Báo cáo Hóa học gống và vi sinh vật

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.2. VI KHUẨN BACILLUS VÀ VAI TRÒ TRONG SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC 2.2.1. Đặc điểm sinh học Theo mô tả trong khóa phân loại Bergey (2008), vi khuẩn Bacillus (B.) thuộc lớp Bacilli, bộ Bacillales, họ Bacillaceae. Đặc điểm của chung của họ này là các vi khuẩn hình gậy, bắt màu Gram dương, sinh nội bào tử, phần lớn có khả năng di động nhờ các lông roi xung quanh thân. Họ Bacillaceae sinh nội bào tử được chia thành 2 chi: Chi sinh nội bào tử yếm khí là Clostridium Chi sinh nội bào tử hiếu khí là Bacillus Chi Bacillus gồm các trực khuẩn Gram dương, nhưng khi nuôi cấy lâu chúng có thể bắt màu Gram âm khi nhuộm. Các trực khuẩn Bacillus là loài sinh trưởng trong điều kiện hiếu khí, sinh nội bào tử. Chúng có ở mọi nơi trong tự nhiên. Phần lớn các loài Bacillus không gây bệnh nhưng một số loài là nguyên nhân gây bệnh ở người và động vật như Bacillus anthracis (gây bệnh than Anthrax) và B. cereus (gây ô nhiễm thực phẩm). Một số loài Bacillus: a. Bacillus subtilis: Bacillus subtilis được phát hiện bởi Ferdinand Cohn vào năm 1872, là một loài thuộc chi Bacillus, thuộc họ Bacillacaea. B. subtilis là trực khuẩn có kích thước 23 x 0,70,8 µm, đứng riêng rẽ, không tạo thành chuỗi; Bắt màu Gram dương, nhưng không đồng nhất; Có khả năng di động. Chúng sinh nội bào tử hình ovan, nằm ở trung tâm hoặc lệch tâm, có kích thước 1,51,8 x 0,60,9µm. Phần lớn bào tử được hình thành sau 48h nuôi cấy và không làm phình tế bào. Ở điều kiện 100oC, bào tử của B. subtilis chịu được 180 phút, có tính ổn định cao với nhiệt độ thấp và sự khô cạn, tác động của hóa chất, tia bức xạ. Trên môi trường thạch nghiêng, vi khuẩn mọc dày, khuẩn lạc khô đục mờ, rìa răng cưa hoặc lượn sóng. Mọc lan tràn, có màu trắng xám. Trên môi trường dịch thể: Môi trường trong, hình thành màng dày, dai, nhăn nheo, lượn sóng. B. subtilis có khả năng phân giải tinh bột và protein (gelatin và casein) để tạo thành vòng phân giải có đường kính lớn. Trong môi trường Litmus milk, chúng gây peptone hóa chậm và thường bị kiềm hóa Bacillus subtilis là loài tự dưỡng hiếu khí, một vài chủng sinh trưởng yếm khí tùy tiện. Nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng từ 2840oC, tối đa là 50oC, một số chủng có thể sinh trưởng ở 55oC. Phân bố: trong đất, cỏ khô, các hợp chất hữu cơ bị phân hủy... B. subtilis được sử dụng trong công nghiệp để sản xuất nhiều loại enzyme, ví dụ như amylase được sử dụng để rũ hồ hàng dệt, làm biến hình tinh bột trong sản xuất giấy. B. subtilis cũng sản xuất các protease bao gồm subtilisin được sử dụng chất tẩy rửa và công nghiệp thuộc da. Tuy nhiên, đáng chú ý là B. subtilis được sử dụng để sản xuất nhiều loại kháng sinh như difficidin, oxydifficidin, bacilli, bacillomyin B và Bacitracin. Các loại kháng sinh này được sử dụng trong điều trị các bệnh nhiễm trùng da do vi khuẩn và ngăn cản sự nhiễm trùng do đứt tay hoặc bị bỏng. B. subtilis cũng được bán như là một sản phẩm probiotic thương mại ở nhiều nước châu Âu từ nhiều năm trước mặc dù sự hiểu biết về cơ chế tác động của chúng còn rất hạn chế (Green D.H và cộng sự, 1999) như chế phẩm Enterogermina® được bán ở Italy vào những năm 1950 gồm 4 chủng B. clausii hoặc Bactisubtil® có chứa B. cereus (Huynh và cộng sự, 2005). b. Bacillus licheniformis Là trực khuẩn Gram dương, kích thước 0,60,8x1,53µm, đứng riêng rẽ, không tạo thành chuỗi, có khả năng di động, sinh nội bào tử 0,60,9x11,5µm, hình cầu hoặc hình trụ, nằm ở trung tâm hoặc lệch tâm tế bào, vách bào tử mỏng. Phần lớn bào tử xuất hiện sau 48 giờ nuôi cấy ở 37oC, không làm phình thân tế bào. Nuôi cấy trên môi trường thạch, hình thành những khuẩn lạc có kích thước lớn, lan tràn, bề mặt khô hoặc nhăn nheo, rìa phát triển dạng lông nhỏ, màu trắng đục. Nuôi cấy trong môi trường dịch thể: môi trường trong, có xuất hiện màng dày, dai, nhăn nheo. Có khả năng phân giải tinh bột và phân giải protein có nguồn gốc là gelatin và casein. Chúng sinh trưởng tốt ở nồng độ muối từ 58%, bị ức chế ở nồng độ muối cao. Là trực khuẩn hiếu khí, một số chủng sống yếm khí tùy tiện. Nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng là 3245oC, tối đa từ 5056oC. Một số chủng B. licheniformis có khả năng sản sinh hoạt chất kháng khuẩn là Bacitracin. Cũng giống như B. subtilis, B. licheniformis được nuôi cấy để thu enzyme alkaline proteases (làm sạch không khí, làm mềm lông trong công nghiệp da, bột giặt sinh học…), alphaamylases (biến tính tinh bột trong sản xuất giấy…); các hoạt chất kháng khuẩn như penicillinases, pentosanases, bacitracin, proticin, 5inosinic acid, inosine, citric acid, và Ltryptophan (Gherna et al., 1989). c. Bacillus megaterium Là trực khuẩn Gram dương, hai đầu tròn, kích thước 1,21,5 x 24µm. Đứng riêng rẽ hoặc nối thành chuỗi ngắn. Có khả năng di động. Sinh bào tử hình elip nằm ở trung tâm hoặc lệch tâm tế bào. Vách bào tử mỏng, phần lớn bào tử xuất hiện sau 48h nuôi cấy. Bào tử không làm phình tế bào. Nuôi cấy trên môi trường thạch, hình thành khuẩn lạc lớn, dạng S, tròn trơn nhẵn bóng, bề mặt vồng lên, rìa gọn, không lan, dạng kem màu trắng ngà. Sinh trưởng trong môi trường dịch thể: môi trường đục, đồng nhất, có cặn, không xuất hiện màng trên bề mặt. B. megaterium được coi là trực khuẩn không có hại. Có khả năng phân giải tinh bột và protein (gelatin và casein). Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu từ 2835oC, tối đa từ 4045oC. B. megaterium được sử dụng trong công nghiệp để sản xuất enzyme amidase, sử dụng cho sản xuất kháng sinh penicillin. d. Bacillus polymyxa Trực khuẩn Gram dương, hai đầu tròn, kích thước 0,61 x 27µm, không tạo thành chuỗi. Có khả năng di động. Sinh bào tử hình elip, nằm ở trung tâm hoặc ở một đầu. Nuôi cấy trên môi trường thạch sinh khuẩn lạc nhỏ, mỏng, trong lan tràn, rìa phân thùy hoặc có dạng lông. Bề mặt thô nhám, màu trắng. Ở môi dịch thể, môi trường đục đồng nhất hoặc có cặn lơ lửng. Cặn keo dính, đôi khi trên bề mặt có màng. B. polymyxa không sinh trưởng ở môi trường có 5% NaCl. Chúng có khả năng phân giải tinh bột và protein (casein và gelatin), đường kính vòng phân giải rộng. Trong môi trường Litmus milk, gây đông vón sữa và có sinh khí. Các chủng B. polymyxa có thể sống hiếu khí hoặc yếm khí tùy tiện. Điều kiện nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng là 2835oC, tối đa là 40oC, không sinh trưởng ở nhiệt độ 45oC. Một số chủng B. polymyxa có khả năng sản sinh các hoạt chất kháng khuẩn là polymyxin. e. Bacillus cereus Là trực khuẩn hình gậy, hai đầu vuông, đứng thành chuỗi từ ngắn đến dài, xếp lộn xộn không theo một trật tự nào. Trực khuẩn bắt màu Gram dương, có khả năng di động và hình thành bào tử. Bào tử hình elip, nằm ở tâm hoặc lệch tâm tế bào, kích thước 11,5µm. Phần lớn các chủng hình thành bào tử sau 1824h nuôi cấy, không làm phình thân tế bào. Nuôi cấy trên môi trường thạch đĩa, hình thành khuẩn lạc lớn, khô, bề mặt phẳng, rìa không đều, có xu hướng lan

