Nghiên cứu tác dụng của các dịch chiết từ thực vật để phòng trừ nấm gây bệnh thối xám (botrytis cinerea) và nấm gây bệnh thán thư (colletotrichum gloeosporioides) trên một số loại rau quả

Để đáp ứng được phần nào những nhu cầu của sản xuất chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: ‘‘Nghiên cứu tác dụng của các dịch chiết từ thực vật để phòng trừ nấm gây bệnh thối xám Botryt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP & PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Người hướng dẫn khoa học

TS Đặng Vũ Thị Thanh

HÀ NỘI - 2011

Lời cảm ơn chân thành tôi xin được gửi tới các Thầy, Cô giáo và tập thể cán bộ Ban Đào tạo Sau Đại Học - Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam

đã tận tình dạy bảo và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của các đồng nghiệp, nhóm Chẩn đoán bệnh hại và tập thể cán bộ Bộ môn Chẩn đoán giám định dịch hại và thiên địch - Viện Bảo vệ thực vật đã giúp đỡ tôi về cơ sở vật chất, thời gian cũng như về phương pháp nghiên cứu

Cuối cùng là lòng biết ơn những người thân trong gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã động viên, khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này

Hà Nội, ngày 20 tháng 11 năm 2011

Tác giả luận văn

Vũ Duy Hiện

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan toàn bộ các kết quả nghiên cứu trong luận văn này là hoàn toàn trung thực và chưa từng sử dụng cho bảo vệ một học vị nào

Mọi sự giúp đỡ cho việc hoàn thành luận văn đều đã được cảm ơn và các thông tin tài liệu đều được ghi rõ nguồn gốc

Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm về số liệu của luận văn này

Tác giả luận văn

Vũ Duy Hiện

1.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 4 1.1.1 Những nghiên cứu về nấm Botrytis cinerea 4 1.1.2 Những nghiên cứu về nấm Colletotrichum spp 5 1.1.3 Nghiên cứu sử dụng dịch chiết từ thực vật để phòng trừ nấm

1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 19 1.2.1 Những nghiên cứu về nấm Botrytis cinerea 19 1.2.2 Những nghiên cứu về nấm Colletotrichum spp 20 1.2.3 Nghiên cứu sử dụng dịch chiết từ thực vật để phòng trừ nấm

Chương 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.3.1 Thu thập tuyển chọn các loài thực vật có chứa các hoạt chất

sinh học có khả năng ức chế nấm gây bệnh thối xám và bệnh

thán thư 27 2.3.2 Chiết tách các hoạt chất sinh học từ thực vật có khả năng ức

chế nấm gây bệnh thối xám và bệnh thán thư 27 2.3.3 Đánh giá khả năng ức nấm B cinerea, C gloeosporioides của

các dịch chiết từ thực vật trong phòng thí nghiệm 28 2.3.4 Đánh giá hiệu lực phòng trừ nấm B cinerea, C

gloeosporioides gây bệnh trên rau quả của các dịch chiết và

ảnh hưởng của chúng tới cây trồng trong nhà lưới 29 2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu 32

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả thu thập tuyển chọn các loài thực vật có chứa các

hoạt chất sinh học có khả năng ức chế nấm gây bệnh thối xám

3.2 Nghiên cứu chiết tách các hoạt chất sinh học từ thực vật có

khả năng ức chế nấm gây bệnh thối xám và bệnh thán thư 34 3.3 Đánh giá khả năng ức chế nấm B cinerea, C gloeosporioides

của các dịch chiết từ thực vật trong phòng thí nghiệm 38 3.4 Đánh giá hiệu lực phòng trừ nấm B cinerea, C

gloeosporioides gây bệnh trên rau quả của các dịch chiết

3.5 Đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết tới sự phát triển của cây

cà chua và ớt trong nhà lưới 65

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU

3.3 Khả năng ức chế của các dịch chiết tới sự phát triển của nấm

B cinerea trên môi trường PDA (Viện BVTV - 2011) 38 3.4 Khả năng ức chế của các dịch chiết tới sự phát triển của nấm

C gloeosporioides trên môi trường PDA (Viện BVTV -

3.5 Đặc điểm thực vật học của các cây có triển vọng sử dụng để

phòng trừ nấm B cinerea, C gloeosporioides (Viện BVTV -

3.6 Khả năng ức chế của dịch chiết DC8 từ củ gừng tới sự phát

triển của nấm B.cinerea trên môi trường PDA (Viện BVTV -

3.7 Khả năng ức chế của dịch chiết DC9 từ củ nghệ tới sự phát

triển của nấm B cinerea trên môi trường PDA (Viện BVTV -

3.8 Khả năng ức chế của dịch chiết DC36 từ đài hoa cúc dã quỳ

tới sự phát triển của nấm B cinerea trên môi trường PDA

3.9 Khả năng ức chế của dịch chiết DC8 từ củ gừng tới sự phát

triển của nấm C gloeosporioides trên môi trường PDA (Viện

3.10 Khả năng ức chế của dịch chiết DC9 từ củ nghệ tới sự phát

triển của nấm C gloeosporioides trên môi trường PDA (Viện

3.11 Khả năng ức chế của dịch chiết DC36 từ đài hoa cúc dã quỳ

tới sự phát triển của nấm C gloeosporioides trên môi trường

3.12 Ảnh hưởng của dịch chiết DC9 và DC36 đến diễn biến bệnh

thối xám (B cinerea) trên cây cà chua trong nhà lưới (Viện

3.13 Hiệu lực phòng trừ bệnh thối xám (B cinerea) trên cây cà

chua của dịch chiết DC 9 và DC 36 trong nhà lưới (Viện

3.14 Ảnh hưởng của dịch chiết DC8 và DC9 đến diễn biến bệnh

thán thư (C gloeosporioides) trên cây ớt trong nhà lưới (Viện

3.15 Hiệu lực phòng trừ bệnh thán thư (C gloeosporioides) ớt của

dịch chiết DC8 và DC9 trong nhà lưới (Viện BVTV - 2011) 63 3.16 Ảnh hưởng của dịch chiết DC9 và DC36 đến sự phát triển của

cây cà chua (Viện BVTV - 2011) 65 3.17 Ảnh hưởng của dịch chiết DC8 và DC9 đến sự phát triển của

DANH MỤC CÁC HÌNH

3.1 Hoạt động chiết tách các loài thực vật 37 3.2 Cây gừng (Zingiber officinali) 45 3.3 Cây nghệ (Curcuma longa) 45 3.4 Cây cúc dã quỳ (Tithonia diversifolia) 45 3.5 Khả năng ức chế của dịch chiết DC8 tới sự phát triển của nấm

B cinerea trên môi trường PDA sau 7 ngày 47 3.6 Khả năng ức chế của dịch chiết DC9 tới sự phát triển của nấm

B cinerea trên môi trường PDA sau 7 ngày 49 3.7 Khả năng ức chế của dịch chiêt DC36 tới sự phát triển của nấm

B cinerea trên môi trường PDA sau 7 ngày 50 3.8 Thí nghiệm đánh giá khả năng ức chế nấm B cinerea của dịch

3.9 Thí nghiệm đánh giá khả năng ức chế nấm B cinerea của dịch

3.10 Thí nghiệm đánh giá khả năng ức chế nấm B cinerea của dịch

3.11 Khả năng ức chế sự phát triển nấm C gloeosporioides của dịch

chiết DC8 trên môi trường PDA sau 7 ngày 53

3.12 Khả năng ức chế sự phát triển nấm C gloeosporioides của dịch

chiết DC9 trên môi trường PDA sau 7 ngày 54

3.13 Khả năng ức chế sự phát triển nấm C gloeosporioides của dịch

chiết DC36 trên môi trường PDA sau7 ngày 56

3.14 Thí nghiệm đánh giá khả năng ức chế nấm C gloeosporioides

của dịch chiết DC8 sau 7 ngày 56

3.15 Thí nghiệm đánh giá khả năng ức chế nấm C gloeosporioides

của dịch chiết DC9 sau 7 ngày 57

3.16 Thí nghiệm đánh giá khả năng ức chế nấm C gloeosporioides

của dịch chiết DC36 sau 7 ngày 57

3.17 Hiệu lực phòng trừ bệnh thối xám (B cinerea) trên cây cà chua

của dịch chiết DC9 và DC36 trong nhà lưới Viện BVTV 60

3.18 Thí nghiệm đánh giá hiệu lực phòng trừ bệnh thối xám (B

cinerea) trên cây cà chua của dịch chiết DC9 và DC36 tại Viện

3.19 Hiệu lực phòng trừ bệnh thán thư (C gloeosporioides)

ớt của dịch chiết DC8 và DC9 tại nhà lưới Viện BVTV 63 3.20 Thí nghiệm đánh giá hiệu lực phòng trừ bệnh thán thư

(C gloeosporioides) ớt của dịch chiết DC8 và DC9 tại Viện

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Điều kiện khí hậu và trồng trọt ở nước ta rất phù hợp cho nấm Botrytis

cinerea và Colletotrichum gloeosporioides phát sinh gây hại Hai loài nấm

này gây các triệu chứng thán thư, thối hoa, thối quả, chết cây con, đốm lá hay thối thân, thối rễ Nấm gây hại trên cây rau, cây cảnh, cây ăn quả, cây rừng Nấm không những gây hại trên cây trồng trước thu hoạch mà còn là một yếu

tố hạn chế đến khả năng bảo quản và chuyên chở của các loại nông sản sau thu hoạch

