Bước đầu xây dựng quy trình phát hiện đồng thời các tác nhân vi khuẩn từ các mẫu bệnh phẩm gây bệnh cho con người bằng phương pháp PCR kết hợp Reverse Dot Lot

Sinh viên Nguy n Tr ng Ngh... Nguy n Tr ng Nghĩa iii... Hình thái t bào Staphylococcus aureus[76] ..... Staphylococcus aureus .... Vibrio cholerae ..... Các gen trên plasmid này mã hóa c

PHÁP PCR K T H P REVERSE DOT LOT

KHOA CÔNG NGH SINH H C

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH - SHPT

MSSV : 1053010486 Khóa : 2010 ậ 2014

Tp H Chí Minh, tháng 5 n m 2014

Nguy n Tr ng Nghĩa i

L I C M N

Em xin chân thành c m n Quý Th y Cô Khoa Công ngh Sinh H c tr ng

i h c M TP.HCM đƣ t n tình d y b o em trong nh ng n m v a qua, truy n đ t

nh ng ki n th c quý báu đ lƠm hƠnh tr ng cho em b c vƠo đ i

Em kính g i l i c m n chơn thƠnh đ n Cô Lê Huy n i Th y đƣ t n tình c

v n, truy n đ t cho em nh ng ki n th c chuyên môn b ích

Em xin chân thành c m n Th y L o c Thu n đƣ t o đi u ki n cho em

đ c th c hi n đ tài khóa lu n t t nghi p t i ph ng th nghi m Sinh H c Phơn T

c bi t em xin chơn thƠnh bƠy t l ng bi t n sơu s c c m nh t i c

Tr ng Kim Ph ng ng i đƣ ch r h ng nghi n c u h ng d n t n t nh đ ng

vi n vƠ gi p đ t ng b c đi c em trong quá tr nh th c hi n đ tài khóa lu n t t nghi p

Em xin chơn thƠnh c m n C ng Ty C Ph n C ng Ngh Vi t đƣ h ch ng

vi khu n c ng nh lƠ b h ch t th nghi m gi p em hoƠn thƠnh đ tƠi kh lu n

t t nghi p

Em xin chơn thƠnh c m n nh C o B o Hi n đƣ t n t nh h tr chuy n gi o

k thu t gi p đ em trong quá tr nh th c hi n đ tƠi kh lu n t t nghi p

Nhơn d p nƠy em c ng xin bƠy t t m l ng c m nh đ i v i các anh ch , các

b n vƠ các em trong ph ng th nghi m Sinh H c Phơn T đƣ nhi t t nh gi p đ em

th c hi n đ tài khóa lu n t t nghi p này

Cu i cùng em xin g i l i bi t n sơu s c c m nh đ n gi đ nh ng i thơn đƣ

ng h đ ng vi n em r t nhi u trong quá tr nh th c hi n đ tài khóa lu n t t nghi p

Sinh viên

Nguy n Tr ng Ngh

Nguy n Tr ng Nghĩa ii

DANH M C CH VI T T T

Nguy n Tr ng Nghĩa iii

Nguy n Tr ng Nghĩa iv

DANH M C B NG BI U

B ng I.1 B ng th nghi m sinh hóa phân bi t nhóm vi khu n gây b nh đ ng

ru t[25] 14

B ng II.1 Thành ph n ph n ng PCR v i c p m i 16S F – 16S_R 28

B ng II.2 Chu k nhi t cho ph n ng PCR v i c p m i 16S_F – 16S_R 29

B ng II.3 Thành ph n ph n ng PCR v i c p m i 23S_F – 23S_R 29

B ng II.4 Chu k nhi t cho ph n ng PCR v i c p m i βγS F – 23S_R 29

B ng III.1 Các vùng gen s d ng trong phát hi n vi sinh v t gây b nh 33

B ng III.2 Các k thu t sinh h c phân t s d ng trong xác đ nh nhanh các vi khu n gây b nh 34

B ng III.3 Các c p m i s d ng trong nghiên c u 35

B ng III.4 Các m u dò s d ng trong nghiên c u m u dò 36

B ng III.5 B ng thông s v t lí c a m i d a vào phân tích IDT 44

B ng III.6 B ng ch s OD c a 5 m u DNA tách chi t t vi khu n đ i ch ng s d ng trong nghi n c u 57

B ng III.7 Ch s OD c a 15 m u DNA tách chi t s d ng trong nghi n c u 57

B ng III.8 V trí ch m m u dò trên màng lai 62

B ng III.9 Thông tin m u b nh ph m s d ng trong nghiên c u 82

B ng III.10 K t qu c y trang (s khu n l c) và m t đ t bào CFU/ml 83

Nguy n Tr ng Nghĩa v

DANH M C HỊNH V

Hình I.1 Hình thái t bào E.coli[75] 3

Hình I.2 Hình thái t bào Staphylococcus aureus[76] 5

Hình I.3 Hình thái t bào Salmonella[77] 6

Hình I.4 Hình thái t bào Shigella[78] 7

Hình I.5 Hình thái t bào Vibrio cholera[79] 8

Hình I.6 Hình thái t bào Y enterocolitica[80] 9

H nh I.7 Các b c trong m t chu k PCR.[81 16

Hình I.8 Minh h ph ng pháp RDB[81 22

Hình III.1 K t qu BLAST m i 16S_F 38

Hình III.2 K t qu BLAST m i 16S_R 39

Hình III.3 K t qu kh o sát kh n ng b t c p c a c p m i 16S_F – 16S_R b ng công c Annhyb 40

Hình III.4 K t qu BLAST m i 23S_F 41

Hình III.5 K t qu BLAST m i 23S_R 42

Hình III.6 K t qu kh o sát kh n ng b t c p c a c p m i 23S_F – 23S_R b ng công c Annhyb 43

Hình III.7 K t qu BLAST m u dò SAL 45

Hình III.8 K t qu kh o sát kh n ng b t c p c a m u dò SAL b ng công c Annhyb 46

Hình III.9 K t qu BLAST m u dò SHI 47

Hình III.10 K t qu kh o sát kh n ng b t c p c a m u dò SHI b ng công c Annhyb 48

Hình III.11 K t qu BLAST m u dò SAU 49

Hình III.12 K t qu kh o sát kh n ng b t c p c a m u dò SAU b ng công c Annhyb 50

Hình III.13 K t qu BLAST m u dò VCH 51

Hình III.14 K t qu kh o sát kh n ng b t c p c a m u dò VCH b ng công c Annhyb 52

Nguy n Tr ng Nghĩa vi

Hình III.15 K t qu BLAST m u dò YER 53Hình III.16 K t qu kh o sát kh n ng b t c p c a m u dò YER b ng công c Annhyb 54Hình III.17 K t qu BLAST m u dò ECO 55Hình III.18 K t qu kh o sát kh n ng b t c p c a m u dò ECO b ng công c Annhyb 56Hình III.19 K t qu đi n di kh o sát nhi t đ lai c a c p m i 16S_F – 16S_R 58Hình III.20 K t qu đi n di s n ph m PCR các m u vi khu n đ i di n v i c p m i 16S rDNA 60Hình III.21 K t qu đi n di s n ph m PCR c a ch ng E coli v i c p m i 23S rDNA 61Hình III.22 K t qu ph n ng lai RDB trên ch ng chu n Staphylococcus aureus 62Hình III.23 K t qu lai RDB trên ch ng chu n Yersinia enterocolitica 63Hình III.24 K t qu lai RDB trên ch ng chu n Salmonella spp và Shigella spp 63Hình III.25 K t qu đi n di s n ph m PCR các m u b nh ph m đ i di n v i c p

m i 16S_F – 16S_R 66Hình III.26 K t qu ph n ng lai RDB trên m u b nh ph m s 3 66Hình III.27 K t qu đi n di s n ph m PCR các m u b nh ph m đ i di n v i c p

m i 23S_F – 23S_R 67Hình III.28 K t qu minh h ng ng phát hi n vi khu n c a ph n ng RDB trên

m u b nh ph m nhi m Staphylococcus aureus 69Hình III.29 K t qu đi n di s n ph m PCR các m u h n h p 3 loài vi khu n khác nhau 70Hình III.30 K t qu lai RDB trên m u h n h p 3 loài vi khu n khác nhau 70