LỜI CẢM ƠN

Sau 4 năm học tập và rèn luyện tại trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội, đặc biệt là sau khi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp, ngoài sự cố gắng nỗ lực của bản thân tôi còn nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ quý báu của nhà trường, các thầy giáo, cô giáo, gia đình và bạn bè.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Tuyết Lê đã tận tình

hướng dẫn, chỉ bảo và động viên tôi trong suốt quá trình thực tập cũng như hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy giáo, cô giáo trong bộ môn Dinh dưỡng- Thức ăn, Khoa Chăn nuôi và Nuôi trồng thủy sản, Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội đã góp ý và chỉ bảo để tôi hoàn thành khóa luận.

Để hoàn thành khóa luận này, tôi còn nhận được rất nhiều sự động viên, khích lệ của những người thân trong gia đình và bạn bè Tôi xin chân thành cảm ơn những tình cảm cao quý đó.

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 15 tháng 08 năm 2013

Sinh viên

Đàm Thị Hoa

được tiến hành từ lâu và đã đem lại nhiều lợi ích cho người chăn nuôi do các

loài Bacillus có khả năng sinh trưởng trong mọi điều kiện của môi trường nhờ

hình thành bào tử Chúng sản sinh nhiều loại enzyme khác nhau như

protease, amylase Đặc biệt chúng có khả năng sản sinh các hoạt chất kháng

khuẩn với hoạt chất kháng khuẩn rộng Hiện nay, các loài Bacillus được sử dụng như một tác nhân kiểm soát sinh học và là tác nhân nitrat hóa, có khả năng phân hủy hợp chất hữu cơ thải ra từ thức ăn thừa và chất thải khác nhờ

khả năng tổng hợp enzyme phân hủy hữu cơ như protease, amylase Chúng

còn có khả năng tổng hợp chất kháng khuẩn làm giảm số lượng vi sinh vật

gây bệnh như Vibrio, Aeromonas do chất lượng nước nuôi bị giảm Chính vì vậy, các loài Bacillus là một trong những vi khuẩn không thể thiếu trong các

chế phẩm sinh học để xử lý chất thải động vật

Để thu được những chủng giống vi khuẩn Bacillus có phẩm chất sinh

học tốt đáp ứng yêu cầu của sản xuất các chế phẩm sinh học hay tạo ra các giống khởi động có chất lượng cao thì khân phân lập, chọn lọc đóng vai trò then chốt Tuy nhiên, công việc chọn lọc này cũng rất tốn kém, đòi hỏi rất nhiều công sức và phụ thuộc rất nhiều vào công tác bảo quản giống sau phân lập Các chủng giống được chọn lọc tự nhiên thường có sức sống tốt và có cácđặc tính sinh học cao nhưng chúng rất dễ bị biến đổi đặc tính sinh học hoặc sinh những biến dị không mong muốn nếu khâu bảo quản và giữ giống không tốt

Hiện nay có rất nhiều các phương pháp bảo quản, giữ giống vi sinh vật hiệu quả như đông lạnh, đông khô… Tuy nhiên, các phương pháp này đòi hỏi

phải có thiết bị, máy móc hiện đại mà nhiều phòng thí nghiệm trong nước chưa đáp ứng được Vì vậy, các chủng giống sau phân lập chọn lọc vẫn được giữ giống với phương pháp truyền thống là cấy truyền trên thạch nghiêng và bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4oC Phương pháp này đơn giản, dễ thực hiện, không tốn kém nhưng lại có một số nhược điểm như thời gian bảo quản ngắn, dễ bị biến đổi đặc tính sinh học của giống hoặc gây thoái hóa giống

Xuất phát từ thực tế trên, để đánh giá sự biến đổi các đặc điểm về hình

thái cũng như đặc tính sinh học của một số chủng Bacillus sử dụng làm chế

phẩm sinh học trong chăn nuôi trong quá trình giữ giống, chúng tôi tiến hành

đề tài: “Đánh giá sự biến đổi chất lượng giống của một số chủng Bacillus trong thời gian bảo quản ở nhiệt độ 4ºC”.

1.2 MỤC ĐÍCH YÊU CẦU

1.2.1 Mục đích

Theo dõi các chủng Bacillus trong quá trình bảo quản, đánh giá sự biến

đổi đặc tính sinh học của chúng trong các điều kiện và khoảng thời gian khác

nhau, từ đó xác định điều kiện thích hợp để bảo quản vi khuẩn Bacillus.

