nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật multiplex pcr phát hiện nhanh và đồng thời staphylococcus aureus và salomonella typhi gây bệnh trong thực phẩm

Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ PHẠM VĂN PHÚC NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR PHÁT HIỆN NHANH VÀ ĐỒNG THỜI Staphylococcus aureus VÀ Salmonella typh

Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

PHẠM VĂN PHÚC

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR

PHÁT HIỆN NHANH VÀ ĐỒNG THỜI Staphylococcus aureus

VÀ Salmonella typhi GÂY BỆNH TRONG THỰC PHẨM

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2013

Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

PHẠM VĂN PHÚC

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR

PHÁT HIỆN NHANH VÀ ĐỒNG THỜI Staphylococcus aureus

VÀ Salmonella typhi GÂY BỆNH TRONG THỰC PHẨM

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan: Luận văn này là công trình nghiên cứu thực sự của cá nhân, được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của TS Nguyễn Văn Duy Các số liệu, những kết luận nghiên cứu được trình bày trong luận văn này là trung thực

Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành chương trình cao học và viết luận văn này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Văn Duy, Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và hướng dẫn tận tình tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến TS Lê Quang Hòa, trưởng phòng Công nghệ gen, Viện CNSH&CNTP, Trường Đại học Bách Khoa

Hà Nội; TS Nguyễn Đắc Trung, phó trưởng khoa Y học Cơ sở, Trường Đại học

Y Dược Thái Nguyên; ThS Nguyễn Thị Lan Hương, cán bộ Trung tâm Y tế dự phòng tỉnh Thái Nguyên; ThS Đỗ Bích Duệ, cán bộ phòng Vi sinh, Viện Khoa học Sự sống, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã cung cấp các chủng vi sinh vật để thực hiện đề tài

sống, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên; các cán bộ Bộ môn Vi sinh, Khoa Y học Cơ sở, Trường Đại học Y Dược Thái Nguyên; các cán bộ phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học & Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

Tôi x

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, ngày 20 tháng 8 năm 2013

Học viên

Phạm Văn Phúc

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài: 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa khoa học, thực tiễn của đề tài 2

4.1 Ý nghĩa khoa học 2

4.2 Ý nghĩa thực tiễn 2

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tình hình ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus và Salmonella 3

1.1.1 Trên thế giới 3

1.1.2 Ở Việt Nam 6

1.2 Tổng quan về Salmonella typhi và Staphylococcus aureus 7

1.2.1 Salmonella typhi 7

1.2.1.1 Hình thái, cấu tạo của Salmonella typhi 7

1.2.1.2 Cấu trúc di truyền của Salmonella typhi 10

1.2.1.3 Các chỉ thị phân tử của Salmonella typhi 11

1.2.1.4 Đặc tính sinh học của Salmonella typhi 12

1.2.1.5 Đặc tính gây bệnh của Salmonella typhi 14

1.2.2 Staphylococcus aureus 15

1.2.2.1 Hình thái , cấu tạo của Staphylococcus aureus 15

1.2.2.2 Cấu trúc di truyền của Staphylococcus aureus 18

1.2.2.3 Các chỉ thị phân tử của Staphylococcus aureus 18

1.2.2.4 Đặc tính sinh học Staphylococcus aureus 19

1.2.2.5 Đặc tính gây bệnh do Staphylococcus aureus 22

1.3 Các phương pháp phát hiện Staphylococcus aureus và Salmonella typhi 24

1.3.1 Các phương pháp vi sinh 24

1.3.2 Các phương pháp sinh học phân tử 25

1.4 Tổng quan về kỹ thuật multiplex PCR 27

1.4.1 Nguyên lý của kỹ thuật multiplex PCR 27

1.4.2 Ứng dụng của kỹ thuật multiplex PCR trong phát hiện nhanh vi sinh vật gây bệnh……….28

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

2.1 Đối tượng nghiên cứu 31

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 31

2.2.1 Địa điểm nghiên cứu 31

2.2.2 Thời gian nghiên cứu 31

2.3 Vật liệu nghiên cứu 31

2.3.1 Các cặp mồi sử dụng trong đề tài 31

2.3.2 Hóa chất sử dụng trong đề tài 32

2.3.3 Dụng cụ, thiết bị 33

2.4 Phương pháp nghiên cứu 33

2.4.1 Phương pháp thiết kế cặp mồi 33

2.4.1.1 Thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho vi khuẩn Staphylococcus aureus 33

2.4.1.2 Thử nghiệm khả năng khuếch đại của các cặp mồi sử dụng bằng phản ứng PCR 34

2.4.2 Phương pháp tách chiết DNA 35

2.4.2.1 Phá vỡ tế bào vi khuẩn bằng sốc nhiệt 35

2.4.2.2 Tách chiết DNA vi khuẩn bằng hóa chất 36

2.4.2.3 Định lượng, kiểm tra chất lượng tách chiết DNA 37

2.4.3 Phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Staphylococcus aureus và Salmonella typhi 38

2.4.4 Phương pháp xác định ngưỡng phát hiện của phản ứng multiplex PCR 39

2.4.5 Phương pháp xác định độ đặc hiệu của multiplex PCR 39

Chương 3: KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 40

3.1 Thiết kế cặp mồi cho phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Staphylococcus aureus và Salmonella typhi 40

3.2 Xây dựng quy trình phát hiện nhanh và đồng thời Staphylococcus aureus và Salmonella typhi bằng phản ứng multiplex PCR 43

3.2.1 Tách chiết DNA tổng số của các chủng vi khuẩn 43

3.2.2 Nghiên cứu nồng độ DNA tối thiểu của các phản ứng PCR đơn phát hiện riêng rẽ Staphylococcus aureus và Salmonella typhi 45

3.2.3 Tối ưu phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Staphylococcus aureus và Salmonella typhi 47

3.2.4 Thử nghiệm quy trình kỹ thuật multiplex PCR với các chủng vi khuẩn thuần ……… 53

3.2.5 Thử nghiệm quy trình kỹ thuật multiplex PCR với các phương pháp tách chiết DNA khác nhau 54

3.3 Xác định giới hạn phát hiện của phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Staphylococcus aureus và Salmonella typhi 56

3.4 Xác định độ đặc hiệu của phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Staphylococcus aureus và Salmonella typhi 57

Chương 4: KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 60

4.1 Kết luận 60

4.2 Kiến nghị 61

TÀI LIỆU THAM KHẢO 62

DANH MỤC CÁC TỪ, CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Tên đầy đủ

ATTP An toàn thực phẩm

ATVSTP An toàn vệ sinh thực phẩm

CIAA Hỗn hợp gồm 24 chloroform : 1 isoamylalcohol

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Bảng phân loại Salmonella và vật chủ theo danh pháp

KauffmannWhite 8

Bảng 1.2 Những đặc tính của S aureus, S epidermidis và Micrococci 22

Bảng 2.1 Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu 32

Bảng 2.2 Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 32

Bảng 2.3 Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 33

Bảng 3.1 Kết quả xác định nồng độ DNA tổng số của các chủng vi khuẩn nghiên cứu 44

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc tế bào vi khuẩn S typhi 9 Hình 1.2 Hình thái Staphylococcus aureus 16

Hình 3.1 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR thử nghiệm khả năng khuếch

đại của các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu 42

Hình 3.2 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết DNA tổng số của các

chủng vi khuẩn nghiên cứu 43

Hình 3.3 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi NucF-NucR

(đường chạy 1-6) và sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi BS1-BS2 (đường chạy 12) sử dụng DNA khuôn ở các nồng độ khác nhau 45

7-Hình 3.4 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm khuếch đại của các phản ứng PCR

phát hiện riêng rẽ S typhi (đường chạy 1-12) và S aureus (đường chạy 13-24) ở

các điều kiện hàm lượng MgCl2 và nhiệt độ gắn mồi khác nhau 48

Hình 3.5 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm multiplex PCR với cặp mồi

BS1-BS2 và NucF-NucR ở nồng độ 0,6 µM sử dụng khuôn là hỗn hợp 1,8 ng/µl

DNA tổng số của S typhi và 2,0 ng/µl DNA tổng số của S aureus 49

Hình 3.6 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm phản ứng multiplex PCR ở các

nồng độ mồi khác nhau 51

Hình 3.7 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm multiplex PCR trên các chủng

