thiết kế vector mang cấu trúc gen gmdreb2 nhằm phục vụ tạo cây đậu tương chuyển gen chịu hạn

Trong những năm gần đây hạn hán xảy ra thường xuyên đã tác động xấu đến sự sinh trưởng, phát triển, làm giảm năng suất và sản lượng cây trồng trong đó có đậu tương.. Đặc tính chịu hạn ở

HOÀNG THỊ THU HOÀN

THIẾT KẾ VECTOR MANG CẤU TRÚC GEN GmDREB2

NHẰM PHỤC VỤ TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG

CHUYỂN GEN CHỊU HẠN

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái nguyên, 2014

HOÀNG THỊ THU HOÀN

THIẾT KẾ VECTOR MANG CẤU TRÚC GEN GmDREB2

NHẰM PHỤC VỤ TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG

CHUYỂN GEN CHỊU HẠN

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Chu Hoàng Mậu

Thái Nguyên, 2014

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan những nội dung trình bày trong luận văn là do tôi tìm hiểu, nghiên cứu dưới sự hướng dẫn của GS.TS Chu Hoàng Mậu và sự cộng tác giúp đỡ của các cộng sự trong nhóm nghiên cứu Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn đã được sự đồng ý của cán bộ hướng dẫn và nhóm nghiên cứu Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

Hoàng Thị Thu Hoàn

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS.TS Chu Hoàng Mậu đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành bản luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn NCS Đào Xuân Tân và các thầy cô Bộ môn

Di truyền học & Sinh học hiện đại, khoa Sinh – Kỹ thuật nông nghiệp, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện các thí nghiệm của đề tài

Tôi xin cảm ơn TS Lê Văn Sơn và các cán bộ Phòng Công nghệ DNA ứng dụng, Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Tôi cũng xin cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Tân Trào, Tuyên Quang đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong học tập và hoàn thành khoá học

Tôi cũng xin bày tỏ lời cảm ơn đến gia đình, bè bạn đã động viên khuyến khích giúp đỡ tôi trong quá trình làm luận văn

Đề tài luận văn thuộc chương trình đào tạo nghiên cứu sinh và cao học của Bộ môn Di truyền & Sinh học hiện đại, khoa Sinh-KTNN, trường Đại học

Sư phạm - Đại học Thái Nguyên

Tác giả luận văn

Hoàng Thị Thu Hoàn

MỤC LỤC

Trang Trang bìa phụ

Lời cam đoan .i

Lời cảm ơn ii

Mục lục .iii

Danh mục bảng iv

Danh mục hình v

Những chữ viết tắt .vi

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 CÂY ĐẬU TƯƠNG VÀ ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG 3

1.1.1 Cây đậu tương 3

1.1.2 Đặc tính chịu hạn của thực vật và cây đậu tương 8

1.2 DREB VÀ GEN DREB2 13

1.2.1 Gen DREB 13

1.2.2 DREB2 và gen GmDREB2 15

1.3 CHUYỂN GEN VÀ VECTOR CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT 17

1.3.1 Kỹ thuật chuyển gen trực tiếp và gián tiếp ở thực vật 17

1.3.2 Hệ thống vector dùng trong chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium 19

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 22

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 22

2.1.2 Hóa chất và thiết bị 23

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 24

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.2.1 Phân lập gen 24

2.2.1.1 Phương pháp tách chiết RNA 24

2.2.1.2 Phương pháp tổng hợp cDNA 25

2.2.1.3 Phương pháp PCR 26

2.2.1.4 Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony – PCR) 27

2.2.1.5 Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR 27

2.2.1.6 Phương pháp ghép nối gen đích vào plasmid 27

2.2.1.7 Phương pháp tách chiết plasmid tái tổ hợp 28

2.2.1.8 Phương pháp xác định trình tự nucleotide của gen 29

2.2.2 Phương pháp thiết kế vector 29

2.2.3 Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào A tumefaciens 30

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 PHÂN LẬP GEN GmDREB2 TỪ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG CHỊU HẠN DT2008 31

3.1.1 Nhân bản gen GmDREB2 từ mRNA bằng kỹ thuật RT-PCR 31

3.1.2 Tách dòng đoạn mã hoá (cDNA) của gen GmDREB2 32

3.1.3 Kết quả đọc trình tự đoạn mã hoá của gen GmDREB2 35

3.2 KẾT QUẢ THIẾT KẾ VECTOR MANG CẤU TRÚC GmDREB2 38

3.2.1 Kết quả cắt plasmid pBT mang gen GmDREB2 bằng XbaI và SacI 38

3.2.2 Kết quả cắt plasmid pBI121 bằng XbaI và SacI 39

3.2.3 Tạo vector chuyển gen pBI121 mang cấu trúc GmDREB2 40

3.3 KẾT QUẢ TẠO DÒNG VI KHUẨN A tumefaciens MANG CẤU TRÚC GEN GmDREB2 41

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 43

1 Kết luận 43

2 Đề nghị 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Sản xuất đậu tương ở Việt Nam từ 2007 đến 2013 7

Bảng 2.1 Trình tự cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu 23

Bảng 2.2 Thành phần cho phản ứng tổng hợp cDNA 25

Bảng 2.3 Thành phần của phản ứng PCR 26

Bảng 2.4 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR 26

Bảng 2.5 Thành phần gắn gen GmDREB2 vào vector tách dòng pBT 27

Bảng 2.6 Thành phần hóa chất tách chiết plasmid 28

Bảng 3.1 Sự sai khác giữa trình tự đoạn gen GmDREB2 của giống đậu tương DT2008 và trình tự có mã số DQ054363 36

Bảng 3.2 Sự sai khác giữa trình tự amino acid của protein DREB2 (DT2008) và trình tự có mã số AAY89658 37

DANH MỤC HÌNH

Trang Hình 2.1 Ảnh hạt của giống đậu tương DT2008 22 Hình 2.2 Sơ đồ cấu trúc các vector sử dụng trong nghiên cứu 23 Hình 2.3 Sơ đồ thiết kế vector chuyển gen 30

Hình 3.1 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân đoạn mã hoá gen GmDREB2; 31

Hình 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm tinh sạch đoạn mã hoá của gen

