thiết kế vector mang cấu trúc gen gmexp1 liên quan đến sự phát triển bộ rễ phục vụ chuyển gen ở cây đậu tương

Theo hướng nghiên cứu này, Nguyễn Thị Thuý Hường và đtg 2009 đã phân lập, tạo đột biến điểm ở gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn và thử nghiệm chuyển vào cây đậu tương Việt Nam [3]..

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN ĐỨC HÀO

THIẾT KẾ VECTOR MANG CẤU TRÚC GEN GmEXP1

LIÊN QUAN ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ PHỤC VỤ

CHUYỂN GEN Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG

 Glycine max (L.) Merrill 

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2013

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN ĐỨC HÀO

THIẾT KẾ VECTOR MANG CẤU TRÚC GEN GmEXP1

LIÊN QUAN ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ PHỤC VỤ

CHUYỂN GEN Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG

 Glycine max (L.) Merrill 

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 60.42.01.21

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Chu Hoàng Mậu

Thái Nguyên - 2013

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các

số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa có ai công bố trong một công trình nào khác Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

Nguyễn Đức Hào

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô, cán bộ Bộ môn Di truyền&Sinh học hiện đại, khoa Sinh-KTNN, trường Đại học Sư phạm –Đại học Thái Nguyên, cảm ơn các cán bộ phòng Công nghệ tế bào thực vật, Phòng thí nghiệm trọng điểm quốc gia về công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện các thí nghiệm của đề tài

Tôi cũng xin cảm ơn Ban giám hiệu trường THPT Phù Lưu, Tuyên Quang đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong học tập và hoàn thành khoá học

Tôi cũng xin bày tỏ lời cảm ơn đến gia đình, bè bạn đã động viên khuyến khích giúp đỡ tôi trong quá trình làm luận văn

Tác giả luận văn

Nguyễn Đức Hào

MỤC LỤC

Trang Trang bìa phụ

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục bảng v

Danh mục hình vi

Các ký hiệu dùng trong luận văn vi

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Chọn giống đậu tương theo định hướng nâng cao khả năng chịu hạn 3

1.1.1 Chọn giống đậu tương chịu hạn bằng đột biến thực nghiệm 4

1.1.2 Chọn dòng đậu tương chịu hạn bằng công nghệ tế bào thực vật 5

1.1.3 Chọn dòng đậu tương chịu hạn bằng kỹ thuật chuyển gen 6

1.2 Gen liên quan đến tính chịu hạn và gen GmEXP1 ở cây đậu tương 7

1.2.1 Các gen liên quan đến tính chịu hạn của cây đậu tương 7

1.2.2 Gen GmEXP1 và protein EXP1 ở cây đậu tương 10

1.2.3 Vector chuyển gen ở thực vật 11

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Vật liệu và thiết bị 14

2.1.1 Vật liệu 14

2.1.2 Hoá chất và thiết bị 15

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 16

2.2 Phương pháp nghiên cứu 16

2.2.1 Phân lập gen 16

2.2.2 Phương pháp chuyển gen vào cây thuốc lá 23

2.3 Phương pháp thiết kế vector 25

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

3.1 Phân lập gen GmEXP1 bằng kỹ thuật RT-PCR 27

3.1.1 Nhân bản đoạn mã hoá của gen GmEXP1 27

3.1.2 Tách dòng đoạn mã hoá (cDNA) của gen GmEXP1 27

3.1.3 Kiểm tra plasmid trước khi đọc trình tự 33

3.1.4 Kết quả đọc trình tự đoạn mã hoá của gen GmEXP1 34

3.2.2 Kết quả cắt mở vòng plasmid pRTRA7/3 40

3.2.3 Tạo plasmid pRTRA7/3 tái tổ hợp mang gen GmEXP1 41

3.2.4 Kết quả cắt plasmid pRTRA7/3 tái tổ hợp bằng HindIII 42

3.2.5 Kết quả cắt plasmid pCB301 bằng HindIII 43

3.2.6 Tạo vector chuyển gen pCB301 mang cấu trúc GmEXP1 44

3.2.7 Kết quả tạo dòng vi khuẩn A tumefaciens mang cấu trúc gen GmEXP1 45

3.3 Kiểm tra hoạt động của vector mang cấu trúc GmEXP1 trên cây thuốc lá mô hình 47

3.3.1 Kết quả chuyển cấu trúc GmEXP1 vào cây thuốc lá 47

3.3.2 Kết quả kiểm tra cây thuốc lá mang gen GmEXP1 49

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Sản xuất đậu tương ở Việt Nam từ 2007 đến 2013 3