Salmonella typhi và Staphylococcus aureus 54

Hình 3.8 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm của phản ứng multiplex PCR khi

sử dụng 2 phương pháp tách chiết DNA khác nhau 55

Hình 3.9 Kết quả điện di kiểm tra giới hạn phát hiện của phản ứng multiplex

PCR phát hiện nhanh và đồng thời S typhi và S aureus 57

Hình 3.10 Kết quả điện di kiểm tra độ đặc hiệu của phản ứng multiplex PCR

trên các chủng vi khuẩn kiểm định 58

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Trong những năm trở lại đây vấn đề bảo đảm chất lượng và an toàn thực phẩm (ATTP) đang là mối quan tâm đặc biệt ở nước ta và nhiều nơi trên thế giới Thực tế hiện nay thực phẩm có nguồn gốc từ động vật, gia cầm bán ở các chợ, cửa hàng lại không đảm bảo chất lượng Chính vì vậy con người có thể bị nhiễm vi sinh vật thông qua thức ăn sống hoặc nấu chưa chín như thịt, gia cầm, trứng và các sản phẩm sữa [54] Điều đó cũng lý giải vì sao mà hàng năm có rất nhiều vụ ngộ độc thực phẩm (NĐTP) xảy ra Trên thế giới các vụ ngộ độc thực phẩm có xu hướng ngày càng tăng [37] Trung bình cứ 1.000 dân có 175 người

bị NĐTP mỗi năm và chi phí cho 1 ca NĐTP mất 1.531 đôla Mỹ (FDA 2006)

Ở Việt Nam theo số liệu thống kê chưa đầy đủ của Cục An toàn vệ sinh thực phẩm (ATVSTP) từ đầu tháng 4/2012 đến hết tháng 12/2012 cả nước đã xảy ra

10 vụ ngộ độc thực phẩm làm 972 người mắc, trong đó có 726 người phải nhập viện và đã có 04 trường hợp tử vong Phần lớn các vụ NĐTP xảy ra với quy mô nhiều người mắc, nguyên nhân chủ yếu gây ngộ độc là do thực phẩm nhiễm vi

sinh vật Đặc biệt vi khuẩn thương hàn (Salmonella typhi) và tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) là thủ phạm chính gây ra các vụ NĐTP

Để phát hiện Salmonella typhi và Staphylococcus aureus, phương pháp

chủ yếu hiện nay vẫn được sử dụng là phương pháp nuôi cấy truyền thống trên

môi trường đặc hiệu Phương pháp này bao gồm nhiều công đoạn nuôi cấy kết

hợp với các bước kiểm tra sinh hóa tốn nhiều thời gian (từ 4 đến 5 ngày theo ISO 6579:2003) [37], [44], [54] Sự phát hiện chậm các vi khuẩn gây bệnh trong mẫu thực phẩm là một trong những nguyên nhân góp phần giúp cho những tác nhân gây bệnh này có cơ hội lây lan trong cộng đồng, ảnh hưởng đến sức khỏe của con người và gây ảnh hưởng đến công tác phòng chống bệnh truyền nhiễm trong cộng đồng

Với sự phát triển của sinh học phân tử, các vùng gen đặc hiệu cho các loài vi

sinh vật gây bệnh, đặc biệt là các vi khuẩn gây bệnh thuộc chi Staphylococcus và Salmonella đã được hiểu biết khá đầy đủ Nhờ đó, nhiều kỹ thuật sinh học phân

tử đã được ứng dụng trong việc phát hiện nhanh và đồng thời nhiều tác nhân gây bệnh trong mẫu phân tích dựa trên các dấu hiệu phân tử mang tính đặc hiệu loài

Các kỹ thuật này bao gồm kỹ thuật PCR, multiplex PCR, ELISA, DNA arrays… Trong đó multiplex PCR là kỹ thuật có độ nhạy cao, cho phép phát hiện nhanh

và đồng thời nhiều tác nhân gây bệnh chỉ trong một phép phân tích [7], [44] Xuất phát từ thực tiễn đời sống, trên cơ sở căn cứ vào năng lực nghiên cứu

và được sự chấp thuận của Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Đại học Thái Nguyên, chúng

tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Staphylococcus aureus và Salmonella typhi gây bệnh trong thực phẩm”

2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài:

Xây dựng được kỹ thuật multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời

Staphylococcus aureus và Salmonella typhi trong mẫu thực phẩm với độ nhạy

và độ đặc hiệu cao

3 Nội dung nghiên cứu

* Thiết kế các cặp mồi cho phản ứng multiplex PCR

* Xây dựng quy trình phát hiện nhanh và đồng thời Staphylococcus aureus và Salmonella typhi bằng phản ứng multiplex PCR

* Xác định độ nhạy của phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh và

đồng thời Staphylococcus aureus và Salmonella typhi

* Xác định độ đặc hiệu của phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh và

đồng thời Staphylococcus aureus và Salmonella typhi

4 Ý nghĩa khoa học, thực tiễn của đề tài

4.1 Ý nghĩa khoa học

Nghiên cứu phát triển kỹ thuật multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng

thời Staphylococcus aureus và Salmonella typhi trong mẫu thực phẩm Tạo tiền

đề khoa học cho việc phát triển bộ kít phát hiện nhanh hai loài vi khuẩn gây bệnh này trong mẫu thực phẩm

4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu sẽ tạo tiền đề phát triển bộ kít phát hiện nhanh và

đồng thời Staphylococcus aureus và Salmonella typhi trong mẫu thực phẩm góp

phần giám sát chất lượng ATTP

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus và Salmonella

1.1.1 Trên thế giới

Ngộ độc thực phẩm là một bệnh cấp tính xảy ra khi ăn phải thức ăn bị nhiễm vi khuẩn, độc tố của vi khuẩn hoặc thức ăn có chứa các chất độc hại đối với người ăn Bệnh có tính chất đột ngột, có thể nhiễm độc cho nhiều người tại cùng một thời điểm khi họ tiêu thụ cùng một loại thức ăn [63] Ngộ độc thực phẩm có những triệu chứng của một bệnh cấp tính như nôn mửa, tiêu chảy…hoặc kèm theo các triệu chứng khác tùy theo từng loại tác nhân gây ngộ

độc [63]

Thực phẩm nhiễm các vi sinh vật và độc tố của vi sinh vật là một trong những nguyên nhân gây bệnh phổ biến trên toàn cầu, xảy ra ở cả các nước có nền khoa học và y học phát triển cũng như các nước lạc hậu kém phát triển [44] Hiện nay, loài người đang phải đối mặt với nguy cơ nhiễm hơn 200 bệnh truyền nhiễm thông qua thực phẩm Các triệu chứng lâm sàng khá đa dạng, từ mức viêm dạ dày, ruột nhẹ cho tới nhiễm trùng, nhiễm độc nặng với nguy cơ tử vong cao, hoặc dẫn tới các biến chứng phức tạp, ảnh hưởng tới đời sống của bệnh nhân Hậu quả và thiệt hại kinh tế do các bệnh lây truyền qua thực phẩm rất lớn và có xu hướng ngày càng tăng Thể hiện, mỗi năm ở Mỹ có khoảng 76 triệu ca mắc bệnh các loại do thực phẩm ô nhiễm, 325 nghìn ca nhập viện và 5 nghìn ca tử vong Các chi phí điều trị cho các bệnh nhân khoảng 6,5 tỷ đô la, thiệt hại do nghỉ điều trị khoảng 34,9 tỷ đô la/năm [51]

Người tiêu dùng có thể mắc bệnh khi sử dụng thực phẩm bị ô nhiễm các mầm bệnh vi sinh vật, độc tố của vi sinh vật hoặc một số kim loại độc Trong số

hơn 200 bệnh có nguồn gốc từ thực phẩm có khoảng 40 mầm bệnh vi sinh vật

đã được xác định vai trò gây bệnh Các mầm bệnh vi sinh vật bao gồm vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng và virút, trong đó các loại vi khuẩn gây ra tới 90% số ca bệnh tử vong ở người Thế giới đang trong kỷ nguyên toàn cầu hóa, việc sản xuất và phân phối một sản phẩm thực phẩm không bị bó hẹp trong không gian địa lý dẫn đến khả năng lan tràn khắp thế giới các bệnh do thực phẩm ô nhiễm Đồng thời, trong quá trình công nghiệp hóa, thực phẩm được sản xuất hàng loạt

đã làm khả năng nhiều người tiêu dùng mắc bệnh tăng cao Số ca mắc các bệnh

do thực phẩm ô nhiễm tăng đáng kể trong vòng 10 năm trở lại đây [51]