Nguy n Tr ng Nghĩa vii

M C L C

L I C M N i

DANH M C CH VI T T T ii

DANH M C B NG BI U iv

DANH M C HÌNH V v

M C L C vii

T V N 1

PH N I T NG QUAN TÀI LI U 3

I.1 S L C V CÁC NHÓM VI KHU N GÂY B NH TH NG G P 3

I.1.1 Escherichia coli 3

I.1.1.1 c đi m hình thái 3

I.1.1.2 c đi m sinh h sinh d ng 3

I.1.1.3 Thông tin b gen 3

I.1.1.4 Phân lo i 4

I.1.2 Staphylococcus aureus 4

I.1.2.1 c đi m hình thái 5

I.1.2.2 c đi m sinh h sinh d ng 5

I.1.2.3 Thông tin b gen 6

I.1.3 Salmonella spp 6

I.1.3.1 c đi m hình thái 6

I.1.3.2 c đi m sinh h sinh d ng 6

I.1.3.3 Thông tin b gen 6

I.1.4 Shigella spp 7

I.1.4.1 c đi m hình thái 7

I.1.4.2 c đi m sinh h sinh d ng 7

I.1.4.3 Thông tin b gen 8

I.1.5 Vibrio cholerae 8

I.1.5.1 c đi m hình thái 8

Nguy n Tr ng Nghĩa viii

I.1.5.2 c đi m sinh h sinh d ng 8

I.1.5.3 Thông tin b gen 9

I.1.6 Yersinia enterocolitica 9

I.1.6.1 c đi m hình thái 9

I.1.6.2 c đi m sinh h sinh d ng 10

I.1.6.3 Thông tin b gen 10

I.2 THÔNG TIN VÙNG GEN 16S VÀ 23S rDNA 10

I.2.1 Gen 16S rDNA 10

I.2.2 Gen 23S rDNA 12

I.3 CÁC K THU T PHÁT HI N VI SINH V T GÂY B NH CHO CON NG I 12

I.3.1 K thu t đ nh danh truy n th ng [25] 12

I.3.2 K thu t sinh h c phân t hi n đ i 15

I.3.2.1 K thu t PCR[2][12] 15

I.3.2.2 Multiplex PCR [12] 19

I.3.2.3 Ph ng pháp micro rr y [64 [59 [1β 19

I.3.2.4 Ph ng pháp Reverse dot blot [12] 20

I.4 CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN C U PHÁT HI N NHANH CHÓNG VẨ NG TH I TÁC NHÂN VI SINH V T GÂY B NH 22

PH N II V T LI U VẨ PH NG PHỄP NGHIểN C U 25

II.1 V T LI U 25

II.2 PH NG PHỄP NGHIểN C U 25

II.2.1 Thu th p d li u và kh o sát in silico 25

II.2.2 Thu th p d li u 25

II.2.3 Kh o sát in silico 25

II.2.3.1 Thu th p tr nh t gen m c tiêu 16S – 23S rRNA 25

II.2.3.2 Thu th p các c p m i 25

II.2.3.3 Ph ng pháp kh o sát các c p m i thi t k m i 26

II.2.4 Kh o sát th c nghi m 26

II.2.4.1 Tách chi t DNA 26

Nguy n Tr ng Nghĩa ix

II.2.4.2 Ki m tra ch t l ng DNA thu nh n b ng ph ng pháp đo qu ng

ph 27

II.2.4.3 Ph n ng PCR: 28

II.2.4.4 Ph ng pháp đi n di: 30

II.2.4.5 Ph ng pháp l i RDB 30

II.2.4.6 Kh o sát đ nh y c ph ng pháp PCR-RDB 31

II.2.4.7 Kh o sát kh n ng phát hi n đ ng th i nhi u tác nhân vi khu n gây b nh 32

PH N III K T QU VÀ TH O LU N 33

III.1 K T QU THU TH P D LI U VÀ KH O SÁT IN SILICO 33

III.1.1 Thu th p d li u 33

III.1.2 K t qu kh o sát in silico 34

III.1.2.1 Thu th p vƠ đánh giá h c p m i, m u dò 34

III.1.2.2 Kh o sát h c p m i 36

III.1.2.3 Kh o sát b m u dò 45

III.2 K T QU TH C NGHI M 56

III.2.1 Tách chi t DNA 56

III.2.2 K t qu kh o sát nhi t đ lai c a m i 16S rDNA 58

III.2.3 K t qu khu ch đ i c a c p m i 16S_F ậ 16S_R trên các ch ng vi khu n đ i ch ng 59

III.2.4 K t qu khu ch đ i c a c p m i 23S_F ậ 23S_R trên ch ng E coli 60

III.2.5 K t qu lai RDB trên các ch ng vi khu n đ i ch ng 61

III.2.6 K t qu th c nghi m trên m u b nh ph m 64

III.2.7 Kh o sát đ nh y c a ph ng pháp PCR-RDB 67

III.2.8 K t qu phát hi n đ ng th i các ch ng vi khu n gây b nh 69

PH N IV K T LU N VẨ NGH 71

IV.1 K T LU N 71

IV.2 NGH 71

TÀI LI U THAM KH O 72

Nguy n Tr ng Nghĩa x

PH L C 82

s c kh e con ng i v i các lo i b nh: tiêu ch y, nhi m trùng đ ng ru t, nhi m trùng huy t, r i lo n th n kinh, viêm màng não,

Hi n nay, t i các phòng xét nghi m t i các b nh vi n Vi t N m ph ng pháp truy n th ng đ c s d ng r t ph bi n nh “ti u chu n vƠng” v i u đi m là

d th c hi n và chi phí th p, tuy nhiên còn nhi u h n ch nh t n nhi u th i gian

th c hi n đ chính xác ch c o do d b ngo i nhi m trong quá trình nuôi c y, gây

kh kh n cho vi c đi u tr Vì v y, vi c phát hi n nhanh các tác nhân gây b nh nhi m trùng lƠ đi u c n thi t, giúp h n ch đ c s lây lan c a chúng và h tr đ c

l c cho các bác s t m r h ng đi u tr đ ng đ n cho b nh nhân Hi n nay, nhi u

ph ng pháp phát hi n nhanh vi khu n gây b nh nhi m trùng đƣ đ c đ vƠo s

d ng nh PCR - đi n di, Real time PCR, Multiplex PCR, PCR k t h p gi i trình

t … nh ng ph ng pháp PCR k t h p lai Reverse Dot Blot (PCR - RDB) đƣ cho

th y nh ng u đi m v t tr i v th i gian, s chính xác và phát hi n đ ng th i nhi u tác nhân gây b nh nhi m trùng cùng lúc (Fiss et al., 1992; Xing et al., 2009),

đi u nƠy gi p các bác s c ph ng pháp đi u tr đ ng đ n và k p th i cho b nh nhơn do đ lƠm gi m đáng k chi ph đi u tr cho b nh nhân

Vì v y, s tìm hi u và thi t l p quy trình phát hi n đ ng th i 6 ch ng vi khu n gây b nh đ ng ru t: Staphylococcus aureus, Escherichia coli O157:H7, Salmonella spp., Shigella spp., Vibrio cholerae, Yersinia enterocolitica là c p thi t

Nh m góp ph n t m r ph ng pháp hi u qu trong vi c phát hi n nh nh đ ng th i

và chính xác các tác nhân vi khu n gây b nh nhi m trùng c ng nh h tr các bác

s l ch n ph ng pháp đi u tr đ ng đ n cho b nh nhân, chúng tôi th c hi n đ tài khóa lu n t t nghi p “B c đ u xây d ng quy trình phát hi n đ ng th i các tác

Nguy n Tr ng Nghĩa 2

nhân vi khu n t các m u b nh ph m gây b nh cho con ng i b ng ph ng pháp PCR k t h p Reverse Dot Lot”

Nguy n Tr ng Nghĩa 3

PH N I T NG QUAN TẨI LI U

I.1.1 Escherichia coli

I.1.1.1 c đi m h nh thái

Vi khu n Escherichia coli thu c h

Enterobateriaceae, E coli là tr c khu n ng n

t 2-3 µm, Gram âm, không t o bào t , có kh

n ng di đ ng nh tiên mao xung quanh.[10]

I.1.1.2 c đi m sinh h sinh d ng

E coli có kh n ng sinh tr ng trong

kho ng 5 - 40oC và t i u 37oC pH trong

kho ng 5,5 – 8 và thích h p nh t là 7,2 – 7,4 [10]

Chúng thu c nhóm vi khu n k khí tùy ý, có kh n ng l n men sinh h i m t

s lo i đ ng nh glucose l ctose xylose, levulose, galactose, ramnose, manit kèm theo sinh h i Kh ng l n men đ ng adonit và inozit

 Th nghi m IMViC dùng đ phơn bi t E.coli v i các vi khu n đ ng ru t khác [10] g m c các ph n ng:

o Ph n ng sinh indol (I): E coli có indol (+)

o Ph n ng đ methyl (M): E coli c ph n ng đ methyl (+)

o Ph n ng Voges Proskauer (V): E coli c ph n ng Voges Prosk uer (-)

o Ph n ng t m kh n ng s d ng c cbon c citr t (C): E coli cho ph n ng citrat âm tính

 E.coli không c kh n ng phơn gi i ure, không sinh H2S s u 48 gi

Tr n Th H ng vƠ c ng s (2012) đƣ phát hi n trong th t (l n, bò, gà) m t

s huy n ngo i thành Hà N i có ch a vi khu n E coli ( bao g m E coli O157: H7), gây ng đ c th c ph m, tiêu ch y [7] Ngoài ra vi khu n nƠy c n đ c tìm th y trong m u phân c a trâu, b …

I.1.1.3 Th ng tin b gen

Hình I.1 Hình thái t bào

E.coli[75]

Nguy n Tr ng Nghĩa 4

B gen c a Escherichia coli c k ch th c kho ng 5,59 Mb, t l %GC chi m kho ng 50,4%, vùng gen 16S rRNA dài kho ng 1542 bp, mã hóa cho 7 locus khác nhau: rrsA, rrsB, rrsC, rrsD, rrsE, rrsG, rrsH và vùng gen 23S rRNA dài kho ng

2903 bp

I.1.1.4 Phơn lo i

Vi khu n E coli đ c chia làm nhi u serotype khác nhau d a trên c u trúc kháng nguyên thân O, kháng nguyên giáp mô K, kháng nguyên lông H và kháng nguyên bám dính F B ng ph n ng ng ng k t các nhà khoa h c đƣ t m r đ c 250 serotype O, 89 serotype K, 56 serotype H và m t s serotype F [59]

Nh ng ch ng E coli gây b nh đ c x p vào nh ng nhóm sau: [58]

- EPEC (enteropathogenic E coli) nh m nƠy c vùng đ o “p thogenicity” locus for enterocyte eff cement (LEE) m ng nhi u y u t đ c l c vƠ c vùng gen eae (attaching and effacing, A/E) và tir (translocated intimin receptor) mã hóa cho intimin vƠ th th intimin gi p cho s bám d nh l n ni m m c ru t

- ETEC (enterotoxigenic E coli) đ gơy b nh các ch ng ETEC ph i bám d nh

l n tr n các t bƠo bi u m c ru t non H u h t các ch ng ETEC đ u c m ng 1

ho c nhi u y u t bám d nh nh : F4 (K88), F5 (K99), F6 (987P), F17, F18, F41, F42, F165 và ch ng ti t β lo i đ c t LT (he t l bile) vƠ ST (he t st ble) Nh ng

d ng nƠy ti t r 1 ho c β lo i đ c t tùy thu c vƠo pl smid c ch ng

- EIEC (enteroinvasive E coli) gơy b nh ch y u do kh n ng xơm nh p vƠo

ni m m c đ i trƠng Kh n ng xơm nh p đ c mƣ h b i gen tr n pl smid 140 MDa Các gen trên plasmid này mã hóa cho các kháng nguy n xơm nh p (IpA (inv sion pl smid ntigen) đ n IpD) EIEC c n c kh n ng xu t đ c t ru t gi ng Shigella đ c mƣ h b i gen sen

VTEC (verotoxigenic E coli) s n xu t đ c t Shiaga-like toxin (Slt), còn g i

là Shiga toxin hay Verotoxin (VT) H đ c t Stl g m 2 nhóm chính là Stx1 và Stx2

m t dòng có th có 1 ho c 2 lo i ho c c 2 Ngoài ra còn có gen eae và tir Trong nhóm này serotype O157:H7 chi m kho ng 75% các tr ng h p gây b nh t VTEC trên toàn th gi i

I.1.2 Staphylococcus aureus

Nguy n Tr ng Nghĩa 5

I.1.2.1 c đi m h nh thái

Staphylococcus aureus thu c nhóm vi khu n Gr m d ng h nh c u, x p đ i

ho c x p thƠnh đám nh nh chùm nho kh ng c kh n ng di đ ng, s ng trong

đi u ki n hi u khí ho c k khí tùy nghi [10]

I.1.2.2 c đi m sinh h sinh d ng

Tr n m i tr ng BP (Baird Parker) khu n

l c đ c tr ng c a S aureus c mƠu đen nhánh

S aureus có ph n ng DNase, catalase

(+), phosphase (+), có kh n ng l n men vƠ sinh cid t mannitol, trehalose, sucrose T t c các dòng S aureus đ u m n c m v i Novobiocine [10]

H u h t các ch ng t c u đ u s n xu t đ c men penicillinase (beta – lactamase) Men này phá hu vòng beta – lactam, c u tr c c b n c a các kháng sinh nh Penicilline G, Ampicilline và Ureidopenicilline, làm cho các kháng sinh này m t tác d ng [10]

S aureus c đ c t ru t Enterotoxin trong th c ph m và gây h i ch ng shock

đ c t do chúng t o ra siêu kháng nguyên trong máu [40]

c t Enterotoxin c a S aureus đ c g i là Staphylococcal enterotoxins (SEs) Bao g m: SEA SEB SEC SED SEE SEG SEH SEI SEJ đ c t ng h p

nh t đ trên 15oC đ c bi t t ng h p nhi u khi vi khu n t ng tr ng 35-37o

C và TSST-1 (Toxic shock syndrom toxin) đ c ti t ra gây h i ch ng s c nhi m đ c t

Nguy n Tr ng Nghĩa 6

I.1.2.3 Th ng tin b gen

B gen c a S aureus c k ch th c kho ng β 84 Mb trong đ t l %GC kho ng 32,8%, vùng gen 16S rRNA dài kho ng 1555 bp và 23S rRNA dài kho ng

2923 bp (Staphylococcus aureus subsp aureus NCTC 8325)

I.1.3 Salmonella spp

I.1.3.1 c đi m h nh thái

Salmonella ssp là tr c khu n Gram âm,

k ch th c t 2-3 µm di đ ng nh tiêm mao (tr

S gallimarum và S pullorum), s ng k khí tùy ý,

không t o bào t chúng phát tri n t t nhi t đ 6

– 42 oC, thích h p nh t 37oC, pH thích h p t 6

– 9 và t i u 7,2 [10]

I.1.3.2 c đi m sinh h sinh d ng

Salmonella spp c đ c đi m sinh hóa:

nitrate d ng t nh (+) ure se ơm t nh

(-), indol âm tính (-), VP âm tính (-), có kh n ng th y phân maltose, lactose, glucose…

Theo h th ng c a Kauffman White, d a trên kháng nguyên thân O, kháng nguyên tiêm mao H và kháng nguyên b m t V, Salmonella spp đ c chia ra kho ng 2463

ki u huy t thanh (serotypes) Ngoài ra gi ng Salmonella spp đ c chia làm hai loài: S enterica và S bongori Trong đ S bongori g m t t c các ki u huy t thanh (serotype) c a loài ph s V, và S enterica đ c chia làm 6 loài ph đánh s : I, II, IIIa, IIIb, IV và VI Salmonella spp có th t o ra hai lo i đ c t : Enterotoxin và Cytoxin [10]