1.2.2 Yêu cầu

Trong quá trình theo dõi đánh giá, vi khuẩn phải đạt được các yêu cầu:

- Không có sự biến đổi về mặt hình thái

- Không có sự biến đổi về đặc tính sinh hóa

- Giữ được khả năng phân giải Protein

- Giữ được khả năng phân giải tinh bột

- Có khả năng sinh trưởng ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau

PHẦN II

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.2 VI KHUẨN BACILLUS VÀ VAI TRÒ TRONG SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC

2.2.1 Đặc điểm sinh học

Theo mô tả trong khóa phân loại Bergey (2008), vi khuẩn Bacillus (B.) thuộc lớp Bacilli, bộ Bacillales, họ Bacillaceae Đặc điểm của chung của họ

này là các vi khuẩn hình gậy, bắt màu Gram dương, sinh nội bào tử, phần lớn

có khả năng di động nhờ các lông roi xung quanh thân Họ Bacillaceae sinh

nội bào tử được chia thành 2 chi:

- Chi sinh nội bào tử yếm khí là Clostridium

- Chi sinh nội bào tử hiếu khí là Bacillus

Chi Bacillus gồm các trực khuẩn Gram dương, nhưng khi nuôi cấy lâu chúng có thể bắt màu Gram âm khi nhuộm Các trực khuẩn Bacillus là loài

sinh trưởng trong điều kiện hiếu khí, sinh nội bào tử Chúng có ở mọi nơi

trong tự nhiên Phần lớn các loài Bacillus không gây bệnh nhưng một số loài

là nguyên nhân gây bệnh ở người và động vật như Bacillus anthracis (gây bệnh than Anthrax) và B cereus (gây ô nhiễm thực phẩm).

Một số loài Bacillus:

a Bacillus subtilis:

Bacillus subtilis được phát hiện bởi Ferdinand Cohn vào năm

1872, là một loài thuộc chi Bacillus, thuộc họ Bacillacaea B subtilis là trực

khuẩn có kích thước 2-3 x 0,7-0,8 µm, đứng riêng rẽ, không tạo thành chuỗi; Bắt màu Gram dương, nhưng không đồng nhất; Có khả năng di động Chúng sinh nội bào tử hình ovan, nằm ở trung tâm hoặc lệch tâm, có kích thước 1,5-1,8 x 0,6-0,9µm Phần lớn bào tử được hình thành sau 48h nuôi cấy và không làm phình tế bào Ở điều kiện 100oC, bào tử của B subtilis chịu được 180

phút, có tính ổn định cao với nhiệt độ thấp và sự khô cạn, tác động của hóa chất, tia bức xạ

Trên môi trường thạch nghiêng, vi khuẩn mọc dày, khuẩn lạc khô đục

mờ, rìa răng cưa hoặc lượn sóng Mọc lan tràn, có màu trắng xám Trên môi trường dịch thể: Môi trường trong, hình thành màng dày, dai, nhăn nheo, lượnsóng

B subtilis có khả năng phân giải tinh bột và protein (gelatin và casein)

để tạo thành vòng phân giải có đường kính lớn Trong môi trường Litmus milk, chúng gây peptone hóa chậm và thường bị kiềm hóa

Bacillus subtilis là loài tự dưỡng hiếu khí, một vài chủng sinh trưởng

yếm khí tùy tiện Nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng từ 28-40oC, tối đa là 50oC, một số chủng có thể sinh trưởng ở 55oC Phân bố: trong đất, cỏ khô, các hợp chất hữu cơ bị phân hủy

B subtilis được sử dụng trong công nghiệp để sản xuất nhiều loại

enzyme, ví dụ như amylase được sử dụng để rũ hồ hàng dệt, làm biến hình

tinh bột trong sản xuất giấy B subtilis cũng sản xuất các protease bao gồm

subtilisin được sử dụng chất tẩy rửa và công nghiệp thuộc da Tuy nhiên, đáng

chú ý là B subtilis được sử dụng để sản xuất nhiều loại kháng sinh như

difficidin, oxydifficidin, bacilli, bacillomyin B và Bacitracin Các loại kháng sinh này được sử dụng trong điều trị các bệnh nhiễm trùng da do vi khuẩn và ngăn cản sự nhiễm trùng do đứt tay hoặc bị bỏng

B subtilis cũng được bán như là một sản phẩm probiotic thương mại ở

nhiều nước châu Âu từ nhiều năm trước mặc dù sự hiểu biết về cơ chế tác động của chúng còn rất hạn chế (Green D.H và cộng sự, 1999) như chế phẩm Enterogermina® được bán ở Italy vào những năm 1950 gồm 4 chủng B

clausii hoặc Bactisubtil® có chứa B cereus (Huynh và cộng sự, 2005).

b Bacillus licheniformis

Là trực khuẩn Gram dương, kích thước 0,6-0,8x1,5-3µm, đứng riêng

rẽ, không tạo thành chuỗi, có khả năng di động, sinh nội bào tử

0,6-0,9x1-1,5µm, hình cầu hoặc hình trụ, nằm ở trung tâm hoặc lệch tâm tế bào, vách bào tử mỏng Phần lớn bào tử xuất hiện sau 48 giờ nuôi cấy ở 37oC, không làm phình thân tế bào.

Nuôi cấy trên môi trường thạch, hình thành những khuẩn lạc có kích thước lớn, lan tràn, bề mặt khô hoặc nhăn nheo, rìa phát triển dạng lông nhỏ, màu trắng đục Nuôi cấy trong môi trường dịch thể: môi trường trong, có xuấthiện màng dày, dai, nhăn nheo

Có khả năng phân giải tinh bột và phân giải protein có nguồn gốc là gelatin và casein Chúng sinh trưởng tốt ở nồng độ muối từ 5-8%, bị ức chế ở nồng độ muối cao Là trực khuẩn hiếu khí, một số chủng sống yếm khí tùy tiện Nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng là 32-45oC, tối đa từ 50-56oC Một số

chủng B licheniformis có khả năng sản sinh hoạt chất kháng khuẩn là

Bacitracin

Cũng giống như B subtilis, B licheniformis được nuôi cấy để thu

enzyme alkaline proteases (làm sạch không khí, làm mềm lông trong công nghiệp da, bột giặt sinh học…), alpha-amylases (biến tính tinh bột trong sản xuất giấy…); các hoạt chất kháng khuẩn như penicillinases, pentosanases, bacitracin, proticin, 5'-inosinic acid, inosine, citric acid, và L-tryptophan (Gherna et al., 1989)

c Bacillus megaterium

Là trực khuẩn Gram dương, hai đầu tròn, kích thước 1,2-1,5 x 2-4µm Đứng riêng rẽ hoặc nối thành chuỗi ngắn Có khả năng di động Sinh bào tử hình elip nằm ở trung tâm hoặc lệch tâm tế bào Vách bào tử mỏng, phần lớn bào tử xuất hiện sau 48h nuôi cấy Bào tử không làm phình tế bào

Nuôi cấy trên môi trường thạch, hình thành khuẩn lạc lớn, dạng S, tròn trơn nhẵn bóng, bề mặt vồng lên, rìa gọn, không lan, dạng kem màu trắng ngà

Sinh trưởng trong môi trường dịch thể: môi trường đục, đồng nhất, có cặn, không xuất hiện màng trên bề mặt