Mặc dù y học hiện nay đã khá phát triển, song các tác nhân gây bệnh trực tiếp từ thực phẩm vẫn chưa được phát hiện đầy đủ Tại Mỹ, chỉ có 14/76 triệu ca mắc, 60/325 nghìn ca nhập viện và 1,8/5 nghìn ca tử vong do nhiễm độc thực phẩm là chẩn đoán được chính xác nguyên nhân [51] Trong số các nguyên nhân đã được xác định, có một số mầm bệnh có khả năng gây nhiễm trùng,

nhiễm độc thực phẩm cấp tính nguy hiểm với tỉ lệ tử vong cao như: Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Vibrio cholera, Salmonella, Campylobacterer, Yersinia enterocolitica Tụ cầu vàng gây ra

khoảng 14% trong các vụ ngộ độc thực phẩm và hàng năm Mỹ mất khoảng 1,5

tỉ đô la cho những vụ ngộ độc do tụ cầu [57] Ngoài vấn đề viện phí còn phải mất nhiều thời gian làm việc cũng như sản phẩm lao động của người bệnh, và cả việc phải loại bỏ những sản phẩm bị nhiễm

Vụ ngộ độc lớn đầu tiên có liên quan đến tụ cầu xảy ra vào năm 1884 ở Michigan do phomai Tiếp đến là ở Pháp vào năm 1894 do thịt bò bị nhiễm vi sinh vật Thịt bò bị nhiễm tụ cầu vàng cũng từng gây ngộ độc ở Kalamazoo, Michigan vào năm 1907 Năm 1914 ở Philippines, Barbert xác định rằng sữa lấy từ bò bị viêm vú đã gây ra ngộ độc ở người Năm 1930, Dark lại xác định

được vụ ngộ độc do S aureus từ bánh giáng sinh [50]

Cách đây vài thập niên, các vụ ngộ độc do tụ cầu chiếm 25% các vụ ngộ

độc thực phẩm ở Mỹ [57] Từ năm 1988 đến 1992, S aureus gây ra 5,1% trong

số các vụ ngộ độc ở Châu Âu [57] Từ năm 1988 đến 1996, ở Đức xảy ra nhiều

vụ ngộ độc thực phẩm do tụ cầu vàng gây ra và vào năm 2000 lại xảy ra một vụ dịch làm 297 người bị ngộ độc cũng do tác nhân là tụ cầu vàng [14]

Ở Đài Loan, S aureus chiếm 30% trong số các vụ dịch từ năm 1986 đến

năm 1995 Vào tháng 6 năm 2000, vụ ngộ độc thực phẩm do tụ cầu vàng tại một trường trung học ở Taichung County làm 10 trong số 356 học sinh có biểu hiện ngộ độc 2-3 giờ sau khi ăn sáng [74] Ở Brazil, vào tháng 2 và tháng 5 năm

1999 đã xảy ra hai vụ dịch làm 378 người bị ngộ độc do dùng phomai và sữa

tươi có nhiễm tụ cầu vàng [28] Tại Pháp, năm 1997 người ta tìm thấy S aureus

là tác nhân gây ra 569 trong tổng số 1142 vụ ngộ độc thực phẩm [28]

Ở các nước châu Á, tụ cầu vàng (S aureus) là nguyên nhân hàng đầu gây

ra ngộ độc [2] Trong khu vực Đông Nam Á, hai quốc gia có tỷ lệ ngộ độc S aureus cao là Indonesia và Philippines Ở Nhật cũng đã có 2 vụ ngộ độc S aureus lớn vào tháng 8 năm 1955 làm ngộ độc hơn 1936 em học sinh tại 5

trường tiểu học ở Tokyo và tháng 6 năm 2006 làm 1478 người bị ngộ độc ở vùng Kansai Nguyên nhân của 2 vụ ngộ độc này đều do họ đã uống sữa có

nhiễm S aureus của tập đoàn Snow Còn ở Trung Quốc trong năm 2008 đã xảy

ra 1 vụ NĐTP ở trẻ em vì uống sữa bị nhiễm S aureus [2]

Ngày 1/1/2006 tại Allanta đã xảy ra một đợt truyền nhiễm vi khuẩn

Salmonella có liên quan tới thực phẩm đã làm ngã bệnh 172 người ở 18 tiểu bang, 11 người phải vào bệnh viện Thực phẩm bị nghi nhiễm Salmonella gồm:

rau diếp và cà chua ở các tiệm ăn và siêu thị Ngày 26/12/2007 Ban kiểm dịch

và an toàn thực phẩm của Bộ Nông nghiệp Mỹ (FSIS) phát hiện vi khuẩn

Salmonella trong thịt bò tươi ở các cửa hàng và các kho chứa tại các siêu thị ở

Arinoza, California, Hawaii, Nevada và New Mexico Đã làm 38 trường hợp bị mắc bệnh [9] Ngày 9/7/2008 tại Mỹ đã có trên 1000 người bị ngã bệnh vì vi

khuẩn Salmonella, được xem là con số lớn nhất từ 10 năm qua tại Mỹ vì NĐTP

Thủ phạm chính bị nghi ngờ là cà chua, ớt đỏ và ngò tươi Tốc độ nhiễm trung

bình là 25-40 ca mỗi ngày, lan tràn trong 41 tiểu bang Tại Canada cũng có 4 trường hợp [9]

1.1.2 Ở Việt Nam

Tuy thời gian gây bệnh ngắn nhưng những vụ ngộ độc thực phẩm do tụ cầu vàng để lại hậu quả không nhỏ Theo đánh giá của tổ chức Y tế thế giới, hàng năm Việt nam có khoảng trên 3 triệu ca ngộ độc thực phẩm, gây tổn hại trên 200 triệu đô la Trong những năm gần đây số vụ ngộ độc thực phẩm ở nước ta ngày càng gia tăng Năm 2000 có 213 vụ ngộ độc thực phẩm với 4233 người mắc 59 người tử vong [3]

Theo số liệu từ cục Quản lý chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm, trong những vụ dịch được tổng kết từ năm 1997 đến 2002 thì ngộ độc thực phẩm do tác nhân vi sinh vật chiếm tỷ lệ cao từ 40 - 45% trong các loại gây ngộ độc,

trong số đó có nhiều vụ được xác định tác nhân là vi khuẩn Staphylococcus aureus và vi khuẩn Salmonella typhi [8]

Tại Việt Nam, thực phẩm nhiễm khuẩn và các độc tố của chúng rất đa dạng, thường gặp nhất là các thực phẩm đường phố ăn ngay (46,6%), xúc xích

(96,6%), bánh gato (85%), patê (83,3%) Đáng chú ý là vi khuẩn S aureus

thường được tìm thấy trong các thực phẩm bị nhiễm khuẩn [10] Qua các cuộc khảo sát tình hình vệ sinh thức ăn đường phố và các thực phẩm chế biến sẵn tại

các chợ cho thấy mức độ nhiễm Staphylococcus aureus là rất cao, phù hợp với

các kết quả xét nghiệm trong các vụ ngộ độc tại thành phố Hồ Chí Minh trong những năm qua Đáng chú ý hơn cả là ở các mẫu bánh mì thịt nguội là 16/30 mẫu (53%), các mẫu thịt quay là 18/20 mẫu (90%) [6], [8] Điển hình là vụ ngộ độc thực phẩm của cán bộ, sinh viên khoa Địa chất và Sinh học trường Đại học Khoa học tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh vào ngày 27/7/2006 trong chuyến đi thực tế

đã ăn trưa tại Nha Trang (Khánh Hòa) Vụ ngộ độc làm tất cả 105 người phải vào bệnh viện để cấp cứu Nguyên nhân được xác định là do thức ăn chế biến không hợp vệ sinh, lại để lâu nên đã nhiễm tụ cầu vàng và đã sinh độc tố enterotoxin [4].

Theo thống kê của Cục quản lý chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm năm 2002, trong tổng số 269 vụ ngộ độc theo dõi từ năm 1983-1989 có 5756

người mắc, tử vong 156 (2,7%) mà nguyên nhân chủ yếu là do Salmonella

Ngày 16/5/2005 vụ ngộ độc kem Tràng Tiền làm 13 người gia đình chị Ngô Mai Lan phải vào viện Bạch Mai Nguyên nhân chính là do trong kem nhiễm vi

khuẩn Salmonella [9]

Tình trạng ngộ độc thực phẩm không chỉ diễn ra ở các thành phố lớn mà còn diễn ra phổ biến ở nhiều địa phương khác trên cả nước [73] Từ dữ liệu của Cục vệ sinh an toàn thực phẩm thì năm 2005 số vụ ngộ độc thực phẩm ở nước

ta là 141 vụ, làm 4291 người bị ngộ độc, trong đó có 73 vụ (51,8%) là do vi sinh vật gây ra [8]

1.2 Tổng quan về Salmonella typhi và Staphylococcus aureus

1.2.1 Salmonella typhi

1.2.1.1 Hình thái, cấu tạo của Salmonella typhi

Salmonella thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae Họ vi khuẩn

này có đặc điểm chung là gram âm, hình que, oxidase âm và có thể di động được

Có nhiều phương pháp khác nhau để định danh Salmonella, trong đó Kauffmann

White là phương pháp định danh được công nhận và sử dụng rộng rãi từ năm

2003 Phương pháp này dựa vào sự ngưng kết của huyết thanh với 2 kháng nguyên

bề mặt của Salmonella là kháng nguyên O và kháng nguyên H [29]