GmDREB2 32 Hình 3.3 Ảnh đĩa khuẩn lạc 33 Hình 3.4 Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR từ khuẩn lạc mang plasmid

tái tổ hợp chứa đoạn cDNA của GmDREB2 34

Hình 3.5 Hình ảnh điện di kiểm tra plasmid pBT/GmDREB2 tái tổ hợp; 34 Hình 3.6 Sơ đồ so sánh trình tự đoạn mã hoá gen GmDREB2 của giống đậu

tương DT2008 và DQ054363 35 Hình 3.7 Sơ đồ so sánh trình tự amino acid của protein DREB2 giữa giống

DT2008 và AAY89658 37 Hình 3.8 Ảnh điện di sản phẩm plasmid pBT/GmDREB2 được cắt bằng XbaI

và SacI 38 Hình 3.9 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm plasmid pBI121 được cắt bằng

XbaI và SacI 39

Hình 3.10 Hình điện di sản phẩm colony- PCR từ khuẩn lạc mang plasmid

pBI121/GmDREB2 tái tổ hợp 41 Hình 3.11 Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR từ vi khuẩn A tumefaciens

mang plasmid pBI121/GmDREB2 42

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

ABA Axit absisic

C:I Chloroform : Isoamyl

DEPC Diethyl pyrocarbonate

DNA Deoxyribonucleic Acid

DREB Dehydration – Responsive Element Binding dNTP Deoxy Nucleotide Triphosphate

EDTA Ethylene diamine tetra- acetic acid

E coli Escherichia coli

TAE Tris - Acetate - EDTA

Taq Thermus aquaticus

v/p vòng / phút

X-gal 5-bromo-4-chloro-indolyl-β-D-galactopyranoside

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) còn gọi là đậu nành là cây trồng

cạn ngắn ngày mang ý nghĩa chiến lược của nhiều quốc gia trên thế giới do có

giá trị dinh dưỡng và kinh tế cao Hạt đậu tương chứa 30% - 56% protein,

chứa 12% - 25% lipid, chứa 36% - 40% hydrat cacbon và các loại amino acid

cần thiết cho cơ thể con người như: cystein, lysine, triptophan, leucine,

methyonine… Ngoài ra trong đậu tương còn chứa nhiều loại vitamin (B1, B2,

C, D, E, K…) là nguồn năng lượng cần thiết cho cuộc sống của con người và

động vật Do có thời gian sinh trưởng ngắn, trong hệ rễ lại có nốt sần mang vi

khuẩn cố định nitơ không khí nên cây đậu tương thường được trồng luân canh

với lúa và ngô để tăng vụ, cải tạo đất bạc màu và bảo vệ môi trường

Cây đậu tương đang trở thành một trong những cây trồng quan trọng

không chỉ đối với Việt Nam mà còn ở nhiều nước trên thế giới Sản phẩm của

nó làm thực phẩm cho con người, thức ăn cho gia súc, nguyên liệu quan trọng

cho nhiều ngành công nghiệp

Trong những năm gần đây hạn hán xảy ra thường xuyên đã tác động

xấu đến sự sinh trưởng, phát triển, làm giảm năng suất và sản lượng cây trồng

trong đó có đậu tương Đậu tương là cây tương đối mẫn cảm với điều kiện

ngoại cảnh và thuộc vào nhóm cây chịu hạn kém, khi thiếu nước ở các thời kì

khác đều có tác động xấu, làm giảm năng suất cây đậu tương

Đặc tính chịu hạn ở đậu tương là tính trạng đa gen mà sản phẩm của

các gen này liên quan trực tiếp đến sự biểu hiện tính chịu hạn hoặc có chức

năng điều hoà nhóm gen chịu hạn DREB là một loại protein điều hòa có chức

năng kích thích hoạt động phiên mã của nhóm gen chịu hạn, đây nhân tố

phiên mã đóng vai trò quan trọng trong sự biểu hiện của nhóm gen chịu hạn khi cây đậu tương ở điều kiện cực đoan

Vì vậy cải thiện tính chịu hạn của cây đậu tương trong định hướng chọn giống chịu hạn bằng công nghệ gen đang được các nhà chọn giống quan tâm

ứng dụng Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Thiết

kế vector mang cấu trúc gen GmDREB2 nhằm phục vụ tạo cây đậu tương chuyển gen chịu hạn”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Tạo được vector chuyển gen mang cấu trúc gen GmDREB2 phân lập từ cây đậu tương chịu hạn và biến nạp được vào vi khuẩn Agrobacterium

tumefacien

3 Nội dung nghiên cứu

3.1 Tách chiết RNA tổng số và tạo cDNA Nhân gen GmDREB2 bằng PCR

với cặp mồi đặc hiệu từ các giống đậu tương chịu hạn tốt DT2008 Tách dòng

và xác định trình tự đoạn mã hóa của gen GmDREB2;

3.2 Tạo vector chuyển gen mang gen GmDREB2 Kiểm tra vector tái tổ hợp

bằng enzym cắt giới hạn;

3.3 Tạo vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 CÂY ĐẬU TƯƠNG VÀ ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG

1.1.1 Cây đậu tương

Đậu tương là một trong những loại cây trồng mà loài người đã biết sử dụng và trồng trọt từ lâu đời, vì vậy nguồn gốc của cây đậu tương cũng sớm được xác minh Cây đậu tương có nguồn gốc từ Trung quốc và nó sớm được người dân thuần hóa và trồng làm cây lương thực vào khoảng thế kỉ 17 trước công nguyên Sau đó, nó được đưa đến Triều Tiên, Nhật Bản, Nga, sang Nam

Á và Đông Nam Á qua con đường tơ lụa Đậu tương truyền bá sang Châu Âu vào khoảng thế kỉ thứ 17, sang Hoa Kì thế kỉ thứ 18 và ngày nay Hoa Kì là quốc gia sản xuất đậu tương hàng đầu trên thế giới, chiếm 50% sản lượng trên toàn thế giới, tiếp theo là các nước Trung Quốc, Ấn Độ,… Ở trung du Việt Nam đậu tương được trồng từ lâu đời, sớm nhất là các tỉnh thuộc khu vực trung du, miền núi phía Bắc và miền đông Nam Bộ [3], [5]

Cây đậu tương hay đậu nành có tên khoa học là Glycine max (L.) Merrill, thuộc chi Glycine, họ đậu (Fabaceae), họ phụ cánh bướm (Papilionoideae), bộ