B megaterium được coi là trực khuẩn không có hại Có khả năng phân

giải tinh bột và protein (gelatin và casein) Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu từ

28-35oC, tối đa từ 40-45oC B megaterium được sử dụng trong công nghiệp để

sản xuất enzyme amidase, sử dụng cho sản xuất kháng sinh penicillin

d Bacillus polymyxa

Trực khuẩn Gram dương, hai đầu tròn, kích thước 0,6-1 x 2-7µm, không tạo thành chuỗi Có khả năng di động Sinh bào tử hình elip, nằm ở trung tâm hoặc ở một đầu

Nuôi cấy trên môi trường thạch sinh khuẩn lạc nhỏ, mỏng, trong lan tràn, rìa phân thùy hoặc có dạng lông Bề mặt thô nhám, màu trắng Ở môi dịch thể, môi trường đục đồng nhất hoặc có cặn lơ lửng Cặn keo dính, đôi khitrên bề mặt có màng

B polymyxa không sinh trưởng ở môi trường có 5% NaCl Chúng có khả

năng phân giải tinh bột và protein (casein và gelatin), đường kính vòng phân giải rộng Trong môi trường Litmus milk, gây đông vón sữa và có sinh khí

Các chủng B polymyxa có thể sống hiếu khí hoặc yếm khí tùy tiện Điều kiện

nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng là 28-35oC, tối đa là 40oC, không sinh trưởng

ở nhiệt độ 45oC Một số chủng B polymyxa có khả năng sản sinh các hoạt

tử sau 18-24h nuôi cấy, không làm phình thân tế bào

Nuôi cấy trên môi trường thạch đĩa, hình thành khuẩn lạc lớn, khô, bề mặt phẳng, rìa không đều, có xu hướng lan ra ngoài Màu trắng ngà Trong môi trường dịch thể, làm đục môi trường, đục nhiều, đồng nhất cặn mềm dễ

tan, có hoặc không hình thành màng trên bề mặt B cereus có khả năng phân

giải tinh bột và protein (gelatin và casein), sống hiếu khí, một số chủng là

yếm khí tùy tiện Nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng là 30oC, đối đa từ 37-48oC Chúng phân bố nhiều trong đất, bụi, trong thực vật, sữa…, có khả năng gây bệnh ngộ độc thực phẩm cho người và động vật do ăn phải thực phẩm nhiễm

B cereus.

f Bacillus thuringiensis

B thuringiensis là trực khuẩn Gram dương, phân bố ở trong đất Về mặt hình thái, tương tự như B cereus Trong quá trình hình thành bào tử B thuringiensis hình thành các tinh thể protein có khả năng kháng côn trùng là δ-endotoxins (hay cry protein) được mã hóa bởi gen cry Trong phần lớn các chủng B thuringiensis các gen cry nằm trong plasmid Vì vậy, bào tử và các tinh thể protein kháng côn trùng của B thuringiensis đã được sử dụng như là

một loại thuốc trừ sâu sinh học từ những năm 1920 Ngày nay chúng có tên

thương mại là Dipel và Thuricide Bacillus thuringiensis serovar israelensis,

là một chủng được sử dụng rộng rãi để kiểm soát ấu trùng muỗi (lavicide)

Tuy nhiên các chủng B thuringiensis cũng sản sinh độc tố đường ruột

enterotoxins,

2.1.2 Vai trò của trực khuẩn bacillus trong sản xuất chế phẩm probiotics

2.1.2.1 Khái niệm về Probiotic

Mặc dù khái niệm Probiotic đã được biết đến vào những năm đầu thế

kỷ 20 tuy nhiên định nghĩa về probiotic vẫn chưa được đưa ra cho đến thập niên 60 Năm 1965, Lilly và Stillwel cho rằng, probiotic là “những chất do vi sinh vật tiết ra có khả năng kích thích sự tăng trưởng của những vi sinh vật khác” và hiểu rằng probiotic là một khái niệm đối lập với kháng sinh Parker (1974) lại có quan điểm hoàn toàn khác về probiotic “đó là những vi sinh vật

và các hoạt chất của chúng có vai trò cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột” Fuller (1989) cũng theo quan điểm này, đưa ra định nghĩa về probiotic “là thức ăn bổ sung gồm các vi sinh vật sống có lợi cho vật chủ bằng cách cải thiện cân bằng sinh thái đường ruột” Havennar và Huis in’t Veld (1992) đã

mở rộng định nghĩa về probiotic: “Là một vi sinh vật đơn lẻ hay hỗn hợp các

vi sinh vật sống khi sử dụng cho người và động vật mang lại những ảnh

hưởng có lợi cho sinh vật chủ bằng cách cải thiện hệ sinh vật đường ruột Trong năm 1996, Schaafsma quan niệm probiotic là “những vi sinh vật sống, khi tồn tại trong đường ruột với một số lượng nhất định sẽ mang lại những ảnh hưởng có lợi cho sức khỏe vượt trội hơn so với các chất dinh dưỡng cơ bản vốn có”

Đứng trên quan điểm về miễn dịch và dinh dưỡng, Naidu và cộng sự (1999) cho rằng probiotic là “một dạng thức ăn bổ sung vi sinh vật mang lại những ảnh hưởng có lợi cho các hoạt động sinh lý của vật chủ do tăng cường

hệ miễn dịch đường ruột cũng như cải thiện sự cân bằng về dinh dưỡng và cân bằng vi sinh vật trong đường ruột” Theo Laurent Verschuere và cộng sự (2000) "Probiotics là sinh vật sống có ảnh hưởng tốt cho vật chủ nhờ vào sự biến đổi hệ sinh vật gắn với vật chủ hay xung quanh vật chủ, từ đó cải thiện khả năng sử dụng thức ăn, nâng cao khả năng chống bệnh của vật chủ, và cải thiện môi trường xung quanh" Tuy nhiên, đến năm 2001, FAO/WHO đã đưa

ra một định nghĩa phù hợp nhất về probiotic như sau “probiotics là những vi sinh vật sống khi được đưa vào cơ thể với một số lượng thích hợp sẽ mang lại các lợi ích về sức khỏe cho vật chủ”

Định nghĩa này được đưa ra dựa trên những quan điểm sau:

- Probiotics phải là những vi sinh vật sống

- Probiotics phải cung cấp các lợi ích về mặt sinh lý cho vật chủ, các lợi ích này phải được xác định qua thực nghiệm được tiến hành trên các vật chủ được lựa chọn

- Probiotics không cần phải giới hạn về cách sử dụng (qua đường ăn hoặc uống)

Ngày nay, các probiotics thường có những đặc điểm sau:

- Là vi sinh vật sống

- Tác động trực tiếp có lợi cho hệ tiêu hóa của người và động vật

- Đề kháng lại với các yếu tố chế biến thức ăn

- Có khả năng chống lại stress trong dạ dày, ruột Thích nghi và tăng trưởng nhanh chóng trong đường ruột