Kháng nguyên O có bản chất là một polysaccharide nằm ở ngoài cùng của màng tế bào Cấu trúc của kháng nguyên O là cao phân tử gồm nhiều tiểu đơn vị Mỗi tiểu đơn vị gồm từ 4 đến 6 gốc đường Những thay đổi trong thành phần hay liên kết giữa các gốc đường của tiểu đơn vị tạo ra những loại kháng nguyên O khác nhau Kháng nguyên O được chia thành các nhóm kháng huyết thanh khác nhau (serogroup) qui ước bằng số như O9, O2, O4 [29]

Salmonella là vi khuẩn đường ruột duy nhất có thể biểu hiện hai loại

kháng nguyên H khác nhau được mã hóa bởi hai gen khác nhau [29] Tuy nhiên hoạt động của 2 gen được phối hợp sao cho chỉ một kháng nguyên H được biểu hiện ở một thời điểm trong một tế bào vi khuẩn [29] Hai kháng nguyên H này được xếp vào pha 1 và pha 2 Các chủng “đơn pha” là các chủng chỉ biểu hiện một kiểu kháng nguyên duy nhất do sự bất hoạt của gen mã hóa cho kháng nguyên pha 1 hoặc pha 2 Ngoài ra, một số tuýp huyết thanh “đơn pha” do tự

nhiên như S enteriditis, S typhi

Theo phương pháp định danh này, Salmonella được chia thành hai loài: Salmonella enterica và Salmonella bongori (trước đây được xếp vào Salmonella enterica phân loài V) Salmonella enterica được chia thành 6 phân loài qui định bằng tên hoặc số La Mã Trong đó S typhi thuộc phân loài I [27]

Bảng 1.1 Bảng phân loại Salmonella và vật chủ theo danh pháp

KauffmannWhite [27].

Loài và phân loài

Salmonella

Số lƣợng tuýp huyết thanh trong mỗi phân loài

Vật chủ

S.enterica subsp.enterica (I) 1454 Động vật máu nóng

S.enterica subsp.salamae (II) 489 Động vật máu lạnh và môi trường

S.enterica subsp.arizonae (IIIa) 94 Động vật máu lạnh và môi trường

S.entericasubsp.diarizonae (IIIb) 324 Động vật máu lạnh và môi trường

S.enterica subsp.houtenae (IV) 70 Động vật máu lạnh và môi trường

S.enterica subsp.indica (VI) 12 Động vật máu lạnh và môi trường

Tổng cộng: 2463 tuýp huyết thanh

Salmonella enterica subsp enterica serotype typhi (S typhi) là chủng vi khuẩn có tên tuýp huyết thanh (serotype) là typhi thuộc giống Salmonella, loài Salmonella enterica và phân loài enterica [27]

Salmonella typhi còn được qui ước bằng công thức kháng nguyên: I

9,12(Vi):d:- để mô tả vi khuẩn này thuộc phân loài I có kháng nguyên O là 9, 12

và mang thêm kháng nguyên vỏ Vi, kháng nguyên H pha I là d và không có

kháng nguyên H pha 2 Phần lớn (59%) tuýp huyết thanh của Salmonella thuộc

S enterica phân loài I trong đó các nhóm kháng huyết thanh O phổ biến nhất là O2, O4, O9 gây ra khoảng 99% sự nhiễm trùng do Salmonella ở người và động

vật máu nóng [27]

* Đặc điểm cấu trúc của Salmonella typhi (Hình 1.1)

Hình 1.1 Cấu trúc tế bào vi khuẩn S typhi [59]

Salmonella typhi có chiều dài 2-3µm và đường kính 0,5 µm, cấu trúc gồm

2 màng, màng trong và màng ngoài ngăn cách nhau bởi vách murein mỏng nhưng chắc chắn giúp định hình tế bào Màng trong và màng ngoài đều là các lớp lipoprotein, đóng vai trò là hàng rào có tính thấm chọn lọc đối với tế bào

Trên màng có các kênh chuyên biệt để vận chuyển các phân tử vào và ra khỏi tế bào chất [59]

Màng ngoài được bao phủ bởi các kháng nguyên O Ở S typhi và S paratyphi đặc biệt còn mang kháng nguyên vỏ Vi, là cao phân tử của axit

Nacetylglucosamine uronic, nằm bên ngoài bề mặt tế bào và bao phủ kháng

nguyên O Salmonella typhi còn mang các roi dài 2-5 µm là sự kéo dài của các thể nền bên trong tế bào Hầu hết Salmonella được bao phủ bởi lớp lông giúp

cho sự gắn của tế bào vi khuẩn lên tế bào chủ Những sợi lông này có đường kính khoảng 10nm, ngắn hơn và thẳng hơn so với các sợi roi, cấu trúc từ các tiểu đơn vị fimbrillin hoặc pilin [59]

Cấu trúc bề mặt của S typhi đóng vai trò quan trọng quyết định các đặc tính sinh lý và sự bám vào các mô của tế bào chủ Nếu Salmonella mất hoặc

không biểu hiện kháng nguyên O sẽ không có khả năng sống sót trong tế bào chủ do kháng nguyên O là lớp lipopolisaccharide bảo vệ vi khuẩn khỏi sự tấn công của các bổ thể của hệ miễn dịch [7], [43]

1.2.1.2 Cấu trúc di truyền của Salmonella typhi

Trình tự bộ gen của chủng S typhi đa kháng thuốc CT18 phân lập ở bệnh

viện Nhiệt Đới thành phố Hồ Chí Minh đã được công bố lần đầu tiên trên thế giới vào năm 2001 [59] Bộ gen có kích thước 4.809.037 bp với khoảng 4599 gen,

mang nhiều đoạn gắn chèn lớn (Salmonella pathogenicity islands-SPIs) Các đảo

độc tính này chứa các gen quan trọng cho sự xâm nhập và tồn tại của vi khuẩn

trong tế bào chủ Đặc biệt bộ gen S typhi mang 204 pseudogen chiếm hơn 4% trình tự mang mã, tương tự với bộ gen của S paratyphi [31], [41] Pseudogen là

những trình tự DNA mang mã nhưng không được dịch mã Những gen này có thể

bị bất hoạt do đột biến tạo stop codon, đột biến gây lệch khung, mất đoạn hay tái

sắp xếp đoạn Trong khi hầu hết các tuýp huyết thanh của S enterica đều gây bệnh

ở nhiều kí chủ khác nhau và giới hạn ở viêm dạ dày, ruột thì S typhi và S paratyphi chỉ gây bệnh ở người và còn gây nhiễm trùng hệ thống Trình tự DNA

bộ gen S typhi và S paratyphi có mức độ tương đồng cao nhất Sự bất hoạt những

gen đóng vai trò quan trọng trong tương tác với các tế bào chủ, các gen làm thay

đổi chu trình kí sinh nội bào…được xem là cơ chế tiến hóa để S typhi cũng như S paratyphi trở thành vi khuẩn gây bệnh chuyên biệt ở người [31], [41]

Một đặc điểm quan trọng khác ở S typhi là vi khuẩn này mang rất ít đặc tính đa dạng di truyền Khi giải trình tự gen để phân biệt S typhi thu được rất ít vị

trí đa hình [42] Việc tìm hiểu những vi khuẩn có tính đa dạng di truyền thấp như

S typhi gặp rất nhiều khó khăn và đòi hỏi những kỹ thuật phức tạp [12]

Trình tự gắn chèn IS200 là một nhân tố di truyền có thể di chuyển Ở E coli không có trình tự này Trình tự IS200 được tìm thấy trên các locus bảo tồn

ở nhiễm sắc thể của nhiều tuýp huyết thanh của Salmonella Trong nghiên cứu của mình, Gibert đã xác định số lượng nhân tố IS200 trên 15 chủng S typhi dao

động từ 10-25 Do số lượng bản sao nhiều và khác biệt đáng kể nên IS200 được

xem là chỉ thị thích hợp để phân biệt các kiểu di truyền ở S Typhi [34] Tuy

nhiên trong một nghiên cứu dịch tễ sử dụng trình tự IS200 để phân biệt các kiểu

di truyền ở S typhi chỉ tìm được 11-15 nhân tố IS200 trên nhiễm sắc thể S typhi Dựa vào các trình tự này có thể xác định được một số kiểu di truyền ở S typhi nhưng hiệu quả phân biệt không cao [59]