Để phòng trừ bệnh thối xám và thán thư trên các loại rau, quả người

ta dùng Captan, Thiram, Benomyl, Iprodione và Vinclozolin Nhưng một số

dòng Botrytis đã xuất hiện khả năng kháng các loại thuốc Benomyl, Iprodione

trên nhiều loại cây trồng gây khó khăn cho việc phòng trừ bệnh

Các loại quả và rau chủ yếu dùng để ăn tươi có thời gian thu hoạch kéo dài theo từng đợt ra hoa, các lứa quả gối nhau, trong 1 chùm quả dâu tây

và cà chua có cả quả xanh và quả chín, hàng ngày phải thu quả theo độ chín không thu gọn được thành đợt Do có đặc tính trên việc sử dụng thuốc trừ nấm hoá học phun phòng trừ bệnh cho các loại rau, dâu tây, cà chua trong thời kỳ ra hoa đậu quả là vô cùng khó khăn do không đảm bảo được yêu cầu của an toàn thực phẩm

Kết quả nghiên cứu bước đầu của Viện Bảo vệ thực vật đã chỉ ra rằng

các loại tinh dầu Thyme, Oregano, Cinnamon có khả năng ức chế nấm B

cinerea, C gloeosporioides phát triển trong môi trường Đặc biệt tinh dầu

Cinnamon được chiết xuất từ cây quế là một loại cây được trồng phổ biến ở nước ta Kết quả nghiên cứu này đã mở ra một triển vọng cho việc nghiên cứu ứng dụng các sản phẩm phụ của cây quế như lá và cành con để sản xuất tinh dầu làm thuốc thảo mộc trừ bệnh mốc xám và thán thư

Việc tìm ra và ứng dụng được những chất trừ nấm chiết tách từ thực vật

an toàn với con người và thân thiện với môi trường để phòng trừ nấm B

cinerea và nấm C gloesporioides không những là một điều cần thiết cho việc

phát triển sản xuất rau, hoa quả mà còn là một yếu tố cần thiết để góp phần phát triển các nghề trồng rau, hoa cây cảnh, cây ăn quả và phát triển nông nghiệp bền vững ở Việt Nam Để đáp ứng được phần nào những nhu cầu của

sản xuất chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: ‘‘Nghiên cứu tác dụng của

các dịch chiết từ thực vật để phòng trừ nấm gây bệnh thối xám (Botrytis

cinerea) và nấm gây bệnh thán thư (Colletotrichum gloeosporioides) trên

một số loại rau quả”

2 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

2.1 Ý nghĩa khoa học

Xác định được các loài thực vật có chứa các hoạt chất sinh học có khả

năng ức chế nấm gây bệnh thối xám B cinerea và nấm gây bệnh thán thư C

gloeosporioides gây hại trên rau quả Kết quả của đề tài sẽ là cơ sở để tiếp tục

nghiên cứu và sản xuất các chế phẩm sinh học phòng trừ bệnh thối xám B

cinerea và bệnh thán thư C gloeosporioides đảm bảo an toàn vệ sinh thực

phẩm và thân thiện với môi trường

Các kết quả nghiên cứu của đề tài cũng sẽ cung cấp thêm các thông tin

của nấm B cinerea, C gloeosporioides, các thông tin này sẽ trở thành nguồn

tài liệu để tham khảo trong nghiên cứu của các lĩnh vực nấm, bảo vệ thực vật,

đa dạng sinh học

2.2 Ý nghĩa thực tiễn

Sử dụng thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc thảo mộc trong phòng trừ bệnh hại là một biện pháp có tính khả thi cao an toàn cho người sử dụng và thân thiện với môi trường, góp phần giảm thiểu sâu bệnh, tăng năng suất cây trồng, giảm thiệt hại cho người sản xuất, đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của

xã hội và xuất khẩu

3 Mục tiêu của đề tài

Phát hiện được các dịch chiết từ thực vật có khả năng phòng trừ nấm

gây bệnh thối xám B cinerea và nấm gây bệnh thán thư C gloeosporioides an

toàn với con người và thân thiện với môi trường trong sản xuất rau, quả và hoa cây cảnh

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài

4.1 Đối tượng nghiên cứu

- Nấm B cinerea, C gloeosporioides gây hại trên rau, quả

- Các dịch chiết được chiết tách từ thực vật

- Các loại rau, quả ( ớt, cà chua…)

4.2 Phạm vi nghiên cứu

- Thu thập các cây có khả năng chứa các hoạt chất có khả năng ức chế nấm gây bệnh thối xám, bệnh thán thư tại Lào Cai, Điên Biên, Hà Nội và phụ cận

- Đánh giá khả năng ức chế của các dịch chiết từ thực vật tới sự phát

triển của các nấm B cinerea, C gloeosporioides trong phòng thí nghiệm tại

Viện Bảo vệ thực vật

- Đánh giá hiệu lực phòng trừ bệnh thối xám và bệnh thán thư trên rau, quả của các dịch chiết từ thực vật trong nhà lưới tại Viện Bảo vệ thực vật

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

1.1.1 Những nghiên cứu về nấm Botrytis cinerea

Nấm Botrytis cinerea là một loài ký sinh đa thực gây bệnh trên cây

trồng đã được phát hiện ở nhiều vùng sinh thái khác nhau trên thế giới Nấm nằm trong ngành Eumycota, ngành phụ Deuteromycotina, lớp Hyphomycetes,

bộ Hyphales, họ Moniliaceae Nấm gây hại trên các cây rau, cây cảnh, cây ăn quả, cây rừng Nấm gây các triệu chứng thối hoa, thối quả, chết cây con, đốm lá, thối thân, thối rễ v.v Nấm không những gây hại trên cây trồng trước thu hoạch mà còn là một yếu tố hạn chế đến khả năng bảo quản và chuyên chở của các loại nông sản sau thu hoạch

Nhiệt độ thích hợp cho nấm Botrytis cinerea phát triển là 18 - 230C, nhưng nấm có thể phát triển ngay cả khi nhiệt độ hạ xuống dưới 100C (Agrios 1988) [17] Thời tiết ẩm ướt là điều kiện lý tưởng cho nấm phát triển, hình thành bào tử, lan truyền và xâm nhiễm Bào tử nảy mầm có thể xâm nhiễm trực tiếp vào mô cây nhưng chủ yếu nấm xâm nhiễm vào mô qua vết thương Sợi nấm và bào tử có thể bao phủ bề mặt các mô bị bệnh (McKeen, 1974) [49] Nấm có thể tồn tại trên tàn dư cây bệnh hay trong đất ở dạng sợi nấm hay hạch và đây là nguồn lan truyền bệnh trên đồng ruộng Hạch nấm chủ yếu nảy mầm thành sợi nấm và xâm nhiễm trực tiếp vào cây, nhưng có những trường hợp từ hạch nấm hình thành các quả bào tử hình phễu và các túi bào tử (Coley-Smith et al., 1980; Agrios, 1988) [29];[17]

Tại Hawai nấm được phát hiện trên 28 loại cây trồng bao gồm cây rau, cây ăn quả, hoa cây cảnh v.v Triệu chứng bệnh do nấm gây ra trên các cây trồng và các bộ phận của cây cũng rất khác nhau (Andrew, Stephen, 1994) [19] Nấm có thể gây chết cây con (damping off) cho rau và một số loài thông

trong vườn ươm Dịch bệnh đã gây thiệt hại nặng cho các vườn ươm cây thông giống ở California (Perterson, Smith, 1975) [57] Nấm gây triệu chứng thối hay thối xám trên lá, thân, hoa, quả, củ trên các cây dâu tây, quả đào, quả nho, đậu, ớt, hành, cà chua, cà rốt, dưa chuột, hoa lay ơn, hoa hồng v.v (Walker, 1926; Roger, 1953; McClellan, Hewitt, 1973; Forsberg, 1975; Ellis, 1976; Agrios, 1988; Andrew, Stephen, 1994) [77]; [64]; [48]; [35]; [33]; [17]; [19]

Cấu trúc gen của nấm B cinerea được chia thành 2 nhóm Các nhóm

này khác nhau ở chỗ có hay không chứa các nguyên tố có thể đổi chỗ Các

dòng B cinerea var transposa có chứa các nguyên tố có thể đổi chỗ trong khi

đó các dòng B cinerea var vacuma không chứa các nguyên tố này (Giraud et

al., 1997) [36]

Trong 117 nguồn nấm có 43 dòng vacuma kháng lại fenhexamid và 17 dòng vacuma mẫn cảm với fenhexamid Có 49 dòng transposa kháng lại fenhexamid và 8 dòng transposa mẫn cảm với fenhexamid Các dòng nấm

kháng fenhexamid có chứa gen Bc-hch1 (nhóm 1), các dòng nấm mẫn cảm

với fenhexamid có chứa gen Bc-hch 2 (nhóm 2) (Elisabeth et al., 2003) [32]

Tuy nhiên các tác giả khác lại cho rằng nhóm 1 chỉ bao gồm các dòng vacuma còn nhóm 2 bao gồm cả các dòng transpora và vacuma (Giraud et al., 1997)

[36]

Một số dòng Botrytis có khả năng kháng các loại thuốc benomyl,

dichloran, iprodione Để hạn chế khả năng xuất hiện tính kháng thuốc của nấm người ta đã sử dụng hỗn hợp thuốc hay phun luân phiên các loại thuốc (Agrios, 1988) [17]

1.1.2 Những nghiên cứu về nấm Colletotrichum spp

Hàng trăm loài nấm Colletotrichum gây bệnh trên cây đã được phát

hiện ở nhiều vùng sinh thái khác nhau trên thế giới Nấm nằm trong ngành

Eumycota, giai đoạn vô tính nấm nằm trong ngành phụ Deuteromycotina, lớp Coelomycetes, bộ Melanconiales, họ Melanconiaceae Nấm gây hại trên các cây lương thực, cây rau, cây cảnh, cây ăn quả, cây rừng v.v Nấm gây các triệu chứng thối hoa, thối quả, đốm lá, thân v.v Nấm không những gây hại trên cây trồng trước thu hoạch mà còn gây hại cả sau thu hoạch, nấm là một yếu tố hạn chế đến khả năng bảo quản và chuyên chở của các loại nông sản (Roger, 1953; Sutton, 1999; Agrios, 1988; Bailey and Jegger, 1992) [64]; [71]; [17]; [21]