- Giải phóng ra sản phẩm trao đổi chất hữu ích (Enzyme, các axit hữucơ…)

- Kiểm soát được quần thể vi sinh vật đường ruột

- Không hại đến tế bào niêm mạc ruột sinh vật chủ

- Có tác dụng ngăn cản vi sinh vật gây bệnh

- Phải đạt các yêu cầu, qui định an toàn sinh học, vệ sinh thực phẩm

và có ảnh hưởng cơ lợi lên sức khoẻ

Cơ chế tác động của probiotics (Sanders, 2009):

- Sản sinh các hợp chất kháng khuẩn như các axit hữu cơ, các

bacteriocins

- Tăng cường đáp ứng miễn dịch (ví dụ như tiết IgA) đối với các tác nhân gây bệnh hoặc vaccine

- Làm giảm viêm nhiễm

- Hỗ trợ đáp ứng miễn dịch trong giai đoạn đầu, giúp cho đáp ứng miễndịch được cân bằng tốt hơn, giảm nguy cơ phát sinh dị ứng

- Cải thiện chức năng của lớp “rào cản” ở niêm mạc ruột

- Tăng cường sự ổn định hoặc giúp phục hồi hệ vi sinh vật đường ruột khi có rối loạn tiêu hóa

- Giảm sự bám dính của các tác nhân gây bệnh

- Cung cấp các protein chức năng (như lactase) hoặc enzyme (tự nhiên hoặc được clone)

Nhiều nghiên cứu đã cho thấy, các probiotic có thể phục hồi chức năng bình thường của đường ruột, và từ đó làm giảm tiêu chảy khi bị rối loạn tiêu hóa do điều trị kháng sinh dài ngày Ngoài ra, probiotics còn có thể ngăn cản hoặc điều trị nhiễm trùng âm đạo, nhiễm trùng đường tiết niệu; giúp kiểm soátđáp ứng miễn dịch (viêm dạ dày), giúp cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột,

ngăn cản eczema ở trẻ em; giảm ung thư bọng đái Probiotics cũng được sử dụng trong điều trị ung thư ruột (Truter I 2010)

2.1.2.2 Vai trò của Bacillus trong sản xuất chế phẩm sinh học

Vi khuẩn “probiotic” đầu tiên được phát hiện bởi nhà khoa học người

Nga Metnhicop năm 1912 là vi khuẩn lactic Lactobacillus sp Rất nhiều loài

vi khuẩn có hoạt tính sinh học được biết đến sau đó như enterococci,

streptococci, bifidobacteria Đây là những vi khuẩn tìm thấy trong hệ vi sinh

vật đường ruột của người và động vật hay còn được gọi là nhóm vi khuẩn bản

địa Ngoài các vi khuẩn lactic, các loài Bacillus cũng được biết đến với vai trò

probiotic

a Bacillus được sử dụng trong các chế phẩm sinh học cho người :

Các chế phẩm sử dụng cho người được chia thành hai nhóm:

chủng 3 hoặc 2335 trong chế phẩm sản sinh kháng sinh loại isocourmarin, aminocourmarin A, có khả năng chống lại Helicobacter pylori (Pinchuk và

cộng sự, 2001) Các chủng B subtilis từ Biosporin® có khả năng thay đổi để tạo thành một interferon và một sản phẩm mới là Subalin được chứng nhận của Nga sử dụng trong điều trị thú y với mục đích kháng virus và kháng u (Beliavskaia, 2001)

Ở một số nước Đông nam Á, do việc sử dụng kháng sinh tràn lan và phổ biến, nên người ta đã sử dụng các chế phẩm probiotics như là một chất bổtrợ Chính vì vậy, một số lượng lớn các chế phẩm sinh học đã được sản xuất,

tất cả đều mang ít chủng được xác định Ví dụ như: Biosubtyl (Việt Nam)

chứa B pumilus hoặc B cereus; Bibactyl (Việt Nam) chứa B subtilis; Biscan (Hàn Quốc) gồm bào tử của B polyfermenticus… Nguồn gốc của các chủng

này khó được xác định

Các sản phẩm probiotic có chứa Bacillus còn được sử dụng điều trị

bệnh uremia Công ty Kibow Biotech (Mỹ) sản xuất sản phẩm probiotics từ

B coagulans để điều trị bệnh viêm dạ dày ruột Chế phẩm này được sản xuất dựa vào khả năng tiết hợp chất kháng khuẩn là bacteriocin - Coagulin là loại kháng sinh phổ rộng đối với các vi khuẩn đường ruột (Hyronimus và cộng sự,1998) Các báo cáo khoa học cũng cho thấy lợi ích của các chế phẩm sinh họcBacillus trong điều trị viêm đường tiết niệu (Meroni và cộng sự, 1983)

* Nhóm thực phẩm bảo vệ sức khỏe và thực phẩm bổ sung

Một số lượng lớn các sản phẩm có chứa Bacillus được sử dụng cho

mục đích thức ăn bổ sung bảo vệ sức khỏe với những sự khuyến cáo như tăng cường sức khỏe cho người sử dụng, phục hồi sự cân bằng hệ vi sinh vật

đường ruột …Natto là một sản phẩm lên men từ đậu tương của Nhật Bản với

B subtilis hoặc B subtilis var natto Các chủng này có những tính chất

probiotics như kích thích hệ thống miễn dịch của cơ thể, sản sinh vitamine K2

và các chất chống ung thư (Tsukamoto và cộng sự, 2001)

b Bacillus được sử dụng trong các chế phẩm sinh học cho động vật

Tại châu Âu, khi các loại kháng sinh bị cấm sử dụng dưới dạng thức ăn

bổ sung năm 2006, các nhà khoa học đã quan tâm đến các chất thay thế khángsinh như prebiotics, synbiotics và probiotics Hai loại sản phẩm probiotic

thành phần có chứa trực khuẩn Bacillus đã được các nước EU cấp phép cho

động vật sử dụng là BioPlus® 2B và Toyocerin® Trong đó, BioPlus® 2B gồm

hỗn hợp 2 chủng Bacillus subtilis và Bacillus licheniformis với vai trò giúp

cải thiện cân bằng hệ sinh thái đường ruột của lợn, từ đó tăng cường tiêu hóa, hấp thu, giảm tỷ lệ tiêu chảy

Toyocerin® chỉ gồm một chủng B cereus var toyoi Chủng này được coi

là an toàn cho vật nuôi bởi vì chúng không sản sinh độc tố đường ruột và không truyền tính kháng kháng sinh (SCAN, 2000; 2001)

Tuy nhiên, rất nhiều chế phẩm sinh học có sử dụng các chủng Bacillus

đã không được cấp phép sử dụng cho động vật vì chúng có chứa các chủng sản sinh độc tố gây hại cho sức khỏe của con người, ví dụ như chế phẩm Paciflor®C10 chứa chủng B cereus (CIP 5832) sản sinh độc tố; chế phẩm