1.2.1.3 Các chỉ thị phân tử của Salmonella typhi

Cho đến nay, nhiều trình tự gen của Salmonella typhi đã được sử dụng

làm chỉ thị trong việc phát triển các phương pháp phát hiện nhanh loài vi khuẩn

này Chaudhry R và cộng sự (1997) đã sử dụng gen fliC-d mã hóa cho kháng nguyên lông có mặt ở hơn 100 phân loài của Salmonella để phát hiện S typhi [30]; Hashimoto Y và cộng sự (1995) đã sử dụng gen kháng nguyên vỏ ViaB làm gen chỉ thị để phát hiện S typhi [36]; Zhu Q và cộng sự (1996) đã sử dụng gen 16S rRNA làm gen chỉ thị để phát hiện S typhi [78]; Pui C F và cộng sự (2011) đã sử dụng gen 23S rRNA làm gen chỉ thị để phát hiện S typhi [63]

Kumar S và cộng sự (2005) đã sử dụng multiplex PCR để khuếch đại bốn trình

tự gen invA, viaB, flic-d, prt nhằm phát hiện vi khuẩn S typhi [44] Gen prt là một phần của cụm gen rfb và mã hóa cho CDP paratose synthase trong đó

chuyển đổi CDP-4-keto-3, 6 - dideoxyglucose thành CDP paratose Gen này

hiện diện trong phân loài typhi, paratyphi A và vài phân loài khác [37], [44]

Một tập hợp 7 gen chỉ thị được chọn nằm rải rác trên nhiễm sắc thể của S typhi CT18 bao gồm aroC (chorismate synthase), dnaN (DNA polymerase III beta subunit), hemD (uroporphyrinogen III cosynthase), hisD (histidinol dehydrogenase), purE (phosphoribosylaminoimidazole carboxylase), sucA (alpha ketoglutaratedehydrogenase) và thrA (aspartokinase+homoserine

dehydrogenase) Các gen này được giải trình tự (tổng cộng 3336 bp) và được

dùng để phân biệt 26 chủng S typhi phân lập khắp nơi trên thế giới từ năm 1918

đến 2000 Tuy nhiên kết quả chỉ tìm thấy có 3 vị trí đa hình ở 26 chủng này và 4 loại trình tự [42]

Gen rfbE là một gen trong S typhi mã hóa protein vận chuyển màng CDP-tyvelose epimerase [18], [47], trình tự hoàn chỉnh của gen rfbE được trích dẫn từ GenBank (mã số AF332602) là 1313 bp [54] Gen rfbE đã được nhiều nghiên cứu sử dụng làm chỉ thị phát hiện đặc hiệu S typhi Mousavi S L và cộng sự (2006) đã sử dụng gen rfbE làm gen chỉ thị để phát hiện S typhi bằng

phương pháp PCR-ELISA, kết quả của nghiên cứu cho thấy quy trình có độ đặc hiệu đạt 100%, giới hạn phát hiện trong PCR-ELISA là 2,5ρg DNA, toàn bộ quy trình mất khoảng 100 phút [54] Liu D và cộng sự (1991) đã nghiên cứu

mối quan hệ giữa các vùng rfb của vi khuẩn Samonella phân loài A, B và D và cho thấy gen rfbE là vùng gen đặc hiệu cho phân loài S typhi [47] Hirose K và cộng sự (2002) đã sử dụng multiplex PCR khuếch đại có chọn lọc các gen tyv (rfbE), prt (rfbS), viaB, và gen flic để xác định Salmonella enterica serovar typhi và paratyphi A đạt kết quả đặc hiệu 100% [37]

1.2.1.4 Đặc tính sinh học của Salmonella typhi

Salmonella typhi là trực khuẩn Gram âm không tạo bào tử, kị khí tùy ý,

di động được bằng các roi có vành lông rung, phát triển tốt nhất ở 37o

C, có khả năng lên men glucose nhưng không lên men lactose, có thể tạo một ít H2S

từ cơ chất sulphat tan Chúng sinh catalase nhưng không tạo oxidase trong quá trình sống [39]

Điều khác biệt giữa S typhi so với hầu hết Salmonella là không bao giờ

sinh hơi từ glucose, không sử dụng citrate hoặc decarboxylate orthinine và

không lên men rhamnose Salmonella typhi không sinh indole, thử nghiệm

Voges-Proskauer âm tính, phenylalanine deaminase và urease âm tính Các đặc tính sinh hóa này được sử dụng kết hợp với các thử nghiệm ngưng kết kháng

huyết thanh trong định danh S typhi [39]

Salmonella typhi là vi khuẩn gây bệnh chuyên biệt ở người mà không gây bệnh ở bất kỳ sinh vật nào khác Salmonella typhi có khả năng thay đổi để

chống lại các điều kiện ngoại cảnh bất lợi như nhiệt độ cao, pH thấp vì vậy rất

khó để loại bỏ tận gốc vi khuẩn này khỏi chuỗi thức ăn Salmonella typhi có thể

tồn tại ở thịt chưa được nấu chín và xâm nhập qua hàng rào cản axit dạ dày để gây bệnh ở người [39]

1.2.1.5 Đặc tính gây bệnh của Salmonella typhi

Nguồn lây bệnh và con đường truyền nhiễm:

Sốt thương hàn là bệnh nhiễm trùng hệ thống do S typhi gây ra [54] Con người là kí chủ duy nhất của S typhi [23], [37], [43], [44], [60] Người lành

mang trùng có thể thải từ 106 đến 109 vi khuẩn thương hàn trong mỗi gram

phân Salmonella typhi có thể tồn tại trong nước ao, hồ, nước ngầm, trong sữa,

thịt, trứng và sò bị nhiễm khuẩn Liều gây bệnh là 103 đến 106 vi khuẩn theo đường miệng [60]

Vi khuẩn thương hàn lây qua đường tiêu hóa Đa số các trường hợp mắc bệnh là do ăn uống thực phẩm, nước bị nhiễm khuẩn và không được nấu chín Những yếu tố nguy cơ phải kể đến nguồn nước nhiễm bẩn, kem, thực phẩm và nước uống đường phố, rau quả được tưới bằng nước thải bẩn hoặc được rửa bằng nước nhiễm khuẩn như nước sông, nước ao hồ, cống rãnh [23], [43], [60] Nguy cơ khác bao gồm tiếp xúc với người lành mang mầm bệnh, điều kiện vệ

sinh ăn ở kém và tiền sử nhiễm Helicobacter pilori Những người từng nhiễm Helicobacter pilori bị giảm axit trong dạ dày tạo điều kiện thuận lợi cho S typhi

xâm nhập qua rào cản axit dạ dày [23] Do liên quan đến những yếu tố điều kiện sống nên bệnh thường lưu hành ở những nơi có mật độ dân số cao cùng với tập quán sinh hoạt kém vệ sinh

Triệu chứng lâm sàng của bệnh do Salmonella typhi:

Sau khi S typhi xâm nhập vào cơ thể từ 7-21 ngày thì bắt đầu xuất hiện

các triệu chứng khó ở, mệt mỏi, nhức đầu, biếng ăn, sốt nhẹ Sau đó sốt cao dần, đặc biệt về đêm (39 - 40oC), kéo dài hàng tuần nếu không điều trị; cùng với đó

là tiêu chảy hoặc táo bón, ho, nôn mửa, đau bụng, cổ cứng Bệnh nhân còn có thể bị chậm nhịp tim, lách to, mơ sảng [23], [43], [60] Trong tuần thứ hai 30% bệnh nhân có những đốm hồng ở bụng, ngực, lưng còn gọi là hồng ban [60] Sau tuần thứ ba bệnh nhân dần hồi phục Tuy nhiên 10% bệnh nhân bị tái phát hay biến chứng nặng hơn [23] Các biến chứng nguy hiểm bao gồm xuất huyết tiêu hóa và thủng ruột

Ngoài ra, 1 - 6% bệnh nhân trở thành nguồn mang S typhi mãn tính Những người này có thể mang vi khuẩn S typhi trong tủy xương hay túi mật từ

vài tháng đến cả cuộc đời, đồng thời thải vi khuẩn qua phân và nước tiểu theo định kỳ mà không hề biểu hiện triệu chứng bệnh nào [23], [43], [53], [58] Đây

là vấn đề y tế công cộng quan trọng vì những người này có thể là nguồn lây nhiễm và làm bùng phát dịch bệnh trong tương lai

Sự phát sinh bệnh do Salmonella typhi:

Các nghiên cứu về sự phát sinh bệnh do S typhi gặp nhiều khó khăn do

con người là kí chủ duy nhất của vi khuẩn này Hầu hết những hiểu biết về sự

phát sinh bệnh do S typhi đều dựa trên những nghiên cứu ở S typhimurium một

týp huyết thanh gây bệnh tương tự bệnh sốt thương hàn ở chuột [23]