Nghiên cứu về gen và mối quan hệ giữa các loài về phả hệ của

Colletotrichum đã được tiến hành Kết quả các phân tích gen đã chỉ ra được

mối quan hệ của các loài thể hiện bằng các khoảng cách trong cây phả hệ

(Saitou, Nei 1987; Sherriff at al., 1994; Josep et al., 2004) [65]; [66]; [40]

Để có thể xác định đến loài của nấm Colletotrichum đã có rất nhiều

nghiên cứu trên thế giới kết hợp phương pháp sinh học phân tử giải trình tự gen bao gồm cả rDNA-ITS, β - tubulin, MAT1-2, GDPH và dựa trên đặc điểm hình thái nấm là một trong những phương pháp hữu ích hiện nay trong chiến lược kiểm soát bệnh và phục vụ các nghiên cứu chuyên sâu (Josep et

al., 2004; Maung Mya Thaung, 2008 ; Hyde et al., 2009) [40]; [47]; [39]

Là một loài nấm gây bệnh rất quan trọng cho cây trồng nhiều kỹ thuật sinh học phân tử đã được ứng dụng để phát hiện nấm và xác định về mối quan

hệ di truyền của các dòng nấm Colletotrichum Mặc dù vậy cho đến nay phân

loại nấm vẫn chưa rõ ràng có tới 11 các gen đồng tên đã được đưa ra cho chi

nấm Colletotrichum (Sutton, 1999) [71] Riêng loài nấm C gloeosporioides

đã có tới gần 600 đồng tên được đưa ra (Von Arx, 1957) [76]

Kết quả nghiên cứu nấm Colletotrichum gloeosporioides Penzig

Nấm C gloeosporioides xuất hiện và gây hại ở nhiều nơi trên thế giới

nhưng chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, người ta đã phát hiện được

470 ký chủ khác nhau của nấm (Hyde et al., 2009) [39] Nấm được xác định

là loài gây hại kinh tế quan trọng trên rất nhiều loại cây lương thực, thực phẩm như lúa, ngô, cây họ đậu, rau, các loài cỏ, trên các cây ăn quả, cây công nghiệp lâu năm có ý nghĩa kinh tế như bông, cà phê, cao su, chuối, xoài, bơ,

đu đủ v.v Nấm làm giảm chất lượng và sản lượng thu hoạch trên các cây trồng bị hại (Bailey et al, 1992) [21]

Nấm Colletotrichum gloeosporioides gây ra triệu chứng cháy lá, khô

hoa, khô hạt, là đối tượng gây hại phổ biến và có ý nghĩa kinh tế quan trọng Bệnh tấn công mạnh giai đoạn ra hoa và chồi non ở nhiều vùng trồng điều trên thế giới, nhiều khi nấm tấn công cả vào quả làm giảm năng suất và phẩm chất hạt Bệnh gây hại phổ biến trong mùa mưa, mức độ nghiêm trọng của bệnh thay đổi từ năm này sang năm khác và từ vùng này đến vùng khác tùy thuộc vào điều kiện môi trường (Brown, 1968) [23]

Nấm Colletotrichum gloeosporioides xâm nhập và tấn công cây qua

các vết thương do côn trùng chích hút Bệnh gây hại nặng vào mùa mưa và trong các vườn có hệ thống thoát nước kém (Suwit Chaikiattiyos, 1998) [72]

Nấm Colletotrichum gloeosporioides gây bệnh thán thư cho cây trồng

và là một vấn đề ở hầu hết các khu vực có mưa lớn và ẩm độ tương đối Bệnh tấn công lá, thân cây và cành non, các bộ phận của hoa và hạt với các triệu chứng bệnh khác nhau (Rajani Nadgauda, 2004) [61] Bệnh có thể làm giảm 50% năng suất ở các vườn trồng điều (Cardoso et al., 2006) [25] Bệnh thán thư cũng gây hại nặng trong các vườn ươm điều giống tại Brazil chủ yếu trong mùa mưa Triệu chứng bệnh trên lá và chồi non tương tự như trên cây điều trưởng thành, bệnh hại nặng làm cho chồi non bị thui đen (Rajani Nadgauda, 2004) [61]

Nấm C gloeosporioides còn được ghi nhận gây rụng lá cao su trên cả

cây non và cây trưởng thành đang trong thời kỳ khai thác nhựa Bệnh rụng lá

do nấm C gloeosporioides gây ra là một trong những bệnh hại kinh tế của cao

su Chúng gây hại ở hầu hết các quốc gia trồng cao su trên thế giới như Brazil, Cameroon, Trung Quốc, Gabon, Guyane, Ấn Độ, Indonesia, Bờ Biển Ngà, Sri Lanka, Thái Lan, Philippin v.v Người ta đã ghi nhận được sự xuất hiện của nấm trên cao su từ năm 1972, có trên 81% các đồn điền trồng cao su nhiễm bệnh này tại Malaysia Các kết quả nghiên cứu cho thấy bệnh gây hại nặng trong mùa thu làm cho lá thứ cấp tăng trưởng chậm dẫn đến giảm sản lượng nhựa cao su (Masanto Masyahit, 2009) [45]

Nấm C gloeosporioides cũng được coi là đối tượng gây hại quan trọng

với nhiều loại cây ăn quả vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới trong bảo quản sau thu hoạch như bơ, ổi, đu đủ, chuối, xoài v.v (Bailey et al, 1994; Wasantha Kumara KL et al., 2008) [66]; [78]

Tuy nhiên, nấm C gloeosporioides cùng với 4 loài Colletotrichum khác (C coccodes, C crassipes, C dematium và C graminicola) trong một

số báo cáo gần đây đã ghi nhận gây bệnh cho con người, gây viêm giác mạc sau khi bị chấn thương mắt và nhiễm trùng dưới da do bệnh nhân bị ức chế hệ thống miễn dịch (Josep Cano et al., 2004) [40]

Đặc điểm sinh học, sinh thái và qui luật phát sinh phát triển của nấm C gloeosporioides

Sợi nấm C gloeosporioides có thể phát triển tốt trên các loại môi

trường nhân tạo, nhưng nấm sẽ phát triển mạnh hơn trên môi trường có bổ sung Nitơ và Các bon Theo Chaturvedi (1965) [26], đường glucose, maltose, fructose và tinh bột bổ sung vào môi trường nuôi cấy rất phù hợp cho sự sinh

trưởng và hình thành bào tử của C gloeosporioides Nhiệt độ tối ưu cho nấm

phát triển nằm trong khoảng 25 - 300C Môi trường mạch nha MEA (Malt extract agar) và môi trường PDA phù hợp nhất cho sự phát triển và hình thành

bào tử của nấm C gloeosporioides Ngoài ra, các loại môi trường OMA (Oat

meal agar), môi trường CM và môi trường CZD-V8 (Czapek-Dox-V8) cũng

được sử dụng trong các thí nghiệm với nấm C gloeosporioides (Muniz et al.,

1997) [52]

Bào tử C gloeosporioides nảy mầm mạnh nhất trong điều kiện nhiệt độ

280C và ẩm độ cao trên 97% Tuy nhiên, trong điều kiện khô hạn bào tử tồn tại trên bề mặt mô cây ký chủ vẫn có thể nẩy mầm, xâm nhiễm gây bệnh do được kích hoạt bởi quá trình lão hóa hoặc do tổn thương mô cây Bào tử chỉ hình thành cơ quan sinh sản (acervuli) khi độ ẩm đạt tối thích Ánh sáng mặt trời, độ ẩm thấp và nhiệt độ dưới 180C và trên 250C nhanh chóng làm cho bào

tử ngừng hoạt động (CABI, 2005) [24]

Trên đồng ruộng, điều kiện khí hậu đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển dịch bệnh Trời sương mù hoặc nhiều sương có ảnh hưởng trực tiếp đến sự nảy mầm, phát triển của bào tử cũng như tốc độ lan truyền bệnh Ngoài ra, bệnh lan truyền qua hạt giống, tàn dư cây bệnh, cỏ dại, nước mưa và tác động của gió góp phần phát tán bào tử nấm trong không khí (Dodd et al., 1991; CABI, 2005) [31];[24]

Các biện pháp giống chống chịu, luân canh, bón phân hợp lý, xử lý nhiệt độ, loại trừ các loài cỏ là ký chủ trung gian và các thuốc trừ nấm và các

chế phẩm Trichoderma hazianum được dùng để phòng trừ Colletotrichum (

Tronsino, Ystaas, 1980; Agrios, 1988; Bailey, Jegger, 1992) [74]; [17]; [21]

1.1.3 Nghiên cứu sử dụng dịch chiết từ thực vật để phòng trừ nấm gây bệnh cây

Trước những năm 1940 rất nhiếu sản phẩm thực vật hay chiết xuất từ thực vật đã được sử dụng rộng rãi để làm thuốc trừ sâu Từ sau những năm

1940 do sự phát triển mạnh mẽ của công nghiệp hóa học, các thuốc trừ sâu tổng hợp theo con đường hóa học đã thay thế và trở thành sản phẩm được dùng chủ yếu trong bảo vệ thực vật ở hầu hết các nước trên thế giới Việc lạm

dụng quá nhiều thuốc bảo vệ thực vật hoá học đã đưa ra nhiều hệ lụy cho sức khoẻ của con người và môi trường