Esporafeed Plus® chứa chủng B cereus mang gen kháng kháng sinh

tetracycline là tetB

Sử dụng các loài Bacillus trong chăn nuôi sản đem lại nhiều lợi ích cho

người chăn nuôi do:

- Bacillus tồn tại trong vật nuôi và trong môi trường sống

- Có khả năng sinh trưởng trong mọi điều kiện của môi trường (nhờ hình thành bào tử

- Sản sinh nhiều loại enzyme khác nhau

- Hoạt động kháng các loại mầm bệnh một cách trực tiếp thông qua

ức chế sinh trưởng hoặc gián tiếp thông qua cơ chế cạnh tranh

- Đặc điểm của bào tử: tồn tại lâu trong cơ thể; Dễ dàng dịch chuyển qua dạ dày, ruột mà không bị ảnh hưởng của axit, dịch mật; Đề kháng tốt với nhiệt độ lên đến 60oC, đề kháng với sự khô hạn

c

Bacillus được sử dụng trong các chế phẩm sinh học cho thủy sản

Trong nuôi trồng thủy sản, một số chế phẩm sinh học thương mại có

chứa bào tử của trực khuẩn Bacillus như chế phẩm kiểm soát sinh học

Biostart® (Mỹ) là một hỗn hợp gồm các loài B megaterium, B licheniformis, Paenibacillus polymyxa và hai chủng B subtilis; Liqualife® (Cargill), sử dụng

4 loài Bacillus không xác định; Promarine® (Đài Loan) chứa 4 chủng thuộc

loài B subtilis; Toyocerin® chứa chủng B cereus var toyoi

(NCIMB-40112/CNCM-1012) với nồng độ tối thiểu là 1x1010 tế bào/g

(Gatesoupe, 1999)

Các loài Bacillus được sử dụng như là một tác nhân kiểm soát sinh học

và là các vi khuẩn nitrat hóa, có khả năng phân hủy hợp chất hữu cơ thải ra từ thức ăn thừa và chất thải khác nhờ khả năng tổng hợp enzyme phân hủy hữu

cơ như protease, amylase Chúng còn có khả năng tổng hợp chất kháng khuẩn

làm giảm số lượng vi sinh vật gây bệnh như Vibrio, Aeromonas… do chất

lượng nước nuôi bị giảm (Verschuere và cộng sự, 2000)

tố làm xuất hiện chúng mất đi do đó đây là biến dị không di truyền

Vi khuẩn trở nên mập hơn nếu được nuôi cấy trong môi trường giàu chất dinh dưỡng, trái lại, trong môi trường nghèo dinh dưỡng, tế bào sẽ có dạng mảnh hoặc dạng cầu bất thường

- Sức căng bề mặt của môi trường như độ axit (pH) tăng cao cũng làm

b Biến dị về dạng khuẩn lạc

Được coi là biến dị gây ra bởi điều kiện môi trường Nguyên nhân do những tổn thương trong cấu trúc của tế bào vi khuẩn có thể tạo nên những biến dạng của khuẩn lạc Ví dụ: Những vi khuẩn cùng loài khi phát triển trên môi trường đặc có thể hình thành khuẩn lạc láng (dạng S) hoặc nhám (dạng R) Trong một số điều kiện nuôi cấy sẽ tạo ra khuẩn lạc trung gian không ổn định như khuẩn lạc con, khuẩn lạc lùn nhỏ, khuẩn lạc G mọc trên mặt, khuẩn lạc L mọc ở rìa khuẩn lạc bình thường, khuẩn lạc lớn nhầy…

Một số vsv có biến dị về màu sắc khuẩn lạc khi nuôi cấy trên môi trường chọn lọc (Serratea marcesceus) hoặc sinh sắc tố làm biến đổi màu sắc của môi trường

2.2.3.2 Biến dị kiểu gen

Biến dị kiểu gen là chỉ những biến đổi xảy ra trong cấu trúc gen Mỗi biến dị dẫn đến sự thay đổi trình tự nucleotid tạo ra các alen khác nhau Đột biến có thể xảy ra do biến đổi nhiều nucleotid hoặc do một nucleotid Đột biến gen không thể phát hiện được khi quan sát tế bào học

Trong tự nhiên, dù giữ trong điều kiện nào, tất cả các gen đều có đột biến, được gọi là đột biến tự nhiên hay ngẫu nhiên (spontanous mutation) Các đột biến tự nhiên thường xuất hiện rất ít Các gen khác nhau của cùng một loài có thể có tần số đột biến khác nhau, nhưng tần số đột biến tự nhiên của mỗi gen là một số ổn định

Ngoài thiên nhiên, hiện tượng đột biến của vi sinh vật xảy ra rất thườngxuyên, nhưng không phải đột biến nào cũng biểu hiện ra tính trạng bên ngoài Nếu đột biến có tính trội thì tính trạng đột biến sẽ thể hiện ngay, nhưng nếu gen đột biến có tính lặn thì tính trạng đột biến không thể hiện ra ngay mà nằmtrong trạng thái lặn khá lâu

Trong phòng thí nghiệm chỉ có một số ít chủng đột biến có thể quan sátđược vì chỉ theo dõi được một số ít tính trạng như tốc độ sinh trưởng, hình thái khuẩn lạc, kháng thuốc kháng sinh…

Đột biến kiểu gen có thể làm thay đổi nhiều tính trạng của vsv, nhưng thường thấy là:

- Thể đột biến bền vững với kháng sinh: gặp ở vk gây bệnh

- Thể đột biến sinh hóa: sự đột biến của một số gen kiểm soát sự hình thành và hoạt động của một số enzyme chuyển hóa làm thay đổi nhu cầu về dinh dưỡng, kiểu lên men…

- Thể đột biến hình thái: sự đột biến hình thành các thể không còn khả năng hình thành tiêm mao (đột biến gen kiểm soát tổng hợp flagelin)

- Thể đột biến khuẩn lạc: Thay đổi hình dạng, trạng thái của khuẩn lạc (dạng R thành dạng S…)

- Ngoài ra còn thấy có đột biến thay đổi tính kháng nguyên, thay đổi độc lực, sự đề kháng chất độc…

2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN VI SINH VẬT

2.3.1 Phương pháp cấy truyền vi sinh vật

Đây là phương pháp bảo quản đơn giản, các chủng vi sinh vật được cấytrên môi trường thích hợp (dịch thể hay trên thạch) trong ống nghiệm hay bình tam giác và để trong điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển Sau

đó các chủng vi sinh vật này được chuyển đến nơi bảo quản có nhiệt độ thích hợp Quá trình này được lặp lại trong một thời gian nhất định, đảm bảo chủng

vi sinh vật luôn được chuyển đến môi trường mới trước khi già và chết Thực

tế có nhiều chủng vi sinh vật thích hợp với phương pháp bảo quản này như:

Staphylococi, Colifom… có thể sống được vài năm theo cách này Cho dù khá

phổ biến và được dùng trong các cơ sở nghiên cứu, nhưng phương pháp này cũng bộc lộ nhiều nhược điểm sau:

- Tốn nhiều công sức để cấy truyền.