B nh th ng hƠn do S typhi và S paratyphi B C gơy r B nh viêm d dày

ru t do các loài: S typhimurium, S enteritidis, S anatum, S budapest gây ra [10]

Tr n Ng c Bích (2012) đƣ nghi n c u và cho bi t r ng Salmonella spp

đ c tìm th y trong m u th t, m u tr ng, m u phân c a v t, v t xiêm, ng ng… lƠ vi khu n gây ng đ c th c ph m t nh H u Giang, Vi t Nam [6]

I.1.3.3 Th ng tin b gen

Hình I.3 Hình thái t bào Salmonella[77]

Nguy n Tr ng Nghĩa 7

B gen c a Salmonella spp c k ch th c kho ng 4 59 Mb trong đ t l %GC kho ng 52,2 (Salmonella enterica subsp enterica serovar Paratyphi A str ATCC 9150), vùng gen 16S rRNA dài kho ng 1366 bp và 23S rRNA dài kho ng 2904 bp

I.1.4 Shigella spp

I.1.4.1 c đi m h nh thái

Shigella spp hay còn g i là tr c khu n l , là

nhóm vi khu n Gram âm, không sinh bào t , không

Chi Shigella đ c chi thƠnh 4 nhóm loài: [23]

- S dysenteriae kh ng l n men đ c m nitol thu c nh m kháng huy t th nh

A g m c 1 ki u huy t th nh

- S flexneri thu c nh m kháng huy t th nh B g m c 6 ki u huy t th nh

- S boydii c kh n ng l n men đ ng m nitol sinh cid thu c nh m kháng huy t th nh C vƠ c 15 ki u huy t th nh

S sonnei c kh n ng s d ng đ ng m nitol thu c nh m kháng huy t

th nh D vƠ ch c 1 ki u huy t th nh

Hình I.4 Hình thái t bào

Shigella[78]

I.1.4.3 Th ng tin b gen

B gen c a Shigella spp c k ch th c kho ng 4 8γ Mb trong đ t l % GC kho ng 50,7, vùng gen 16S rRNA dài kho ng 1542 bp và 23S rRNA dài kho ng

2904 bp (Shigella sonnei Ss046)

I.1.5 Vibrio cholerae

I.1.5.1 c đi m h nh thái

Vibrio cholerae là vi khu n Gram âm (-),

h nh que h i cong kh ng c v , không sinh nha

bào, có chi u r ng kho ng 0.7-1.0 µm và dài

kho ng 1.5-γ.0 µm di đ ng đ c nh m t roi b i,

hô h p k khí tùy nghi [10]

I.1.5.2 c đi m sinh h sinh d ng

Vi khu n V cholerae phát tri n đ c

nhi t đ t 15oC đ n 45o

C và trong kho ng

pH t 6-10, tuy nhiên đi u ki n cho vi khu n V cholerae t ng sinh t t là nhi t đ

35oC đ n 37oC và pH vào kho ng 8-9 Ngoài ra, vi khu n còn có th phát tri n trong

m i tr ng c đ m n cao (mu i NaCl 6%) [10]

V cholera c đ c đi m sinh hóa: có kh n ng sinh emzyme oxydase (+), không sinh H2S, không có kh n ng phơn gi i ure và s d ng D-glucose làm ngu n

C chính S n xu t nhi u lo i enzyme: amylase, gelatinase, chitinase và DNase [10]

V cholera đ c chia thành 206 serotypes khác nhau và n i b t là 2 serotypes O1 và O139, là hai tác nhân gây b nh d ch t h y đ c g i là V cholerae - O1 và

V cholerae non - O1 [53] Có s khác nh u c b n gi a 2 serotype này, giúp phân

bi t d dàng: serotype O139 có m t nan m ng, còn O1 thì không có nan này V cholerae O1 t o khu n l c trong còn V cholerae O139 thì có khu n l c đ c [53]

Hình I.5 Hình thái t bào Vibrio

cholera[79]

Nguy n Tr ng Nghĩa 9

LPS (lippolysaccharide) c a serotype O1 thì m m và chu i dƠi h n so v i O139 thì semirough và ng n h n

Vi khu n V cholera c đ c t t (choler gen) ơy lƠ n i đ c t có c u trúc

g m h i đ n nguy n: đ n nguy n A (tr ng l ng phân t là 27 000 dalton, mang

đ c t nh c o) vƠ đ n nguy n B c t nh kháng nguy n đ c hi u và m t c u n i A2 có tác d ng k ch th ch t ng AMP v ng (Adenosin γ 5-cyclic mono phosphat)

D vƠo đ c đi m các quy t đ nh kháng nguyên A, B, C c a kháng nguyên thân O, V cholerae - O1 đ c phân thành 3 type huy t thanh (serotype) sau:

- Serotype Og w (c quy t đ nh kháng nguy n A B)

- Serotype In b (c quy t đ nh kháng nguy n A C)

- Serotype Hikojim (c c b quy t đ nh kháng nguy n A B C)

Serotype O139 là ch ng huy t thanh m i c kháng nguy n O đ c thù

Ph y khu n t (V cholera) xâm nh p vƠo đ ng ti u h c tr vƠ phát tri n màng nhày ph niêm m c ru t non Ngu n n c b nhi m V cholerae, các lo i rau s ng kh ng đ c v sinh k n các lo i h i s n không n u k là nh ng ngu n lây nhi m b nh chính [5]

Nguy n Th Xuân Trang và c ng s (2012), tìm th y V cholerae trong m u tôm và nhuy n th thu th p ng Nai và Thành ph H Chí Minh, Vi t Nam [5] I.1.5.3 Th ng tin b gen

V cholera c k ch th c b gen kho ng 4.03 Mb, thành ph n %GC là 47.5, vùng trình t 16S rRNA c k ch th c kho ng 1535 bp và vùng trình t 23S rRNA dài 2887 bp (Vibrio cholerae O1 biovar El Tor

str N16961)

I.1.6 Yersinia enterocolitica

I.1.6.1 c đi m h nh thái

Yersinia enterocolitica lƠ vi khu n Gr m

âm, hình que ng n kh ng sinh bƠo t k khí tùy

nghi Vi khu n c kh n ng di đ ng

25oC nh ng γ7oC th vi khu n b b t

Hình I.6 Hình thái t bào Y enterocolitica[80]

Nguy n Tr ng Nghĩa 10

đ ng [14]

I.1.6.2 c đi m sinh h sinh d ng

Vi khu n sinh tr ng kho ng nhi t đ lƠ 0 - 44 0C trong đi u ki n hi u kh

và k kh Ch ng c kh n ng t n t i trong đi u ki n l nh đ t m t vƠ c th

s ng trong đi u ki n n ng đ mu i c o (5% N Cl) sinh tr ng trong kho ng pH

r ng t 4 đ n 10 [10]

Y enterocolitica c kh n ng s d ng m t s ngu n c rbon nh glucose treh lose … nh ng kh ng c kh n ng l n men đ ng l ctose Ch ng c kh n ng lƠm phơn gi i ure nh enzyme ure se kh ng c kh n ng sinh H2S [10]

D a trên kh n ng gơy b nh đ c đi m sinh thái và s phân b đ a lý Y enterocolitica đ c chia thành 5 nhóm: 1A, IB, 2, 3, 4, và 5 Y enterocolitica bao

g m 60 serotypes: IA (O:5; O:6, 30; O:7, 8; O:18; O:46), IB (O:8; O:4; O:13a, 13b; O:18; O:20; O:21), 2 (O:9; O:5, 27), 3 (O:1,2,3; O:5,27), 4 (O:3), và 5 (O:2,3) Trong đ gơy nhi m nhi u nh t là O:3 (biogroup 4) , O:8 (biogroup 1B), O:9 (biogroup 2) , và O:5,27 (biogroups 2 và 3)

Nguy n H ng Th y và c ng s (2011), phát hi n đ c vi khu n Y enterocolitica trong th c ph m bao g m h i s n, th t gà, s ch th nh trùng

Vi t Nam [4]

I.1.6.3 Th ng tin b gen

B gen c a Y enterocolitica c k ch th c kho ng 4.68 Mb, %GC vào kho ng

47 γ% k ch th c vùng 16S rRNA kho ng 1489 bp và 23S rRNA kho ng 2994 bp (Yersinia enterocolitica subsp enterocolitica 8081)

I.2 THÔNG TIN VÙNG GEN 16S VÀ 23S rDNA

I.2.1 Gen 16S rDNA

Vùng trình t 16S rDNA là gen mã hóa cho trình t 16S rRNA, có chi u dài kho ng 1540 bp [61] Vùng gen này có c u tr c đ c bi t do nó có th hình thành c u trúc b c 2 và t o thành 4 trung tâm ch c n ng (dom ins) vƠ n c cu n g p l i nh

nh ng liên k t b tr t nh ng đo n x nh u th ng nh h n 8 bp nh ng đo n c p

đ i nƠy th ng không hoàn ch nh và có nh ng đo n ph ng, l i lên [71] Vùng trình

t 16S rDNA đ c ghi nh n lƠ “đ ng h ti n h ” (evolution ry clock) [64],

Nguy n Tr ng Nghĩa 11

th ng đ c đ c s d ng ph bi n trong nh ng công trình nghiên c u khoa h c

v h ng đ nh danh [71][64], phân lo i c ng nh phát hi n các loài vi khu n m i [54] vƠ đ c ng d ng r ng rƣi trong l nh v c y h c

Hi n nay, gen 16S rDNA đ c xem lƠ “chu n vƠng” (gold st nd rd) trong nghiên c u m i quan h gi a các c ng đ ng vi sinh v t [21] Chúng có s l ng

b n sao r t l n trong b gen c a vi sinh v t [29][71]

Trên vùng trình t gen 16S rDNA, các nhà khoa h c đƣ xác đ nh đ c các vùng b t bi n U (universal) là các vùng có s bi n đ i r t ít gi a các loài (b o t n

c p đ loài) và các vùng siêu bi n đ ng V (hypervariable) là nh ng vùng có s khác nhau gi a các loài, các ch ng thu c loài ho c nhóm loài [58] Vùng siêu bi n đ ng

đ c chia thành 9 vùng khác nhau, m i vùng có chi u dài kho ng 18 - 20 bp, và

gi a 2 vùng trên có nh ng vùng có bi n đ i t đ c g i là vùng bán b o t n S (semi-conserved) [16]

bi n th đ n đ h nh (single nucleotide polymorphism –SNP) đ phơn bi t Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium vƠ nhi u loƠi vi khu n khác

ứ Vùng Vγ gi p xác đ nh gi Mycobacterium fortuitum, Nocardia spp., Propionibacterium acnes và Rhodococcus equi Vùng Vγ c ng gi p phơn

bi t gi Enterobacteriacea: K pneumonia và E aerogenes

ứ Vùng V6 lƠ vùng si u bi n đ ng ng n nh t dƠi kho ng 58bp, có s bi n

đ ng l n vƠ gi p phơn bi t gi Enterobacteriaceae: Escherichia spp., Shigella spp và Salmonella spp

Nguy n Tr ng Nghĩa 12

ứ Vùng V4 V5 V7 vƠ V8 m c đ b o t n c o h n m c đ bi n đ ng do đ

kh ng th ch h p lƠ tr nh t m c ti u h tr cho vi c đ nh d nh m c loƠi

I.2.2 Gen 23S rDNA

Vùng gen 23S rDNA c k ch th c kho ng 2900bp [35] Theo Uzuka và

c ng s (2004), vùng 23S rDNA th hi n s bi n đ ng gi các loƠi h n vùng 16S rDNA [65] Theo đ c th thi t k m i ph quát (universal primer) d a trên vùng

b o t n và m i/m u dò chuyên bi t (specific primer/probe) d a trên vùng bi n đ ng

c a trình t 23S rDNA đ phân bi t đ c các nhóm vi khu n gây b nh đ ng ru t [35][65]

Theo Uzuka và c ng s , vùng 23S rDNA th ng li n qu n đ n vi c kháng kháng sinh phân t vòng l n (macrolide antibiotic) [65].Vi c thi t k các m i/m u

dò chuyên bi t trên vùng 23S rDNA là r t h u ích trong ch n đoán các vi khu n kháng thu c.[65]

I.3 CỄC K THU T PHỄT HI N VI SINH V T GỂY B NH CHO CON

I.3.1 K thu t đ nh danh truy n th ng [25]

Vi c đ nh danh và phân lo i vi sinh v t đ u d tr n các đ c đi m hình thái, sinh lý, sinh hóa vi sinh v t: nhu m t bào, hình d ng t bào khu n l c, kh n ng di

đ ng, nhu c u dinh d ng, kh n ng sinh cid …

D a trên ph n ng sinh hóa: ngoài vi c d tr n các đ c đi m hình thái, các nhà khoa h c còn s d ng thêm các ph n ng sinh h đ phân lo i vi sinh v t

Nh ng ph n ng sinh h th ng dùng trong vi c đ nh danh vi sinh v t:

 Th nghi m chuy n h citr te: xác đ nh vi sinh v t c kh n ng s d ng citr te lƠm ngu n hydroc rbon duy nh t S n ph m chuy n h lƠm ki m h m i

tr ng vƠ th y đ i ch th mƠu Ph n ng d ng t nh mƠu x nh n c bi n ph n ng

ơm t nh: kh ng đ i mƠu

 Th nghi m c t l se: phát hi n men c t l se chuy n h n ng l ng theo

ph ng th c h h p v i oxy lƠ ch t nh n đi n t cu i cùng các vi khu n hi u kh

vƠ k kh tùy nghi Ph n ng d ng t nh c b t kh xu t hi n ph n ng ơm t nh

kh ng c b t kh

Nguy n Tr ng Nghĩa 13

 Th nghi m Oxyd se: phát hi n kh n ng sinh enzyme cytochrome oxidase

c vi khu n Ph n ng d ng t nh c mƠu t m vƠ ch xu t hi n trong 10 giây đ u tiên

 Th nghi m phơn gi i Ure: phát hi n enzyme ure se phơn gi i ure thƠnh

NH4 và CO2 NH4 lƠm ki m h m i tr ng Ph n ng d ng t nh m i tr ng c mƠu t m đ ph n ng ơm t nh m i tr ng kh ng đ i mƠu

 Th nghi m Co gul se: phát hi n s c m t c men Co gul se b ng ph n

ng đ ng huy t t ng Ph n ng d ng t nh xu t hi n kh i đ ng máu ph n ng ơm

t nh kh ng xu t hi n kh i đ ng máu

 Th nghi m sinh Indol: phát hi n các vi sinh v t c enzyme tryptophanase chuy n h trypton t o thƠnh indol Ph n ng d ng t nh t o mƠu h ng cánh sen

ph n ng ơm t nh c mƠu vƠng

 Th nghi m MR (Methyl Red): phát hi n các vi khu n l n men glucose t o

s n ph m cid b n Nh Methyl Red đ đ c k t qu ph n ng d ng t nh c mƠu

đ ph n ng ơm t nh c mƠu vƠng

 Th nghi m VP (Voges – Proskeur): nh m phát hi n các vi sinh c enzyme chuy n h β γ – but nediol thƠnh cetoin vƠ khi c oxi chuy n h ti p thƠnh

di cetyl Ph n ng d ng t nh c mƠu đ tr n b m t m i tr ng ph n ng ơm t nh

 Th nghi m phơn gi i h ng c u (th nghi m kh n ng lƠm t n máu): m t s

vi khu n cho kh n ng phơn gi i h ng c u c th qu n sát th y tr n th ch máu C γ

lo i t n máu: t n máu t o vùng trong su t xung qu nh khu n l c t n máu vùng xám x nh xung qu nh khu n l c t n máu kh ng t n máu

