Bước đầu tìm hiểu kỹ thuật sinh học phân tử trong xác định đột biến trên gen HBB gây bệnh thiếu máu hồng cầu hình liềm

ơy lƠ giai đo n kéo dài elongation.

TR NG I H C M TP.HCM

BÁO CÁO KHÓA LU N T T NGHI P

Tên đ tài:

B C U TỊM HI U K THU T SINH H C PHÂN T TRONG XỄC NH T BI N TRểN

HỊNH LI M

KHOA CÔNG NGH SINH H C

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH ậ SINH H C PHÂN T

GVHD: ThS Tr ng Kim Ph ng SVTH: Nguy n Th Thu NgânMSSV: 1053012479

Khóa: 2010 - 2014

TP.HCM, tháng 06 n m 2014

L I C M N

Em xin g i lòng tri ơn đ n cô Tr ng Kim Ph ng, ng i đƣ t n tình h ng

d n và truy n đ t ki n th c cho em trong quá trình h c t p và giúp em hoàn thành

t t chuyên đ khóa lu n t t nghi p này

Em c ng chơn thƠnh c m n QuỦ Th y Cô khoa Công Ngh Sinh H c ậ

Tr ng i h c M TP.HCM đƣ t n tình giúp đ và truy n đ t ki n th c cho em

trong quá trình h c t p

Xin chân thành c m n cô Lê Huy n Ái Thúy, th y Lao c Thu n đƣ t n tình giúp đ và t o đi u ki n thu n l i cho em trong su t th i gian th c hi n chuyên đ

khóa lu n t t nghi p này

Xin chân thành c m n Trung tơm ch n đoán y khoa Medic đƣ t o đi u ki n

thu n l i vƠ giúp đ em trong th i gian th c hi n chuyên đ khóa lu n t t nghi p

này

Em c ng xin g i l i bi t n sơu s c đ n gia đình, ng i thân và l i c m n đ n

b n bè đƣ đ ng viên em trong su t th i gian h c t p

Sau cùng em xin chân thành c m n QuỦ Th y Cô đƣ dƠnh th i gian đ c và xem xét chuyên đ khóa lu n t t nghi p này c a em

Sinh viên th c hi n

Nguy n Th Thu Ngân

DANH M C CÁC CH VI T T T

AS-PCR Allele specific ậ polymerase chain reaction

THU T NG DI N GI I

B nh h ng c u hình li m Sickle cell disease

Thi u máu h ng c u hình li m Sickle cell anemia

T n th ng c quan m n tính Chronic organ damage

DANH M C CÁC B NG

B ng I.1 Các đ c đi m lâm sàng c a b nh h ng c u hình li m 6

B ng I.β Các đ c đi m sinh h c c a b nh h ng c u hình li m 7

B ng II.1 Thành ph n ph n ng PCR v i c p m i HBB1-F và HBB1-R 21

B ng II.2 Chu k nhi t cho ph n ng PCR v i c p m i HBB1-F và HBB1-R 22

B ng II.3 Thành ph n ph n ng PCR v i c p m i HBB2-F và HBB2-R 22

B ng II.4 Chu k nhi t cho ph n ng PCR v i c p m i HBB2-F và HBB2-R 23

B ng III.1 Các d ng đ t bi n trên gen HBB 26

B ng III.2 T l các th đ t bi n trên gen HBB 27

B ng III.γ Các ph ng pháp đ c s d ng trong xác đ nh đ t bi n 27

B ng III.4 Thông tin trình t gen HBB thu th p trên NCBI 28

B ng III.5 Các h m i thu th p đ c 29

B ng III.6 Các thông s v t lý c a m i 31

B ng III.7 Kh o sát đ đ c hi u c a m i HBB1-F và HBB1-R, F và HBB2-R b ng ph n m m Annhyb 32

B ng III.8 đ c hi u c a h m i b ng công c Blast 33

B ng III.9 K t qu đo OD DNA b gen ng i c a 3 m u b nh ph m 35

B ng 1 Thông tin m u b nh ph m s d ng trong nghiên c u 55

DANH M C HÌNH NH

Hình I.1: Hình nh c a gen HBB[44] 3 Hình I.2: Hình nh mô t các b c trong ph n ng PCR (P1 vƠ Pβ: các đo n m i-

Primers)[49] 15 Hình III.1: Hình nh mô t v trí khu ch đ i vùng gen HBB c a b m i HBB1-F và

HBB1-R, HBB2-F và HBB2-R 35 Hình III.2: K t qu đi n di kh o sát nhi t đ lai c a c p m i HBB1-F và HBB1-R