Trong những năm gần đây nhằm tìm ra các loại thuốc bảo vệ thực vật

an toàn với con người và thân thiện với môi trường các nghiên cứu ứng dụng các sản phẩm tự nhiên để phòng trừ sâu bệnh hại cây trồng đã được nghiên cứu ở nhiều nước trên thế giới

Sử dụng các sản phẩm chiết tách từ cây Achyranthes japonica và rễ

Rumex crispus đã trừ được bệnh phấn trắng dưa chuột do nấm Podosphaera xanthii gây ra trong nhà lưới (Kim et al., 2004) [41] Từ rế cây Rumex crispus

người ta đã chiết tách được 3 hợp chất nepodin, chrysophanol, và parietin có

khả năng kháng nấm (Choi et al., 2004) [] Các dịch chiết của hành tỏi Allium spp., của ớt Capsicum và các loại tinh dầu của Palmarosa, Thyme, Cinnamon

có hiệu quả cao trong phòng trừ B cinerea

Nghiên cứu về khả năng phòng trừ nấm của dịch chiết từ 57 loài thực

vật bằng dung môi Methanol đối với các bệnh đạo ôn trên lúa (Magnaporthe

grisea), thối xám trên cà chua (B cinerea), khô vằn (Corticium sasaki), sương

mai cà chua, (Phytophthora infestans), rỉ sắt lúa mì (Puccinia recondita) và phấn trắng đại mạch (Blumeria graminis f sp hordei) đã được tiến hành tại

Hàn Quốc Trong 57 loài cây này dịch chiết từ 7 loài cây có khả năng ức chế trên 90% với ít nhất 1 loài nấm Tuy nhiên không có loại dịch chiết nào có

khả năng ức chế cao với nấm B cinerea (Gyung Ja Choi et al., 2004) [37]

Trong số dịch chiết của 26 loài cây thuộc 20 họ thực vật đã xác định

được 22 loài cây có khả năng ức chế sự phát triển của nấm Phytophthora

infestans trên lá khoai tây, trong đó dịch chiết của các loài cây Glycyrrhiza glabra, Lauris nobilis, Salvia officinalis, Solanum nigrum, Sytrax officinalis, Xanthium strumarium có nồng độ ức chế (MIC) thấp từ 2 - 8% w/v (Yusuf

Yanar et al., 2011) [80]

Patcharavipa Chaijuckam và Michael Davis (2010) [55] đã sử dụng dịch chiết từ gừng, ớt, húng, tỏi và sử dụng tinh dầu neem, tỏi, sả và quế để

phòng trừ nấm Rhizoctonia oryzae- sative gây bệnh trên bẹ lúa tại phòng thí

nghiệm của trường đại học California Với nồng độ sử dụng 5% trong các dịch chiết từ gừng, ớt, húng, tỏi chỉ có dịch chiết từ tỏi có khả năng ức chế sự sinh trưởng của nấm, các dịch chiết từ gừng, ớt, húng không ức chế sự phát triển của nấm mà còn kích thích tản nấm phát triển Các loại tinh dầu khảo nghiệm đều ức chế sự phát triển của nấm trong đó tinh dầu tỏi, tinh dầu sả và tinh dầu quế ức chế hoàn toàn sự phát triển của nấm trong môi trường nuôi cấy Trong nhà lưới thí nghiệm sử dụng tinh dầu quế hoà tan trong dầu ăn ở

các nồng độ 12,5; 37,5; 62,5 và 87,5% để trừ 2 nguồn nấm Rhizoctonia

oryzae- sative mang ký hiệu 13B và 3B Ở nguồn 13B tinh dầu quế ở tất cả

các nồng độ sử dụng đều không ức chế sự phát triển của nấm Với nguồn nấm 3B tinh dầu quế ở các nồng độ 12,5 và 37,5% không ức chế sự phát triển của nấm các nồng độ 62,5 và 87,5% ức chế sự phát triển của nấm nhưng lại làm giảm khối lượng hạt cũng như khối lượng của cây lúa

Kitherian et al (2006) [42] đã nghiên cứu khả năng phòng trừ nấm

Fusarium oysporum của một số dịch chiết từ các loài cây bằng các dung môi

khác nhau Dịch chiết trong các loại dung môi Benzene, Methanol,

Petroleumether và nước từ củ hành (Alium sativum), hạt na (Annona

squamosa) và lá cây Vitex negundo được đánh giá khả năng ức chế nấm Fusarium oysporum gây hại trên đậu trong điều kiện phòng thí nghiệm Trong

3 loại cây được khảo nghiệm dịch chiết từ củ hành có khả năng ức chế sự phát

triển của nấm cao nhất và thấp nhất là dịch chiết từ lá cây Vitex negundo

Dịch chiết bằng Benzene và Methanol của hạt na có khả năng ức chế nấm phát triển hơn so với các dung môi khác

Dịch chiết bằng các dung môi Chloroform và Methanol của 20 loài thực vật đã được nghiên cứu để phòng trừ các nấm gây bệnh trên quả cam sau

thu hoạch trong bảo quản tại Ma Rốc Dịch chiết của các cây T leptobotrys,

C villosus, E globulus, P harmala có hiệu quả phòng trừ cao với các nấm

gây bệnh thối xám trên quả cam Penicillium digitatum, Penicillium italicum

và Geotrichum candidum (Ameziane at al., 2007) [20]

Dịch chiết từ các cây Cassia alata (Candle bush) and Dennetia

tripetala (Pepper fruit) đã ức chế khả năng phát triển của nấm Sclerotium rolfsii trên môi trường PDA (Eunice O Nwachukwu and Osuji J.O, 2008)

[34]

Tại Hungari và Rumani các hợp chất chiết tách từ các cây thanh hao

hoa vàng (Artemisia annua) - Artemisinin, Chelidonium maius - Chelidonine,

Mentha piperita - Menthol, Populus nigra - Populin, Thymus vulgaris -

Thyme ở nồng độ 3% - 6% đã ức chế khả năng nảy mầm của bào tử nấm

Venturia inaequalis gây bệnh sẹo trên táo từ 40 - 85% (Rezso et al., 2007)

[63]

Sản phẩm Neemazal của cây neem (Azadirachta indica) có chứa 5%

azadirachtin đã kích thích khả năng kháng bệnh phấn trắng của cây đậu (Prithiviraj et al., 1998) [60]

Tại Mỹ một số sản phẩm sinh học trừ bệnh cây đã được thương mại hóa như Actigard (acibenzolar-S-methyl) trừ nhiều loại bệnh trên các cây họ

cà, Actinovate (Streptomyces lydicus) trừ các bệnh có nguồn gốc từ đất; AQ10 Biofungicide (Ampelomyces quisqualis isolate M-10) trừ bệnh phấn

trắng ,Aspire (Candida oleophila I-182) Trừ các bệnh do nấm Botrytis spp.,

Penicillium spp Bio-save 10LP, 110 (Pseudomonas syringae) trừ các bệnh

gây ra bởi các nấm Botrytis cinerea, Penicillium spp., Mucor pyroformis,

Geotrichum candidum (Brian B McSpadden Gardener, Deborah R Fravel,

2002)[22]

Các hợp chất kháng nấm chiết tách từ các loài thực vật chủ yếu tập trung trong các nhóm hợp chất phenolics, phenolic acids, coumarins, pyrones,

flavonoids, isoflavonoids, steroids, steroidal alkaloids, miscellaneous (Mitra

et al., 1984) [50]

Nghiên cứu của Soon Ok Oh và nnk (2008) [70] đã chỉ ra rằng trong dịch chiết của lá bạch đàn thành phần chủ yếu của hợp chất là 3 Flavonoit (Quercetin, Quercetin-3-O-α –L rhamoside, Quercetin-3-O-β- Dglucoside) và

2 Phenolic acid (Gallic acid, 3,4 dihydroxy benzoic acid) Trong các đơn chất

này Gallic acid đã hạn chế sự phát triển của nấm B cinerea trên môi trường hơn 80% Bào tử nấm B cinerea không nảy mầm trong Gallic acid ở nồng độ

5000mg/L Các dung dịch Quercetin, Quercetin-3-O-α –L rhamoside, Quercetin-3-O-β- Dglucoside ở nồng độ 5000mg/L giảm khả năng nảy mầm

của bảo tử nấm Botryosphaeria dothidea trên 50%

Tại Ấn Độ đã xác định được 20 loại tinh dầu thực vật có khả năng ức

chế sự phát triển nấm B cinerea trong môi trường PDA ở nồng độ 500ppm

Trong 20 loại tinh dầu trên 10 loại tinh dầu chiết tách từ các cấy

Chenopodium ambrosioides, Eucalyptus citriodora, Eupatorium cannabinum, lawsonia inermis, Ocinum canum, O gratissinum, O sanctum, Prunus persica, Zingiber cassumunar, Z officinali có khả năng ức chế hoàn toàn sự

phát triển của nấm trong môi trường Tinh dầu của các loại cây O sanctum,

Prunus persica,, Z officinali có nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) thấp hơn với

giá trị tương đưong 200, 100 và 100ppm Tinh dầu của các loại cây O

sanctum, Prunus persica, Z officinali đã được sử dụng nghiên cứu phòng trừ

bệnh thối xám B cinerea trên nho trong quá trình bảo quản Tinh dầu của các cây O sanctum kéo dài được thời gian bảo quản của nho được thêm 5 ngày, tinh dầu Prunus persica kéo dài được thời gian bảo quản của nho được thêm 4 ngày, tinh dầu Z officinali kéo dài được thời gian bảo quản của nho được

thêm 6 ngày Các loại tinh dầu này đều không gây ra các triệu chứng có hại cho quả nho (Pramila Tripathi, Dubey, Shukla, 2008) [58]