Phaseoleae và có bộ NST 2n = 40 Đối với đậu tương có thể phân loại theo đặc

điểm thực vật học, dựa vào thời gian sinh trưởng, theo thời vụ Theo cách phân loại của Hymowit và Newell (1984) dựa trên đặc điểm về hình thái, sự phân bố

địa lý và số lượng nhiễm sắc thể thì ngoài chi Glycine còn có thêm chi phụ Soja Chi Glycine được chia ra thành 7 loài hoang dại lâu năm, và chi phụ Soja được chia ra làm 2 loài: loài đậu tương trồng Gtycine (L) Merr và loài hoang dại hàng năm G Soja Sieb và Zucc [3], [5], [9]

Cây đậu tương gồm các bộ phận chính: rễ, thân, lá, hoa, quả và hạt Rễ đậu tương là rễ cọc, gồm rễ cái và các rễ phụ, trên rễ có nhiều nốt sần chứa vi

khuẩn Rhizobium japonicum, có khả năng cố định đạm của không khí tạo

thành đạm dễ tiêu Bộ rễ phân bố nông sâu, rộng hẹp, số lượng nốt sần ít hay nhiều phụ thuộc vào giống, đất đai, khí hậu và kĩ thuật trồng Trong giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng, sinh trưởng của rễ nhanh hơn thân, nên khi vào thời

kì ra hoa rộ, lúc đó độ sâu của rễ thường dài gấp đôi chiều cao của thân cây,

và rễ vẫn tiếp tục phát triển cho đến khi quả vào mẩy và hạt bước vào giai đoạn chín sinh lý mới ngừng lại [3], [5], [14]

Thân cây đậu tương là thân thảo, ít phân cành dạng bụi, thân hình tròn, nhiều lông nhỏ, mang nhiều đốt Thân khi còn non thường có màu xanh hoặc màu tím khi về già chuyển sang màu nâu nhạt, chiều cao trung bình từ 0,5 – 1,2 m, thay đổi tùy theo giống, thời vụ, mật độ cây, đất đai, phân bón… Giống đậu tương dại cao 2 - 3 m Những giống thân nhỏ lóng dài dễ bị đổ hay mọc bò thường làm thức ăn cho gia súc Những giống thân to thường là thân đứng và có nhiều hạt và chống được gió bão [5] Số cành trên thân nhiều hay

ít phụ thuộc vào giống và các kỹ thuật canh tác Có giống chỉ có 1 - 2 cành hoặc thậm chí không có cành Các cành mọc ra từ chồi ở các nách lá Các chồi ở dưới thân chính sẽ phát triển thành các chùm quả, các chồi ở giữa và ngọn thì phát triển thành các chùm hoa Các cành mọc ra ở đốt thứ nhất hay đốt thứ hai sẽ khỏe hơn các cành mọc ở phía trên Các cành cùng với thân sẽ tạo thành tán cây [14]

Cây đậu tương có 3 loại lá chính là: lá mầm, cặp lá đơn, lá chét và ngoài ra còn có thêm lá gốc Lá đậu tương có hình dạng khác nhau: tròn, hẹp, bầu dục, lưỡi mác hoặc hình thoi… nhưng thường quy thành hai loại là lá rộng và lá hẹp Cặp lá mầm là 2 lá đầu tiên, khi mới mọc thường có màu vàng hay xanh lục nhưng khi tiếp xúc với ánh sáng thì chuyển sang màu xanh Hạt

giống to thì cho lá mầm to thì chứa nhiều chất dinh dưỡng để nuôi cây, khi hết chất dinh dưỡng thì khô và rụng đi Cặp lá đơn xuất hiện khi cây mọc được 2 - 3 ngày và mọc trên lá mầm Lá có màu xanh đậm và có phiến lá hình

ô van Lá đơn mọc đối xứng nhau Lá đơn to màu xanh bóng là biểu hiện cây sinh trưởng tốt Lá đơn to xanh đậm biểu hiện của một giống có khả năng chịu rét Lá đơn nhọn gợn sóng là biểu hiện cây sinh trưởng không bình thường Đậu tương thường có 3 lá chét sau cặp lá đơn và được xếp xen kẽ thành 2 hàng đối diện Phiến lá chét có hình ô van rộng tới hẹp tùy thuộc vào từng loại giống Phần lớn trên lá có nhiều lông tơ Những giống có lá nhỏ và dài chịu hạn khỏe nhưng cho năng suất thấp Còn những giống có lá to chống chịu hạn kém nhưng lại cho năng suất cao Lá gốc xuất hiện ở cuống của mỗi cành, là một lá đơn rất nhỏ Lá gốc không có cuống và lá gối [3], [5]

Đậu tương là cây tự thụ phấn, có hoa dạng cánh bướm đặc trưng, hoa đậu tương nhỏ, không hương vị, có màu tím, tím nhạt hoặc trắng, hoa mọc từ nách lá hoặc ngọn Hoa mọc thành từng chùm, mỗi chùm có từ 1 - 10 hoa và thường có 3 - 5 hoa Hoa đậu tương nhiều nhưng tỉ lệ đậu quả thấp do chịu nhiều ảnh hưởng từ môi trường [9], [14]

Quả đậu tương thuộc loại quả ráp, thẳng hoặc hơi cong, có nhiều lông

khi chín có màu vàng hoặc xám Quả đậu tương có số lượng biến động từ 2

đến 20 quả trên một chùm hoa và có thể có 400 quả trên một cây Một quả

thường có từ 1 đến 5 hạt, nhưng chủ yếu là 2 đến 3 hạt Hạt đậu tương không

có nội nhũ mà chỉ có một lớp vỏ bao quanh một phôi lớn Hạt có hình tròn hoặc bầu dục, tròn dài, tròn dẹt, ovan vỏ hạt thường nhẵn và có màu vàng

nhạt, vàng đậm, xanh, nâu, đen đa số là hạt màu vàng Trong hạt, phôi

thường chiếm 2%, lá mầm chiếm đến 90% và còn lại là vỏ hạt chiếm 8% tổng khối lượng hạt [3], [5]