Bảng 2.1 Thành phần cho phản ứng tổng hợp cDNA 17

Bảng 2.2 Thành phần của phản ứng PCR 18

Bảng 2.3 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR 18

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng colony – PCR 20

Bảng 2.5 Chu trình nhiệt của phản ứng colony – PCR 20

Bảng 2.6 Thành phần gắn gen GmEXP1 vào vector tách dòng pBT 21

Bảng 2.7 Thành phần hóa chất tách chiết plasmid 22

Bảng 2.8 Thành phần dung dịch đệm tách chiết DNA 24

Bảng 3.1 Kết quả tạo cây thuốc lá chuyển gen GmEXP1 48

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Ảnh hạt của giống đậu tương SL1 14

Hình 2.2 Sơ đồ cấu trúc các vector sử dụng trong nghiên cứu 15

Hình 3.1 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân đoạn mã hoá gen GmEXP1 28

Hình 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm thôi gel đoạn mã hoá của gen GmEXP1 29

Hình 3.3 Ảnh khuẩn lạc 31

Hình 3.4 Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR 32

Hình 3.5 Hình ảnh điện di kiểm tra plasmid tái tổ hợp 33

Hình 3.6 Hình ảnh điện di kiểm tra plasmid trước khi đọc trình tự 34

Hình 3.7 Sơ đồ so sánh trình tự đoạn mã hoá gen GmEXP1 của giống đậu tương SL1 và AF516879 36

Hình 3.8 Sơ đồ so sánh trình tự amino acid của protein EXP1 giữa giống SL1 và AF516879 37

Hình 3.9 Ảnh điện di sản phẩm cắt pBT/EXP1 38

Hình 3.10 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt pRTRA7/3 bằng NotI + NcoI 40

Hình 3.11 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt pRTRA7/3 bằng HindIII 42

Hình 3.12 Ảnh cắt pCB301 bằng HindIII 43

Hình 3.13 Hình điện di sản phẩm colony- PCR 45

Hình 3.14 Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR 47

Hình 3.15 Hình ảnh minh họa giai đoạn chuyển gen vào cây thuốc lá 49

Hình 3.16 Ảnh điện di kiểm tra DNA tổng số tách từ lá cây thuốc lá 50

Hình 3.17 Hình điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen GmEXP1 từ thuốc lá 51

CÁC KÝ HIỆU DÙNG TRONG LUẬN VĂN

BAP 6- benzyl amino purine

bp Base pair

DDT Dichloro-diphenyl-trichloroethane

DNA Deoxyribonucleic Acid

dNTP Deoxy Nucleotide Triphosphate

EDTA Ethylene diamine tetra- acetic acid

đtg Đồng tác giả

E coli Escherichia coli

GM Germination medium - Môi trường nảy mầm của hạt

GMO Genetically modified organism - Sinh vật biến đổi gen GMP Genetically modified plant - Thực vật biến đổi gen

HSG Heat Shock Granules

HSP Heat Shock protein - Protein sốc nhiệt

IBA Indole 3 - butyric acid

IPTG Isopopyl -D-1 thiogalactopyranoside

kb Kilo base

LB Luria Bertani

MS Môi trường nuôi cấy mô cơ bản theo Murashige và Skoog MSI Dung dịch I (muối đa lượng) dùng để pha môi trường MS MSII Dung dịch II (muối đa lượng) dùng để pha môi trường MS MSIII Dung dịch III (sắt) dùng để pha môi trường MS

MSIV Dung dịch IV (muối vi lượng) dùng để pha môi trường MS MSV Dung dịch V (vitamin) dùng để pha môi trường MS