37 Hình III.3: K t qu đi n di s n ph m PCR m u 1 v i c p m i HBB1-F và HBB1-R

38 Hình III.4a: K t qu đi n di s n ph m PCR m u 2 v i c p m i HBB1-F và HBB1-

R 39 Hình III.4b: K t qu đi n di s n ph m PCR m u 2 v i c p m i HBBβ-F và HBB2-

R 39 Hình III.5a: K t qu đi n di s n ph m PCR m u 3 v i c p m i HBB1-F và HBB1-

R 2 Hình III.5b: K t qu đi n di s n ph m PCR m u 3 v i c p m i HBBβ-F và HBB2-

R 2 Hình III.6: K t qu Blast trình t A3-F trên NCBI 42 Hình III.7: K t qu phơn tích tính t ng đ ng c a trình t A3-F v i trình t gen

HBB và v trí b t c p c a m i HBB1-R 43 Hình 1: M c đ t ng đ ng c a trình t 7 (AF007546) và trình t 9 (U01317) trên

Seaview 53 Hình 2: K t qu Blast c a trình t 7 (AF007546) trên NCBI 54 Hình 3: K t qu ki m tra đ đ c hi u c a c p m i HBB1-F và HBB1-R b ng ph n

m m Annhyb 55 Hình 4: M c đ t ng đ ng c a trình t A3-F và trình t gen HBB 56

Hình 5: M c đ t ng đ ng c a trình t A3-R và trình t gen HBB 57

M C L C

PH N I: T NG QUAN

I.1 T NG QUAN V B NH THI U MÁU H NG C U HÌNH LI M 3

I.1.1 T ng quan v gen HBB (beta-hemoglobin)[44] 3

I.1.1.1 Gen HBB[44] 3

I.1.2 B nh h ng c u hình li m (Sickle cell disease, SCD) 4

I.1.2.1 nh ngh a b nh h ng c u hình li m (SCD) 4

I.1.2.2 Các th b nh h ng c u hình li m 5

I.1.2.3 D u hi u c a b nh h ng c u hình li m 5

I.1.3 B nh h ng c u hình li m th HbSS[24] 7

I.2 TÌNH HÌNH B NH THI U MÁU H NG C U HÌNH LI M 8

I.2.1 Tình hình trên th gi i 8

I.2.2 Tình hình b nh Vi t Nam 10

I.3 BI N CH NG C A B NH THI U MÁU H NG C U HÌNH LI M 10

I.3.1 t qu .10

I.3.2 H i ch ng ng c c p tính (ACS) 10

I.3.3 T n th ng c quan m n tính 11

I.4 TÁC NG C A B NH THI U MÁU H NG C U HÌNH LI M 11

I.5 CÁC PH NG PHÁP CH N OÁN B NH THI U MÁU H NG C U HÌNH LI M

13 I.5.1 Xét nghi m máu 13

I.5.2 Xét nghi m c n lâm sàng 13

i n di hemoglobin 13

I.5.4 Ph ng pháp PCR (Polymerase chain reaction) 14

I.5.5 Ph ng pháp gi i trình t .15

I.5.6 M t s ph ng pháp khác 16

PH N II: V T LI U VẨ PH NG PHÁP NGHIÊN C U II.1 V T LI U 18

II.2 PH NG PHÁP NGHIÊN C U 18

II.2.1 Khai thác d li u 18

II.2.2 Kh o sát in silico ậ thi t k m i 18

II.2.3 Kh o sát th c nghi m 19

II.2.3.1 Tách chi t DNA 19

II.2.3.2 Ki m tra ch t l ng DNA thu nh n b ng ph ng pháp đo quang ph 20 II.2.3.3 Ph n ng PCR 21