 Th nghi m kh n ng gel tin: phát hi n vi khu n c enzyme gelatinase phân

gi i vƠ h l ng gel tin qu n sát nhi t đ th p h n β5oC

Nguy n Tr ng Nghĩa 14

 Xác đ nh kh n ng di đ ng: dùng đ phát hi n các vi khu n c kh n ng di

đ ng tr n m i tr ng bán l ng vƠ lƠm đ c m i tr ng Ph n ng d ng t nh vi khu n m c l n r tr n đ ng c y ph n ng ơm t nh vi khu n ch m c tr n đ ng

c y

Phân bi t theo serotype huy t thanh: nguyên t c c ph ng pháp nƠy d a vào nhóm quy t đ nh kháng nguyên trên t bào vi sinh v t (b m t t bào tiên mao ho c protein v )

Phân bi t b ng lo i ho t ch t kháng khu n: Bacteriocin b n ch t là peptid kháng kh n sinh r đ ch ng l i vi sinh v t

Các b c đ nh danh vi khu n bao g m:

- Xác đ nh m i tr ng th ch h p đ nu i c y

- Nghi n c u h nh th h c

- Nghi n c u các đ c đi m sinh lý - sinh h h c

- X p lo i vi khu n phơn l p đ c vƠo gi ng loƠi vƠ tuýp huy t th nh c th

B ng I.1 B ng th nghi m sinh hóa phân bi t nhóm vi khu n gây b nh đ ng

Ph ng pháp phơn t ch vi sinh truy n th ng đ c xem lƠ ph ng pháp

“chu n vƠng” trong nh ng quy trình xét nghi m th ng quy [25] Tuy nhiên,

ph ng pháp truy n th ng có m t s h n ch : tiêu t n th i gian, tiêu t n v môi

PCR (Polymerase Chain Reaction - ph n ng polymer se dơy chuy n) lƠ

ph ng pháp khu ch đ i nh nh nhi u b n s o c các đo n DNA trong đi u ki n in vitro theo các chu k nhi t kh ng c n s hi n di n c t bƠo.[12]

K thu t nƠy do K rl Mullis vƠ c ng s phát minh n m 1985 đ c ng d ng

nh nh vƠ c ý ngh cách m ng đ i v i s phát tri n c sinh h c phơn t vƠ k thu t di truy n.[2]

I.3.2.1.2 Nguy n t c chung c ph ng pháp PCR

PCR lƠ quá tr nh khu ch đ i m t đo n tr nh t DNA đ c hi u trong đi u ki n

in vitro d i x c tác c enzyme DNA polymerase [12]

T t c các DNA polymer se khi ho t đ ng t ng h p m t m ch DNA m i t

m ch khu n đ u c n s hi n di n c nh ng m i chuy n bi t: m i xu i (sense primer) vƠ m i ng c ( ntisense primer) M i c kh n ng b t c p b sung v i m t

đ u c m ch khu n vƠ DNA polymer se s n i dƠi đ h nh thƠnh m ch m i [12]

Ph n ng PCR lƠ m t chu i nhi u chu k n i ti p nh u M i chu k g m γ

 Gi i đo n b t c p ( nne ling): Nhi t đ đ c h th p (th p h n Tm c các

m i) cho phép các m i b t c p v i khu n th ng lƠ 40o

C – 70oC tùy thu c

Tm c các m i s d ng vƠ kéo dƠi t γ0 giơy – 1 phút [2]

 Gi i đo n kéo dƠi (elong tion): Nhi t đ đ c t ng l n đ n 7βoC giúp cho DNA polymer se s d ng v n lƠ polymer se ch u nhi t ho t đ ng t ng h p t t

Nguy n Tr ng Nghĩa 16

nh t Th i gi n tùy thu c đ dƠi c tr nh t DNA c n khu ch đ i th ng kéo dƠi t γ0 giơy đ n nhi u ph t [2]

M t chu k b o g m b gi i đo n tr n s đ c l p đi l p l i nhi u l n vƠ m i

l n l i lƠm t ng g p đ i l ng m u c l n tr c ơy lƠ s khu ch đ i theo c p s nhân [2]

Hình I.7 Các b c trong t chu PCR.[81]

I.3.2.1.3 ThƠnh ph n ph n ng PCR

 Khu n m u lƠ đo n DNA c n khu ch đ i

 Các đo n m i xu i vƠ ng c

 DNA polymer se ch u nhi t

 dNTP: các lo i nucleotide triphosph te

Nguy n Tr ng Nghĩa 17

xu ng c n 100 ng) v i vi c s d ng các polymer se cho hi u qu c o [12] H n

n vi c gi m l ng m u b n đ u c n h n ch đ c các khu ch đ i ký sinh t o

nh ng s n ph m ph kh ng mong mu n M t u đi m l n khác c ph ng pháp PCR lƠ cho phép khu ch đ i nh ng m u DNA kh ng đ c b o qu n t t đƣ b phơn

h y t ng ph n nh trong các v t máu đ lơu ngƠy tinh d ch đƣ kh h th ch t c

m ng t y c ng i đƣ ch t … [2]

 Enzyme

Enzyme đ c s d ng đ u ti n lƠ đo n Klenow c DNA polymer se I V đơy lƠ enzyme kh ng ch u nhi t n n th o tác ph c t p vƠ hi u qu th p (ph i th m enzyme m i vƠo ph n ng s u m i l n bi n t nh v enzyme c đƣ b nhi t phơn h y nhi t đ l i th p khi n s khu ch đ i ký sinh cƠng c o …) [2]

NgƠy n y nhi u polymer se ch u nhi t đ c đ r th tr ng v i nhi u ch c

n ng chuy n bi t h y hoƠn thi n h n Taq DNA polymerase và Pfu DNA polymer se đ c s d ng th ng d ng [2]

Nguy n Tr ng Nghĩa 18

N ng đ ion Mg2+ c ng lƠ nhơn t nh h ng m nh đ n hi u qu vƠ t nh đ c

hi u c quá tr nh PCR Kh ng c m t quy lu t chung cho v n đ nƠy N ng đ t i

u ph i đ c xác đ nh cho t ng ph n ng qu nhi u th nghi m Nh ng th ng

th ng n ng đ Mg quá th p s lƠm gi m hi u qu nhơn b n c n n ng đ quá c o

s t o s n ph m kh ng đ c hi u

 S l ng chu k c ph n ng PCR: [2][12]

Trong th c t ph n ng PCR th ng đ c th c hi n kh ng v t quá 40 chu

k [12] S d nh v y lƠ v ph n ng PCR di n ti n qu β gi i đo n: trong gi i

đo n đ u s l ng b n s o t ng theo c p s nhơn t l v i l ng m u b n đ u s u

đ hi u qu khu ch đ i gi m h n v nh ng nguy n nhơn s u:

 S phơn h y vƠ c n ki t nh ng thƠnh ph n c ph n ng

 S xu t hi n các s n ph m ph c ch ph n ng

 Các b n s o v đ c t ng h p kh ng k t h p v i m i mƠ b t c p v i

nh u …

S chu k cho m t ph n ng tùy thu c s l ng b n m u b n đ u [12] V d

n u s b n m u lƠ 105 th c n β5 – γ0 chu k n u s l ng b n m u lƠ 102 – 103 thì

s chu k ph i lƠ γ5 – 40 …

 Thi t b vƠ d ng c cho ph n ng PCR: [2]

Th c ch t m t thi t b dùng đ ti n hƠnh ph n ng PCR ch c n đáp ng đ c

y u c u th y đ i nhi t đ th t nh nh vƠ ch nh xác Các thi t b hi n n y đƣ đ c c i

ti n đ tránh t i đ s b c h i n c trong quá tr nh ph n ng h y cho phép ti n hƠnh PCR ng y tr n m vƠ t bƠo … Tuy nhi n m i ki u thi t b c đ c đi m khu ch đ i ri ng n n m i th nghi m c m t nghi n c u c n đ c ti n hƠnh tr n cùng m t lo i thi t b