Khả năng ức chế nấm B cinerea phát triển trên môi trường PDA của

các loại tinh dầu đinh hương, tinh dầu quế, tinh dầu sả và tinh dầu củ gấu cũng đã được nghiên cứu ở Thái Lan Các loại tinh dầu đinh hương, tinh dầu quế có MIC là 15mg/ml và tinh dầu củ gấu có MIC là 25mg/ml đối với nấm

B cinerea (Sirirat Siripornvisal, Wimolpun Rungprom, Sanit Sawatdikarn,

2009)[68]

Kết quả nghiên cứu ở Rumani đã cho thấy dịch chiết từ vỏ cây

Berberil vulgaris đã làm thay đổi cấu trúc của bào tử nấm B.cinerea Người ta

thấy rằng khả năng thay đổi cấu trúc của bào tử nấm của dịch chiết từ vỏ cây

Berberil vulgaris còn mạnh hơn khả năng của berberine tinh khiết nồng độ

MIC của dịch chiết từ vỏ cây Berberil vulgaris là 18,6 mg/ml trong khi MIC

của berberine tinh khiết là 27,8 mg/ml Từ những kết quả này đã mở ra những

gợi ý tiếp tục nghiên cứu để sử dụng dịch chiết từ vỏ cây Berberil vulgaris để phòng trừ nấm B cinerea (Parvu et al., 2010) [56]

Tại Nam Phi khi nghiên cứu sử dụng dịch chiết của các cây

Aspalanthus linearis, Cyclopia genistoides và C subternata để phòng trừ nấm B.cinerea người ta nhận thấy ở nồng độ 10mg/ml dịch chiết của các cây Aspalanthus linearis, C subternata không ức chế sự phát triển của nấm mà

còn kích thích sự phát triển sinh khối của nấm trên môi trường PDA có cho thêm các nguyên tố dinh dưỡng Khi sử dụng ở nồng độ 100 mg/ml dịch chiết

của các cây Aspalanthus linearis, C subternata đã ức chế sự sinh trưởng của

nấm trên môi trường Ở nồng độ 100 mg/ml khả năng nảy mầm của bào tử

nấm giảm 36% với dịch chiết của cây Aspalanthus linearis và 19% với dịch chiết của cây Cyclopia genistoides (Coetzee et al., 2008) [28]

Nghiên cứu sử dụng dịch chiết từ các loài thực vật để phòng chống

nấm Colletotrichum đã được tiến hành ở nhiều nước khác nhau trên thế giới Tại Thái Lan dịch chiết của các cây Acorus calamus, Peper betel đã được

nghiên cứu để trừ nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư trên ớt Thí

nghiệm được bố trí trên ô 2,5 x 5 m, thí nghiệm nhắc lại 3 lần, tại trường đại

học Kasetsart, Dịch chiết Acorus calamus nồng độ 1000 ppm đã giảm 20% sự

phát triển của nấm trên quả và tăng năng suất của ô thí nghiệm so với đối chứng 30% (Nalinee Charigkapakorn, 2000) [53]

Tại Nigeria nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết từ các bộ phận lá, vỏ

thân, vỏ rễ của 11 loài thực vật với nấm C capsici đã cho thấy rằng dịch chiết

của các bộ phận khác nhau của cùng một cây có ảnh hưởng khác nhau đến sự nảy mầm của bào tử nấm và sự phát triển của nấm khác nhau Các loại cây

khác nhau thì các hoạt chất sinh học có khả năng kháng nấm C capsici tập

trung ở các bộ phận cũng khác nhau (Nduagu, Ekefan, Nwankiti, 2008) [54]

Tại Ấn Độ dịch chiết bằng Ethanol của các cây Aloe vera, Ocinum

sanctum, Cenetella asiatica, Piper betle, Calotropis gigante, Vitex negumdo, Ocinum basilicum và Azadirachta indica đã được đánh giá khả năng ức chế

sự phát triển của nấm C falcatum trên môi trường PDA Dịch chiết của cả 8 loại cây này đều có khả năng ức chế sự phát triển của nấm C falcatum trên môi trường PDA Dịch chiết của các cây Vitex negumdo, Piper betle,

Cenetella asiaticacó khả năng ức chế lớn nhất tới sự sinh trưởng phát triển

của nấm, khoảng cách ức chế đạt tới 25mm và nhỏ nhất là dịch chiết của cây

Azadirachta indica khoảng cách ức chế chỉ đạt 5mm (Prince, Prabakaran,

2011) [59]

Tại Bangladesh hiệu quả ức chế sự phát triển của nấm C falcatum gây

bệnh thối đỏ mía của các dịch chiết từ hạt neem và từ lá các cây: nghệ, cà độc

dược, cây Ocinum sanctum và vỏ cây Swietenia mahagoni đã được nghiên

cứu Các dịch chiết này đều có khả năng ức chế sự nảy mầm của bào tử nấm

cũng như sự phát triển của sợi nấm Trong đó dịch chiết từ vỏ cây Swietenia

mahagoni có khả năng hạn chế 80,2% sự phát triển của sợi nấm, và làm giảm

khả năng nảy mầm của bào tử nấm tới 98,2% (Ahmed Imtiaj et al., 2007) [18]

Thí nghiệm đánh giá khả năng ức chế của dịch chiết từ các loài cây

Aloe vera, Ocinum sanctum, Azadirachta indica, Lantana camara, Clerodendron inerme, Alium sativum, Alium cepa, Cucurma longa với sự

phát triển của nấm gây hại đu đủ C gloeosporioides trên môi trường PDA đã

được tiến hành tại Khoa Nông nghiệp Đại học Dharwad Dịch chiết của các

cây được sử dụng ở 2 nồng độ 5 và 7,5% Dịch chiết của 2 loài cây Lantana

camara & Cucurma longa có hiệu quả ức chế cao nhất tương ứng 42,6% và

37,4% ở nồng độ 5% ; 45,55% và 40,7% ở nồng độ 7,5% (Vinod Tasiwal et al., 2009) [75]

Tại phòng thí nghiệm MMA labs của vùng Visakhapatnam Ấn Độ, trong tổng số dịch chiết của 42 loại cây được nghiên cứu khả năng ức chế với

nấm C graminicola trong khoảng nồng độ sử dụng từ 100 – 500mg/ml dịch chiết của loài Terminalia chebula có hiêụ quả ức chế cao nhất, khoảng cách

ức chế ở nồng độ 500mg/ml đạt xấp xỉ 20mm Trong các loài cây này 6 loài

cây Acalypha indica, Eichhornia crassipes, Gyanandropsis gyanandra,

Suaeda maritime, Tephrosia pumila và Tinospora cordifolia không có khả

năng ức chế sự phát triển của nấm C graminicola (Varaprasad Bobbarala et

al., 2009) [73] Tương tự tại Burkina Faso dịch chiết từ cây neem (

Azadirachta indica), cây sả (Cymbopogon citratus) và cây bạch đàn

(Eucalytus camadulensis) đã được thử nghiệm với nấm C graminicola gây

bệnh trên cây cao lương, dịch chiết từ cây sả có khả năng hạn chế sự phát triển của nấm ở nồng độ 30% (Somda, Leth, Sereme, 2007) [69]

Dịch chiết của 15 loài cây thuốc được chiết từ các dung môi khác nhau Methanol, Chloroform và Acetone được đánh giá khả năng ức chế sự phát

triển của nấm C gloeosporioides gây hại trên cây xoài tại phòng thí nghiệm

của khoa Khoa Sinh học trường đại học Putra, Malaixia Trên môi trường

PDA dịch chiết của cây Blechnum orientale ở tất cả các loại dung môi khác

nhau, trên tất cả các nồng độ thí nghiệm 0,01mg/ml; 0,10mg/ml; 1,00mg/ml

và 10,00mg/ml đều không ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và hình thành

bào tử của nấm C gloeosporioides trên môi trường PDA Trong dung môi Methanol, Chloroform dịch chiết của cây Alpinia galanga đạt hiệu quả ức chế cao nhất và sau đó là cây Piper betle Khoảng cách ức chế của dịch chiết bằng

Methanol ở nồng độ 1mg/ml đạt tương ứng là 55,8 và 51,9 mm Khoảng cách

ức chế của dịch chiết bằng Chloroform ở nồng độ 1mg/ml đạt tương ứng là

51,7 và 51,6 mm Khả năng hạn chế sự hình thành bào tử của nấm C

gloeosporioides trên môi trường cũng tương tự dịch chiết của cây Alpinia galanga đạt hiệu quả ức chế cao nhất và sau đó là dịch chiết của cây Piper betle trong cả 3 loại dung môi Methanol, Chloroform và Acetone Ở nồng độ

10mg/ml dịch chiết bằng cồn của cây Alpinia galanga ức chế hình thành bào

tử tới 68,89% nhưng với dịch chiết bằng Acetone ở nồng độ 0,01mg/ml khả năng hình thành bào tử của nấm đã giảm đi 62,68% Khả năng ức chế của các

dịch triết từ các cây trên cũng đã được tiếp tục nghiên cứu với nấm C capsici gây bệnh thán thư trên ớt cũng tương tự như với nấm C gloeosporioides hiệu quả ức chế đạt cao nhất là dịch chiết của cây A galanga và P betle nồng độ

ức chế thấp nhất (MIC) đạt tương ứng là 15mg/ml và 12mg/ml với dung môi Methanol, 17,5mg/ml và 17,5 mg/ml với dung môi Chloroform (Lucy Johnny, Umi Kalsm Yusut, Rosimah Nulit, 2010, 2011) [43];[44]