Đậu tương là cây trồng có giá trị kinh tế cao, nó được dùng làm thực phẩm cho con người, thức ăn cho gia súc, nguyên liệu cho công nghiệp, là hàng xuất khẩu và là cây cải tạo đất tốt Đậu tương có hàm lượng protein cao hơn trong gạo, thịt, cá và cao gấp hai lần các loại đậu đỗ khác Trong hạt đậu tương không có thành phần cấu tạo của cholesteron Đậu tương còn được xem

là cây cung cấp dầu thực vật quan trọng, lipid đậu tương chứa thành phần các acid béo không no cao, tổng số chất béo chiếm khoảng 18% Hạt đậu tương còn chứa nhiều loại vitamin như: Vitamin nhóm B như: B1, B2, B6, vitamin E,… Ngoài ra, nó còn chứa sắt, canxi, photpho và các thành phần chất xơ tốt cho tiêu hóa Đậu tương là cây cung cấp nguyên liệu hàng đầu cho công nghiệp ép dầu và một số ngành công nghiệp khác như chế biến cao su nhân tạo, mực in, chất dẻo, tơ nhân tạo… Đối với nông nghiệp đậu tương được sử dụng làm thức ăn gia súc và đóng vai trò quan trọng trong việc cải tạo đất trồng [5], [12], [14]

Đậu tương là cây trồng lấy hạt, cây có dầu quan trọng bậc nhất trên thế giới, đứng hàng thứ 4 sau cây lúa mì, lúa nước và ngô Do khả năng thích ứng rộng nên nó đã được trồng ở khắp năm châu lục, nhưng tập trung nhiều nhất ở châu Mỹ trên 70%, tiếp đến là Châu Á 21,27% và một số nước khác trên thế giới Hiện nay, đậu tương được trồng ở gần 80 quốc gia khác nhau trên thế giới Trong đó, 4 nước có sản lượng đậu tương đứng đầu là Mỹ, Brazil, Argentina và Trung Quốc Hiện nay đậu tương được trồng ở Việt Nam có hai nguồn gốc, đó là các giống địa phương và giống nhập nội Trước cách mạng tháng 8 năm 1945, diện tích gieo trồng đậu tương ở Việt Nam chỉ khoảng 32

ha, năng suất 4,1 tạ/ha, cho đến nay diện tích đó tăng lên đáng kể [5], [18]

Ở Việt Nam, đậu tương được trồng trên cả 7 vùng nông nghiệp, trong

đó vùng núi phía Bắc có diện tích gieo trồng lớn nhất là 46,6%, đồng bằng Sông Hồng 19,3%, vùng Tây Nguyên 11%, miền Đông Nam Bộ 10,2%, đồng

bằng Sông Cửu Long 8,9%, khu Bốn 2,3% và vùng Duyên hải miền Trung 1,6%, diện tích gieo trồng đậu tương tính đến tháng 4/2010 là 123,9 nghìn

ha Cây đậu tương chiếm một vị trí quan trọng trong nền nông nghiệp của nước ta, đặc biệt là ở những vùng nông thôn nghèo, kinh tế chưa phát triển [5], [7], [12], [18]

Trong những năm gần đây do ảnh hưởng của biến đổi khí hậu toàn cầu cũng như hạn hán đã làm ảnh hưởng tới tình hình phát triển cây đậu tương ở Việt Nam Từ năm 2007 đến nay, diện tích trồng đậu tương có sự biến động

và có xu hướng tăng vào năm 2012, 2013, nhưng năng suất và sản lượng đậu tương gần như không tăng đáng kể (Bảng 1.1)

Bảng 1.1 Sản xuất đậu tương ở Việt Nam từ 2007 đến 2013

2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013

Diện tích

(1000 ha) 190,1 192,1 146,2 197,8 173,6 200 230 Năng suất

(tấn/ha) 1,45 1,39 1,46 002 1,46 1,5 1,52 Tổng sản lượng

cả năm (tấn) 275,5 267,6 213,6 296,9 254,2 300 350

Nguồn: Tổng cục thống kê [38]

Do chưa được đầu tư cao nên năng suất đậu tương còn nhiều hạn chế Năng suất đậu tương của nước ta rất thấp, chỉ bằng 50 – 70% năng suất đậu tương của toàn thế giới Sản lượng đậu tương sản xuất ra chưa kịp đáp ứng nhu cầu trong nước Hàng năm, chúng ta vẫn phải nhập khẩu một số lượng đáng kể từ nước ngoài Có nhiều nguyên nhân dẫn đến tình trạng trên, có thể

là do dịch bệnh, kỹ thuật canh tác, nhưng chủ yếu là do biến đổi khí hậu và hạn hán Cùng với việc nghiên cứu các công nghệ sinh học và các loại đậu

tương cao sản mới để tìm ra giống cho năng suất cao với chi phí sản xuất thấp, các nhà chọn giống Việt Nam còn quan tâm nghiên cứu các giống đậu tương có khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi của môi trường như: nóng, lạnh, hạn, mặn, phèn… [4], [7], [9]

1.1.2 Đặc tính chịu hạn của thực vật và cây đậu tương

Mỗi loài cây trồng có một giới hạn nhất định đối với các nhân tố sinh thái của môi trường như: nhiệt độ (nóng, lạnh), nước, phèn, độ mặn… Hạn tác động lên cây theo hai hướng chính làm tăng nhiệt độ cây

và gây mất nước trong cây [2], [14] Trong những nhân tố sinh thái của môi trường thì nước là một nhân tố giới hạn quan trọng của cây trồng, là sản phẩm khởi đầu, trung gian và cuối cùng của các quá trình chuyển hoá sinh hoá diễn ra trong cơ thể thực vật Nước là môi trường để các phản ứng trao đổi chất xảy ra trong tế bào Sự thiếu hụt nước ảnh hưởng xấu đến quá trình sinh trưởng và phát triển của cây, nếu thiếu nước nhẹ

sẽ làm giảm tốc độ sinh trưởng, thiếu nước trầm trọng sẽ làm biến đổi hệ keo nguyên sinh chất làm tăng cường quá trình già hóa tế bào khi bị khô kiệt nước, nguyên sinh chất bị đứt vỡ cơ học dẫn đến tế bào, mô bị tổn thương và chết Thiếu nước trước tiên ảnh hưởng đến sự cân bằng nước của cây, từ đó ảnh hưởng đến các chức năng sinh lý như quang hợp, hô hấp, dinh dưỡng khoáng do đó ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của thực vật [1], [7], [12] Ở thực vật khi bị thiếu hụt nước sẽ xảy ra sự hoạt hóa phosphoryl hóa các protein Một số protein kinase đã được mô