H n n ng nghi m dùng cho các ph n ng c cùng m t nghi n c u ph i thu c cùng m t ki u v đ c t nh truy n nhi t c các ng nƠy c ng nh đ ti p x c

gi ng vƠ b ph n t o nhi t c thi t b c nh h ng l n đ n quá tr nh khu ch

đ i

I.3.2.1.5 u nh c đi m

 Sai sót gây ra do Taq polymer se S s o chép b i Taq polymer se cho t

l s i khá c o (10-4 ngh lƠ c 10000 nucleotide th enzym g n s i 1 nucleotide) [12] c t nh nƠy kh ng gơy nh h ng nghi m tr ng n u t

ch c n xem xét k ch th c h y s c m t c m t s n ph m khu ch đ i

nh ng c ý ngh l n n u c n xác đ nh ch nh xác tr nh t nucleotide c DNA

I.3.2.2 Multiplex PCR [12]

Multiplex PCR là k thu t PCR c i ti n, s d ng các c p m i đ c hi u khác nhau trong cùng m t ph n ng PCR đ khu ch đ i các đo n trình t DNA khác nhau [12] K thu t nƠy đ c th nghi m thƠnh c ng vƠo n m 1988 vƠ t đ đƣ

đ c áp d ng thành công trong nhi u công trình nghiên c u v các bi n đ i di truy n ng i c ng nh nhi u l nh v c nghiên c u khác u đi m c ph ng pháp này có th phát hi n đ ng th i nhi u s n ph m m c tiêu Tuy nhiên, k thu t này có th t o ra nhi u s n ph m DNA kh ng đ c hi u

I.3.2.3 Ph ng pháp micro rr y [64][59] [12]

Nguy n Tr ng Nghĩa 20

Nguyên lý c ph ng pháp nƠy d tr n ph ng pháp l i Southern vƠ đ c

ng d ng r ng rãi trong các nghiên c u c p phân t [12] Ph ng pháp microarray có nh ng đ c đi m chính:

 Các m u d th ng lƠ các đo n cDNA đ c t o r t phi n mƣ ng c các mRNA t ng ng đ c tách chi t t các m ho c t bƠo

 Các dƣy “gi ng th ” ch các phơn t DNA đ c tách chi t t các m u sinh

v t khác nh u trong đ m i dƣy gi ng th ng đ c b sung m u d đ c hi u

là m t công ngh đ n gi n nh nh vƠ đáng tin c y, là công c có giá tr ti m n ng cho vi c xác đ nh vi sinh v t [64] Ph ng pháp nƠy th ng dùng ch y u cho các

ph n ng xác đ nh vi khu n có bi u hi n gen đ c, tuy nhiên t n nhi u chi phí cho

đ u t thi t b [59]

I.3.2.4 Ph ng pháp Reverse dot blot [12]

Ph ng pháp l i phơn t d a trên nguyên t c s tách r i hai m ch đ n c a chu i xo n kép cid nucleic d i tác đ ng c a nhi t đ v t quá nhi t đ nóng ch y

Tm và s b t c p tr l i gi a hai m ch khi nhi t đ gi m d n [12] M t trong hai

m ch acid nucleic b sung đ c c đ nh trên m t giá th r n (màng lai nitrocellulose) ho c n m ngay trên t bào hay mô S tái b t c p ch x y ra gi a hai trình t hoàn toàn b sung d n đ n hình thành các phân t lai DNA-DNA, hay DNA-RNA Ph ng pháp lai dùng m u d kh ng đánh d u b ng phóng x (đ c khuy n cáo s d ng) ch phát hi n đ c sinh v t m c 106-108 t bào/g m u

Reverse dot blot (RDB) là m t ph ng pháp l i phơn t c i ti n lƠ ph ng pháp s s ng m u dò oligonucleotide đ c hi u allele g n c đ nh tr n mƠng s u đ

b sung các s n ph m PCR t DNA tách chi t t các m u b nh ph m Trong ph n

ng PCR, b m i có g n biotin T đ k t qu l i đ c phát hi n d a vào ph n ng

Nguy n Tr ng Nghĩa 21

streptavidin-horseradish peroxidase [12] Ph ng pháp nƠy c u đi m: không s

d ng ch t phóng x , ti n l i, nhanh, thi t th c vƠ kh ng đ i h i k n ng c o

Ph n ng RDB bao g m các ph n ng chính: (Hình II.2)

ứ Bi n t nh s n ph m PCR đánh d u biotin

ứ X lý mƠng l i (ti n l i)

ứ L i s n ph m PCR đ ch v i các m u d đ c hi u v i nhi t đ th ch h p (th ng th ng kho ng 4βo

C trong 15 phút)

ứ Phát hi n t n hi u l i d vƠo s phát mƠu c c ch t γ γ 5 5- tetramethylbenzidine (TMB) chromogen do b th y phơn b i peroxidase

x , rút ng n th i gian ch còn 1-2 ngày (thay vì 2-8 tu n các ph ng pháp nu i

c y s d ng phóng x ) Bên c nh đ , quy trình này phát hi n vƠ xác đ nh đ c các

ch ng vi khu n Mycobacteria đ n m c loài [26]

W ng vƠ c ng s (β00β), d tr n vùng tr nh t 16S rDNA phát hi n β0 loài vi khu n đ ng ru t c trong m u phơn: Clostridium clostridiiforme, Clostridium leptum, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium infantis, Eubacterium biforme, Eubacterium aerofaciens, Lactobacillus acidophilus, Escherichia coli, Enterococcus faecium … b ng k thu t micro rr y [68]

Hong vƠ c ng s (n m β004), đƣ khu ch đ i m t đ t bi n tr n vùng βγS rDNA

đ phát hi n 14 loƠi vi khu n: Escherichia coli, Shigella dysenteriae, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes và Clostridium botulinum Ph ng pháp nƠy đ c cho r ng đ r k t qu nh nh

ch ng ch nh xác hi u qu trong ch n đoán đi u tr các tác nhân vi khu n gơy b nh nhi m trùng ng đ c th c ph m.[34]

Nguy n Tr ng Nghĩa 23

Trong nghiên c u c a Jin và c ng s (2005), s d ng ph ng pháp PCR k t

h p lai Reverse dot blot trên vùng 16S rDNA đƣ phát hi n đ c các tác nhân gây

b nh đ ng ru t bao g m Samonella sp., Escherichia coli, Shigella spp., Listeria monocytogenes, Vibrio parahaemolyticus, Staphylococcus aureus, Proteus spp., Bacellus cereus, Vibrio cholera, Enterococcus faecalis, Yersina enterocolitica và Campylobacter jejuni [36]

Chi ng YC vƠ c ng s (β006), s d ng PCR k t h p v i l i ng c d vƠo vùng tr nh t bi n đ ng tr n gen 16S rDNA đ phát hi n Bacillus spp., Escherichia coli, Salmonella spp., Staphylococcus spp và Vibrio spp [17]

M ity vƠ c ng s (β008) đƣ nghi n c u s d ng ph ng pháp l i ng c

m cro rr y v i b m u d đ c hi u tr n vùng tr nh t 16S - βγS rDNA đ ch n đoán nh nh tác nhơn vi khu n gơy b nh ng i: Vibrio cholerae, Salmonella typhimurium, Shigella influenza …[46]

Xing vƠ c ng s (β008) đƣ s d ng ph ng pháp PCR k t h p ph ng pháp microarray d vƠo tr nh t 16S rDNA vƠ βγS rDNA đ phát hi n 7 loƠi vi khu n

th ng gơy b nh đ ng ru t EHEC O157:H7 Vibrio parahaemolyticus, Salmonella spp., Vibrio cholerae, Listeria monocytogenes, Campylobacter jejuni và Shigella spp [73]

Xing vƠ c ng s (β009) xác đ nh nh nh tác nhơn gơy b nh đ ng ru t trong

m u phơn b ng ph ng pháp PCR – Reverse Dot Blot: Salmonella spp., Echerichia coli O157:H7, Clostridium botulinum, Bacillus cereus, Shigella spp., Yersinia enterocolitica, Vibrio cholerae, Listeria monocytogenes và Staphylococcus aureus

d tr n tr nh t m c ti u 16S – βγS rDNA B m i ph quát đ c thi t k tr n vùng tr nh 16S vƠ βγS rDNA Nh m nghi n c u đƣ s d ng ph ng pháp RDB phơn t ch 540 m u phơn t b nh nhơn ti u ch y K t qu ghi nh n ph ng pháp RDB c nh ng u đi m: th i gi n th c hi n nh nh vƠ đ nh y c o so v i các

ph ng pháp khác [72]