Ảnh hưởng của dịch chiết từ vỏ bưởi (Citrus garandis) tới sự phát triển của nấm C gloeosporioides trong môi trường PDA và ảnh hưởng tới sự nảy

mầm của bào tử nấm đã được nghiên cứu ở trường đại học Mae Fah Luang vùng Chiềng Rai Người ta nhận thấy rằng dịch chiết vỏ quả bưởi không ảnh hưởng tới sinh trưởng của tản nấm trong đĩa petri trên môi trường PDA trong

thí nghiệm trộn 10 µl dịch chiết vỏ quả bưởi ở các nồng độ pha loãng 25%, 50%, 75% và 100%, tuy nhiên dịch chiết vỏ bưởi đã ảnh hưởng đến sự nảy mầm của bào tử nấm ngay từ nồng độ pha loãng 25% (Matchina Naradisron, Ampai Ruenkun, 2009) [46]

Dịch chiết từ quả cây Jatropha curcas đã ức chế sự phát triển của nấm

C gloeosporioides trên môi trường PDA Dịch chiết từ các bộ phận khác

nhau của quả thì khả năng ức chế sự phát triển của nấm cũng khác nhau Dịch chiết từ hạt khả năng ức chế đạt cao nhất 78,8%, từ thịt quả đạt có khả năng

ức chế 72,1% và toàn bộ quả chỉ đạt 46,4% (Mukleur Rahman et al., 2011) [51]

Tại Mehico ảnh hưởng của dịch chiết từ lá, thân của 40 loài thực vật tới

sự nảy mầm của bào tử nấm C gloeosporioides gây hại trên cây đu đủ đã

được tiến hành tại phòng thí nghiệm của Viện Kỹ thuật quốc gia Morelos

Các dịch chiết này từ các cây Cestrum nocturnum, Annona cherimola,

Origanum majorana, Carica papaya, Citrus aurantium, Citrus aurantifolia, Bougainvillea spectabilis, Justicia spicigera, Petroselinum sativum, Parthenium hysterophorus, Schimus molle , Ricinus communis ức chế bào tử

nảy mầm trên 60% Trong các cây này dịch chiết từ 2 cây Cestrum

nocturnum, Annona cherimola có khả năng ức chế bào tử nảy mầm tốt nhất (

Hernandez Albiter et al., 2007) [38]

Hiệu quả ức chế với nấm C dematium gây hại trên đậu tương của các

dịch chiết từ tỏi, hành, gừng và cây neem đã được khảo nghiệm tại Bangladesh Thông qua 2 chỉ tiêu kích thước của tản nấm và khối lượng khô của sợi nấm nuôi cấy trên môi trường PDA trộn với dịch chiết ở các nồng độ dịch chiết 5%, 10% và 20% Kết quả thí nghiệm đã chỉ ra rằng nồng độ dịch chiết càng cao thì khả năng ức chế sự phát triển của nấm càng lớn Trong các loại dịch chiết được khảo nghiệm, dịch chiết từ tỏi có khả năng ức chế sự phát

triển của nấm C dematium lớn nhất tiếp theo là dịch chiết từ hành, dịch chiết

từ cây neem có khả năng ức chế sự phát triển của nấm C dematium nhỏ nhất

(Shovan, Bhuiyan, Bengum Pervez, 2008) [67]

Tại Srilanka các loại tinh dầu quế (Cinnamomum zeylanicum) và tinh dầu đinh hương (Syzygium aromaticum) đã được nghiên cứu để sử dụng phòng bệnh thối cuống quả chuối do nấm C.musae gây ra trong quá trình bảo quản Người ta đã xác định được nồng độ ức chế thấp nhất (MIC) với nấm C

musae của dầu đinh hương là 0,04%, của tinh dầu chiết xuất từ lá quế là

0,05% và tinh dầu chiết xuất từ vỏ quế là 0,03% (Ranasinghe, Jayawardena, Abeywickrama, 2002) [62] Các loại tinh dầu đinh hương, tinh dầu quế cũng

hạn chế sự nảy mầm của bào tử nấm C gloeosporioides ở nồng độ 0,1% và

0,04% sử dụng các tinh dầu này phun cho ớt ở đã làm giảm tỷ lệ bị nhiễm

bệnh do nấm C gloeosporioides và hạn chế khả năng hình thành bào tử trên

mặt vết bệnh (Yulia, Shipton, Coventry, 2006) [79]

1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

1.2.1 Những nghiên cứu về nấm Botrytis cinerea

Nấm Botrytis cinerea đã được phát hiện trên nhiều loại cây trồng ở các

vùng khác nhau của Việt Nam Nấm đã được phát hiện trên các cây cà chua, mận, đào, dâu tây v.v Nấm là một yếu tố hạn chế đến khả năng bảo quản và chuyên chở của các loại quả sau thu hoạch ở nước ta (Viện BVTV, 1975; Đặng Vũ Thị Thanh, Hà Minh Trung, 1999) [12]; [4]

Trong những năm gần đây nấm Botrytis cinerea đã phát sinh và gây hại

rất nghiêm trọng tại các vùng trồng cây ăn quả ôn đới Sa Pa - Lào Cai, Mộc Châu - Sơn La Vào tháng 2 - 8 năm 1998 nấm đã là đối tượng chính gây bệnh thối xám cho dâu tây và phúc bồn tử ở vùng Sa Pa và Hà Nội Gặp điều kiện mưa ẩm, trời âm u khóm dâu tây bị bệnh sẽ bị lụi Có những vườn đào tại Sa

Pa tỉ lệ quả bị nấm xâm nhiễm và gây hại lên tới 20% Nấm không những xâm

nhập và gây hại cho quả đào, mận trước thu hoạch mà còn tiếp tục gây thối

quả sau thu hoạch Nấm Botrytis cinerea đã trở thành yếu tố hạn chế cho việc

mở rộng diện tích trồng đào, dâu tây ở miền Bắc Việt Nam Nấm gây hiện tượng thối ngọn và thối quả cà chua Nấm đã làm giảm năng suất cà chua đáng kể và đồng thời nấm còn làm giảm khả năng bảo quản, chuyên chở của

cà chua Vào vụ xuân trong điều kiện mưa ẩm nhiệt độ không quá cao và cũng không quá lạnh, có những vườn cà chua số cây bị nhiễm bệnh lên tới 30% (Đặng Vũ Thị Thanh và nnk, 2000) [5]

Tại vùng Đồng bằng Sông Hồng (ĐBSH) và vùng Lào Cai, Lâm Đồng

đã phát hiện được 30 loại cây trong 16 họ thực vật đã bị nấm B cinerea xâm

nhiễm và gây hại Trong các cây ký chủ có 21 loại cây lần đầu tiên được xác nhận là ký chủ của nấm ở Việt Nam như thuốc lá, bí ngô, rau diếp, húng quế,

cà, chè v.v Nấm thường gây hại trên chồi non, lá, nụ hoa và quả non của các cây Gặp điều kiện ẩm ướt nấm thường làm cho các mô bệnh trở nên thối nhũn, trên bề mặt vết bệnh có 1 lớp mốc xám mọc Các nghiên cứu về các đặc

điểm sinh học của nấm cũng đã được tiến hành Các nguồn nấm B cinerea

phân lập từ hoa hồng, cà chua, cải bắp, lạc, đào đều không phát triển trên môi trường PDA có chứa các loại thuốc trừ nấm hoá học Iroprodin trong khoảng nồng độ 75 - 600 ppm, Cacbendazim trong khoảng nồng độ 125 - 1000 ppm

và Benomyl trong khoảng nồng độ 100 - 900 ppm (Đặng Vũ Thị Thanh, Vũ Duy Hiện, Mai Văn Quân, 2008) [6]

Để phòng trừ nấm B cinerea và phát triển bền vững sản xuất rau, hoa,

quả việc tìm ra những chất trừ nấm chiết tách từ thực vật an toàn với con người, thân thiện với môi trường là một điều cần thiết

1.2.2 Những nghiên cứu về nấm Colletotrichum spp

Ở Việt Nam qua các đợt điều tra bệnh hại cây trồng và các nghiên cứu

về bệnh cây đã được phát hiện 32 loài thuộc chi nấm Colletotrichum gây bệnh

trên 40 loại cây trồng ở các vùng sinh thái khác nhau (Viện BVTV 1975, Viện

BVTV 1999a; Đặng Vũ Thị Thanh, 2008) [12]; [14]; [7] Nấm C

gloeosporioides được phát hiện gây hại trên nhiều loại cây ăn quả, cây rau

màu ở Việt Nam

Tại các vùng trồng ớt của Việt Nam đã phát hiện được 3 loài nấm

Colletotrichum gây bệnh: C gloeosporioides, C nigrum và C capsici Sự gây

bệnh của các loài nấm khác nhau ở các vùng sinh thái và trên các giống là

khác nhau Nấm C nigrum gây hại nặng hơn trên ớt tại vùng Thừa Thiên Huế nhưng ở vùng Đồng bằng Sông Hồng nấm C capsici gây hại trên ớt nặng hơn Tại vùng Hà Nội nấm C gloeosporioides gây hại trên ớt năng hơn C

capsici Trồng các giống chống chịu, bón phân cân đối và sử dụng các thuốc

trừ nấm như Agrostim, Score và Ridomil có thể hạn chế được bệnh phát triển (Ngô Bích Hảo, 1992; Trần Thanh Tùng, 2002; Trần Thị Miên, 2008) [2]; [11]; [3]