Sau khi vào cơ thể, vi khuẩn tấn công vào ruột Tại đây chúng xâm nhập qua các tế bào M của mảng Peyer hoặc di chuyển qua các tế bào biểu mô hấp thu

để xuyên qua lớp dưới niêm mạc ruột non Tiếp đó vi khuẩn kích thích phản ứng viêm và hoạt động thực bào bởi bạch cầu trung tính và đại thực bào; đồng thời huy động tế bào bạch huyết B và T Vi khuẩn này có thể tồn tại và nhân lên trong

các bạch cầu đơn nhân, qua đó giúp S typhi phát tán theo đường máu và bạch

huyết đến các hạch bạch huyết mạng treo ruột và các mô sâu hơn [43] Sau khi phát tán vi khuẩn sẽ gây nhiễm trùng máu sơ cấp với các triệu chứng nhẹ như

hồng ban, ho; tiếp đó S typhi nhiễm vào lách, gan và tủy xương gây nhiễm trùng máu thứ cấp Trong tuần thứ hai của bệnh, S typhi nhiễm vào túi mật Sau đó vi

khuẩn nhân lên, theo ống mật vào ruột non và được thải ra ngoài qua phân [43]

1.2.2 Staphylococcus aureus

1.2.2.1 Hình thái , cấu tạo của Staphylococcus aureus

* Danh pháp và phân loại của Staphylococcus aureus

Vi khuẩn tụ cầu vàng thuộc giới Eubacteria, ngành Firmicutes, lớp Cocci, bộ Bacillales, họ Staphylococcaceae, giống Staphylococcus, loài Staphylococcus aureus Tên khoa học là Staphylococcus aureus [15]

Trên phương diện gây bệnh, tụ cầu khuẩn được chia thành hai nhóm

chính: tụ cầu có coagulase và tụ cầu không có coagulase Staphylococcus aureus gây bệnh ngộ độc thực phẩm là tụ cầu có coagulase Nhờ enzyme này

mà trên môi trường nuôi cấy có máu, vi khuẩn tạo nên các khuẩn lạc màu vàng nên còn được gọi là tụ cầu vàng

Phân loại tụ cầu dựa trên kháng nguyên: Các tụ cầu có nhiều loại kháng nguyên như protein, polysaccharid, axit teichoic của vách tế bào vi khuẩn Nhưng dựa vào kháng nguyên, việc định loại vi khuẩn rất khó khăn

Phân loại tụ cầu dựa trên phage (phage type): tụ cầu được phân vào các

nhóm I, II, III, IV Đây là phương pháp sử dụng nhiều trong phân loại S aureus

* Đặc điểm cấu trúc của Staphylococcus aureus (Hình 1.2)

Hình 1.2 Hình thái Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus thuộc giống Staphylococcus, do đó mang những tính chất chung của Staphylococcus Staphylococcus aureus là những vi khuẩn

hình cầu, không di động, gram dương, đường kính 0,5-1,5 µm, tế bào xếp thành

hình chùm nho, không di động Thành tế bào kháng với lysozyme và nhạy với lysotaphin, một chất có thể phá hủy cầu nối pentaglycin của tụ cầu [50]

1.2.2.2 Cấu trúc di truyền của Staphylococcus aureus

Hiện nay người ta đã thành công trong giải trình tự gen của các chủng tụ cầu vàng được kí hiệu: Newman, COL, UMRSA 252, MW2, MSSA476, N315, Mu50, RF122 [15], [16], [35], [38], [45] Steven và cộng sự đã thành công

trong việc giải trình tự bộ gen dài 2809422 bp của chủng S aureus COL Kết

quả giải trình tự đã được đăng ký trên Genbank với mã số: CP000046.1 cho hệ gen và CP000045 cho hệ gen plasmid Theo đó, trình tự gen của tụ cầu vàng có chứa ít các cặp G - C, điều này gây ra mối quan ngại về sự chuyển gen từ các chủng tụ cầu vàng tới các tác nhân gây bệnh Gram dương khác [70]

Trong số các chủng S aureus phân lập từ các mẫu thực phẩm, tỷ lệ giống

enterotoxigenic được ước tính khoảng 25% Tại Pháp, trong số 61 chủng phân lập từ phomát và sữa tươi có 15,9% chủng là giống enterotoxigenic Ở Pháp,

trong 332 chủng S aureus được phân lập từ nhiều loại thức ăn có 57% chủng

chứa các gen SEG, SEB, SEI và SEJ xuất hiện với tần số cao hơn hẳn chủng chứa gen SEA và SEE, trước đây vốn được xem là chiếm ưu thế [5], [65]

1.2.2.3 Các chỉ thị phân tử của Staphylococcus aureus

Chủng S aureus sản xuất ra một enzyme ngoại bào chịu nhiệt nuclease

(thermonuclease [TNase]) với tần số tương ứng với thời điểm mà nó sản xuất ra coagulase [25], [48] Các TNase là một loại protein có khối lượng phân tử 17.000 Da [25] Nó là một endonuclease, làm giảm cả DNA và RNA và hoạt động của enzyme có thể chống lại nhiệt độ 100o C trong vòng 1 giờ [25]

Trong các phản ứng PCR phát hiện S aureus, người ta thường dùng các mồi chuyên biệt để phát hiện gen nuc mã hóa nuclease chịu nhiệt [21], [25], [67], [76] Sasaki T và cộng sự (2010) đã sử dụng gen nuc trong việc nhận dạng loài Staphylococci dương tính với coagulase bằng phướng pháp multiplex-PCR

Để đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu quy trình multiplex PCR đã được sử dụng trên 374 chủng tụ cầu mà trước đó đã được xác định mức độ loài bằng cách tiếp

cận sử dụng trình tự hsp60, quy trình đã thành công trong việc phân biệt giữa S aureus, S hyicus, S schleiferi, S intermedius, S pseudintermedius, và nhóm S Delphini A và B Phương pháp có độ nhạy là 99,8% và độ đặc hiệu 100% và là

phương pháp nhanh chóng đơn giản, tiết kiệm chi phí [67] Brakstad O G và

cộng sự (1992) đã sử dụng gen nuc làm gen chỉ thị trong phát hiện S aureus bằng phản ứng khuếch đại gen nuc [25] Wilson I G và cộng sự (1991) đã sử dụng gen nuc làm gen chỉ thị để phát hiện S aureus trong sữa nghi ngờ bị

nhiễm tụ cầu vàng [76] Ngoài ra theo nghiên cứu của Pinto B và cộng sự (2004) cho biết có thể dùng các mồi chuyên biệt khác để phát hiện các gen mã

hóa độc tố ruột (enterotoxin), gen tst (gây hội chứng sốc), gen eta và etb (mã

hóa độc tố A và B gây mảng tróc), vùng đệm rDNA 16-23S và rDNA 23S [61] Còn có nhiều phương pháp dựa trên PCR được dùng để phát hiện nhanh tụ cầu như inter-IS256 PCR, spa typing [74], hay phương pháp DNA fingerprinting cũng như phương pháp RLPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA) để

phân loại các dòng S aureus và kĩ thuật PCR-RFLP (Randomly Fragment Length Polymorphism) để phân tích gen aroA [61]

1.2.2.4 Đặc tính sinh học Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus là những vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy nghi, có

enzyme catalase phân giải oxy già giải phóng oxy và nước:

catalase

H2O2 H2O + O2

Staphylococcus aureus cho phản ứng đông huyết tương dương tính do chúng tiết ra enzyme coagulase Đây được xem là tính chất đặc trưng của S aureus, là tiêu chuẩn để phân biệt S aureus với các tụ cầu khác Có hai dạng

coagulase: coagulase “cố định” (“bound” coagulase) gắn vào thành tế bào và coagulase “tự do” (“free” coagulase) được phóng thích khỏi thành tế bào Có hai phương pháp để thực hiện thử nghiệm coagulase là thực hiện trên lam kính

và trong ống nghiệm Phương pháp lam kính giúp phát hiện những coagulase

“cố định” bằng cách phản ứng trực tiếp với fibrinogen, phương pháp ống nghiệm phát hiện những coagulase “tự do” bằng phản ứng gián tiếp với fibrinogen qua cộng hợp với những yếu tố khác trong huyết tương [66]

Ngoài ra, chúng còn cho phản ứng DNAse, phosphatase dương tính, có

khả năng lên men và sinh axít từ manitol, trehalose, sucrose Tất cả các dòng S aureus đều nhạy với Novobicine, có khả năng tăng trưởng trong môi trường

chứa đến 15% muối NaCl [66]