tả như nhân tố truyền tín hiệu (singnal transduction factor) liên quan đến phản ứng thẩm thấu ở thực vật Trong đó, SnRK2 (SNF1 – related protein kinase 2) là protein liên quan đến các phản ứng thích nghi với điều kện bất lợi của môi trường và nó điều hòa hoạt động bởi ABA (Umezawa và cs, 2004; Hiroaki Fujii và cs, 2009) [25] Một số nghiên

cứu cũng đã chứng minh được rằng SnRK2.8 (SRK2C) có liên quan đến phản ứng điều kiện khô hạn của cây trồng (Umezawa và cs, 2004) [36] Những cây có khả năng duy trì sự phát triển và cho năng suất tương đối

ổn định trong điều kiện khô hạn gọi là cây chịu hạn Khả năng của thực vật có thể giảm thiểu mức độ tổn thương do thiếu hụt nước gây ra gọi là tính chịu hạn [15], [17]

Khô hạn có thể phân ra làm các trường hợp sau:

(i) Hiện tượng khô xảy ra khi mất một phần nước trong các cơ quan ở giai đoạn nhất định trong chu kì sống ở thực vật (hạt, hạt phấn, bào tử) Hiện tượng này không làm ảnh hưởng đến tế bào, mô của cây Đây là quá trình biến đổi trạng thái trong tế bào có sự điều khiển của hệ thống thông tin di truyền Trong giai đoạn hình thành hạt nếu tế bào mất nước khả năng chịu hạn tăng lên Khả năng này đạt cực đại ở thời kì hạt chín và có chiều hướng giảm dần khi hạt nảy mầm Hạt khô còn có khả năng chống chịu với hàng loạt điều kiện ngoại cảnh bất lợi khác như nhiệt độ, gió

(ii) Hạn do tác động của môi trường chịu tác động bên ngoài rất lớn, gây ảnh hưởng đến đời sống của cây, có thể gây hủy hoại cây cối và gây mất mùa Hiện tượng này xảy ra khi trong môi trường đất và không khí thiếu nước đến mức áp suất thẩm thấu của cây không cạnh tranh được để lấy nước vào tế bào Những yếu tố bất lợi chính là các thành phần như thổ nhưỡng, nhiệt độ, gió nóng hay thời tiết, khí hậu Có hai loại hạn do môi trường tác động là hạn đất và hạn không khí

(iii) Hạn đất thường xảy ra ở những vùng có khí hậu hay thổ nhưỡng đặc thù, hạn tác động mạnh mẽ lên bộ rễ của cây Sự tác động này được biểu hiện qua sự điều tiết các hoocmon giúp cho cây chống chịu với điều kiện cực đoan

(iv) Hạn nhiệt độ không khí thường xảy ra ở những vùng có gió nóng, nhiệt độ cao Hạn không khí thường tác động lên các bộ phận trên mặt đất như lá, hoa Hạn do tác động của môi trường dẫn đến hiện tượng mất nước trong cây ở các bộ phận mô, tế bào khác nhau [8], [13]

Cây đậu tương là cây có nhu cầu về nước cao hơn các loại cây khác và

là cây chịu hạn kém Trong suốt thời gian sinh trưởng, nhu cầu nước của cây không đồng đều qua các giai đoạn Hạn thường làm giảm 40% năng suất đậu tương và tác động đến tất cả các giai đoạn sinh trưởng và phát triển, từ nảy mầm, ra hoa, tạo hạt cũng như chất lượng hạt được tạo thành Nói chung hạn hán ảnh hưởng đến mọi giai đoạn sinh trưởng của cây, đặc biệt với cây đậu tương thì giai đoạn tạo hạt đặc biệt cần nước vì giai đoạn này quá trình tổng hợp protein diễn ra mạnh do đó nước cung cấp cho cây lúc này có ý nghĩa lớn quyết định năng suất Ở cây đậu tương, để tổng hợp 1kg chất khô cần 500-530

kg nước Trong quá trình nảy mầm thì nhu cầu về nước của đậu tương cũng khá cao 50%, trong khi ở ngô chỉ là 30%, lúa là 26%

Khi nghiên cứu về đặc tính chịu hạn của cây đậu tương về phương diện sinh lý và di truyền đã cho thấy, các đặc tính này liên quan chặt chẽ đến đặc điểm hóa keo của nguyên sinh chất, đặc điểm của quá trình trao đổi chất Khi gặp hạn, axit absisic (ABA) được sinh ra chủ yếu ở phần rễ rồi chuyển hoá lên lá, gây hiện tượng héo lá, đóng khí khổng và đẩy nhanh tốc độ già hoá bộ

lá Khi hàm lượng ABA được chuyển hoá tới hạt, làm hạt bị lép trong quá trình đẫy hạt Theo Paroda thì khả năng chịu hạn ở thực vật liên quan đến một

số đặc trưng về hình thái như chín sớm, mầu lá, diện tích lá, khả năng phát triển của hệ rễ, số lượng lông hút, mầu sắc thân, độ phủ lông trên thân lá Ngoài ra, khả năng chịu hạn còn liên quan đến một số yếu tố sinh lý như khả năng đóng mở của khí khổng, quá trình quang hợp, hô hấp, điều chỉnh áp suất thẩm thấu, nhiệt độ tán cây

Tính chịu hạn của cây đậu tương mang tính đa gen, chúng thể hiện ở nhiều khía cạnh khác nhau: như sự phát triển nhanh của bộ rễ, tính chín sớm tương đối cũng như bản chất di truyền của từng giống có khả năng sử dụng nước tiết kiệm trong quá trình sinh trưởng và phát triển của cây Căn cứ vào đặc điểm này, đậu tương được chia thành hai nhóm:

- Nhóm chịu được sự mất nước trong từng giai đoạn phát triển của cây

- Nhóm chịu được sự thiếu nước trong tất cả giai đoạn phát triển của cây

Ở giai đoạn cây con khi gặp hạn, đậu tương có thể dễ vượt qua hơn, còn ở những giai đoạn sau như giai đoạn ra hoa, kết quả, hạt chín sữa mà gặp hạn thì sẽ dẫn đến năng suất giảm đáng kể