II.2.3.4 Ph ng pháp đi n di 23

II.2.3.5 Ph ng pháp gi i trình t .24

PH N III: K T QU VÀ BÀN LU N III.1 KHAI THÁC D LI U 26

III.1.1 Thu th p bài báo 26

III.1.2 Thu th p trình t gen HBB 27

III.1.3 Thu th p b m i xác đ nh đ t bi n gen HBB 29

III.2 KH O SÁT IN SILICO 30

III.2.1 Trình t gen HBB 30

III.2.2 Trình t m i 30

III.3 KH O SÁT TH C NGHI M 35

III.3.1 K t qu đo OD 35

III.3.2 K t qu ph n ng PCR vƠ đi n di 36

III.3.3 K t qu gi i trình t .41

PH N IV: K T LU N VẨ NGH IV.1 K T LU N 45

IV.1.1 Khai thác d li u 45

IV.1.2 Kh o sát in silico 45

IV.1.3 Kh o sát th c nghi m 45

IV.2 NGH .46

TÀI LI U THAM KH O 47

PH L C 53

T V N

Thi u máu h ng c u hình li m th HbSS (Sickle Hemoglobin) là m t d ng

b nh lý di truy n v máu, tính ch t gia đình, th đ ng h p, do đ t bi n đi m (GAG

GTG) exon 1 c a gen – globin d n đ n s thay th c a acid glutamic thành

valine (Glu6Val) v trí acid amin th sáu c a chu i polypeptide ậ globin làm

bi n đ i HbA thành HbS Th HbSS hình thành các t bào h ng c u hình li m gây

thi u máu, d n đ n s t c ngh n m ch máu, nhi m trùng và t n th ng m t s c

quan quan tr ng trong c th con ng i, có th làm gi m tu i th và gây t vong cho ng i b nh

Hi n nay, trên th gi i có nhi u công trình nghiên c u v ch n đoán b nh

HbSS và các b nh lý khác thu c nhóm SCD (Sickle cell disease) Tuy nhiên, Vi t Nam v n ch a có s li u v tình hình b nh c ng nh các công trình nghiên c u

phân t v b nh HbSS Do v y, nh m góp ph n tìm hi u thông tin v b nh di truy n HbSS Vi t Nam, chúng tôi th c hi n chuyên đ nghiên c u:

ắB C U TÌM HI U K THU T SINH H C PHÂN T TRONG

C U HÌNH LI M”.

M c tiêu nghiên c u t ng quát:

Tìm hi u thông tin v b nh di truy n HbSS Vi t Nam

N i dung nghiên c u:

Chúng tôi ti n hành thu th p tài li u, đánh giá tình hình b nh h ng c u hình

li m do đ t bi n trên gen – hemoglobin (HBB) Vi t Nam và trên th gi i

Kh o sát in silico, thi t k m i phù h p nh m phát hi n đ t bi n trên gen HBB

gây b nh thi u máu di truy n

B c đ u xây d ng quy trình d a trên k thu t PCR nh m tìm hi u v đ t

bi n gây b nh thi u máu h ng c u hình li m th HbSS trên gen HBB trên các m u

b nh ph m

PH N I: T NG QUAN

I.1 T NG QUAN V B NH THI U MÁU H NG C U HÌNH

Hemoglobin đ c c u t o b i b n chu i globin bao g m 2 lo i hemoglobin: [2]

 Hemoglobin bào thai (HbF) có hai chu i vƠ hai chu i ( β β)

 Hemoglobin ng i l n (HbA) có hai chu i vƠ hai chu i ( β β)

M i ti u đ n v protein c a hemoglobin mang m t phân t heme Phân t này

c n cho các t bƠo máu đ đ l y oxy t ph i và cung c p cho các t bào kh p c

th M t hemoglobin hoàn ch nh có kh n ng mang b n phân t oxy cùng m t lúc

(m t phân t oxy g n v i m t phân t heme).[44]

I.1.2 B nh h ng c u hình li m (Sickle cell disease, SCD)

I.1.2.1 nh ngh a b nh h ng c u hình li m (SCD)

B nh h ng c u hình li m (Sickle cell disease - SCD) là m t d ng b nh lý di truy n v máu, th đ ng h p v i các d ng đ t bi n đi m trên gen HBB (HbS, HbC,

HbD, HbE, ầ) d n đ n vi c t ng h p ậ globin b t th ng t o ra c u trúc phân t

hemoglobin hình li m làm gi m ho c ng n c n quá trình v n chuy n O2 đ n t

bào.[1,24,44]

Các d ng b t th ng c a ậ globin th ng x y ra v i m t ti u đ n v ậ

globin b bi n đ i thành hemoglobin S (HbS), ti u đ n v ậ globin còn l i b đ t

bi n thành hemoglobin C (HbC), hemoglobin E (HbE), [44]

Các d ng b nh h ng c u hình li m:

 D ng b nh HbSS: d ng b nh h ng c u hình li m HbSS x y ra do s đ t bi n

trên gen HBB đƣ t o nên các ti u đ n v ậ globin th HbS Th hemoglobin S đ c hình thƠnh do đ t bi n đi m (GAG GTG) exon 1

c a gen – globin d n đ n s thay th c a acid glutamic thành valine v trí

acid amin th 6 (Glu6Val) d n đ n vi c t o d ng b t th ng c a -globin là

HbS (hemoglobin S).[7,25,44]