Một số chủng S aureus có khả năng gây tan máu trên môi trường thạch

máu, vòng tan máu phụ thuộc vào từng chủng nhưng chúng đều có vòng tan

máu hẹp hơn so với đường kính khuẩn lạc Hầu hết các dòng S aureus đều tạo

sắc tố vàng, nhưng các sắc tố này ít thấy khi quá trình nuôi cấy còn non mà thường thấy rõ sau 1-2 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng Sắc tố được tạo ra nhiều hơn trong môi trường có hiện diện lactose hay các nguồn hidrocacbon khác mà

vi sinh vật này có thể bẻ gãy và sử dụng [66]

Trên môi trường BP (Baird Parker), khuẩn lạc đặc trưng của S aureus có

màu đen nhánh, bóng, lồi, đường kính 1-1,5 mm, quanh khuẩn lạc có vòng sáng rộng 25 mm (do khả năng khử potassium tellurite K2TeO3 và khả năng thủy phân lòng đỏ trứng của lethinase) [66] Trên môi trường MSA (Manitol salt agar) hay còn gọi là môi trường Chapman, khuẩn lạc tròn, bờ đều và lồi, màu vàng nhạt đến vàng đậm và làm vàng môi trường xung quanh khuẩn lạc (do lên men đường manitol) [66]

Đa số các dòng S aureus có thể tổng hợp một hay nhiều enterotoxin

trong môi trường có nhiệt độ trên 15oC, nhiều nhất khi chúng tăng trưởng ở nhiệt độ 35-37o

C

Đặc tính sinh học của S aureus, S epidermidis và Micrococci được thể

hiện ở bảng 1.2 sau:

Bảng 1.2 Những đặc tính của S aureus, S epidermidis và Micrococci [20]

Đặc tính S aureus S epidermidis Micrococci

1.2.2.5 Đặc tính gây bệnh do Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus được xem là một trong ba tác nhân chính của các

vụ ngộ độc thực phẩm ở nhiều nước chỉ sau Salmonella và Clostridium perfringens [14], [26], [57], [75] Triệu chứng thường gặp ở các vụ ngộ độc do tụ

cầu là buồn nôn, nôn mửa, đau bụng, có hay không có tiêu chảy, ngoài ra còn có thể bị đau đầu, chuột rút, thay đổi huyết áp Triệu chứng ngộ độc xảy ra nhanh, từ 3-6 giờ sau khi ăn thực phẩm bị nhiễm, tùy vào lượng thực phẩm đã dùng, lượng độc tố có trong thực phẩm và độ nhạy với độc tố cũng như sức khỏe của từng người [26] Thường thì các triệu chứng chỉ kéo dài trong một thời gian ngắn, khoảng 6-8 giờ và hết bệnh sau 1-2 ngày [26] Tuy nhiên khoảng 10% trường hợp người bệnh bị mất nhiều nước cần phải nhập viện để truyền dịch [57]

Những thực phẩm bị nhiễm tụ cầu và gây ngộ độc thường gặp là thịt, cá,

gà và sản phẩm từ chúng, rau cải, trứng, nấm, sữa và sản phẩm từ sữa, kem, phomai, thực phẩm lên men [54], [57]

Hầu hết các vụ ngộ độc do tụ cầu là do quá trình chế biến hoặc bảo quản thực phẩm không tốt Tụ cầu thường nhiễm trực tiếp vào thực phẩm do tay người chế biến bị trầy xước hay do ho, hắt hơi Việc bảo quản thực phẩm ở nhiệt độ không phù hợp cũng rất quan trọng, một khi thực phẩm đã nhiễm tụ cầu, chúng sẽ tăng nhanh số lượng do tụ cầu phát triển được trong khoảng nhiệt

độ rất lớn, từ 7o

C - 48oC Điều đáng lo ngại độc tố được tạo ra trong suốt quá trình phát triển của tụ cầu nhưng lại không gây ảnh hưởng đến cảm quan của thực phẩm, do đó ít được chú ý [66]

Việc tìm hiểu các cơ chế mà vi khuẩn sử dụng để xâm nhập và gây bệnh

có ý nghĩa quan trọng trong quá trình phòng chống bệnh Bước quan trọng đầu tiên trong quá trình tương tác giữa tác nhân gây bệnh và vật chủ là sự bám dính (adherence) của tác nhân gây bệnh vào các bề mặt của vật chủ Các bề mặt này bao gồm da, niêm mạc (khoang miệng, mũi hầu, đường tiết niệu) và các tổ chức sâu hơn (tổ chức lympho, biểu mô dạ dày ruột, bề mặt phế nang, tổ chức nội

mô) Giống như các vi khuẩn Gram dương khác là Streptococcus và Mycobacteria, S aureus bám dính vào bề mặt vật chủ nhờ các adhensin có bản

chất polypeptide Một khi đã bám dính vào bề mặt tế bào vật chủ, tác nhân gây

bệnh như S aureus mới có khả năng khởi động các quá trình hóa sinh đặc hiệu

gây bệnh như tăng sinh, bài tiết độc tố, xâm nhập và hoạt hóa các chuỗi tín hiệu

của tế bào vật chủ Staphylococcus aureus sẽ tiếp tục tiến sâu vào trong cơ thể vật chủ để tiếp tục chu trình xâm nhập [77] Staphylococcus aureus xâm nhập

ngoại bào bằng cách tiết một số enzyme như: hyaluronidase, hemolysine, leukocidin, exfoliatine ,… phá hủy các thành phần cấu tạo tế bào vật chủ [72]

Ngộ độc thức ăn do tụ cầu có thể do ăn, uống phải độc tố ruột của tụ cầu hoặc do tụ cầu vàng vốn cư trú ở đường ruột chiếm ưu thế về số lượng Nguyên nhân là sau một thời gian dài bệnh nhân dùng kháng sinh có hoạt phổ rộng, dẫn đến các vi khuẩn đường ruột nhạy cảm kháng sinh bị tiêu diệt, tạo điều kiện thuận lợi cho tụ cầu vàng tăng trưởng về số lượng Ngoài nguyên nhân là do tụ

cầu, một số trường hợp có thêm vai trò của vi khuẩn Clostridium difficile Ước

tính khoảng 0,1 mg S aureus đã đủ gây ngộ độc thực phẩm ở người Tuy nhiên,

lượng này cũng có thể thay đổi tùy thuộc độ nhạy cảm với tác nhân ở mỗi bệnh nhân [77]

1.3 Các phương pháp phát hiện Staphylococcus aureus và Salmonella typhi 1.3.1 Các phương pháp vi sinh

Hiện nay, phương pháp truyền thống để xét nghiệm Salmonella typhi và Staphylococcus aureus trong thực phẩm dựa trên nguyên tắc nuôi cấy, phân lập

vi khuẩn; quy trình này phải trải qua nhiều bước: đồng nhất mẫu, tăng sinh chọn lọc, xác định các tính chất hóa sinh và miễn dịch [17], [37], [44], [54]

Ưu điểm: Thao tác đơn giản, dễ làm, không phải đầu tư dụng cụ và thiết

bị đắt tiền

Nhược điểm: Độ nhạy không cao [63], thời gian để xác định tình trạng ô nhiễm thực phẩm do Salmonella typhi và Staphylococcus aureus lâu, tốn nhiều

nhân công cần có nhân viên có kỹ thuật có kinh nghiệm về vi sinh vật, không

thể phát hiện được các chủng Salmonella typhi và Staphylococcus aureus này

có sinh độc tố do đó hạn chế trong công tác phòng ngừa, tốn nhiều hóa chất, yêu cầu kỹ năng thao tác

Tụ cầu dương tính với coagulase không phải là S aureus thường xuyên được xác định nhầm là S aureus [67] Rất khó để phát hiện các loài dựa trên sự

khác biệt về kiểu hình bởi vì không có dấu hiệu phản ứng sinh hóa duy nhất (tiêu chuẩn vàng) nào đặc trưng cho nhận dạng các loài [67], [68]

Phương pháp miễn dịch: dựa trên phản ứng của kháng thể đặc hiệu với

kháng nguyên bề mặt để phát hiện nhanh sự nhiễm vi sinh vật trong thực phẩm

Ưu điểm: Độ nhạy cao, cho phép phát hiện các sản phẩm ở mức độ

khoảng 10 pg Thời gian cho kết quả nhanh hơn các phương pháp xét nghiệm truyền thống

Nhược điểm: Phải có những cán bộ kinh nghiệm và được đào tạo bài bản

mới có thể thực hiện được

Tuy vậy phương pháp miễn dịch vẫn cho tỉ lệ kết quả dương tính giả cao Theo nghiên cứu của Berke A và cộng sự (1986) cho biết tỉ lệ dương tính giả

khi xác định Staphylococcus aureus bằng phương pháp miễn dịch là 10,3% và

họ khuyến cáo sử dụng phương pháp miễn dịch như là biện pháp thông thường

để xác định Staphylococcus aureus [21]