Signh và Sarkar (1991) chia cơ chế chịu hạn ở thực vật làm 3 loại:

- Tránh hạn: là khả năng của cây có thể hoàn thành chu kỳ sống của nó trước khi sự thiếu hụt nước xuất hiện

- Chịu hạn: là khả năng của cây có thể sống, phát triển và cho năng suất trong điều kiện cung cấp nước hạn chế hoặc thụ động trải qua các giai đoạn thiếu nước và tiếp tục phát triển khi điều kiện trở lại bình thường

- Chống hạn: là khả năng của cây trồng chống lại sự thiếu hụt nước bằng cách duy trì nước trong mô tế bào cao [6], [9], [13]

Đã có rất nhiều công trình khoa học trên thế giới nghiên cứu về tính chịu hạn của cây đậu tương nhằm góp phần quan trọng trong công tác chọn giống

Năm 2004, nhóm nghiên cứu gồm Huang và cs của trường Đại học Tự

nhiên và Kỹ thuật Pingtung - Taiwan đã phân lập được gen P5CS ở đậu tương từ mRNA với kích thước 2148 bp Gen P5CS là nhân tố giới hạn cho nhịp độ tổng

hợp proline ở thực vật trong điều kiện bất lợi do hạn và do mặn gây nên [6]

Prorcel và cs (2005) đã nghiên cứu phân lập gen P5CS ở đậu tương

và đăng kí trên ngân hàng gen NCBI với mã số là AJ715851, kích thước

Năm 1998, Ji Hoon Ahn và cs phát hiện gen Sb-HRGP3 dài 1.353 bp ở

đậu tương mã hoá hydroxyproline giàu glycoprotein hoạt động mạnh trong

mô của vùng chuyển đổi cấu tạo sơ cấp sang cấu tạo thứ cấp của rễ Ở rễ thứ cấp, gen này hoạt động mạnh hơn so với các rễ chính Rất có thể, sự biểu hiện

của gen Sb-HRGP3 liên quan đến việc chấm dứt sự kéo dài của rễ [19]

Khi nghiên cứu về gen TCS (gen hai thành phần hệ thống có chức năng

chống hạn) ở đậu tương các tác giả Dung Tien Le, Rie Nishiyama, Yasuko Watanabe và cs (2011) nhận thấy, cơ chế kháng hạn là một trong hai cơ chế liên quan đến rễ và chồi Khảo sát hình thái của 29 hệ rễ cây đậu tương các tác giả đã có nhận xét là sự phát triển của bộ rễ có sự tương quan mật thiết với các cơ chế kháng hạn Sự thích nghi linh hoạt của hệ rễ là một yếu tố quan trọng để duy trì sự sống trong điều kiện hạn hán

Ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu phân lập các gen liên quan đến tính chịu hạn, chịu nóng của cây đậu tương Trần Thị Phương Liên

và cs (2003) phân lập gen chaperonin CCTδ từ giống đậu tương địa phương

chịu hạn Cúc Vàng, gen này gồm 1602 nucleotide mã hoá cho 533 axit amin [8] Nguyễn Thu Hiền và cs (2005) phân lập gen dehydrin với kích thước 751

bp liên quan đến khả năng chịu hạn từ hai giống đậu tương vàng Mường Khương và Cao Bằng 4 Nguyễn Thị Thuý Hường và cs (2011) đã phân lập,

tạo đột biến điểm ở gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn và thử nghiệm

chuyển vào cây đậu tương Việt Nam [6]

1.2 DREB VÀ GEN DREB2

1.2.1 Gen DREB

Các protein điều hoà phiên mã có khả năng hoạt hóa hoặc ức chế biểu hiện của các gen chức năng thông qua việc bám vào trật tự DNA điều khiển trên vùng khởi động gen và tương tác với RNA polymerase tạo thành phức hợp khởi đầu quá trình phiên mã các gen chức năng Nhóm gen mã hóa các nhân tố phiên mã chiếm khoảng 8-10% trong hệ gen mỗi loài và đóng vai trò quan trọng trong mọi hoạt động sống như quá trình sinh trưởng phát triển và chống chịu với bất lợi môi trường Ở đậu tương, hơn 2000 yếu tố phiên mã từ các mô cơ quan chính đã được xác định, khoảng trên 180 yếu tố phiên mã ở rễ liên quan đến tính chịu hạn Các nhà khoa học đã xác định các nhân tố tham gia vào quá trình phiên mã của nhóm gen chịu hạn là DREB, ADREB, NAC, bZIP, ZFHD…

DREB là họ gen tổng hợp protein được tìm thấy nhiều trong tế bào sống khi thực vật gặp các điều kiện bất lợi như hạn hán, mặn và lạnh Nhiều công trình nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới cho rằng DREB là nhân tố phiên mã tham gia tích cực vào quá trình này bằng cách kích hoạt nhanh chóng sự hoạt động của các gen tham gia trực tiếp chống lại các điều kiện bất lợi của môi trường như hạn hán, mặn và lạnh Khi nghiên cứu cấu trúc protein họ DREB đã cho thấy rằng chúng có chứa vùng bảo thủ duy nhất

để gắn với trình tự DNA đặc hiệu là AP2/ERF, cho phép chúng tương tác với một loạt các gen phía sau theo hình thức không phụ thuộc ABA Các miền AP2/ERF khá bảo thủ và có khoảng 60 amino acid [21], [24], [27]

Shahrokhabadi và cs (2008) đã xác định được các gen trong họ gen DREB ở đậu tương

Trình tự đặc hiệu của nhóm nhân tố DREB1/CRT có trình tự lõi là A/GCCGAC lần đầu tiên được phát hiện nằm trong vùng điều khiển gen rd29

ở Arabidopsis và sau này được phát hiện trên rất nhiều vùng điều khiển gen của các gen biểu hiện trong điều kiện hạn và lạnh khác (Huang B, 2007) [27]

Dubouzet và cs (2003) cho rằng gen OsDREB1A, OsDREB1B, OsDREB1C, OsDREB1D, gặp lạnh, OsDREB2A được biểu hiện khi mất nước và nồng độ muối cao; các OsDREB1A và OsDREB2A tạo protein liên quan đến yếu tố DRE và kích hoạt yếu tố phiên mã của GUS tham gia vào quá trình chống chịu hạn