 D ng b nh HbSC: d ng b nh h ng c u hình li m HbSC x y ra do s đ t

bi n trên gen HBB đƣ t o nên các ti u đ n v ậ globin th HbS và HbC

Th hemoglobin C (HbC) đ c hình thành do s thay th c a glutamic b ng

lysine v trí acid amin th 6 (vi t là Glu6Lys) M c đ nghiêm tr ng c a

hemoglobin E (HbE) hình thành do s thay th glutamic b ng lysine v trí acid amin 26 (vi t là Glu26Lys) V i d ng b nh nƠy, ng i b nh có th có

các d u hi u và tri u ch ng nghiêm tr ng liên quan đ n thi u máu h ng c u

hình li m nh các đ t đau [10,44], thi u máu và ch c n ng lách b t

th ng.[44]

 D ng b nh HbSD: d ng b nh h ng c u hình li m HbSD x y ra do s đ t

bi n trên gen HBB đƣ t o nên các ti u đ n v ậ globin th HbS và HbD

Th hemoglobin D (HbD) hình thành do s thay th glutamic b ng glutamin

v trí acid amin 121.[2]

 M t d ng b nh khác là HbS BetaThal, đ c gây ra b i đ t bi n hemoglobin

S (HbS) và beta thalassemia xu t hi n cùng nhau Các d u hi u và tri u

B ng I.1 Các đ c đi m lâm sàng c a b nh h ng c u hình li m

 S t, đau kh p, đau b ng, đau x ng

 Vàng da, thi u máu, tan máu m n, có c n tan

B ng I.2 Các đ c đi m sinh h c c a b nh h ng c u hình li m

Thi u máu h ng c u hình li m th HbSS là m t b nh di truy n đ ng h p l n,

do đ t bi n đi m (GAG GTG) exon 1 c a gen – globin d n đ n s thay th

c a acid glutamic thành valine (Glu6Val) v trí acid amin th sáu c a chu i

polypeptide ậ globin làm bi n đ i HbA thành HbS gây thi u máu h ng c u hình

li m th HbSS [7,25,44] Thi u máu h ng c u li m là d ng b nh lý r i lo n liên

quan đ n máu, nh h ng t i phân t hemoglobin và làm cho toàn b t bào máu thay đ i hình d ng K t qu c a đ t bi n này là vi c s n xu t m t d ng b t th ng

c a -globin là HbS.[44]

Ng i b b nh thi u máu h ng c u hình li m th HbSS do nh n y u t di

truy n th HbS t c cha và m Do đó ng i b nh có tri u ch ng thi u máu

h ng c u hình li m gây ra b i s thay th 2 ti u đ n v ậ globin b ng HbS.[25]

I.2 TÌNH HÌNH B NH THI U MÁU H NG C U HÌNH

LI M

I.2.1 Tình hình trên th gi i

B nh h ng c u hình li m l n đ u tiên đ c công nh n là m t r i lo n v huy t

h c do Herrick đ a ra vƠo n m 1910 N m 1949, Pauling công b nghiên c u v

m t lo i huy t c u t b t th ng chi t xu t t h ng c u các b nh nhân thi u máu có

h ng c u hình li m [15,25], đơy là m t c n b nh phân t [15]

Theo báo cáo c a T ch c y t th gi i (World Health Organisation, WHO)

các b nh v r i lo n di truy n hemoglobin ban đ u đ c tr ng c a vùng nhi t đ i và

c n nhi t đ i nh ng hi n nay ph bi n trên toàn th gi i do di c [6,25] B nh thi u

máu h ng c u hình li m là b nh ph bi n trên th gi i B nh th ng g p nh t

nh ng ng i Châu Phi, các n c vùng a Trung H i nh Hy L p, Th Nh K

vƠ ụ, bán đ o R p, n và khu v c ti ng Tây Ban Nha Nam M , Trung M (đ c bi t là Panama), và các b ph n c a vùng bi n Caribean.[25]

B nh h ng c u hình li m tác đ ng t i h n 1γ tri u ng i trên toàn th gi i và

nh h ng đ n h n 70.000 ng i t i Hoa K và có ít nh t 75.000 ca nh p vi n t n

trên 500 tri u USD m i n m đ đi u tr các bi n ch ng c a b nh h ng c u hình

li m (SCD) [19] c tính có kho ng 1/500 ng i M g c Phi vƠ 1/1000 đ n 1/1400 ng i M g c Tây Ban Nha b m c b nh này [21,24] Có kho ng 2 tri u

ng i M ho c 1/1β ng i M g c Phi mang đ c đi m h ng c u hình li m [24]