- Giống gốc có thể mất do sai sót khi dùng môi trường cấy truyền không thích hợp

- Chủng vi sinh vật cấy truyền dễ bị thay đổi các đặc điểm sinh học do đột biến xuất hiện sau mỗi lần cấy truyền

a Cấy truyền trên môi trường dịch thể

- Cách tiến hành rất đơn giản là chuẩn bị 10ml môi trường nuôi cấy vi sinh vật trong lọ McCartney khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong 15 phút

Thường làm 2 lọ cho mỗi chủng bảo quản

- Một vòng que cấy chủng vi sinh vật bảo quản được đưa vào môi trường bằng thao tác vô trùng và giữ ở nhiệt độ thích hợp trong 72 giờ Phải kiểm tra sự phát triển của chủng bảo quản

- Sau đó các mẫu được giữ ở 4oC

Thông thường, theo cách này thời gian bảo quản các chủng thường thayđổi 2 – 6 tháng

b Cấy truyền trên môi trường thạch

Cấy truyền trên môi trường thạch tương tự như trên môi trường dịch thể nhưng ở đây môi trường được bổ sung thạch (1,6%) Giống sau khi cấy được giữ trong 72 giờ ở nhiệt độ thích hợp để đạt độ phát triển cần thiết, sau

đó được để ở 4 – 8oC Định kỳ để cấy truyền giống, tuỳ từng nhóm vi sinh vậtkhác nhau mà định kỳ cấy truyền khác nhau, song giới hạn tối đa là 3 tháng

Theo phương pháp này giống có thời gian sống lâu hơn phương pháp cấy truyền dịch thể, thông thường giống được bảo quản 3 – 6 tháng

c Phương pháp giữ giống trên môi trường thạch dưới lớp dầu khoáng

Để khắc phục nhược điểm của phương pháp cấy chuyển nhiều lần, cụ thể là hạn chế sự phát triển của vi sinh vật trong thời gian bảo quản, tránh cho lớp thạch môi trường bị khô dần và giống có thể bị chết, thì phủ lên môi trường thạch có vi sinh vật phát triển một lớp dầu khoáng parafil dày khoảng 10mm Lớp parafil này sẽ hạn chế được sự tiếp xúc của vi sinh vật đối với

oxy không khí (O2) và hạn chế sự thoát hơi nước của môi trường thạch, do vậy giống có thể bảo quản được lâu hơn và không bị nhiễm tạp, thoái hóa Những chủng đã được xử lý ở trên sẽ được giữ trong tủ lạnh ở 5oC và có thể bảo quản nhiều năm.

2.3.2 Gi gi ng vi sinh v t trong môi tr ữ giống vi sinh vật trong môi trường đất, cát, hạt ống vi sinh vật trong môi trường đất, cát, hạt ật trong môi trường đất, cát, hạt ường đất, cát, hạt ng đ t, cát, h t ất, cát, hạt ạt

a Bảo quản giống trong cát

Dùng cát sông rửa sạch bằng nước nhiều lần đến khi nước không đục, sấy khô, sàng qua rây lỗ nhỏ để loại đất và rác bẩn Có thể dùng axit clohydricđặc để oxy hóa các chất hữu cơ Sấy khô ở 120oC trong 3 – 4 giờ Chia cát khô vào ống nghiệm thủy tinh đã sấy thanh trùng ở 160 – 180oC khoảng 2 giờ

Ta có thể kiểm tra độ vô trùng của cát bằng cách cho môi trường dịch đường hóa và thịt – peptone vô trùng vào ống cát đã hấp thanh trùng Sau đó cho vào

tủ ấm 28 – 30oC khoảng một tuần Quan sát hàng ngày nếu thấy loại dịch này đục thì coi như cát chưa vô trùng

Đổ cát đã chuẩn bị vào các ống nghiệm giống đã thanh trùng sao cho cát không rơi vào mặt thạch, không dính lên thành ống nghiệm Úp mặt thạch,dùng que cấy cào bào tử vào cát, đổ cát có bào tử vào ống nghiệm vô trùng lắc đều Chỉ bảo quản những ống cát vào bào tử khô không bị ướt và vón cục, các ống cát giống đậy bằng nút bông Dùng parafil nóng chảy phết lên nút bông của ống nghiệm giúp cho ống giống không bị ẩm ướt và giữ ở nhiệt độ phòng hay ở 4 – 6oC

Phục hồi chủng bằng cách dùng que cấy lấy cát trong ống và cấy vào các ống thạch nghiêng, sau đó chọn lựa và cấy chuyển tiếp

b Bảo quản giống trong đất khô

Nghiền đất và rây lấy những hạt bằng nhau Chia đất nghiền vào các ống nghiệm, thêm 1 – 2 giọt nước, có thể thêm 1 – 2% CaCO3 để trung hòa các loại đất chua hoặc cho một ít than hoạt tính vào đáy ống để cho đất sau khi thanh trùng luôn khô Đậy bông và để các ống nghiệm có đất vào giỏ đem

hấp thanh trùng hai lần ở 120oC một giờ cách nhau một ngày Kiểm tra độ vô trùng của môi trường giữ giống như đối với cát và giữ giống trong đất như ở cát Ngoài ra ta có thể giữ giống trong hỗn hợp cát và đất Phương pháp này

bảo quản thành công với giống Clostridium pasteurianum.

c Giữ giống trên hạt

Có thể giữ bào tử nấm mốc, xạ khuẩn trên các hạt thực vật khác nhau Ở Liên Xô cũ thường bảo quản giống xạ khuẩn sinh kháng sinh trên hạt kê: chọn hạt kê vàng đã làm sạch, cho vào nước sôi khuấy trộn đều, giữ 30 phút cho các hạt thấm ẩm hoàn toàn rồi lọc Tãi kê ẩm ra trên mặt khay để xoa cồn, làm nguội các hạt phải rời nhau rồi cho vào từng lọ (khoảng 15 – 16g mỗi lọ thể tích 250ml) Các bình đậy nút kín và thanh trùng ở 115oC khoảng 30 – 40 phút.Thử vô trùng các giống bằng phương pháp trên Cấy vào mỗi bình 2ml dịch huyền phù bào tử hay khuẩn ty dinh dưỡng Lắc nhẹ cho giống đều trên các hạt

kê và nuôi ở nhiệt độ 24 – 28oC trong 8 ngày Sau đó sấy trong các thiết bị chânkhông đến khi độ ẩm kê có giống phát triển không quá 8% Kiểm tra giống và tráng parafil lên nút bông Bảo quản ở nhiệt độ phòng trong tối và khô

2.3.3 Phương pháp đông khô và đông khô dịch thể trực tiếp

a Phương pháp đông khô

Đông khô là quá tình mà nước được lấy ra khỏi mẫu khi các mẫu đang

ở trạng thái lạnh sâu Ở đây, vi sinh vật được huyền phù trong môi trường thích hợp và được làm lạnh trong môi trường chân không Thiết bị đông khô

sẽ hút nước và cuối cùng mẫu được làm khô đến mức nhất định Mẫu được hàn kín để cho môi trường chứa mẫu là chân không

Phương pháp này cũng phải cấy truyền và làm lại, nhưng thời gian giữacác lần cấy chuyển kéo dài hơn so với phương pháp giữ giống trên thạch:

Giữ ở to = -15oC đến -20oC : 6 tháng cấy chuyển một lần

Giữ ở to = -30oC : 9 tháng cấy chuyển một lần

Giữ ở to = -40oC : 1 năm cấy chuyển một lần

Giữ ở to = -50oC đến -60oC : 3 năm cấy chuyển một lần.

Giữ ở to = -70oC : 10 năm cấy chuyển một lần

b Phương pháp đông khô dịch thể trực tiếp (L-drying)

Khác với phương pháp đông khô ở chỗ dịch huyền phù vi sinh vật đượclàm khô nhanh ở chế độ chân không thích hợp mà mẫu không cần làm lạnh từtrước Phương pháp này thường sử dụng cho nhóm vi khuẩn không có khả năng sống trong điều kiện nhiệt độ thấp của giai đoạn tiền đông

Các thông số quan trọng cần chú ý:

- Tuổi của vi sinh vật bảo quản

- Thành phần dịch huyền phù tế bào vi sinh vật

- Tốc độ đông khô

- Nhiệt độ đông khô thấp nhất

- Khoảng thời gian làm khô mẫu và độ ẩm cuối cùng của mẫu

Đây là phương pháp nhanh và thuận lợi khi phải bảo quản số lượng mẫu lớn Thông thường theo phương pháp này vi sinh vật được bảo quản từ

10 – 20 năm

2.3.4 Phương pháp bảo quản lạnh sâu

Đối với phương pháp bảo quản lạnh sâu thì vi sinh vật được bảo quản trong môi trường dịch thể và nước cần cho hoạt động sống của vi sinh vật bị bất hoạt ở nhiệt độ lạnh sâu (-196oC đến -80oC)

Khi bảo quản vi sinh vật theo phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu Một trong những nguyên nhân dẫn đến vỡ tế bào là do tích lũy các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước trong tế bào Để khắc phục nhược điểm này, người ta

đã bổ sung các chất làm hạn chê tốc độ lạnh sâu như Glycerol, DMSO

(dimethyl sulfoxide)

Bảo quản ở mức nhiệt độ cao hơn -30oC thì hiệu quả thấp hơn do tế bàochịu nồng độ muối cao sinh ra từ các chất điện giải

Phương pháp này mặc dù có nhiều ưu điểm nhưng cũng bộc lộ một số nhược điểm như: kinh phí đầu tư cho thiết bị cao, rủi ro cháy nổ… Đặc biệt, phương pháp này không thích hợp với những chủng vi sinh vật thường xuyên dùng đến

Nói chung, phương pháp này được áp dụng cho những chủng vi sinh vật có những đặc tính quý mà không thích hợp với phương pháp đông khô

PHẦN III

ĐỐI TƯỢNG – NỘI DUNG- PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ĐỐI TƯỢNG –ĐỊA ĐIỂM – THỜI GIAN NGHIÊN CƯU

- Đối tượng: Một số chủng vi khuẩn Bacillus đang được bảo quản tại

phòng thí nghiệm bộ môn Dinh dưỡng-Thức ăn, khoa Chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản

- Địa điểm: Phòng thí nghiệm Vi sinh, bộ môn Dinh dưỡng-Thức ăn, khoa Chăn nuôi và Nuôi trồng thủy sản, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội

- Thời gian : từ tháng 01đến tháng 07 năm 2013

3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

3.2.1 Đánh giá sự biến đổi về mặt hình thái của vi khuẩn Bacillus trong thời

gian giữ giống:

- Đặc điểm hình thái khuẩn lạc

- Đặc điểm hình thái tế bào vi khuẩn

3.2.2 Đánh giá sự biến đổi về đặc tính sinh học của các chủng Bacillus

- Đánh giá khả năng phân giải Protein

- Đánh giá khả năng phân giải tinh bột

- Đánh giá khả năng sinh trưởng ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau

3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tất cả các chủng giống đều được phân lập và chọn lọc mới.

3.3.2 Phương pháp bảo quản, giữ giống

Sử dụng phương pháp cấy truyền trên môi trường thạch nghiêng (Agar slope method) và bảo quản ở 4oC

Các chủng Bacillus sau khi phân lập và chọn lọc với mục đích sử dụng

làm giống khới động sẽ được nuôi cấy trên môi trường thạch LB ở 37o48h để giữ giống Kiểm tra tạp nhiễm giống trước khí bảo quản trong giống trong tủ lạnh ở điều kiện nhiệt độ 4oC Giống được cấy truyền 1 tháng một lầnsang môi trường LB mới

C/24-Trong quá trình bảo quản, tiến hành đánh giá các chỉ tiêu về hình thái, đặc tính sinh học của giống tại các thời điểm 0, 30, 60, 90 ngày

3.3.3 Phương pháp xác định hình thái

- Hình thái tế bào được xác định bằng phương pháp nhuộm Gram (Xemphụ lục) và quan sát tiêu bản nhuộm dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1500 lần

- Quan sát bào tử bằng phương pháp nhuộm với Lục Malachite Bào tử bắt màu xanh, tế bào bắt màu đỏ

- Hình thái của bào tử được nhuộm với thuôc

- Quan sát hình thái, tính chất khuẩn lạc nuôi cấy trên môi trường thạchbằng kính lúp có độ phóng đại 20 lần

3.3.4 Phương pháp đánh giá khả năng phân giải protein

Sử dụng phương pháp khuếch tán trên thạch

- Chuẩn bị môi trường thạch đĩa:

- Âm tính: Không có vòng phân giải

3.3.5 Phương pháp đánh giá khả năng phân giải tinh bột

- Chuẩn bị môi trường thạch đĩa :

Tinh bột tan : 10g Cao thịt: 3g

Nhỏ đều dung dịch Lugol lên trên bề mặt thạch, để 15 phút

+ Dương tính: Có vòng phân giải Tinh bột xung quanh khuẩn lạc, dùng thước đo đường kính của vòng phân giải

- Âm tính: Không có vòng phân giải

3.3.6 Đánh giá khả năng sinh trưởng ở các nhiệt độ khác nhau

- Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường thạch LB dịch thể

- Đưa vi khuẩn đã cấy vào tủ ấm Điều chỉnh nhiệt độ của tủ ấm ở các nhiệt độ 30oC, 35oC, 40oC, 50ºC, 55ºC Đếm số lượng tế bào ở các thời điểm 0giờ, 24 giờ, 48 giờ

3.3.7 Phương pháp xác định số lượng tế bào