Theo Li và cộng sự (2005) phân lập gen trên đối tượng cây đậu tương

và đã chia thành các phân họ DREB gồm: GmDREBa, GmDREBb, GmDREBc, ngoài ra còn có DREB1, DREB2, DREB3, DREB4, DREB5 mỗi gen có trình tự, độ dài khác nhau nhưng đều được biểu hiện nhiều khi đậu tương gặp các điều kiện hạn [29]

Ở Arabidopsis, 10 DREBs (DREB2 – DREB11) được phân thành 5 nhóm, nhóm thứ nhất gồm DREB3, DREB4, DREB5; nhóm thứ hai gồm W50, DREB6, DREB7, DREB1; nhóm thứ ba gồm DREB2 và DREB8; nhóm thứ tư gồm DREB9 và DREB10; nhóm thứ năm gồm DREB11, ERF1 và ERF2 (Liu và cs, 1998; Riechman và cs, 2000; Tsui – Hung Phang, 2008)

Các nhà khoa học Trung Quốc, Đức, Pháp, Mỹ… đã nghiên cứu và giải trình tự gen DREB trên loài cúc và hướng dương, lúa mỳ…

Chen và cs (2007) đã nghiên cứu phân lập gen DREB5 từ mRNA ở cây đậu tương với kích thước là 927 bp [23]

Liu và Feng (2008) đã phân lập gen DREB4 từ mRNA ở cây thuốc lá

có kích thước là 644 bp [31]

Lucas và cs (2009) nghiên cứu gen DREB11 từ mRNA ở cây hướng dương có kích thước 1380 bp [32]

Trong những gen trên, gen DREB2 tham gia tích cực vào việc chống hạn của đậu tương Gen DREB2 được biểu hiện trong môi trường có xử lý bởi hạn hán, nồng độ muối cao, nhiệt độ thấp

1.2.2 DREB2 và gen GmDREB2

Việc mất nước được đáp ứng bởi nhóm DREB2 bao gồm các yếu tố phiên mã góp phần chống hạn và chống stress nhiệt bằng cách kích hoạt phiên

mã thông qua các yếu tố cis đáp ứng mất nước

Gen DREB2 tham gia tích cực vào việc chống hạn Gen DREB2 được biểu hiện trong môi trường có xử lý bởi hạn hán, nồng độ muối cao, nhiệt độ thấp

Nakashima và cs đã xác định được ở cây Arabidopsis gen DREB2 có liên

quan đến sự mất nước và độ mặn cao trong biểu hiện gen Trong cây

Arabidopsis gen biểu hiện trong điều kiện mất nước đặc trưng bởi một nhóm gen

DRE/CRT – binding protein là DREB2A và DREB2B Khi phân tích thấy rằng

cả hai gen được gây ra bởi sự mất nước và độ mặn cao Mức độ biểu hiện của hai gen rất cao trong rễ khi nồng độ muối cao và trong thân và rễ khi cây bị mất nước Gen DREB2A nằm trên NST số 5 và DREB2B nằm trên NST số 3, cả 2 gen bị gián đoạn bởi 1 intron duy nhất tại các vị trí giống hệt nhau [33]

Trong cây chuyển gen Arabidopsis gen DREB2 giải phóng ra

Beta-glucuronidase (GUS) trong điều kiện cây bị mất nước và độ mặn cao [33]

Chen và cs (2007), đã phân lập gen GmDREB2 từ đậu tương và dựa

trên sự giống nhau về miền AP2, gen GmDREB2 xếp vào phân họ A5 trong gen GmDREB2 nhóm gen DREB Sự biểu hiện của gen GmDREB2 trong môi trường có xử lý bởi hạn hán, nồng độ muối cao, nhiệt độ thấp và AB [23]

Sự biểu hiện của GmDREB2 ở cây thuốc lá chuyển gen được tích lũy cao hơn của hàm lượng proline [31] Đối với cây đậu tương với chức năng kích hoạt

sự phiên mã của là cơ sở quan trọng và hữu ích cho việc cải tiến khả năng chịu hạn của cây

Liu và cs (2008) đã nghiên cứu gen DREB2 ở cây hoa cúc

Dendranthema vestitum DvDREB2A được phân lập từ hoa cúc Dendranthema vestitum nó chứa một (ORF) dài 1.471 bp mã hóa 366 amino

acid và được xếp vào phân họ DREB2 dựa trên sự liên kết nhiều trình tự Trình tự protein điển hình chứa AP2/EREBP DNA - binding miền gần khu vực N Trong một phân tích protein DvDREB2A đã bị ràng buộc bởi yếu tố DRE (Trình tự lõi, AGCCGAC) và kích hoạt sự biểu hiện của HIS3 và giải phóng lacZ Các thí nghiệm cho thấy mức độ biểu hiện của DvDREB2A đã bị ảnh hưởng đáng kể bởi nhiệt, nhiệt độ thấp, hạn hán, ABA, độ mặn cao, những kết quả này chỉ ra rằng gen DvDREB2A là một yếu tố mới của các yếu

tố phiên mã DREB, có thể đóng một vai trò quan trọng trong việc tăng khả năng chịu áp lực môi trường [30]

Kobayashi và cs (2008) kích hoạt gen DREB2 lúa mì (wDREB2) trong thuốc lá chuyển gen Tạo ra cây thuốc lá biến đổi gen biểu hiện wDREB2, wDREB2 biểu hiện tăng khả năng chịu lạnh và thẩm thấu trong cây thuốc lá [28]

Chen và cs (2009) đã phân lập gen PeDREB2 từ cây populus euphratica Dựa trên sự liên kết nhiều trình tự và đặc tính phát sinh loài PeDREB2 được xếp vào phân họ A2 trong nhóm gen DREB Sự biểu hiện của PeDREB2 được gây ra bởi môi trường có xử lý hạn hán, lạnh và độ mặn cao nhưng không có ABA PeDREB2 tăng khả năng chịu mặn trong cây thuốc lá chuyển gen và không gây ra chậm phát triển Kết quả cho thấy PeDREB2 có chức năng như là một yếu tố phiên mã liên quan đến phản ứng của nồng độ muối cao và có thể có ích trong việc cải thiện khả năng chịu mặn trong cây chuyển gen [22]