Brazil s ph bi n c a b nh thi u máu h ng c u hình li m đ c c tính t β5.000 đ n γ0.000 tr ng h p [21] tu i m c b nh Brazil t nh nhi đ n

ng i tr ng thành v i t l t vong cao nh t t 0 ậ 9 tu i: 31%, t l nam n mang

b nh t ng đ ng nhau v i t l là nam 47,6% và n 52,4% [31]

SCD là b nh ph bi n Châu Phi t i ti u vùng Sahara n i s t rét đ c tìm

th y [24,14] Các ki u gen đ c tr ng lƠ HbSS vƠ HbSC chi m u th trong dân s

mang b nh h ng c u hình li m c a Ghana T l th mang b nh trong dân s là 30% trong khi có 2% tr s sinh Ghana b b nh h ng c u hình li m [14] Tanzania

b nh xu t hi n các nhóm tu i t tr em đ n ng i tr ng thành và có t l t

vong cao nh t nhóm tu i <5 tu i (9,1%), tu i m c b nh c a nam trung bình là 7

tu i và tu i m c b nh c a n trung bình là 9 tu i [30]

n , hemoglobin hình li m là r i lo n di truy n ph bi n nh t trong các

b l c Trung và Nam n Hemoglobin hình li m l n đ u tiên đ c phát hi n

t m t b l c mi n Nam n vƠo n m 195β [22] n m i n m có kho ng

5.200 tr em sinh ra b b nh h ng c u hình li m (SCD) [46]

R i lo n hemoglobin ban đ u l u hƠnh 60% c a 229 qu c gia, nh h ng

đ n 75% các ca sinh, nh ng bơy gi ph bi n 71% qu c gia v i 89% ca sinh

Theo T ch c y t th gi i (WHO) có ít nh t 5,2% dân s th gi i vƠ h n 7% ph

n mang thai mang m t bi n th hemoglobin b t th ng [14] Hemoglobin S chi m

40% c a các th mang nh ng gơy ra h n 80% các r i lo n: kho ng 85% các r i

lo n h ng c u li m, và h n 70% c a t t c các ca sinh b nh h ng x y ra châu

Phi Ngoài ra, ít nh t 20% dân s th gi i mang thalassemia

Kho ng 1,1% các c p v ch ng trên toàn th gi i có nguy c có con b m t r i

lo n hemoglobin và 2,7/1000 tr ng h p th thai b nh h ng T l sinh b nh

h ng c tính là 2,55/1000 tr em b nh h ng nhi u nh t các n c có thu nh p

cao v i m t r i lo n m n tính, trong khi tr em đ c sinh ra các n c có thu nh p

th p h u h t ch t tr c 5 tu i: v i t l t vong tr em d i 5 tu i trên toàn th

gi i là 3,4% ho c 6,4% châu Phi

I.2.2 Tình hình b nh Vi t Nam

Vi t Nam cho đ n n m β014, v n ch a có s li u th ng kê nào c th v

tình hình b nh thi u máu h ng c u hình li m, đi u này ch ng t các công trình

nghiên c u phân t v b nh này t i Vi t Nam còn r t ít Chính vì v y vi c nghiên

c u này r t thi t th c vƠ nên đ c ti n hƠnh đ tìm hi u tình hình b nh Vi t Nam

I.3 BI N CH NG C A B NH THI U MÁU H NG C U HÌNH LI M

B nh có ph r ng gây ra r t nhi u bi n ch ng Ph bi n nh t là bi n ch ng do các t bào h ng c u hình li m làm gi m kh n ng v n chuy n O2 tr em các

h ng c u hình li m không có kh n ng di chuy n đ n các mô, c quan khác trong

c th ( đ ng trong lách) Do v y, b nh h ng c u hình li m d n đ n nguy c thi u máu đ t ng t có th gây t vong tr em Tr em t 6 đ n 18 tháng tu i b b nh

th ng b s ng đau bƠn tay và/ho c bàn chân (h i ch ng tay-chân) Ng i tr ng

b nh nhân thi u máu h ng c u hình li m Nguyên nhơn th ng g p do nh i máu

ph i, các t bào h ng c u hình li m ch n m ch máu, t y x ng ACS lƠ bi n ch ng

ph bi n th hai c a SCD, v i t l 1β,8 tr ng h p trên 100 b nh nhơn/n m Bi n

ch ng d ng này gây ra kho ng β5% tr ng h p t vong đ i v i b nh này.

SCD thì ch c n ng c a th n không t t, có th ti n tri n đ n suy th n

m t t l nh b nh nhơn ng i l n và có th d n đ n h i ch ng th n h

 Ho i t các vùng mang tr ng l ng nh x ng đùi c a hông và các

kh p l n do k t qu c a thi u máu c c b , l p đi l p l i vi c nh i máu

kh p, x ng, vƠ các s n t ng tr ng Bi n ch ng nƠy có liên quan đ n đau m n tính và tàn t t

 Bi n ch ng m t: nh i máu trên khuôn m t có th d n đ n sa mí m t,

khi nh ng m ch máu nh cung c p oxy cho võng m c, các mô m t sau c a m t b ch n b i các t bào h ng c u hình li m, d n đ n tình

tr ng g i là b nh võng m c, b nh võng m c t ng sinh, xu t huy t th y

tinh th và bong võng m c, d n đ n mù lòa

Bên c nh đó m t s bi n ch ng gây ra b i HbSS bao g m: t ng áp ph i có th

gây ng t, t vong Bi n ch ng chi có th gây l loét, ho i t , có th d n đ n nhi m

trùng toàn thân và bi n ch ng x hóa c

LI M

 i v i tr em

B nh nh h ng đ n s c kh e c a tr em c v th ch t l n trí tu T l t

vong c a tr em d i 5 tu i chơu Phi lƠ 5% vƠ 16% tr ng h p t vong các

qu c gia tây Phi

Tr em v i SCA th ng xuyên ngh h c nh h ng đ n quá trình ti p thu ki n

c c b nh ng ng i có SCA lƠ cao h n b n l n tr em 2-15 tu i, cao h n b t c

l a tu i khác [23,43] Các tr ng h p b đ t qu do thi u máu c c b chi m 12%

các ca t vong tr em b b nh SCA [24] B nh nhân h ng c u hình li m d i 15

tu i có nguy c phát tri n t n th ng m ch máu nƣo h n so v i nh ng ng i trên

15 tu i [43] Tr em SCA c ng có th phát tri n nh i máu não im l ng, trong đó liên quan đ n suy gi m nh n th c và k t qu h c t p kém [23] Kho ng 11% b nh nhân

d i 20 tu i b đ t qu [13] 75% c a 300.000 ca sinh trên toàn c u b nh h ng

[30,41], c tính 50-80% nh ng b nh nhân này s ch t tr c khi tr ng thành

I.5 CỄC PH NG PHỄP CH N OỄN B NH THI U MÁU

H NG C U HÌNH LI M

I.5.1 Xét nghi m máu

Xét nghi m máu có th ki m tra hemoglobin S Hoa K , xét nghi m máu là

m t ph n c a sàng l c s sinh th ng đ c th c hi n t i b nh vi n ng i l n,

m u máu đ c l y t t nh m ch cánh tay tr nh và tr s sinh, các m u máu

th ng đ c thu th p t m t ngón tay ho c gót chân M u nƠy đ c g i đ n phòng

thí nghi m đ sàng l c hemoglobin S

Xét nghi m âm tính là không có t bào h ng c u hình li m N u xét nghi m là

d ng tính, các xét nghi m thêm c n đ c th c hi n đ xác đ nh s có m t c a gen

t bào h ng c u hình li m.[48]

I.5.2 Xét nghi m c n lâm sàng

Huy t đ : th hi n thi u máu h ng c u bình th ng Xét nghi m phi u đ máu

nhu m khô có th nhìn th y vài t bào h ng c u hình l i li m (hình m t tr ng l i

li m v i hai đ u kéo dài và nh n) Th ng hay th y t ng b ch c u trong th i gian

có c n

Th nghi m t o hình li m: nh ng h ng c u hình li m s nhìn th y đ c d i

nh h ng c a m t ch t kh (nh m t gi t Metabisulfit Na 2% vào m t gi t máu),

ch t kh oxy này s làm gi m đ hòa tan c a hemoglobin S

I.5.3 i n di hemoglobin [47]

K thu t đi n di hemoglobin đ c áp d ng đ u tiên vào th p niên 19γ0, sau đó

đ c áp d ng r ng rãi trong ch n đoán b nh ng i trong nh ng n m 1950 ậ 1960

K thu t này cho phép phát hi n các d ng đa hình (polymorphism) ng i d a trên

nguyên t c có s đ t bi n trên trình t DNA mã hóa cho gen có th d n đ n s khác

bi t trình t acid amin trong trình t protein

K thu t đi n di hemoglobin giúp phân tách các th Hb khác nhau (s khác

bi t m c t ng amino acid)

I.5.4 Ph ng pháp PCR (Polymerase chain reaction)

Ph ng pháp PCR ra đ i b i Karl Mullis và c ng s vƠo n m 1985.[4,5]

 Nguyên t c c a ph ng pháp PCR:

S sao chép DNA x y ra khi có s tham gia c a DNA polymerase giúp t ng

h p m ch DNA m i khi đo n m i b t c p v i m ch DNA khuôn v i v t li u là các dNTP trong đi u ki n phù h p Ph n ng PCR là s khu ch đ i DNA m ch khuôn

theo c p s nhân, m i ph n ng PCR g m nhi u chu k n i ti p nhau, m i chu k

g m ba b c:

B c 1: Trong h n h p ph n ng có đ y đ thành ph n (dNTP, Mg2+, Taq polymerase, DNA m ch khuôn) DNA m ch khuôn b bi n tính b i tác nhân nhi t

đ thành m ch đ n Nhi t đ này ph i cao h n Tm (melting temperature ậ nhi t đ

nóng ch y c a DNA) c a phân t DNA khuôn m u, th ng vào kho ng 94 ậ 950C trong vòng 30 giây ậ 1 phút ơy lƠ giai đo n bi n tính (denaturation).[4]

B c 2: LƠ giai đo n lai (hybridization), các m i b t c p đ c hi u v i m ch

khuôn nhi t đ thích h p (th p h n Tm c a các m i) Nhi t đ ph n ng giai

đo n này ph thu c vào Tm m i s d ng, th ng dao đ ng trong kho ng 40 ậ 700

C, kéo dài t 30 giây ậ 1 phút

B c 3: nhi t đ đ c t ng lên kho ng 720

C, là kho ng nhi t đ thích h p cho

DNA polymerase ho t đ ng giúp t ng h p m ch s n ph m Th i gian tùy thu c đ

dài c a trình t DNA c n khu ch đ i, th ng kéo dài t γ0 giơy đ n nhi u phút

ơy lƠ giai đo n kéo dài (elongation)

Hình I.2: Hình nh mô t các b c trong ph n ng PCR (P1 và P2: các

đo n m i-Primers) [49Error! Reference source not found.]

K thu t PCR dùng đ ch n đoán tr c sinh c a b nh h ng c u hình li m đƣ

đ c các nhà khoa h c áp d ng t n m 1989 [33] và hi n nay v n lƠ ph ng pháp

thích h p đ c l a ch n trong các phòng thí nghi m nghiên c u v b nh lâm sàng

I.5.5 Ph ng pháp gi i trình t

K thu t phân tích trình t gen b ng máy t đ ng d a trên nguyên t c Sanger

s d ng 4 lo i dideoxynucleotide triphosphat (ddNTP) đ c đánh d u b ng 4 màu

hu nh quang khác nhau đ k t thúc chu i DNA K thu t phân tích trình t gen tr c

ti p b ng máy t đ ng có th phân tích 300 ậ 1000 nucleotide trong 1 ph n ng K

thu t đ c ng d ng ch y u đ phát hi n nhanh đ t bi n đi m ho c xóa đo n ng n

Ph n ng gi i trình t t ng t nh PCR, nh ng ch s d ng m t m i duy nh t

Bi n tính

B t c p

Kéo dài

do đó ch nh n đ c chu i DNA đ n V i s hi n di n c a các ddNTP ph n ng có

th k t thúc ng u nhiên b t c v trí nào Nên k t qu cu i cùng là t o nên nhi u

đo n DNA đ n có đ dƠi khác nhau đ c g n hu nh quang c a ddNTP đ u 3'

S n ph m sau đó đ c đi n di mao qu n, đo n kích th c ng n di chuy n nhanh

h n đo n kích th c dài H th ng ph n m m gi i trình t s th c hi n vi c phân

bi t kích c các đo n DNA, ghi l i d li u màu hu nh quang d i d ng các đ nh

s c ph [27]

I.5.6 M t s ph ng pháp khác

 Ph ng pháp SNP (Single Nucleotide Polymorphism)

SNP (single nucleotide polymorphism) là ph ng pháp xác đ nh đ c các

d ng allele đ t bi n ho c hoang d i d a trên s đ t bi n t i v trí m t nucleotide c a

PH N II: V T LI U VẨ PH NG

PHÁP NGHIÊN C U

II.1 V T LI U

Trong nghiên c u này chúng tôi s d ng 3 m u b nh ph m máu c a b nh nhân

b b nh thi u máu di truy n đ c cung c p b i Trung tâm Ch n đoán Y khoa Medic

(Hòa H o)