N m β01β Tanja Kostić vƠ c ng s đƣ s d ng ph ng pháp micro rr y nh m phát hi n các tác nhân vi khu n gây b nh t n c, th c ph m… [64]

vi khu n kh o sát hoƠn toƠn c th th c hi n đ ng th i nh ng r ng r ng y tr n

t ng “l ” (dot) tr n mƠng l i mƠ đ (“l ”) các m u d đ c tr ng cho t ng lo i s n

ph m PCR (đ ng ngh v i t nh đ c tr ng cho t ng vi khu n kh o sát) đƣ đ c c

đ nh s n Do đ ph ng pháp PCR-RDB lƠ r t phù h p đ phát hi n đ ng th i nhi u tác nhân vi khu n gây b nh v i k thu t l i đ n gi n nh nh bán t đ ng

H n n ph ng pháp PCR-RDB kh c ph c tính ngo i nhi m và c th áp d ng sƠng l c đ i trƠ

Vi t Nam, k thu t PCR – RDB ch đ c s d ng ph bi n trong nh ng nghiên c u xây d ng quy trình phát hi n đ ng th i các nhóm vi khu n gây b nh truy n nhi m c ng nh các nh m vi khu n gây ng đ c th c ph m Vì v y, trong nghiên c u này chúng tôi s d ng ph ng pháp PCR – RDB v i nhi u u đi m nêu

tr n đ xác đ nh đ ng th i nhi u tác nhân vi khu n gây b nh (nhóm vi khu n gây

b nh đ ng ru t) trên m t s ngu n m u b nh ph m thu th p đ c t i Vi t Nam

Nguy n Tr ng Nghĩa 25

NGHIểN C U

II.1 V T LI U

Trong nghiên c u này chúng tôi s d ng 15 m u máu (chai c y máu) đƣ đ c

ch n đoán lơm sƠng lƠ nhi m các tác nhân vi sinh v t gây nhi m trùng huy t b ng

ph ng pháp truy n th ng đ c cung c p b i B nh vi n Tr ng V ng ThƠnh Ph

H Chí Minh, chúng tôi còn s d ng các ch ng vi khu n gây b nh th ng g p đ c cung c p b i Phòng Thí Nghi m Sinh H c Phân T Khoa Công Ngh Sinh H c

Tr ng i H c M TP HCM (Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, Shighella spp., Escherichia coli) và Công Ty C Ph n Công Ngh Vi t Á (Yersinia enterocolitica) đ lƠm đ i ch ng

II.2.3.1 Thu th p tr nh t gen m c ti u 16S – 23S rRNA

Chúng tôi thu nh n các trình t 16S và 23S rDNA c a 6 loài vi khu n Salmonella spp., Escherichia coli O157:H7, Shigella spp., Yersinia enterocolitica , Vibrio cholerae và Staphylococcus aureus t ngân hàng gen NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) Bên c nh đ ch ng t i c n thu nh n trình t gen 16S và 23S rRNA c a các loài vi khu n khác nh Brucella spp., Clostridium botulinum, Bacillus cereus, Clostridium perfringens, Vibrio parahaemolyticus và L monocytogenes… đ tìm hi u và l a ch n vùng gen thích h p đ thi t k m i và các

m u dò s d ng cho k thu t PCR và RDB

II.2.3.2 Thu th p các c p m i

Nguy n Tr ng Nghĩa 26

Chúng tôi thu th p t t c các h - c p m i, b m u dò t các bài báo nghiên

c u khoa h c v phát hi n xác đ nh các loài vi khu n nói trên

II.2.3.3 Ph ng pháp kh o sát các c p m i thi t k m i

Trong nghiên c u này, chúng tôi ti n hành phân tích, kh o sát các đ c tính, các thông s v t lý vƠ t nh đ c hi u c a các c p m i, m u dò thu th p đ c t các bài báo nghiên c u khoa h c, t đ h ng t i vi c thi t k m i, m u dò M t s công c tin sinh h c đ c s d ng trong quá trình phân tích, kh o sát các c p m i,

 Cluxt lX β.1: so sánh s t ng đ ng c h i h y nhi u tr nh t sinh h c

II.2.4 Kh o sát th c nghi

II.2.4.1 Tách chi t DNA

II.2.4.1.1 Nguy n t c

Chúng tôi s d ng ph ng pháp phenol/chloroform đ tách chi t DNA Trong

đ mƠng t bƠo vƠ mƠng nhơn đ c bi n tính b ng ch t t y m nh S u đ protein s

đ c bi n tính b ng phenol/chloroform và b lo i b DNA b gen s đ c t a v i Ethanol l nh

II.2.4.1.2 Thi t b vƠ hóa ch t

 Thi t b : + Máy ly tơm l nh (Hettich)

+ B n nhi t (Thermo Final Test)

 Hoá ch t + Phenol (TBR)

 Chloroform (Merck)

 NaCl 5 M

 Tris HCl 1 M (pH=8)

B c 1: Thu sinh kh i t bƠo: Dùng b m kim ti m v trùng l y 1ml d ch vi khu n t chai c y máu cho vào ng eppendorf lo i 1,5 ml, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút nhi t đ phòng, thu t a

B c β: B sung m t th tích dung d ch đ m ly gi i (N Cl 5 M Tris - HCl 1

M (pH 8), EDTA 0,5 M (pH 8), SDS 10 %, H2O), và proteinase K (18,5 mg/ml),

tr n đ u S u đ đem d ch vi khu n 56oC trong 1 gi

B c 3: B sung m t th tích phù h p dung d ch phenol : chloroform (t l 1:1) Ly tâm 13000 vòng/phút trong 3 phút, nhi t đ phòng Thu d ch n i, chuy n sang eppendorf m i

B c 4: B sung m t l n th tích dung d ch chloroform Ly tâm 13000 vòng/phút trong 3 phút, nhi t đ phòng Thu d ch n i, chuy n sang eppendorf

m i

B c 5: Th m 0 β l n th tích Ammonium acetate 5 M và 2,5 l n th tích Ethanol tuy t đ i (tr l nh) Ly tâm 13000 vòng/30 phút, 4oC Thu t a

B c 6: R a t a l i b ng Ethanol 70 %, ly tâm 13000 vòng/15 phút, 4o

C Thu t đ khô t nhiên B sung 50 µl dung d ch TE, b o qu n -20oC

II.2.4.2 Ki m tr ch t l ng DNA thu nh n b ng ph ng pháp đo qu ng ph II.2.4.2.1 Nguy n t c:

HƠm l ng DNA có th xác đ nh đ c nh s h p thu m nh ánh sáng b c sóng 260 nm Giá tr m t đ quang OD260nm c a các m u DNA cho phép xác đ nh

n ng đ DNA trong dung d ch (v i A260nm= 1 OD = 50 µg/ml DNA s i đ i) tinh s ch c DNA đ c đánh giá qu t l A260/A280

Nguy n Tr ng Nghĩa 28

II.2.4.2.2 Thi t b vƠ h ch t

 Thi t b : Máy đo qu ng ph (Bio Rad)

 Hoá ch t: N c c t hai l n

II.2.4.2.3 Các b c ti n hƠnh:

DNA sau khi tách chi t đ c pha loãng 20 l n b ng n c c t v trùng S u đ chuy n t t c dung d ch vƠo cuvette vƠ đo n ng đ DNA b c s ng β60 nm tinh s ch c a dung d ch đ c xác đ nh b ng OD260/OD280

II.2.4.3 Ph n ng PCR:

II.2.4.3.1 Thi t b h ch t:

 Thi t b : Máy PCR (Bio R d)

 Hoá ch t: + M stermix βX (Bio Line)

 M i (IDT)

 N c c t hai l n

II.2.4.3.2 Các b c ti n hành:

 Ph n ng PCR đ c ti n hƠnh trong th t ch β5 µl v i c p m i 16S F – 16S R thƠnh ph n vƠ chu k nhi t c ph n ng PCR nh B ng II.1 vƠ