Khi nghiên cứu về tính đa dạng di truyền trong điều kiện khô hạn của một nhóm đậu tương hoang dã được tìm thấy dọc theo dãy núi Andes ở Nam

Mĩ và khu vực Trung Mĩ, Cortes và cs (2012) cho rằng mức độ đa dạng nucleotide khi gặp điều kiện khô hạn của DREB2A cao hơn DREB2B [20]

Xiaoshuang Li và cs (2014) đã nghiên cứu EsDREB2B trong nhóm gen DREB2 ở một nhóm cây họ đậu và thấy rằng EsDREB2B mã hóa cho các polypeptide DREB2 Sự biến đổi gen quá mức của EsDREB2B làm tăng khả năng chịu nhiều stress phi sinh học trong cây EsDREB2B là một gen chức năng trong DREB2 có thể ảnh hưởng đến phản ứng sinh lý và sinh hóa của thực vật khi gặp điều kiện ngoại cảnh bất lợi [37]

Một gen DREB2 mới ở đậu tương là GmDREB2A, GmDREB2A được

đánh giá cao gây ra không chỉ bởi mất nước và nhiệt mà còn bởi nhiệt độ thấp GmDREB2A còn cải thiện sốc nhiệt và cải thiện chịu hạn ở cây

Arabidopsis biến đổi gen

Trong Ngân hàng gen quốc tế (Genbank) trình tự gen GmDREB2 đã được công bố, đó là trình tự gen GmDREB2 của Chen và cs công bố năm

2007 có kích thước 480 bp mã hóa 159 amino acid, mã số trên NCBI là

DQ208968 Trình tự gen GmDREB2 của Wang và cs công bố năm 2006 có

kích thước 480 bp, mã số trên NCBI là DQ054363

Thông tin về gen GmDREB2 cho thấy trình tự nucleotide của gen

GmDREB2 có số lượng nucleotide 480 bp, từ vị trí nucleotide thứ 1 đến 480,

mã hóa cho 159 amino acid, từ vị trí số 1 đến vị trí amino acid thứ 159

1.3 CHUYỂN GEN VÀ VECTOR CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT

1.3.1 Kỹ thuật chuyển gen trực tiếp và gián tiếp ở thực vật

Kỹ thuật chuyển gen ở thực vật là kỹ thuật đưa một hay nhiều gen lạ đã được thiết kế dạng plasmid tái tổ hợp, hoặc được gắn vào hệ gen của tế bào

chủ Trong tế bào chủ, gen lạ hoạt động tổng hợp nên các protein đặc trưng,

từ đó xuất hiện đặc tính mới của cơ thể đã mang gen chuyển Muốn chuyển gen lạ vào tế bào thực vật chủ, phải gắn gen mong muốn chuyển vào vector Các vector chuyển gen càng nhỏ càng tốt vì chúng dễ xâm nhập vào tế bào Vector phải có khả năng tự sao chép, nhờ đó gen lạ cũng được sao chép cùng với DNA vector Đồng thời vector phải được gắn gen chỉ thị chọn lọc, ví dụ, gen kháng với kháng sinh hoặc gen chỉ thị màu Vector phải có một hay một vài đoạn trình tự nhận biết và cắt của enzyme giới hạn tạo vị trí ghép nối với DNA để tạo DNA tái tổ hợp [1], [4], [16]

Có nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật nhưng có thể phân loại thành hai nhóm phương pháp chính: phương pháp chuyển gen gián tiếp và phương pháp chuyển gen trực tiếp

Ở phương pháp chuyển gen gián tiếp, gen được chuyển vào tế bào thực vật qua một sinh vật trung gian, thường là vi sinh vật hoặc virus Ở phương pháp chuyển gen trực tiếp, gen được chuyển trực tiếp vào tế bào thực vật thông qua những thiết bị hoặc máy móc nhất định mà không cần phải nhờ các

sinh vật trung gian [4], [11], [16]

Các phương pháp chuyển gen trực tiếp được sử dụng phổ biến trong các nghiên cứu chuyển gen thực vật có thể kể đến là (i) Phương pháp chuyển gen nhờ kỹ thuật xung điện, (ii) Phương pháp chuyển gen nhờ vi tiêm, (iii) Phương pháp chuyển gen trực tiếp qua ống phấn, (iv) Chuyển gen nhờ súng bắn gen, (v) Chuyển gen nhờ kĩ thuật siêu âm và (vi) Chuyển gen nhờ silicon carbide

Khác với các phương pháp chuyển gen trực tiếp ở thực vật, phương pháp chuyển gen gián tiếp được thông qua một vi sinh vật trung gian mang gen chuyển Những sinh vật này tiến hành quá trình chuyển gen vào tế bào thực vật thông qua các cơ chế rất tự nhiên Một trong những phương pháp

chuyển gen gián tiếp ở thực vật được sử dụng, nghiên cứu và ứng dụng khá phổ biến là phương pháp chuyển gen thông qua loài vi khuẩn đất là

(3) Thiết kế vector chuyển gen;

(4) Tạo vi khuẩn mang cấu trúc gen chuyển;

(5) Biến nạp vào mô hoặc tế bào thực vật;

(6) Chọn lọc các thể biến nạp;

(7) Tái sinh cây biến nạp;

(8) Phân tích cây chuyển gen [10], [12]

1.3.2 Hệ thống vector dùng trong chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium

Có hai hệ thống vector dùng cho chuyển gen thông qua A tumefaciens

là hệ thống vector liên hợp và hệ thống vector nhị thể

Vector liên hợp (cointegrate)

Vì kích thước Ti plasmid quá lớn nên thao tác với chúng rất khó khăn Giải pháp cho việc này là chuyển vùng T – DNA lên một vector nhỏ hơn

Điều này là hoàn toàn có thể nhờ gen vir đóng vai trò vận chuyển gen vào tế

bào chủ Hệ thống này gọi là hệ thống vector liên kết Cả gen tiền ung thư và gen tổng hợp opine ở dạng T – DNA hoang dại đều được thay thế bởi gen chọn lọc (gen kháng kháng sinh) Gen sinh tổng hợp opine trên Ti plasmid