II.2.1 Khai thác d li u

Khai thác thông tin, d li u v gen nghiên c u trên ngân hàng d li u c a

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) Chúng tôi s d ng PubMed, PubMed Central đ tìm

ki m các bƠi báo, các công trình nghiên c u v đ t bi n trên gen HBB, các ph ng pháp đ c s d ng đ phát hi n đ t bi n, nh m xác đ nh đ t bi n trên gen c ng

nh ph ng pháp phát hi n đ t bi n thích h p, phù h p v i đi u ki n phòng thí nghi m

II.2.2 Kh o sát in silico ậ thi t k m i

Thu nh n trình t nucleotide gen HBB (hoang d i vƠ đ t bi n) trên ngơn hƠng

gen NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)

đ c s d ng trong quá trình phơn tích, kh o sát các c p m i:

 IDT analyzer (www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/):

giúp xác đ nh các thông s quan tr ng c a m i nh kích th c, thƠnh

ph n GC, nhi t đ lai, kh n ng t o hairpin loop, primer-dimer,

hetero-dimer,

 Annhyb: ki m tra v trí b t c p c a m i vƠ kích th c s n ph m

 BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) v i các thông s m c đ nh s n trên NCBI: nh m xác đ nh đ đ c hi u c a h - c p m i

 Seaview4: so sánh s t ng đ ng c a hai hay nhi u trình t sinh h c

II.2.3 Kh o sát th c nghi m

II.2.3.1 Tách chi t DNA

 Nguyên t c:

Chúng tôi s d ng ph ng pháp phenol/chloroform đ tách chi t DNA Trong

đó, mƠng t bƠo vƠ mƠng nhơn đ c bi n tính b ng ch t t y m nh Sau đó protein

s đ c bi n tính b ng phenol/chloroform vƠ b lo i b DNA b gen s đ c t a

v i ethanol l nh

 Thi t b vƠ hóa ch t

 Thi t b :

 Máy ly tơm l nh (Hettich)

 B n nhi t (Thermo Final Test)

B c β: B sung 500 µl H2O, vortex 10.000 vòng/phút trong 5 phút.

B c γ: B sung m t th tích dung d ch ly gi i (NaCl 5M, Tris - HCl 1M (pH

8), EDTA 0,5M (pH 8), SDS 10%, H2O), vƠ proteinase K (18,5 mg/ml), tr n đ u Sau đó, đem d ch 56oC trong β4 gi

B c 4: B sung m t th tích phù h p dung d ch phenol:chloroform (t l 1:1)

Ly tâm 13.000 vòng/phút trong γ phút, nhi t đ phòng Thu d ch n i, chuy n sang eppendorf m i

B c 5: B sung m t th tích dung d ch chloroform Ly tơm 1γ.000 vòng/phút trong γ phút, nhi t đ phòng Thu d ch n i

B c 6: Thêm 0,β l n th tích Ammonium acetate 5M vƠ β,5 l n th tích Ethanol tuy t đ i (tr l nh) Ly tơm 1γ.000 vòng/γ0 phút, 4oC Thu t a

B c 7: R a t a l i b ng Ethanol 70%, ly tơm 1γ.000 vòng/15 phút, 4o

C

Thu t a, đ khô t nhiên B sung 50µl dung d ch TE, b o qu n -20oC

II.2.3.2 Ki m tra ch t l ng DNA thu nh n b ng ph ng pháp đo quang ph

 Thi t b vƠ hóa ch t:

 Thi t b : Máy đo quang ph (Bio Rad)

 Thi t b : Máy PCR (Bio Rad)

 Hoá ch t: Mastermix 2X (Taq pol)

M i (IDT)

N c c t hai l n

 Các b c ti n hƠnh:

Ph n ng PCR đ c ti n hƠnh trong th tích β5µl v i c p m i HBB1-F và HBB1-R, thƠnh ph n vƠ chu k nhi t c a ph n ng PCR nh B ng II.1 vƠ B ng II.β

B ng II.2 Chu k nhi t cho ph n ng PCR v i c p m i HBB1-F và

HBB1-R

B c Nhi t đ

( 0 C)

Th i gian S chu k

B ng II.4 Chu k nhi t cho ph n ng PCR v i c p m i HBB2-F và

HBB2-R

B c Nhi t đ

( 0 C)

Th i gian S chu k

đ c ghi l i d i tia t ngo i (UV) nh ethidium bromide Ch t nƠy có kh n ng

g n xen vƠo gi a các base c a acid nucleic vƠ phát quang d i tác d ng c a tia t ngo i ( =γ00 nm) Kích th c c a các acid nucleic s đ c xác đ nh khi so sánh

v i kích th c đƣ bi t tr c c a thang chu n

 Thi t b , hóa ch t:

 Thi t b : Bu ng đi n di (Bio Rad)

Máy đ c gel (Bio Rad)