1.2.3 Nghiên cứu sử dụng dịch chiết từ thực vật để phòng trừ nấm gây bệnh cây

Ngay từ thời xa xưa cha ông chúng ta đã biết dùng các dịch chiết từ thực vật để sử dụng vào nhiều lĩnh vực trong cuộc sống cũng như trừ sâu trong sản xuất nông nghiệp Tuy nhiên sử dụng các dịch chiết từ thực vật để phòng trừ các loại nấm gây bệnh cây thì chưa có nhiều ứng dụng Trong những năm gần đây một số nghiên cứu sử dụng dịch chiết thực vật để phòng trừ vi sinh vật gây bệnh cho cây trồng đã được thực hiện ở Việt Nam

Từ hạt cây neem (Azadirachta indica) nhập khẩu từ Ấn Độ về trồng tại

Ninh Thuận, Bình Thuận Quả neem được thu từ các cây 4, 5 tuổi, loại bỏ vỏ

và phần thịt quả, hạt được sấy khô ở 500C Từ 5 kg hạt chiết tách bằng ete dầu hoả thu được 970g cặn dầu sệt màu vàng nâu Hoà tan cặn dầu sệt trong Methanol thu được 230g cặn sệt màu vàng sậm Cặn tan trong Methanol cho

chạy sắc ký cột nhanh 2 lần với hệ dung môi là ete dầu hoả và chloroform với

độ phân cực tăng dần đã thu được 120mg tinh thể hình lăng trụ không màu Salanin Xác định khả năng gây độc tế bào người và đánh giá hoạt tính đối

kháng của salanin với các vi khuẩn Gram âm (E.coli, P aeruginisa) và vi khuẩn Gram dương (B subtilic, S aureus) và các nấm mốc A niger và F oysporum, nấm men C ablican và S cerevisiae Kết quả cho thấy Salanin

không có tác dụng gây độc tế bào người nhưng lại có hoạt tính kháng vi sinh

vật kiểm định đặc biệt kháng mạnh với các nấm A niger và C ablican (Vũ

Văn Độ, Nguyễn Tiến Thắng, Nguyễn Thị Minh, Nguyễn Ngọc Hạnh, 2006) [1]

Dịch chiết từ lá của cây Ageratum coryzoides (cỏ cứt lợn) đã được

nghiên cứu để phòng chống bệnh đạo ôn và bệnh khô vằn hại lúa tại trường đại học Cần Thơ (Phan Thị Hồng Thuý, Nguyễn Chơn Tình, Bào Thanh Loan, Trần Thị Thu Thuỷ, 2010) [9] Các tác giả đã nhận thấy rằng dịch chiết

của cây Ageratum coryzoides ở nồng độ sử dụng từ 1 - 6% không ảnh hưởng

đến tỷ lệ nảy mầm của các giống lúa Jasmine 85 và OM4498, dịch chiết có ảnh hưởng đến chiều dài rễ và chiều dài của mầm ở cả 2 giống Nồng độ dịch chiết càng cao chiều dài rễ và chiều dài mầm càng giảm ở giống Jasmine 85

Xử lý hạt giống lúa Jasmine 85 bằng dịch chiết của cỏ Ageratum coryzoides ở

các nồng độ 1,2 và 4% theo 2 phuơng pháp ngâm hạt vào dịch chiết hoặc chỉ

trộn hạt với dịch chiết đều có khả năng hạn chế sự xâm nhiễm của nấm

Pirycularia oryzae vào cây lúa sau khi lây bệnh nhân tạo cho cây Diện tích

vết bệnh trên lá lúa ở công thức xử lý hạt giống ở nồng độ 4% chỉ đạt 14,2% trong khi đó ở công thức đối chứng diện tích vết bệnh trên lá lúa đạt tới

36,2% Bằng cách phun dịch chiết cỏ Ageratum coryzoides trên lá lúa vào 25

và 35 ngày sau khi gieo các tác giả cũng nhận thấy rằng ở nồng độ dịch chiết 4% chiều dài của vết bệnh ở các công thức thí nghiệm đều giảm so với đối chứng

Đối với bệnh khô vằn do nấm Rhizoctonia solani gây ra dịch chiết của

cỏ Ageratum coryzoides đã làm giảm được sự phát triển của bệnh trên thân

cây lúa

Trong khuôn khổ dự án “Nâng cao chất lượng sau thu hoạch một số

loại quả ôn đới ở Việt Nam và Australia” Viện Bảo vệ thực vật đã hơp tác với

ACIAR đánh giá khả năng trừ nấm của các loại tinh dầu thực vật Thyme,

Oregano và Cinnamon đã được khảo nghiệm với các loại nấm B.cinerea,

M.fructicola và C gloeosporioides gây hại trên quả đào tại Viện BVTV Khả

năng ức chế của các loại tinh dầu Thyme (Thymus zygis), Oregano (Origanum

vulgare L.) và Cinnamon (Cinnamomum zeylanicum) tới sự phát triển của

nấm B cinerea đã được tiến hành trên môi trường PDA (Đặng Vũ Thị Thanh

& nnk., 2006) [30]

Khả năng ức chế sự phát triển của nấm B cinerea của Thyme và

Oregano ở nồng độ 250 và 500 ppm là không rõ ràng Ở nồng độ 1000 ppm

cả 2 loại tinh dầu này đều có khả năng ức chế sự phát triển của nấm

B.cinerea Tinh dầu Cinnamon có khả năng ức chế nấm B cinerea phát triển

từ nồng độ 250 ppm trở đi

Khả năng ức chế bào tử nấm Botrytis cinerea nảy mầm của các tinh dầu

ở các mức nồng độ thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện nhiệt độ 240C Các loại tinh dầu đã làm giảm khả năng nảy mầm của bào tử nấm Nồng độ tinh dầu càng cao khả năng nảy mầm của bào tử nấm càng giảm Sau 12 giờ trong tinh dầu Thyme ở nồng độ 1000 ppm bào tử nấm không nảy mầm, ở nồng độ 250 ppm có 34,2% bào tử nấm nảy mầm Sau 18 giờ ở nồng độ 250 ppm bào tử nấm nảy mầm được 91,3% và ở nồng độ 1000 ppm bào tử nấm đã nảy mầm được 25,8%

Khả năng ức chế của tinh dầu Oregano với sự nảy mầm của bào tử nấm

B cinerea lớn hơn so với Thyme sau 18 giờ 73,8% bào tử nảy mầm ở nồng

độ 250 ppm và 5,0% ở nồng độ 1000 ppm

Nấm B cinerea không nảy mầm trong dung dịch chứa tinh dầu

Cinnamon trong tất cả các nồng độ nghiên cứu

Tất cả các dầu Thyme, Oregano, Cinnamon đều có khả năng úc chế sự

phát triển của nấm M fructicola trên môi trường Sau 2 ngày nấm có thể mọc

trên môi trường chứa dầu Thyme 250 ppm và 500ppm, môi trường chứa Oregano 250 ppm Sau 10 ngày kích thước của khuẩn lạc đạt 24,6 mm và 26,6 mm trong môi trường có chứa Thyme 250 ppm và 500 ppm Kích thước của khuẩn lạc trong môi trường chứa Oregano đã có sự sai khác, ở nồng độ

250 ppm kích thước của khuẩn lạc là 27,7 mm, ở nồng độ 500 ppm kích thước của khuẩn lạc là 11,6 mm Trong công thức đối chứng sau 10 ngày kích thước của khuẩn lạc là 84,1 mm Cả 2 tinh dầu Thyme và Oregano đều ức chế

sự phát triển của nấm M fructicola ở nồng độ 1000 ppm Tinh dầu Cinnamon

có khả năng ức chế rất cao với sự phát triển của nấm M fructicola Nấm

không phát triển được trên tất cả các nồng độ thí nghiệm

Các tinh dầu Thyme và Oregano không những không ức chế sự phát

triển của nấm C gloeosporiodes ở các nồng độ 250 ppm và 500 ppm mà còn

kích thích nấm phát triển hơn So với đối chứng tản nấm mọc trên các môi trường chứa tinh dầu đều dày hơn, ở nồng độ 1000 ppm nấm mọc chậm hơn

so với đối chứng nhưng tản nấm vẫn dày hơn

Cũng giống như nấm M fructicola và B cinerea sự phát triển của nấm

C gloeosporiodes đã bị ức chế hoàn toàn và không phát triển trong tất cả các

nồng độ thử nghiệm của tinh dầu Cinnamon

Song song với các nghiên cứu trên từ năm 2005 - 2008 Viện Bảo vệ thực vật đã kết hợp chặt chẽ giữa Phòng nghiên cứu hoá học BVTV - Viện Hoá học nghiên cứu chiết xuất và đánh giá khả năng trừ bệnh của một số dịch

chiết thực vật Kết quả cho thấy hoạt chất Plumbagin chiết tách từ cây Bạch

hoa xà (Plumbago zeylanica L) được dùng để phòng trừ bệnh chết cây địa lan

do vi khuẩn Erwinia carotovora gây ra trong nhà lưới của Viện Bảo vệ thực

vật Kết quả khảo nghiệm trong nhà lưới đã chỉ ra rằng Plumbagin đã hạn chế được bệnh phát triển so với đối chứng không phun thuốc từ 45 - 57% Hiệu quả này đạt xấp xỉ với hiệu quả phòng trừ bệnh bằng Agromycin (Nguyễn Thanh Trà, Đặng Vũ Thị Thanh, Lưu Tham Mưu, Dương Anh Tuấn, 2008) [10]

