từ một bệnh nhân tại Việt Nam Nhưng sau đó nó cũng đã được tìm thấy trong chủng P aeruginosa được phân lập

từ một bệnh nhân ở Thái Lan

Một số dạng khác cũng có mối liên hệ với PER-1, VEB-1 gồm CME-1, TLA-1 Bốn dạng này có mối liên hệ, tuy nhiên mức độ tương đồng chỉ đạt khoảng 40-50 % Tất cả các men này đều kháng oxyimino-cephalosporin, đặc biệt là ceftazidime, và aztreonam Ngoài ra có một số nhóm chiếm thiểu số khác như: SFO-1, GES-1, IMP-1, ACT-1, TOHO-1

Hình 1.6: Sơ đồ mô tả một số đột biến của TEM và SHV theo nghiên cứu của Patricia A

Bradford và cộng sự[12]

Hình 1.7: Cây phát sinh loài các dạng ESBL theo nghiên cứu của Patricia A Bradford

và cộng sự [12] 3.2.4 Cơ chế đề kháng kháng sinh nhóm β-lactam của trực khuẩn Gram âm sinh ESBL[3]:

Các trực khuẩn Gram âm đề kháng kháng sinh bằng cách sinh ESBL sẽ khiến vòng β-lactam bị phá huỷ Các kháng sinh này sẽ bị phân giải thành pencillinonic acid và cephalosporic acid không còn hoạt tính kháng khuẩn

4 Yếu tố nguy cơ nhiễm trực khuẩn Gram âm sinh ESBL ở bệnh nhân nhiễm khuẩn đường tiết niệu:

Như đã trình ở các phần, tỷ lệ trực khuẩn Gram âm trong nhiễm khuẩn đường tiết niệu là rất cao, trong đó E coli chiếm đến hơn 75% Các vi khuẩn này có thể nhiễm từ người này sang người khác hoặc do chọn lọc tự nhiên trong quá trình điều trị kháng sinh Bệnh nhân nhiễm khuẩn đường tiết niệu có nguy cơ cao bị nhiễm các chủng sinh ESBL là các bệnh nhân điều trị nội trú, đặc biệt là các bệnh nhân sử dụng các thủ thuật Niệu khoa: nong niệu đạo, soi bàng quang, thông tiểu Bên cạnh đó, với tình trạng sử dụng kháng sinh bừa bãi như hiện nay, các bệnh nhân đã sử dụng hầu hết các kháng sinh, nhất là kháng sinh nhóm cephalosporin thế hệ thứ ba có nguy cơ nhiễm ESBL cao Một yếu tố khác cũng dáng quan tâm là đối với các bệnh nhân bị suy giảm sức đề kháng vì một lý do nào đó, các bệnh nhân bị bội nhiễm, bệnh nhân nhiễm trùng huyết cũng đều có nguy cơ nhiễm trực khuẩn Gram âm sinh ESBL

5 Phòng chống và điều trị:

Việc điều trị các bệnh nhiễm khuẩn nói chung và nhiễm khuẩn đường tiết niệu do trực khuẩn Gram âm sinh ESBL nói riêng đều dựa trên nguyên tắc lựa chọn kháng sinh phù hợp, kết hợp với điều trị triệu chứng và điều trị bổ trợ khác Tuy nhiên, vấn đề này trở nên nan giải khi lượng kháng sinh trong trường hợp này bị kháng rất nhiều, bao gồm nhóm cephalosporin cũng như monobactams; chưa kể trong trường hợp nếu xảy ra đồng kháng sẽ có thêm các aminoglycoside, sulfamethoxazol-trimethoprim Việc lập kháng sinh đồ, lựa chọn kháng sinh, xây dựng phác đồ điều trị với các chủng này là hết sức cần thiết

Song song với đó, bệnh nhân cũng có thể áp dụng các biện pháp bổ trợ như uống nhiều nước để tăng cường đào thải các vi khuẩn này qua đường tiểu, acid hoá nước tiểu

để ức chế các vi khuẩn,…

Tuy nhiên, biện pháp tối ưu nhất vẫn là phòng ngừa bệnh Một lối sống khoa học, cân bằng, hợp lý và vệ sinh sẽ giúp giảm các nguy cơ bị mắc bệnh Xây dựng thói quen sử dụng kháng sinh theo chỉ định, khám sức khoẻ định kỳ,…nhằm phòng bệnh hiệu quả

PHƯƠNG TIỆN

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

PHẦN II: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

I PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU

1 Địa điểm và thời gian tiến hành thí nghiệm:

1.1 Địa điểm:

Đơn vị Vi sinh – Sinh học phân tử, Khoa Xét nghiệm, Bệnh viện nhân dân 115

527 Sư Vạn Hạnh nối dài, Phường 12, Quận 10, Thành phố Hồ Chí Minh

1.2 Thời gian:

Từ tháng 11 năm 2013 đến tháng 05 năm 2014 (06 tháng)

2 Thiết bị và dụng cụ:

2.1 Thiết bị:

- Tủ an toàn sinh học cấp 2 Airstream của ESCO

- Đèn Bunsen của Electrothermal

- Tủ ấm nuôi cấy vi khuẩn INCUCELL 222 của MMM Group

- Kính hiển vi CX21 của Olympus

- Bồn nhuộm Gram

Hình 2.1: Tủ an toàn sinh học cấp 2 Airstream của ESCO

và kính hiển vi CX21 của Olympus (Nguồn: Internet)

Hình 2.2:Tủ ấm nuôi cấy vi khuẩn INCUCELL 222 của MMM Group (Nguồn:Internet) và đèn Bunsen của Electrothermal

3.1.1 Dung dịch Tím kết tinh (Crystal violet):

- 2 g tím kết tinh hoà tan trong 20 ml etanol 95 %

- 0,8 g ammon oxalate hoà tan trong 80 ml nước cất

Trộn hai dịch nói trên lại với nhau, giữ 48 giờ rồi lọc Bảo quản trong lọ tối, sử dụng vài tháng

3.1.4 Safranin:

Chuẩn bị sẵn dung dịch Safranin O 2,5 %, trước khi dùng pha với nước cất theo tỷ lệ 1:5 để có dung dịch 0,5 %

3.2 Môi trường thạch máu (Blood Agar – BA):

Môi trường do Công ty TNHH Nam Khoa sản xuất và cung cấp

Công thức môi trường*:

Máu thỏ hoặc máu cừu……… 50 ml (Máu 5%)

*Theo Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương 3.3 Môi trường MacConkey (MC):

Môi trường do Công ty TNHH Nam Khoa sản xuất và cung cấp

Công thức môi trường*:

Thạch MacConkey……… 50g

*Theo Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương 3.4 Môi trường thạch Mueller-Hinton (MHA):

Môi trường do Công ty TNHH Nam Khoa sản xuất và cung cấp

Công thức môi trường*:

Hình 2.3: Môi trường BA, MC và MHA

3.5 Bộ KIT định danh vi khuẩn API(Analytical Profile Index)10S [16]:

- ONPG: Kiểm tra sự hiện diện của enzyme β-galactosidase

- GLU: Kiểm tra khả năng lên men đường glucose

- LDC: Kiểm tra phản ứng decarboxylation của các amino acid lysine bởi lysine decarboxylase

- ODC: Kiểm tra phản ứng decarboxylation của các amino acid ornithine bởi ornithine decarboxylase

- CIT: Kiểm tra khả năng sử dụng citrate như là nguồn carbon duy nhất

- H2S: Kiểm tra khả năng sinh hydrogen sulfide

- URE: Kiểm tra khả năng sinh enzyme urease

- TDA: Phát hiện sự hiện diện của enzyme tryptophan deaminase

- IND: Kiểm tra khả năng sinh indol từ tryptophan nhờ enzyme tryptophanase Ngoài ra, kiểm tra sự hiện diện của cytochrome oxidase được thực hiện bằng một phản ứng riêng biệt và không có trên khay của bộ KIT API 10S

3.6 Kháng sinh:

Kháng sinh sử đụng trong nghiên cứu này được trình bày ở “Danh mục từ viết tắt”

4 Nguyên liệu:

4.1 Mẫu nước tiểu:

Mẫu nước tiểu dùng trong nghiên cứu này là mẫu lấy từ bệnh nhân có chẩn đoán nhiễm khuẩn đường tiết niệu, được chỉ định cấy nước tiểu và thực hiện kháng sinh đồ từ tháng 11 năm 2013 đến tháng 05 năm 2014

Mẫu được lấy tại Bệnh viện nhân dân 115

4.2 Trực khuẩn Gram âm:

Kết quả khảo sát, nuôi cấy, phân lập và định danh từ các mẫu nước tiểu nói trên là trực khuẩn Gram âm

Toàn bộ quy trình được thực hiện tại Đơn vị Vi sinh – Sinh học phân tử, Khoa Xét nghiệm, Bệnh viện nhân dân 115

II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU [4, 11,16]

1 Phương pháp lấy mẫu nước tiểu[4]:

Mẫu nước tiểu được lấy khi có chỉ định cấy nước tiểu của bác sĩ lâm sàng Các thao tác lấy nước tiểu do người được phân công lấy hoặc do bệnh nhân tự lấy theo hướng dẫn