1.3.2 Các phương pháp sinh học phân tử

Phương pháp truyền thống tuy được sử dụng từ rất lâu, được nhiều quốc gia công nhận nhưng cũng có những nhược điểm nhất định như mất nhiều thời gian, công sức, tốn kém, thường phải mất khoảng 4-5 ngày mới xác định được mẫu có nhiễm vi sinh vật hay không [37], [44], [54] Để khắc phục những nhược điểm này việc ứng dụng kĩ thuật sinh học phân tử hiện đại để phát hiện

và phân biệt các tác nhân gây bệnh ngày càng trở nên quan trọng hơn trong vệ sinh an toàn thực phẩm [14], [44]

Kỹ thuật PCR: Nguyên tắc của kỹ thuật PCR dựa trên sự thay đổi nhiệt

độ ở 3 giai đoạn khác nhau của quá trình phản ứng: giai đoạn biến tính, giai đoạn gắn mồi và giai đoạn kéo dài Đây là kỹ thuật nhân số lượng bản sao gen của độc tố vi khuẩn trong thực phẩm lên hàng triệu lần đến mức có thể phát hiện được chúng

Nhiều công trình nghiên cứu sử dụng phương pháp PCR để phát hiện S typhi

và các phân loài Salmonella khác đã được công bố [13], [30], [36], [37], [56], [78]

Ưu điểm: Độ nhạy cao, độ đặc hiệu cao Thời gian thực hiện nhanh giúp

cho công tác phòng ngừa Đơn giản ít tốn kém

Nhược điểm: Có thể xuất hiện hiện tượng dương tính giả nếu có hiện

tượng nhiễm DNA đích trong không khí hoặc trong sinh phẩm, trong dụng cụ

Kỹ thuật Realtime PCR: Phương pháp này cho phép theo dõi sự hình

thành sản phẩm PCR theo từng chu kỳ của phản ứng qua sử dụng kỹ thuật phát huỳnh quang từ đó định lượng nồng độ vi sinh vật trong thực phẩm

Năm 2007 Malorny B và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật realtime PCR để

phát hiện vi khuẩn Salmonella enteritidis trong thịt gia cầm và trứng Gen Prot6e nằm trên S enteritidis đã được sử dụng để thiết kế mồi và mẫu dò Độ

nhạy và độ đặc hiệu của quy trình đạt 100% [49] Munoz N và cộng sự (2010)

đã nghiên cứu và phát triển kỹ thuật multiplex realtime PCR để xác định loài

Salmonella enterica Serovars phổ biến có trong mẫu bệnh phẩm và thực phẩm Trong nghiên cứu này các gen rfb, flic, fljB, và viaB đã được sử dụng để thiết kế

15 cặp mồi và các mẫu dò Độ đặc hiệu và độ nhạy của quy trình lần lượt là

100% và 95,5% khi được đánh giá thông qua việc sử dụng 267 Salmonella mẫu

được chọn ngẫu nhiên [55]

Ưu điểm: Nhanh, xác định chính xác lượng sản phẩm tạo ra tại mỗi thời

điểm của phản ứng Độ nhạy độ đặc hiệu cao Không cần chạy điện di kiểm tra kết quả PCR

Nhược điểm: Hạn chế lớn nhất của kỹ thuật này là chi phí cao, yêu cầu thiết

bị đắt tiền và yêu cầu cán bộ phân tích có kinh nghiệm, được đào tạo bài bản

Kỹ thuật khuếch đại ngẫu nhiên các đoạn DNA đa hình PCR): Phương pháp này lần đầu tiên được phát hiện bởi Williams và cộng sự

(RAPD-năm 1990 trên cơ sở kỹ thuật PCR Khác với kỹ thuật PCR thông thường sử dụng các đoạn mồi bổ sung cho các trình tự đã biết, RAPD chỉ sử dụng các mồi oligonucleotid được tổng hợp ngẫu nhiên từ 9 đến 12 base Như vậy, RAPD cho phép phát hiện tính đa hình mà không cần biết trước một trình tự nucleotide nhất định Tính đa hình này có thể sử dụng làm chỉ thị phân tử hoặc dùng để lập bản đồ gen

Các công trình nghiên cứu trên thế giới ứng dụng kỹ thuật RAPD đã được công bố như Quintaes B R và cộng sự (2004) tối ưu hóa của phản ứng RAPD

đặc trưng cho Salmonella enterica serovar typhi, trong nghiên cứu này để tối ưu

phản ứng RAPD các nhà khoa học đã sử dụng nồng độ khác nhau của DNA khuôn, mồi, MgCl2 và Taq polymerase để kiểm tra 8 chủng Salmonella typhi

được phân lập ở các khu vực khác nhau của Brazil [64]

Ưu điểm: Có độ nhạy và độ đặc hiệu cao khi phân biệt các loài khác nhau Nhược điểm: Phương pháp này rất nhạy cảm với điều kiện phản ứng như

sự tách biệt trong trường điện di Trong trường hợp PFGE làm thay đổi khả năng di động lại là trường điện tích thay đổi liên tục dẫn đến các mảnh DNA có kích thước khác nhau thay đổi hướng di động Như vậy kết quả là các mảnh có kích thước khác nhau sẽ có khả năng di động khác nhau Kích thước càng lớn thì mức độ di động càng chậm Sự di động khác nhau của DNA phụ thuộc chủ yếu vào kích thước chứ không phải do gel agarose như ở phương pháp điện di thông thường [32], [40]

Stephen G L và cộng sự (2010) đã sử dụng phương pháp PFGE để giám

sát sự tăng cường lây nhiễm của vi khuẩn Salmonella [69].

Ưu điểm: Tiêu chuẩn vàng để phân tích mối liên hệ về kiểu gen của các

vi khuẩn

Nhược điểm: Kỹ thuật này đòi hỏi phải có trang thiết bị chuyện dụng,

cũng như kinh nghiệm vì việc tách nhiểm sắc thể đôi khi gặp khó khăn trên một

số đối tượng vi sinh vật

1.4 Tổng quan về kỹ thuật multiplex PCR

Multiplex PCR là phản ứng PCR cho phép phát hiện cùng lúc nhiều gen của một sinh vật hay nhiều sinh vật khác nhau bằng cách sử dụng nhiều cặp mồi khác nhau trong một phản ứng [63]

Kỹ thuật này không khác nhiều so với kỹ thuật PCR thông thường Điểm khác biệt duy nhất là thay vì sử dụng 1 cặp mồi để nhân lên 1 loại DNA hay gen đích ở PCR thông thường, multiplex PCR sử dụng từ 2, 3 hay 5 cặp mồi trở lên

để nhân lên ít nhất là 2 loại DNA hay gen đích tại cùng một thời điểm và cùng một chế độ nhiệt của chu kỳ phản ứng PCR [33], [37], [63], [71]

Các đoạn DNA, gen được nhân lên đồng thời thường nhằm mục đích phát hiện cùng một lúc nhiều đối tượng (loài, chủng…) khác nhau hoặc sàng lọc các đối tượng gây bệnh có khả năng đồng nhiễm ở một loại mẫu bệnh phẩm (máu, nước tiểu, mô…) Vì thế, multiplex PCR giúp giảm thiểu các thao tác và tiết kiệm thời gian trong chẩn đoán, sàng lọc phát hiện bệnh [67]

1.4.2 Ứng dụng của kỹ thuật multiplex PCR trong phát hiện nhanh vi sinh vật gây bệnh

Mặc dù đã có nhiều phương pháp sinh học phân tử khác nhau được áp

dụng để phát hiện Staphylococcus aureus [19], [22], [24], [46], [62], [68] nhưng

hầu hết các phương pháp đó đều tốn kém về kinh phí và thời gian, không những thế cách bố trí thí nghiệm và diễn giải kết quả rất phức tạp [67]

So với các kỹ thuật phát hiện nhanh và đồng thời tác nhân gây bệnh khác,

kỹ thuật multiplex PCR là kỹ thuật đơn giản, không yêu cầu thiết bị phức tạp nên đã trở thành công cụ phổ biến trong việc phát hiện nhiều tác nhân gây bệnh trên người, vật nuôi cũng như trong các mẫu thực phẩm Vì vậy chúng tôi lựa chọn và nghiên cứu phương pháp multiplex PCR để phát hiện nhanh đồng thời

cả hai vi khuẩn S typhi và S aureus

Từ các mô tả đầu tiên năm 1988, phương pháp multiplex PCR đã từng được áp dụng thành công trong rất nhiều lĩnh vực thí nghiệm DNA gồm có phân