Trong năm 2007 Bộ môn Chẩn đoán Giám định Viện Bảo vệ thực vật

đã tiến hành đánh giá khả năng phòng trừ nấm B.cinerea của 45 hợp chất

chiết xuất từ 29 loài thực vật do bộ môn Hóa bảo vệ thực vật của Viện Hóa học cung cấp Trong môi trường nuôi cấy 45 hợp chất đã được đánh giá có 18

hợp chất có khả năng ức chế nấm B cinerea phát triển hoàn toàn và 16 hợp

chất có khả năng ức chế tản nấm phát triển từ 50 - 80% Trong tổng số 29 loại cây được khảo nghiệm hợp chất sinh học chiết xuất từ 12 loại cây thuộc

các họ Lauraceae, Polygalaceae (Polygonum hydropiper), Rhamaceae, Melastomaceae (Cleodendrum godefroyi), đã có khả năng ức chế hoàn toàn các nấm B cinerea và C gloeosporioides phát triển trên môi trường Trong

các hợp chất chiết xuất của các cây này đã phát hiện thấy thành phần chính trong hợp chất là các chất thuộc lớp chất Flavonoit và lớp chất Phenolic Đồng thời kết quả khảo nghiệm cũng chỉ ra hợp chất sinh học chiết xuất theo các phương pháp khác nhau hay chiết xuất từ các bộ phận khác nhau của cây khả năng ức chế nấm của hợp chất cũng sẽ thay đổi

Các nghiên cứu sử dụng các hoạt chất sinh học chiết xuất từ thực vât có khả năng kháng nấm gây bệnh trên cây trồng ở nước ta hầu như chưa có Kết quả thí nghiệm này đã gợi mở khả năng ứng dụng các hoạt chất sinh học của thực vật để phòng trừ các nấm gây bệnh cây

CHƯƠNG II VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

- Nấm B cinerea, C gloeosporioides phân lập trên cà chua và ớt

- Các loài cây được thu thập ở các địa phương Hà Nội, Điện Biên, Lào Cai, Vĩnh Phúc

- Các mẫu dịch chiết đã chiết tách được từ các loài cây

- Giống cà chua, ớt, hành

- Môi trường nuôi cấy nấm PDA

- Dung môi: Methanol, Ethanol, Dimethyl sulfoxide

- Tweel 80

- Dụng cụ nghiên cứu:

+ Máy nghiền Electrolux EBR 2501

+ Tủ sấy, tủ định ôn, buồng cấy

+ Pipet: 10 -20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl

+ Cân điện tử, bể siêu âm

+ Ống đong, bình tam giác, đĩa Petri, phễu lọc, giấy lọc, v.v

+ Chậu nhựa để gieo và trồng cây thí nghiệm

+ Các dụng cụ khác: găng tay cao su, túi nhựa, v.v

2.2 Nội dung nghiên cứu

1 Thu thập tuyển chọn các loài thực vật có chứa các hoạt chất sinh học

có khả năng ức chế nấm gây bệnh thối xám và bệnh thán thư

2 Chiết tách các hoạt chất sinh học từ thực vật có khả năng ức chế nấm gây bệnh thối xám và bệnh thán thư

3 Đánh giá khả năng ức chế sự phát triển của nấm B cinerea, C

gloeosporioides của các dịch chiết trong phòng thí nghiệm

4 Đánh giá hiệu lực phòng trừ nấm B cinerea và C gloeosporioides

gây bệnh trên rau quả của các dịch chiết và ảnh hưởng của chúng tới cây trồng trong nhà lưới

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Thu thập tuyển chọn các loài thực vật có chứa các hoạt chất sinh học có khả năng ức chế nấm gây bệnh thối xám và bệnh thán thư

Tìm hiểu tài liệu về các loài cây có chứa các hoạt chất sinh học có khả năng kháng nấm Xác định các loài cây có ở Việt Nam tiến hành thu thập toàn

bộ cây hay từng bộ phận của cây theo phương pháp thu mẫu thực vật của Viện BVTV - Phương pháp nghiên cứu bảo vệ thực vật tập 1 NXB Nông nghiệp Hà Nội (1997) [13]

2.3.2 Chiết tách các hoạt chất sinh học từ thực vật có khả năng ức chế nấm gây bệnh thối xám và bệnh thán thư

Phương pháp chiết tách các hoạt chất sinh học có khả năng ức chế nấm gây bệnh thối xám và bệnh thán thư dựa theo phương pháp của Gyung Ja Choi và cs (2004) [27], Viện Dược liệu (2008) [15], Hồ Viết Quý (2006) [16]

Các cây nguyên liệu sau khi thu hái được tiến hành phân loại theo từng

bộ phận sau đó phơi hoặc sấy khô trong phòng thí nghiệm Các mẫu cây được cân xác định trọng lượng, các mẫu này được nghiền nhỏ bằng máy nghiền Electrolux EBR 2501 trong 1 phút, sau đó các mẫu nghiền được phân vào bình tam giác 1000 ml và đổ dung môi MeOH ngập mẫu, tiến hành chiết trong bể siêu âm trong 45 phút sau đó lọc phần dịch bằng giấy lọc Phần bã còn lại được đổ thêm dung môi MeOH vào chiết siêu âm tiếp, quá trình này được lặp lại 2 lần Tiến hành cô đặc dịch chiết theo phương pháp bay hơi thu được dịch chiết, các dịch chiết này được cân trọng lượng sau đó hòa tan trong

2 ml Dimethyl sulfoxide (DMSO) để phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo

2.3.3 Đánh giá khả năng ức nấm B cinerea, C gloeosporioides của các

dịch chiết từ thực vật trong phòng thí nghiệm

2.3.3.1 Xác định các dịch chiết có khả năng ức chế nấm B cinerea và C gloeosporioides trên môi trường

Các nguồn nấm B cinerea, C gloeosporioides được phân lập từ cà chua

và ớt theo phương pháp nuôi cấy đơn bào tử, các nấm này được nhân trên môi trường PDA một tuần trước thí nghiệm

Trộn các dịch chiết từ thực vật vào môi trường PDA đổ vào đĩa petri 90

cm Khả năng ức chế của các dịch chiết được đánh giá ở nồng độ 2000 ppm

Cấy tản nấm B cinerea hoặc C gloeosporioides có kích thước 4 mm

vào tâm đĩa môi trường

Công thức đối chứng cấy trên môi trường PDA thay các dich chiết bằng nước cất

Mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần 2 đĩa petri

Nấm B.cinerea được đặt ở nhiệt độ nhỏ hơn 240C, nấm C

gloeosporioides được đặt ở điều kiện nhiệt độ 280C

Theo dõi sự phát triển của nấm, đo đường kính tản nấm sau 3, 5 và 7 ngày

Đánh giá khả năng ức chế dựa theo công thức Abbott

C - T KNƯC % = - x 100

C Trong đó:

KNƯC %: Khả năng ức chế của dịch chiết với nấm T: Đường kính tản nấm ở công thức thí nghiệm C: Đường kính tản nấm ở công thức đối chứng

2.3.3.2 Xác định khả năng ức chế nấm B cinerea và C gloeosporioides của các dịch chiết có triển vọng trên môi trường ở các nồng độ

Thí nghiệm gồm 4 công thức, 3 lần nhắc lại, mỗi lần 2 đĩa petri

+ Công thức 1: nồng độ dịch chiết 3500 ppm

+ Công thức 2: nồng độ dịch chiết 4500 ppm

+ Công thức 3: nồng độ dịch chiết 5500 ppm

+ Công thức 4: Đối chứng (thay dịch chiết bằng nước cất)

Dịch chiết được trộn vào 20ml môi trường PDA đổ vào đĩa Petri 90 cm

Cấy tản nấm B cinerea hoặc C gloeosporioides có kích thước 4 mm

vào tâm đĩa môi trường

Nấm B cinerea được đặt ở nhiệt độ nhỏ hơn 240C, nấm C

gloeosporioides được đặt ở điều kiện nhiệt độ 280C

Theo dõi sự phát triển của nấm, đo đường kính tản nấm sau 3, 5 và 7 ngày

Đánh giá khả năng ức chế dựa theo công thức Abbott

C - T KNƯC % = - x 100

C Trong đó:

KNƯC %: Khả năng ức chế của dịch chiết với nấm T: Đường kính tản nấm ở công thức thí nghiệm C: Đường kính tản nấm ở công thức đối chứng

2.3.4 Đánh giá hiệu lực phòng trừ nấm B cinerea, C gloeosporioides gây

bệnh trên rau quả của các dịch chiết và ảnh hưởng của chúng tới cây trồng trong nhà lưới

2.3.4.1 Đánh giá hiệu lực phòng trừ nấm B cinerea, C gloeosporioides gây bệnh trên rau quả của các dịch chiết

Thiết kế thí nghiệm kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD) với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc 10 cây

Thí nghiệm tiến hành trong chậu vại

Cây thí nghiệm: Cà chua, ớt

Các nguồn nấm: B cinerea, C gloeosporiodes phân lập theo phương

pháp đơn bào tử trên môi trường PDA từ cà chua, ơt bị nhiễm bệnh

Các cây thí nghiệm được trồng trong chậu vại và lây bệnh nhân tạo bằng các nguồn nấm đã phân lập được Dịch bào tử lây bệnh đạt mức 106 bào tử/ml phun ướt cả toàn bộ cây

Nồng độ các dịch chiết kháng nấm sử dụng trong các công thức thí nghiệm 2500 ppm - 6000 ppm

Thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp

- Phun dịch bào tử sau 48 giờ phun các dịch chiết kháng nấm

- Đối chứng 1: Lây bệnh, phun thuốc trừ nấm

- Đối chúng 2: Lây bệnh, không phun dịch chiết

Chỉ tiêu theo dõi

- Tính tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh theo công thức

A TLB(%) =

B

x 100 Trong đó:

TLB(%): Tỷ lệ bệnh A: Tổng số lá (quả) bị bệnh B: Tổng số lá (quả) điều tra

Σ (ni x vi)CSB(%) =

k x n

x 100 Trong đó: