Khảo sát tính đề kháng kháng sinh của nhóm trực khuẩn gram âm Pseudomonas Aeruginosa, Klebsiella Pneumoniae được phân lập từ bệnh phẩm dịch đường hô hấp dưới tại Bệnh viện Nhi Đồng 2 từ tháng 11 năm 2013 đến tháng 04 năm 2014

DANH M C CH VI T T T ADH: Arginine decarboxylase AMP: Ampiciline AMS: Ampicillin ậ sulbactam AUG: Amoxcillin ậ clavulanic acid BA: Blood agar BCP: Bromocresol purpe agar CA: Chocolate ag



BÁO CÁO KHÓA LU N T T NGHI P

Tên đ tài:

KH O SỄT TệNH KHÁNG KHÁNG SINH C A NHÓM TR C KHU N GRAM ÂM: PSEUDOMONAS

THỄNG 11/2013 N THÁNG 04/2014 KHOA CÔNG NGH SINH H C

CHUYÊN NGHÀNH: VI SINH ậ SINH H C PHÂN T

GVHD : ThS.BS Tr n Th Ng c Anh SVTH : Lê Th T Quyên

MSSV : 1053010622 KHÓA : 2010-2014

Tp H Chí Minh, tháng 04, n m 2014

Ng c Anh, tr ng khoa Vi sinh B nh vi n Nhi ng II, ng i đƣ t n tình h ng

d n, ch b o, giúp đ em trong su t quá trình h c, th c hi n và hoàn thành t t bài

báo cáo th c t p t t nghi p này

Xin g i l i c m n đ n Ban Giám đ c b nh vi n Nhi ng II đƣ đ ng ý và

t o đi u ki n cho em th c t p t i khoa Vi sinh c a b nh vi n

Em xin g i l i c m n chơn thƠnh đ n quý cô Nguy n Th Ánh H ng và các

anh ch trong khoa Vi sinh B nh vi n Nhi ng II V i s h ng d n và nhi t tình giúp đ , trao đ i kinh nghi m đƣ b sung nh ng ki n thúc chuyên môn cho em,

giúp em có thêm nhi u ki n th c trong su t quá trình th c t p

Em xin chân thành c m n Ban giám hi u nhƠ tr ng và các th y cô trong

khoa Công ngh sinh h c đƣ truy n đ t cho em nh ng ki n th c quý báu và t o đi u

ki n cho em trong su t th i gian h c và rèn luy n t i tr ng

Cu i cùng, xin g i l i c m n đ n gia đình, th y cô, anh ch , b n bè đƣ giúp

đ cho em trong quá trình th c t p t t nghi p t i b nh vi n Nhi đ ng II

Em xin chân thành c m n!

Tp H Chí Minh, Ngày 17 tháng 06 n m 2014

LÊ TH T QUYÊN

Tp H Chí Minh, Ngày tháng n m 2014

(Ký và ghi h tên)

M C C

T V N 1

CH NG 1 T NG QUAN TÀI LI U 5

1.1 TÌNH HÌNH NHI M TRỐNG NG HÔ H P D I 6

1.1.1 Trên th gi i 6

1.1.2 Vi t Nam 7

1.1.3 Các tri u ch ng lâm sàng 8

1.1.4 Các v n đ liên quan nhi m trùng đ ng hô h p d i 8

1.2 I T NG VI KHU N NGHIÊN C U 8

1.2.1 Vi khu n Klebsiella pneumoniae 9

1.2.2 Vi khu n Pseudomonas aeruginosa 10

1.3 KHỄNG SINH VẨ KHÁNG KHÁNG SINH 11

1.3.1 Kháng sinh 11

1.3.2 kháng kháng sinh 15

CH NG 2 I T NG, V T LI U VẨ PH NG PHỄP NGHIểN C U 21

2.1 TH I GIAN VẨ A I M NGHIÊN C U 22

2.2 V T LI U NGHIÊN C U 22

2.2.1 V t li u thí nghi m 22

2.2.2 Môi tr ng ậ sinh ph m 22

2.2.3 Thi t b ậ d ng c 23

2.3 PH NG PHỄP NGHIểN C U 24

2.3.1 Phân l p đ nh danh vi khu n 24

2.4 TH NGHI M KHỄNG SINH 38

2.4.1 Môi tr ng và sinh ph m 38

2.4.2 Ph ng pháp th c hi n (theo ph ng pháp Kirby Bauer) 38

2.4.3 Ph ng pháp th nghi m kh n ng sinh ESBL 39

CH NG 3 K T QU VÀ TH O LU N 41

3.1 T L PHÂN L P NH DANH KLEBSIELLA PNEUMONIAE VÀ

PSEUDOMONAS AERUGINOSA TRONG M U B NH PH M HÔ H P

D I 42

3.2 T L NHI M KLEBSIELLA PNEUMONIAE VÀ PSEUDOMONAS AERUGINOSA THEO TU I 44

3.3 T L KLEBSIELLA PNEUMONIAE VÀ PSEUDOMONAS AERUGINOSA C PHÂN L P THEO GI I TÍNH 45

3.4 NH Y C M KHÁNG SINH C A KLEBSIELLA PNEUMONIAE VÀ PSEUDOMONAS AERUGINOSA 47

3.5 T L SINH ENZYME ESBL C A KLEBSIELLA PNEUMONIAE VÀ PSEUDOMONAS AERUGINOSA 51

3.6 TH O LU N 52

CH NG 4 K T LU N VÀ KI N NGH 58

4.1 K T LU N 59

4.2 NGH 59

TÀI LI U THAM KH O 61

PH L C 65

DANH M C CH VI T T T

ADH: Arginine decarboxylase

AMP: Ampiciline

AMS: Ampicillin ậ sulbactam

AUG: Amoxcillin ậ clavulanic acid

BA: Blood agar

BCP: Bromocresol purpe agar

CA: Chocolate agar

CAZ: Ceftazidime

CIP: Ciprofloxacine

CTX: Cefotaxime

CXM: Cefuroxime

CFU: Colony forming unit

CLSI: Clinical and Laboratory Standards Institute

CS: Colistin

DNA: Desoxyribonucleic acid

E coli: Escherichia coli

ESBL: Extended Spectrum Beta ậ Lactamases

FEP: Cefepime

FOX: Cefoxitine

GN: Gentamycine

IMI: Imipenem

K pneumoniae: Klebsiella pneumoniae

KIA: Kligler Iron Agar

KS: Kháng sinh

LEV: Levofloxacine

LDC: Lysine decarboxylase

LPS: Lipopolyshacharide

MRP: Meropenem

MIC: Minimum Inhibitory Concentration

MHA: Mueller Hinton agar

ODC: Ornithine decarboxylase

p ậ: para ậ

p ậ DMABA: para ậ Dimethylaminobenzaldehyd

P aeruginosa: Pseudomonas aeruginosa

PABA: para ậ aminobenzoic acid

PBP: Penicillin binding protein

S pneumoniae Streptococcus pneumoniae

DANH M C CÁC B NG

B ng 2.1 Thang đi m Barlett dùng đánh giá m u đƠm 29

B ng 2.2 Thang đi m Barlett dùng đánh giá m u hút qua m i (NTA), m u n i soi ph qu n (BW) 29

B ng 2.3 K t qu th nghi m sinh hoá: Klebsiella pneumoniae 37

B ng 2.4 K t qu th nghi m sinh hoá: Pseudomonas aeruginosa 38

B ng 3.1 S l ng vi khu n phân l p đ c t đ ng hô h p d i 42

B ng 3.2 T l Klebsiella pneumoniae chia theo đ tu i 44

B ng 3.3 T l Pseudomonas aeruginosa chia theo đ tu i 45

B ng 3.4 T l vi khu n đ c phân l p theo gi i tính 46

B ng 3.5 K t qu kháng sinh đ c a Klebsiella pneumoniae 47

B ng 3.6 K t qu kháng sinh đ c a Pseudomonas aeruginosa 49

B ng 3.7 T l vi khu n sinh ESBL 51

DANH M C CÁC HỊNH V

Hình 1.1 C ch đ kháng kháng sinh 17

Hình 2.1 Quy trình nuôi c y và phân l p vi khu n 24

Hình 2.2 S đ minh h a thƠnh t bƠo vi khu n Gram d ng (trái) vƠ Gram ơm (ph i) 26

Hình 2.3 C u khu n Gram d ng 26

Hình 2.4 Tr c khu n Gram âm 26

Hình 2.5 Quy trình nhu m Gram 28

Hình 2.6 Khu n l c Klebsiella pneumoniae trên môi tr ng CA 30

Hình 2.7 Khu n l c Klebsiella pneumoniae trên môi tr ng BA 30

Hình 2.8 Khu n l c Klebsiella pneumoniae trên môi tr ng BCP 31

Hình 2.9 Khu n l c Pseudomonas aeruginosa trên môi tr ng CA 31

Hình 2.10 Khu n l c Pseudomonas aeruginosa trên môi tr ng BA 31

Hình 2.11 S đ đ nh danh m t s vi khu n đ ng ru t th ng g p 32

Hình 2.12 S đ đ nh danh m t s tr c khu n Gram âm 33

Hình 2.13 K t qu th nghi m sinh hoá c a Klebsiella pneumoniae 37

Hình 2.14 Kháng sinh đ đ t cho Pseudomonas aeruginosa 39

Hình 2.15 Kh n ng sinh men ESBL c a vi khu n Klebsiella pneumoniae theo 2 ph ng pháp 40

Hình 3.1 a kháng sinh đ đ t cho tr c khu n Gram âm và k t qu sinh ESBL c a vi khu n 51

Hình 3.2 Pseudomonas aeruginosa sinh men  ậ lactamase type AmpC 52

Bi u đ 3.3 Bi u đ th hi n t l nhi m Klebsiella pneumoniae 2 đ tu i 44

Bi u đ 3.4 Bi u đ th hi n t l nhi m Pseudomonas aeruginosa 2 đ tu i 45

Bi u đ 3.5 Bi u đ th hi n s l ng Klebsiella pneumoniae và Pseudomonas

aeruginosa đ c phân l p theo gi i tính 46

Bi u đ 3.6 Bi u đ th hi n tính đ kháng kháng sinh c a Klebsiella pneumoniae

48

Bi u đ 3.7 Bi u đ th hi n tính đ kháng kháng sinh c a Pseudomonas

aeruginosa 50

T V N

Nhi m trùng là s xâm nh p c a vi sinh v t (bao g m các tác nhân gây b nh

nh virus, vi trùng, Mycoplasma, Chlamydia, n m, kỦ sinh trùngầ) vƠo c th con

ng i Ngày nay b nh nhi m trùng đang lƠ v n đ l n c a Y t th gi i, nh t là các

n c đang phát tri n B nh nhi m trùng đƣ xu t hi n t r t lơu nh ng con ng i ch

hi u rõ chúng trong kho ng m t th k tr l i đơy Hi n nay, b nh nhi m trùng

đ ng hô h p đang x y ra và là v n n n cho xã h i, đ c bi t là viêm ph i Viêm

ph i là b nh c nh nhi m trùng b nh vi n th ng g p, ch đ ng sau nhi m trùng

ti u Vì lây truy n b ng đ ng hô h p nên vi khu n d b phát tán và lan truy n

b nh nhanh chóng B nh có th x y ra v i b t c ai ho c nh ng ng i đang m c

b nh, h mi n d ch b suy gi m, đ c bi t là tr em h mi n d ch còn non y u ch a

có s c đ kháng đ i v i các tác nhân gây nhi m trùng Trong nhóm các vi khu n

gây b nh, tr c khu n Gram ơm lƠ tác nhơn th ng phân l p đ c nhi u nh t [6]

M t v n đ lo ng i h n lƠ kh n ng kháng thu c c a các vi khu n đ i v i các

lo i kháng sinh đang đ t ra cho nhân lo i nh ng thách th c m i Nh ng ch ng vi

khu n kháng thu c thông th ng là do s s d ng kháng sinh b t h p lý và thi u

ki m soát S kháng thu c mãnh li t c a Pseudomonas aeruginosa kháng v i cephalosporines th h th 3, các aminoglycosides vƠ fluoroquinolones đang gơy khó kh n cho vi c đi u tr nh ng b nh nhi m do vi khu n này

Trong s các vi khu n Gram ơm, vi khu n Gram ơm đ ng ru t ch u trách nhi m chính cho các nhi m trùng b nh vi n, c ch đ kháng chính là sinh men

beta ậ lactamases, vƠ đ kháng v i t t c kháng sinh nhóm beta ậ lactamines L n

đ u tiên, vi c sinh men beta ậ lactamases ph r ng (ESBL) lơy truy n qua plasmide

đ c phát hi n c n m 1983 vƠ sau đó M ESBL l n đ u ti n đ c xác đ nh

ch ng Klebsiella pneunomiae vƠ sau đó lan truy n nhanh chóng cho các vi khu n Gram ơm khác nh E coliầ Song song v i vi c đ kháng v i thu c nhóm beta ậ lactamines, s đ kháng v i nhóm fluoroquinolones đang cƠng ngƠy phát tri n [8]

Tr c khu n Gram âm d m c th ng có t l t vong cao không ch do c

ch sinh b nh khá ph c t p c a vi khu n Gram âm mà ngày nay còn do khó ch n

đ c kháng sinh thích h p ng th i, tr c khu n Gram âm d m c là các tác nhân hƠng đ u gây nhi m khu n Vi c s d ng kháng sinh m t cách lan tràn, không theo

ch đ nh c a bác s d n đ n tình tr ng các tr c khu n Gram ơm kháng đa kháng sinh ngƠy cƠng t ng gơy khó kh n trong quá trình đi u tr T ch c Y t th gi i đƣ bƠy

t nh ng lo ng i sâu s c tr c s gia t ng nhanh chóng c a các ch ng vi khu n

kháng thu c vƠ đƣ có nh ng khuy n cáo v vi c s d ng kháng sinh nh m kh ng

ch s phát tri n tính đ kháng c a vi khu n

Nh m góp ph n nghiên c u tính nh y c m v i các kháng sinh c a các vi khu n Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae ph c v cho các nghiên

c u lâm sàng, tôi th c hi n đ tài: ắKh o sát tính đ kháng kháng sinh c a nhóm

tr c khu n Gram âm: Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae đ c phân l p t b nh ph m d ch đ ng hô h p d i t i b nh vi n Nhi ng II t tháng 11/2013 đ n tháng 04/2014”

M C TIÊU

M c tiêu t ng quát

Xác đ nh m t s tr c khu n Gram ơm: Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella

pneumoniae th ng gơy b nh nhi m trùng hô h p trong các m u b nh ph m vƠ kh

n ng đ kháng kháng sinh c a chúng

M c tiêu chuyên bi t

 T l phơn l p các ch ng tr c khu n Gram ơm: Pseudomonas

aeruginosa, Klebsiella pneumoniae trong m u b nh ph m đƠm, d ch hút n i khí qu n, d ch r a ph qu n, d ch hút đƠm qua m i trên khí

qu n

 Xác đ nh t l phơn l p Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella

pneumoniae theo gi i tính

 Xác đ nh t l phơn l p Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella

pneumoniae theo đ tu i, kh o sát s liên quan v đ tu i vƠ m c đ nhi m khu n

 Kh o sát tình hình đ kháng kháng sinh c a Pseudomonas

aeruginosa, Klebsiella pneumoniae

 Xác đ nh kh n ng sinh enzyme  ậ lactamase ph r ng (ESBL) c a

vi khu n Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae

CH NG 1 T NG QUAN

1.1 TÌNH HÌNH NHI M TRỐNG NG HỌ H P D I

1.1.1 Trên th gi i

Nhi m trùng đ ng hô h p d i nh : viêm ph qu n c p, viêm ph i, đ t c p

b nh ph i t c ngh n mƣn tính lƠ m t trong nh ng nguyên nhơn chi m t l cao khi n b nh nhơn ph i nh p vi n, đ c bi t lƠ viêm ph i Theo T ch c Y t Th gi i,

viêm ph i là nguyên nhân t vong hƠng đ u tr em và nh ng ng i có h mi n

d ch suy y u M t s nghiên c u t i M và châu Âu cho th y t l t vong ng i

b nh m c nhi m khu n ph i b nh vi n do các tác nhân gây b nh đa kháng kháng

sinh b i nhóm tr c khu n Gram âm chi m trên 70% ng th i s xu t hi n c a các

ch ng vi khu n kháng thu c ngày càng nhi u lƠm gia t ng kh n ng m c b nh và

kh n ng lƠnh b nh là r t th p vì các ch ng vi khu n luôn luôn bi n đ i do quá trình

l m d ng thu c kháng sinh S phát hi n tình c ch ng vi khu n Klebsiella pneumoniae vƠo n m 2008 trong m t ca ch a tr cho m t b nh nhân 59 tu i ng i

Th y i n b nhi m khu n B nh vi n New Delhi đƣ t o s c ép l n cho các nhà

khoa h c do kh n ng kháng ch u c a nó r t m nh l i có m t chu i nh DNA có th

d dƠng trao đ i v i các lo i vi khu n khác lƠm t ng kh n ng bi n đ i c a vi khu n

hình thành nhi u ch ng kháng đa kháng sinh

Nhi m khu n hô h p c p tính là b nh lý ph bi n nh t trong b nh lý nhi khoa Tuy viêm ph i ch chi m 10 ậ 15% các tr ng h p nhi m khu n hô h p c p tính, nh ng l i gây m t t l t vong đáng k Theo UNICEF, h ng n m trên toƠn

th gi i có kho ng 3 tri u tr ch t vì viêm ph i Tuy đa s các tr ng h p t vong

x y ra nh ng n c đang phát tri n, nh ng viêm ph i v n là nguyên nhân gây t

h ng gi i quy t L n đ u tiên các nhà khoa h c phát hiên kh n ng sinh enzyme 

ậ lactamase ph r ng vi khu n Klebsiella pneumoniae, tác nhân gây nhi m trùng hƠng đ u gây nh h ng đ n đ ng hô h p, t đó hình thƠnh nên hƠng lo t các

nghiên c u liên quan b ng các ph ng pháp nuôi c y vi sinh v t truy n th ng th m

chí b ng các ph ng pháp sinh h c phân t nh các nghiên c u c a Parveen R

Mohamudha và c ng s (2012), Kolar và c ng s (2010), nghiên c u “phát hi n

nhanh kh n ng s n xu t ESBL c a tr c khu n Gram ơm” c a Patrice Nordmann và

c ng s [19][20][22]

Bên c nh tác nhơn gơy b nh ch y u lƠ Klebsiella pneumoniae, các tác nhân

gây nhi m trùng đ ng hô h p d i còn có Escherichia coli, Acinetobacter spp.,

Pseudomonas aeruginosa,… Pseudomonas aeruginosa hi n nay đƣ xu t hi n kh

n ng kháng đa kháng sinh vƠ chúng d dàng truy n cho các vi khu n khác D i

s c ép ngày càng nhanh chóng c a các vi khu n lây truy n tính kháng đòi h i các

nhà nghiên c u t p trung h n n a trong vi c tìm ra nguyên nhân và h n ch h u qu

c a chúng M t s các nghiên c u chuyên sâu nh c a Maria Koutsogiannou và

c ng s , Anne Marie Queenan vƠ c ng s ,ầ c ng góp ph n tìm ra các gen kháng

này [9][18]

1.1.2 Vi t Nam

Viêm ph qu n ph i do vi khu n Gram ơm tr em luôn lƠ v n đ đáng lo

ng i đ i v i bác s nhi khoa do b nh di n bi n dai d ng, n ng vƠ t l t vong cao t

25 ậ 50% c bi t, nh ng tr có y u t nguy c cao nh ti n s đ non, d t t b m

sinh, suy dinh d ng, suy gi m mi n d ch, b nh ph i m n tính Nhóm vi khu n Gram ơm gơy b nh đ ng hô h p r t đa d ng nh Haemophilus influenzae,

Klebsiella pneumoniae, Moraxella catarrhalis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Proteus, Enterobacterầ [6]

Vi t Nam là m t trong nh ng qu c gia có t l t vong cao do viêm ph i,

môi tr ng b nh vi n đ c bi t làm cho vi khu n t ng kh n ng gơy b nh, nhi m

trùng b nh vi n hình thành các ch ng vi khu n đa kháng đ t ra cho các nhà nghiên

c u trong n c ph i ti n hành m t cách nhanh chóng đ tìm ra h ng gi i quy t

M t kh o sát tr c khu n Gram âm sinh men  ậ lactamase ph r ng c a HoƠng Th

Ph ng Dung vƠ c ng s góp ph n nh vƠo vi c tìm ra h ng đi u tr cho b nh nhơn nhi m lo i vi khu n có gen kháng nƠy [4]

1.1.3 Các tri u ch ng lâm sàng

Viêm đ ng hô h p lƠ nguyên nhơn hƠng đ u c a các tr ng h p b nh t t

tr em vƠ ng i l n

Ho lƠ tri u ch ng c n b n c a b nh đ ng hô h p d i B t k m t t n

th ng viêm nƠo c a khí qu n, ph qu n, ti u ph qu n ho c ph nang đ u có th gơy ra ho M t ph n, vì ho lƠ c ch c a c th đ lƠm s ch các ch t ti t ra t cơy khí qu n, vƠ viêm nhi m đ ng hô h p d i th ng t ng s n sinh niêm d ch (đƠm)

Khó th th ng lƠ m t d u hi u v trao đ i khí ph i không đ Nh ng r i

lo n v tim vƠ hô h p lƠ nh ng nguyên nhơn thông th ng nh t gơy khó th [29]

1.1.4 Các v n đ liên quan nhi m trùng đ ng hô h p d i

Viêm ph i là hi n t ng viêm nhi m c a nhu mô ph i do vi khu n đơy lƠ

m t b nh ph bi n, đ ng th hai sau b nh tiêu hoá, viêm ph i th ng g p tr em

và là nguyên nhân chính gây t vong đ c bi t tr d i 1 tu i và tr s sinh

Tri u ch ng ban đ u th ng r t nghèo nƠn vƠ không đ c hi u Tr b t đ u

s t sau là suy hô h p, khó th da tím tái, có ti ng th rít

Enterobacteriaceae là tr c khu n Gram âm, hình que, kích th c thay đ i t

1 ậ 5 m Ph n l n di đ ng nh nhu mao, m t s không di đ ng g m Klebsiella,

- Ph n ng oxidase âm tính

- M c d dƠng trên các môi tr ng nuôi c y thông th ng

1.2.1 Vi khu n Klebsiella pneumoniae

Klebsiella pneumoniae thu c h Enterobacteriaceae, là tr c khu n Gram

ơm, kích th c thay đ i, không sinh bào t , m t s gi ng có nang nh Klebsiella

Ph n l n di đ ng nh chu mao, tr Klebsiella, Shigella, Yersinia

1.2.1.3 c đi m sinh hóa

Lên men sinh h i đ ng glucose vƠ lactose trên môi tr ng KIA Có kh

Kháng nguyên O (kháng nguyên thân): là kháng nguyên c a vách t bào c u

t o b i lipopolysaccharide có kh n ng ch u đ c nhi t, không b phân hu khi đun

nóng 100oC trong 2 gi Kháng nguyên này r t đ c

Kháng nguyên K (kháng nguyên nang): b n ch t là polysaccharide, m t s ít

là protein N u kháng nguyên K che ph toàn thân vi khu n s ng n c n ph n ng

ng ng k t O, kháng nguyên K là y u t liên quan đ n đ c tính c a vi khu n

1.2.1.5 c đi m gây b nh

C u trúc kháng nguyên ph c t p liên quan đ n đ c tính c a vi khu n

Klebsiella pneumoniae bám dính lên b m t t bào ch nh h th ng pili

đ c c u t o b i nh ng đ n v protein hình c u có kh i l ng phân t kho ng 15 ậ

26 kDa Nh ng lông pili này có kh n ng đông t h ng c u c a nhi u loƠi đ ng v t

khác nhau

Có kh n ng s n xu t hai lo i sidephore lƠ enterobactin vƠ aerobactin đ đ m

b o nhu c u s t c a vi khu n c n cho s t ng tr ng thi t y u c a vi khu n, có ch c

n ng xúc tác cho các ph n ng oxi hóa kh trong quá trình truy n đi n t

1.2.2 Vi khu n Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas là vi khu n Gram âm d ng tr c khu n di đ ng s ng hi u khí Chúng đ c tìm th y g n nh kh p m i n i, trong đ t, trong n c, th c v t và

đ ng v t P aeruginosa là m t tác nhân gây b nh nhơn c h i n i ti ng ph bi n

nh t nh h ng đ n b nh nhân suy gi m mi n d ch Pseudomonas gây b nh đ c

có th s ng sót trong th i gian dài và trong nhi u môi tr ng s ng khác nhau, trong

nh ng đi u ki n r t b t l i Trên môi tr ng nuôi c y chúng có mùi th m nh nh

nho khô [17]

Có biên đ nhi t t 5 ậ 42o

C M c t t nhi t đ t 37 ậ 42o

C Không có kh n ng lên men đ ng glucose Gây tiêu huy t  trên th ch máu

1.2.2.3 c đi m sinh hóa

Th nghi m oxidase d ng tính, catalase d ng tính Có kh n ng bi n

d ng Citrate

P aeruginosa có th ti t ra 4 lo i s c t :

Pyocyanin: mƠu xanh l , có th tan trong n c, không phát hu nh quang P

aeruginosa là vi khu n duy nh t ti t ra s c t pyocyanin nên d a vƠo đ c tính này

đ phân bi t P aeruginosa v i các vi khu n khác

Pyoverdin: màu xanh lá phát hu nh quang d i tia c c tím

Pyorubin: mƠu đ s m

Pyomylanin: mƠu nơu đen

1.2.2.4 Kháng nguyên và đ c t

Kháng nguyên thân O: có kh n ng ch u nhi t 120oC/ 90 phút, là m t ph c

h p lipopolysaccharide D a vào kháng nguyên này chia tr c khu n m xanh thành

12 nhóm

Kháng nguyên lông H: có b n ch t protein, d b phá h y 100oC ho c trong

c n 50% Có tính kháng nguyên y u, nên khó áp d ng vƠo xác đ nh type huy t

thanh c a vi khu n

1.2.2.5 c đi m gây b nh

Pseudomonas aeruginosa ti t ra các enzyme ngo i bào (elastase và alkalinne protease) có kh n ng phá h y l p fibronectin làm cho vi khu n d dàng

bám dính lên các th th có trên t bào bi u mô

Pseudomonas aeruginosa ti t ra ch t nh y có c u t o là polysaccharide g m nhi u ti u ph n mannuronic acid vƠ glucuronic acid hay còn đ c g i là alginate

Các d ng alginate này k t h p v i nhau t o thành d ng c u trúc n n cho P aeruginosa thành d ng biofilm giúp b o v che ch vi khu n t n t i đ c trong môi tr ng t nhiên c ng nh tránh đ c h mi n d ch c a c th ký ch

Pseudomonas aeruginosa có th t o ra 3 lo i protein đóng vai trò trong vi c

xâm nhi m: protein cytotoxin, protein hemolysin phân gi i phospholipid, lecithin

đ ngvào m t hay nhi u giai đo n chuy n hoá c n thi t c a đ i s ng vi khu n ho c tác đ ng vào s cân b ng lý hoá [1]

Kháng sinh có tác d ng đ c hi u, m t lo i kháng sinh s tác đ ng lên m t vi

khu n hay m t nhóm vi khu n nh t đ nh M t s kháng sinh có ho t ph r ng,

chúng có ho t tính t ng đ i v i nhi u lo i vi khu n gây b nh khác nhau, m t s có

Ng i Hy L p và Serbia dùng bánh mì lên m c đ đi u tr v t th ng

N m 1928, Alexander Flemming m t nhà khoa h c Scotland phát hi n n m

Penicillium notatum ti t ra ch t penicillin có tác d ng di t khu n

v c ng bên ngoài g i là vách t bào, có nhi m v gi hình d ng t bƠo đ c

nguyên v n tr c áp l c th m th u cao bên trong t bào

Thu c g n vào th th PBP (Penicillin binding protein) c a t bào Có kho ng 3 ậ 6 th th PBP, trong đó m t s th th là nh ng enyme transpeptidase

Sau khi g n vào m t hay nhi u th th thu c s phong b transpeptidase lƠm ng n

ch n vi c t ng h p peptidoglycan, m t thành ph n quan tr ng c a vách t bào

Ti p theo là ho t hóa các enzyme t tiêu (autolytic enzymes) gây ra s ly

gi i t bào môi tr ng đ ng tr ng (isotonic) Trong môi tr ng u tr ng nh ng

t bào b bi n đ i thành protoblast hay spheroblast ch đ c bao b c b i m t màng

t bào nên r t d v

Khi s t ng h p vách t bào b c ch do tác d ng kháng sinh: vi khu n

Gram d ng bi n thành d ng hình c u không có vách (proto ậ plast); vi khu n

Gram âm có vách không hoàn ch nh (spheroplast)  t bào d v môi tr ng có

tr ng l c bình th ng [1]

c ch nhi m v c a màng t bào:

Các kháng sinh thu c nhóm này: amphoterricin B, colistin, imidazoles: làm suy y u s toàn v n c a màng t bào vi n m b ng cách c ch s t ng h p lipid c a màng t bƠo, nystatin, polymyxins: tác đ ng lên vi khu n Gram âm

T bào ch t c a t t c t bào s ng đ u đ c bao b c b i m t màng t bào

ch t mƠng nƠy đ c coi nh m t hàng rào có kh n ng th m th u ch n l c, th c

hi n ch c n ng v n chuy n ch đ ng vƠ nh v y ki m soát các thành ph n bên

trong màng t bào

N u toàn v n ch c n ng mƠng t bào ch t b phá v thì nh ng đ i phân t và

nh ng ions s thoát kh i t bào làm t bào ch t [1]

c ch s t ng h p protein:

Có nh ng kháng sinh nh chloramphenicol, erythromycins, lincomycins,

tetracyclines, aminoglycosides (amikacin, gentamicin, kanamicin, neomicin, netilmicin, streptomicin, tobramicinầ)

Nh ng thu c chloramphenicol, tetracyclines, aminoglycosides, erythro ậ mycin, lincomycins đƣ đ c bi t là nh ng thu c có th c ch s t ng h p protein

c a vi khu n

Aminoglycosides: ki u tác đ ng c a streptomicin đƣ đ c nghiên c u k h n

các lo i aminoglycosides khác Giai đo n đ u thu c g n vào m t lo i protein là th

th chuyên bi t trên ti u đ n v 30S Giai đo n hai thu c phong b ho t tính c a

ph c h p đ u tiên (initiation complex) c a quá trình thành l p chu i peptide Giai

đo n ba thông tin mRNA b đ c sai vùng nh n di n c a ribo th , k t qu là m t

acid amin không phù h p đ c đ a vƠo chu i peptide, t o ra m t protein không

ch c n ng Giai đo n th t s g n c a thu c làm v các polysomes thành các

monosome không có kh n ng t ng h p protein

Tetracyclines: thu c này g n v i ti u đ n v 30S c a ribo th Thu c c ch

s t ng h p protein b ng cách ng n ch n các amino acids m i n i vào chu i peptide

m i thành l p

Cloramphenicol: thu c này g n v i ti u đ n v 50S c a ribo th c ch enzyme peptidyl transferase, lƠm ng n ch n các amino acids m i n i vào chu i

peptide m i thành l p

Macrolides (erythromycin, oleandomicin): các thu c này g n vào ti u đ n v

50S c a ribo th v trí 23S rRNA, ng n c n vi c thành l p ph c h p đ u tiên đ

t ng h p chu i peptide

Lincomycins (lincomycin, clindamycin): lincomycins g n vào ti u đ n v

50S c a ribo th , vƠ t ng t nh các macrolides nh ng đi m nh v trí g n, tác

đ ng kháng khu n vƠ c ch tác đ ng [1]

c ch s t ng h p acid nucleic:

Nh actinomycin, mitomicin, nalidixic acid, novobiocin, pyrimethamine, rifampin, sulfonamides, trimethoprimầ

Nh ng thu c nh actinomycin lƠ nh ng ch t c ch hi u qu s t ng h p

DNA Thu c g n vào DNA t o nên m t ph c h p, ph c h p này c ch các polymerase t ng h p các RNA t ng ng, đ c bi t là mRNA

i v i nhi u lo i vi khu n, p ậ aminobenzoic acid (PABA) là m t ch t bi n

d ng c n thi t Ch t nƠy đ c dùng nh m t ti n ch t đ t ng h p folic acid, m t giai đo n quan tr ng đ t ng h p nucleic acids

Các lo i sulfonamides do c u trúc t ng t PABA nên c nh tranh v i PABA,

t o nh ng ch t t ng t acid folic nh ng không có ch c n ng d n đ n vi c c n tr

s phát tri n c a vi khu n [1]

1.3.1.3 Phân lo i

Ng i ta có th phân lo i kháng sinh theo tính ch t hoá h c, theo ngu n g c

ho c theo ph tác d ng i v i Vi sinh Y h c thì cách s p x p theo ph tác d ng ậ

kh n ng ch ng vi khu n và cách tác d ng c a kháng sinh lên t bào vi khu n có giá

tr th c t h n [2]

Theo ph tác d ng:

Thu c kháng sinh có ho t ph r ng: có ngh a lƠ m t kháng sinh có th tác

d ng lên nhi u lo i vi khu n, bao g m:

Nhóm aminoglycoside g m có streptomycin, kanamicin, gentamicin,

amikacinầ

Nhóm tetracylin: tetracylin, doxycylinầ

Nhóm chloramphenicol

Nhóm sulfamid và trimethoprim

Nhóm quinilon m i (flouroquinolon) g m có ciprofloxacin, nofloxacinầ

Thu c kháng sinh có ho t ph ch n l c: ngh a lƠ kháng sinh ch có tác d ng

Nhóm beta lactam: penicillin, cephalosporin, các beta lactam khác:

carbapenem, monobactam, ch t c ch beta lactam [28]

Nhóm aminoglycosid (aminosid): streptomycin, gentamicin, tombramycin,ầ Nhóm macrolid: erythromycin, clarithromycin, spiramycin,ầ

Nhóm lincosamid: lincomycin, clidamycin,ầ

Nhóm phenicol: cloramphenicol, thiamphenicol

Nhóm tetracyclin: tetracyclin, doxycyclin

Nhóm quinolon: acid nalidixic, ciprofloxacin, ofloxacin,ầ

đ i v i m i loƠi vi khu n đ c m t phòng thí nghi m đ c l p xác đ nh vƠ đ c

Vi n nghiên c u các Tiêu chu n Phòng thí nghi m vƠ Lơm sƠng (g i t t lƠ CLSI)

c p nh t đ u đ n Th c t , m t ch ng đ c g i lƠ “đ kháng” khi n ng đ kháng sinh mƠ vi khu n có th ch u đ ng đ c t ng cao h n n ng đ kháng sinh đ t đ c trong c th sau khi dùng thu c

ôi khi, s đ kháng v i kháng sinh nƠy l i gơy ra đ kháng cho kháng sinh khác, g i lƠ đ kháng chéo Vi khu n đ c g i lƠ đa đ kháng (multiresistant) sau khi có tích l y đ kháng t nhiên vƠ m c ph i, chúng ch nh y c m v i r t ít kháng sinh vƠ đ kháng v i r t nhi u kháng sinh ho c nhi u nhóm kháng sinh [12][27]

1.3.2.2 Tình hình đ kháng kháng sinh

K t th p niên 1940, kháng sinh đƣ lƠm nên m t cu c cách m ng l n trong

vi c lƠm gi m đáng k t l t vong do b nh nhi m trùng Nh ng không may lƠ s

đ kháng c a vi khu n v i thu c kháng sinh đƣ tr thƠnh v n đ nghiêm tr ng c a toƠn c u Có th k nh sau: đ kháng v i thu c penicillin phát tri n th p niên 1950; v i nhóm cephalosporines th h 1 th p niên 1970 vƠ v i nhóm cephalosporines th h 3 th p niên 1990 [10]

Trong nh ng n m g n đơy, t l b nh nhi m trùng do vi khu n đ kháng kháng sinh t ng lên rõ r t c môi tr ng b nh vi n vƠ c ng đ ng Hi n nay, g n

nh t t c các vi khu n gơy b nh n ng đ u kháng thu c M t th ng kê Canada cho

th y: hƠng n m có kho ng 25 tri u đ n thu c kháng sinh đ c kê vƠ trong đó trên

50% kháng sinh đ c kê không h p lỦ B c M , kho ng 1/ 3 b nh nhơn nh p

vi n đ c cho dùng kháng sinh trong th i gian đi u tr t i b nh vi n Theo nhi u nghiên c u khác nhau, t l s d ng không h p lỦ thu c kháng sinh chi m kho ng

40 ậ 75% [23][11]

1.3.2.3 Ngu n g c c a quá trình đ kháng kháng sinh

Ngu n g c không do di truy n:

S nhân lên c a vi khu n là y u t c n thi t cho nh ng tác đ ng c a thu c

kháng sinh Khi vi khu n vì lí do nƠo đó không nhơn lên đ c và có th tr thành

kháng thu c, nh ng nh ng th h sau có th nh y c m tr l i

Ngu n g c không do di truy n còn do vi khu n m t đi m g n đ c bi t dành

cho thu c [1]

Ngu n g c di truy n:

Ph n l n vi khu n kháng thu c là do s thay đ i v m t di truy n và là h u

qu c a quá trình ch n l c b i thu c kháng sinh

kháng do nhi m s c th : do đ t bi n ng u nhiên c a m t đo n gen ki m

soát tính nh y c m đ i v i m t kháng sinh, th ng do thay đ i c u trúc th th dành

cho thu c S có m t c a thu c đ c xem là m t c ch ch n l c, c ch vi khu n

nh y c m và t o thu n l i cho vi khu n đ t bi n kháng thu c phát tri n

kháng ngoài nhi m s c th : plasmid có y u t R mang nh ng gen ki m soát vi c s n xu t enzyme phá hu thu c d n t i tình tr ng kháng kháng sinh và

nh ng kim lo i n ng [1]

1.3.2.4 C ch đ kháng kháng sinh

Hình 1.1 C ch đ kháng kháng sinh [34]

Vi khu n s n xu t enzyme đ phá hu ho t tính c a thu c

Vi khu n s n xu t ra enzyme gơy phơn h y ho c lƠm b t ho t kháng sinh S

s n xu t enzyme có th đ c c m ng b i m t y u t bên ngoƠi (m t kháng sinh

khác) ho c b t bi n (không b nh h ng b i kích thích bên ngoƠi) [3]

B m đ y

Kháng sinh Kháng sinh

 S sinh men beta ậ lactamase

 ESBL(Extended Spectrum Beta ậ Lactamases)

ESBL lƠ m t beta ậ lactamase ph r ng đ c vi khu n ti t ra, lƠ m t lo i

enzyme có th ng n ch n m t s kháng sinh b ng cách phá h y chúng Kh n ng

d ng tác đ ng c a thu c kháng sinh đ c g i lƠ kh n ng kháng ESBL có kh n ng phá v kháng sinh, ngoƠi ra chúng có th truy n t i kh n ng nƠy cho nh ng vi khu n khác

Ngu n g c:

- Gene trên plasmid, đ t bi n t các gen s n xu t ậ lactamase kinh

đi n

- t bi n b ng cách thay đ i m t nhóm kho ng 1 ậ 7 amino acid n m

g n tâm ho t đ ng c a ậ lactamase T đó, đƣ t o ra v trí tâm ho t đông linh đ ng h n nên gia t ng ái l c vƠ t ng ho t đ ng th y phân

v i kháng sinh

- Còn nh y v i các ậ lactamase nh clavulanic acid, tazobactam

VƠo đ u th p niên 1980, các Cephalosporines th h th 3 đ c l u hƠnh trên th tr ng, nh ng sau khi đ c s d ng r ng rƣi trong đi u tr nhi u b nh nhi m trùng, các bi n đ i nh trong chu i gen g c đƣ lƠm thay đ i đáng k tính ái

l c c a các enzyme đ i v i c ch t, vƠ đƣ hình thƠnh m t nhóm enzyme beta ậ lactamase ph r ng, hay còn đ c g i lƠ ESBL (Extended Spectrum Beta ậ

Lactamases)

Các beta ậ lactamase là các men do vi khu n sinh ra vƠ lơy truy n theo

đ ng nhi m s c th ho c plasmid Các men nƠy đ kháng kháng sinh r t hi u qu Chúng lƠm b t ho t các thu c nhóm beta ậ lactamine b ng cách phá h y n i amide

c a vòng beta ậ lactam

Vi khu n đ c tìm th y có gen ESBL bao g m Escherichia coli, Klebsiella

pneumoniae, Pseudomonas aeruginosaầ vƠ m t s ch ng khác H u h t các vi khu n sinh ESBL đ u kháng v i cephalosporines th h th 3 [15]

 Vi khu n Gram ơm đ ng ru t sinh men cephalosporinases b c cao t nhi m

s c th (men beta ậ lactamases type AmpC):

Ban đ u, các men cephalosporinases đ c xem lƠ các men t nhi m s c th

c a vi khu n Pseudomonas aeruginosa, chúng có th phơn h y các kháng sinh nh cefotaxime vƠ ceftazidime Vi c t ng s n các men nƠy th ng kèm v i vi c gi m s

l trên mƠng ngoƠi t bƠo vi khu n Lơy truy n qua plasmide vƠ có các vi khu n Gram ơm đ ng ru t, lƠm cho t l men cephalosporinases r t cao các vi khu n E

coli; Klebsiella pneumoniae; Enterobacter và Citrobacter Gen liên quan đ n men cephalosporinases lƠ AmpC Có trên 20 lo i men lactamases khác nhau thu c type

AmpC, vƠ vì th chúng gơy đ kháng r t cao v i các thu c kháng sinh nhóm lactamines Các vi khu n sinh men nƠy ch nh y c m v i cefepime vƠ nhóm

Carbapenemes

 Vi khu n sinh men carbapenemases

Ng i ta đƣ phơn l p đ c men carbapenemes t các vi khu n, vƠ

Acinetobacter baumanii, đơy chính lƠ nguyên nhơn gơy nhi m trùng b nh vi n r t

n ng vƠ khó đi u tr

 S đ kháng c a vi khu n Gram ơm đ ng ru t v i nhóm fluoroquinolones

T i b nh vi n, các kháng sinh nhóm beta ậ lactamines và fluoroquinolones

th ng đ c kê đ n nh t trong đi u tr các nhi m trùng do vi trùng Gram ơm đ ng

ru t Song song v i vi c đ kháng v i thu c nhóm beta ậ lactamines, s đ kháng

v i nhóm flouroquinolones đang cƠng ngƠy phát tri n LỦ do chính lƠ vi c t ng s

d ng thu c kháng sinh fuoroquinolones trong c ng đ ng đ đi u tr viêm ph i, nhi m trùng ti t ni u, nhi m trùng da vƠ mô m m C ch đ kháng v i kháng sinh

nhóm flouroquinolones theo 2 ki u: bi n đ i đích tác d ng c a kháng sinh vƠ b m

đ y thu c ra ngoƠi lƠm gi m n ng đ kháng sinh bên trong vi khu n

Vi khu n làm thay đ i kh n ng th m th u c a màng t bào đ i v i thu c

Các vi khu n Gram ơm có thêm m t v bên ngoƠi dƠy, g i lƠ thƠnh ngoƠi, có tác d ng nh m t hƠng rƠo che ch cho các PBP n m bên trong Ch t dinh d ng

vƠ kháng sinh ph i đi ngang qua l p v nƠy đ th m vƠo bên trong vi khu n, theo cách th c khuy n tán th đ ng ngang qua các kênh (l nh ) S gi m tính th m c a

t bƠo lƠm gi m l ng kháng sinh đi vƠo bên trong đ n đích tác d ng, nguyên nhơn

do bi n đ i tính th m l p mƠng bên trong ho c bên ngoƠi vi khu n S bi n đ i các

l c a l p thƠnh t bƠo vi khu n Gram ơm có th lƠm gi m ho c ng n c n s khuy ch tán c a kháng sinh vƠo v trí tác d ng

S bi n đ i các l c a l p thƠnh t bƠo vi khu n Gram ơm có th lƠm gi m

ho c ng n c n s khuy ch tán c a kháng sinh vƠo v trí tác d ng D ng đ kháng nƠy nói chung x y ra đ i v i nhi u kháng sinh c a nhi u nhóm khác nhau, do có khi

các kháng sinh khác nhau nh ng có th dùng chung m t lo i l M t khác, s đ kháng nƠy lƠ đ c hi u khi m t kháng sinh ch dùng riêng m t lo i l Ví d s đ kháng c a Pseudomonas aeruginosa v i imipenem lƠ s đ kháng đ c hi u gơy ra

do m t đi các l riêng dƠnh cho các carbapeneme

i m g n c a thu c có đi m g n b thay đ i: Do đ t bi n nhi m s c th làm

thay đ i c u trúc c a th th dành cho thu c

Vi khu n đ t bi n nhi m s c th  m t ho c thay đ i protein đ c bi t trên

ti u đ n v 30S làm m t đi m g n c a aminoglycosides d n đ n đ kháng

Vi khu n m t ho c thay đ i PBPs d n đ n đ kháng penicillin

Vi khu n thay đ i th th trên ti u đ n v 50S  đ kháng erythromycin

Vi khu n thay đ i đ ng bi n d ng làm m t tác d ng c a thu c

CH NG 2 I T NG,

NGHIÊN C U

Bao g m: m u đƠm, các b nh ph m có đƠm, d ch hút n i khí qu n, d ch r a

ph qu n, d ch hút đƠm qua m i trên khí qu n

Các m u b nh ph m đ c ti n hành nuôi c y phân l p vƠ đ nh danh đ th c

hi n th nghi m kháng sinh đ nh m đ a ra phác đ đi u tr cho các bác s lơm

sàng Ch ng nghiên c u: Klebsiella pneumoniae và Pseudomonas aeruginosa đ

th c hi n kháng sinh đ đ c phân l p t các b nh nhi t i b nh vi n Nhi ng II

 i t ng nghiên c u:

Ch ng vi khu n Klebsiella pneumoniae và Pseudomonas aeruginosa đ c

phân l p t m u b nh ph m đƠm c a các b nh nhi đ c g i t i khoa Vi sinh t i

b nh vi n Nhi ng II t tháng 11 ậ 2013 đ n tháng 04 ậ 2014

2.2.2 Môi tr ng ậ sinh ph m

 Môi tr ng

Môi tr ng nuôi c y phân l p: Chocolate Agar (CA), Blood Agar (BA),

Bromocresol Purpe Agar (BCP)

Môi tr ng dùng trong các th nghi m sinh hoá: KIA, Manitol, Citrate,

ADH, LDC, ODC, Ure ậ Indol

Môi tr ng đ th c hi n th nghi m kháng sinh đ : Mueller Hinton Agar

Oxidase , b th nghi m sinh hoá

2.3 PH NG PHỄP NGHIểN C U

S d ng ph ng pháp mô t c t ngang: ch ng vi khu n nghiên c u đ c

phân l p t m u b nh ph m đ ng hô h p d i trong th i gian t tháng 11 n m

2013 đ n tháng 04 n m 2014

Ch ng vi khu n đ c đ nh danh qua các th nghi m sinh hóa n u thu đ c

vi khu n đích thì s ti n hành kh o sát m c đ nh y c m kháng sinh b ng ph ng

pháp Kirby Bauer

2.3.1 Phân l p đ nh danh vi khu n

Quy trình nuôi c y và phân l p vi khu n

Hình 2.1 Quy trình nuôi c y và phân l p vi khu n

D a vƠo thang đi m Barlett

CA, BA, BCP Không c y, l y l i m u

Không tin c y Barlett = 0

M u ch a tin c y

Barlett = 1ậ 2

nh danh:

KIA Manitol Citrate ADH LDC ODC Ureậ Indol

c khóm trùng

c phân tích k t qu

B nh ph m: Bao g m: m u đƠm, các b nh ph m có đƠm, d ch hút n i khí

qu n, d ch r a ph qu n, dch hút đƠm qua m i trên khí qu n

Ch đ nh l y m u: các tr ng h p viêm nhi m đ ng hô h p d i nh : viêm

ph i, viêm ph qu n c p, c n c p c a viêm ph qu n m n

Ch t l ng m u: m u có m , m nh y, m xanh, m vàng  nh n m u

Nh ng m u có l n n c b t, d ch trong thì tr l i m u Th i gian l y m y và nh n

m u không quá 2 gi , n u quá thì t ch i m u

Quan sát vi th : Nhu m Gram

M c đích: Nhu m Gram lƠ m t ph ng pháp th c nghi m nh m phơn bi t

các loài vi khu n thƠnh 2 nhóm Gram d ng (Gram positive) vƠ Gram ơm (Gram negative) d a trên các đ c tính hoá lỦ c a thƠnh t bƠo Ph ng pháp nƠy đ c đ t

tên theo ng i phát minh ra nó, nhƠ khoa h c ng i an M ch Hans Christian J

Gram (1853 ậ 1938) Ông phát tri n k thu t nƠy vƠo n m 1884, v sau đ c Hucker vƠ nhi u ng i khác c i ti n

C ch :

Vi khu n Gram d ng có thƠnh t bƠo dƠy t 15 đ n 50 nm, d ng l i, c u

t o b i peptidoglycan Ch t nƠy có kh n ng gi ph c h p tím k t tinh ậ lugol Trong khi đó, l p thƠnh t bƠo peptidoglycan c a các vi khu n Gram ơm thì m ng

h n vƠ th ng có thêm l p mƠng lipopolysaccharde (LPS) bên ngoài

Sau khi nhu m v i ph c h p tím k t tinh ậ lugol, m u đ c x lý ti p v i

h n h p kh mƠu, lƠm m t n c c a các l p peptidoglycan trong thƠnh t bƠo Gram

d ng, t đó lƠm gi m kho ng tr ng gi a các phơn t vƠ khi n thƠnh t bƠo b t gi

ph c h p tím k t tinh ậ lugol bên trong t bƠo

i v i vi khu n Gram ơm, h n h p kh mƠu đóng vai trò lƠ ch t hoƠ tan lipid vƠ lƠm tan mƠng ngoƠi c a thƠnh t bƠo L p peptidoglycan m ng (ch kho ng

10 nm) không th gi l i ph c h p tím k t tinh ậ lugol và t bƠo Gram ơm b kh mƠu vƠ b t mƠu thu c nhu m b sung

Hình 2.2 S đ minh h a thƠnh t bƠo vi khu n Gram d ng (trái) vƠ

Gram ơm (ph i) [27]

 Cách ti n hƠnh:

Chu n b m u b nh ph m, lam kính s ch vƠ ghi thông tin c a m u b nh

ph m Dùng pipet vô trùng l y l ng nh đƠm tr i đ u thƠnh ph t 2 cm x 1 cm trên lam (ch n vùng nh y m ) khô t nhiên nhi t đ phòng

C đ nh ph t c y trên ng n l a đèn c n Ti n hƠnh nhu m Gram

B c 1: Ph đ u crystal violet lên ph t nhu m vƠ đ yên trong vòng 1 phút

B c 5: T y nh b ng c n đ n khi m t mƠu thu c nhu m r i r a s ch l i v i

n c

B c 6: Ph đ u safranine lên v t nhu m vƠ đ yên trong vòng 1 phút

B c 7: R a s ch b ng n c, đ khô c k t qu nhu m Gram

- L u Ủ khi nhu m Gram:

 Vi khu n Gram d ng b t màu Gram âm có th là do ph t vi khu n

quá m ng, dung dch lugol không đ t ho c do vi c t y màu quá lâu

 Vi khu n Gram âm b t mƠu Gram d ng n u ph t vi khu n quá dày,

t y màu quá ng n ch a lƠm s ch ph c h p tím k t tinh d n đ n vi

khu n s có mƠu Gram d ng

 Quan sát vi th :

Kh o sát d i v t kính 10X tìm t bào v y, t bào b ch c u ho c t bào m ,

d a vƠo thang đi m Barlett đánh giá m u đƠm

B ng 2.1 Thang đi m arlett dùng đánh giá m u đƠm

Barlett <= 0: b nh ph m không tin c y, l y l i m u

Barlett = 1 ậ 2: ch a tin c y  nghi ng Có th nuôi c y ho c l y l i m u

Barlett >= 3: m u tin c y, ti p t c nuôi c y

Nuôi c y phân l p:

M u b nh ph m đ c c y trên ba môi tr ng: CA, BA, BCP

M u b nh ph m ph i đ c pha loãng theo t l m u: NaCl 0,85% là 1:1 n u

m u đ c, nh y m đ c vƠ đ c vortex th t k tr c khi c y Dùng pipet vô trùng

l y m t ít đƠm (ch n vùng nh y m ) c y vào ba h p th ch CA, BA, BCP theo

Trên môi tr ng CA: khu n l c nh y đ c, khúm to

Hình 2.6 Khu n l c Klebsiella pneumoniae trên môi tr ng CA

Trên môi tr ng BA: khu n l c nh y đ c, khúm to, không tiêu huy t

Hình 2.7 Khu n l c Klebsiella pneumoniae trên môi tr ng BA