NST Nhiễm sắc thể

PCR Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi

RM Rooting medium - Môi trường ra rễ

TAE Tris - Acetate - EDTA

Taq Thermus aquaticus

v/p vòng / phút

X-gal 5-bromo-4-chloro-indolyl-β-D-galactopyranoside

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là loại cây trồng thuộc họ Đậu, là

cây trồng ngắn ngày Hạt đậu tương có giá trị dinh dưỡng và có giá trị kinh tế cao, với tỉ lệ 30% - 56% protein; 12% - 25% lipid; 36% - 40% hydrat cacbon Ngoài ra hạt đậu tương còn chứa các loại amino acid không thay thế như: cystein, lysine, triptophan, leucine, methyonine Từ hạt đậu tương người ta có thể chế biến ra khoảng 600 sản phẩm khác nhau bằng các phương pháp cổ truyền, thủ công hoặc hiện đại Do nguồn nguyên liệu trong nước chưa đáp ứng được yêu cầu của ngành công nghiệp chế biến, cho nên nước ta vẫn phải

nhập đậu tương từ một số quốc gia trên thế giới

Mặt khác luân canh cây đậu tương với cây ngũ cốc sẽ có tác dụng phá

vỡ sự độc canh của cây lương thực, cắt đứt sự lây lan nguồn bệnh ở đất từ vụ trước sang vụ sau, giảm thiệt hại do sâu bệnh gây ra Rễ đậu tương là nơi khu trú của vi khuẩn cộng sinh tiết enzym nitrogenase có khả năng cố định nitơ tự

do cung cấp cho cây, đồng thời góp phần cải tạo đất

Do biến đổi khí hậu, hạn hán nắng nóng kéo dài đã tác động xấu đến sinh trưởng và phát triển của cây đậu tương Chính vì vậy nghiên cứu tuyển chọn giống đậu tương chịu hạn và nâng cao khả năng chịu hạn của cây đậu tương là rất cần thiết Theo hướng nghiên cứu này, Nguyễn Thị Thuý Hường

và đtg (2009) đã phân lập, tạo đột biến điểm ở gen P5CS liên quan đến tính

chịu hạn và thử nghiệm chuyển vào cây đậu tương Việt Nam [3] Năm 2003,

Lee và đtg đã phân lập được gen GmEXP1 mã hoá protein expansin và

protein expansin được xem là một trong số các nhân tố chính làm dãn thành tế bào thực vật bằng cách làm kéo giãn các liên kết polymer tại vùng sinh trưởng

của mô [23] Phát hiện trên đã cung cấp dữ liệu quan trọng cho hướng nghiên cứu làm tăng diện tích tiếp xúc của rễ với giá thể để nâng cao hiệu quả lấy nước của hệ rễ cây đậu tương

Chính vì vậy ý tưởng nghiên cứu xác định biện pháp làm tăng cường khả năng hút nước của hệ rễ theo cách tiếp cận tăng áp suất thẩm thấu và diện tích tiếp xúc của hệ rễ phục vụ tạo dòng đậu tương chuyển gen có hệ rễ phát

triển, chúng tôi đã lựa chọn và tiến hành đề tài luận văn là: “Thiết kế vector

mang cấu trúc gen GmEXP1 liên quan đến sự phát triển bộ rễ phục vụ chuyển gen ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill)”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Tạo được vector chuyển gen mang cấu trúc GmEXP1 liên quan đến sự

phát triển bộ rễ đậu tương và chuyển vào cây thuốc lá

3 Nội dung nghiên cứu

3.1 Tách chiết RNA tổng số và tạo cDNA từ mRNA;

3.2 Nhân gen GmEXP1 từ cDNA, tách dòng và xác định trình tự đoạn mã hoá của gen GmEXP1 phân lập từ cây đậu tương;

3.3 Tạo vector chuyển gen mang cấu trúc GmEXP1 và biến nạp vector chuyển gen mang cấu trúc GmEXP1 vào vi khuẩn Agrobacterium

tumefaciens

3.4 Chuyển gen GmEXP1 vào cây thuốc lá Nicotiana tabacum K326 và kiểm

tra sự có mặt của gen chuyển bằng PCR

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Chọn giống đậu tương theo định hướng nâng cao khả năng chịu hạn

Hạn tác động lên cây theo hai hướng chính làm tăng nhiệt độ cây và gây mất nước trong cây Nước là môi trường để các phản ứng trao đổi chất xảy ra trong tế bào Sự thiếu hụt nước ảnh hưởng xấu đến quá trình sinh trưởng và phát triển của cây, nếu thiếu nước nhẹ sẽ làm giảm tốc độ sinh trưởng, thiếu nước trầm trọng sẽ làm biến đổi hệ keo nguyên sinh chất làm tăng cường quá trình già hóa tế bào khi bị khô kiệt nước, nguyên sinh chất bị đứt vỡ cơ học dẫn đến tế bào, mô bị tổn thương và chết Nói chung hạn hán ảnh hưởng đến mọi giai đoạn sinh trưởng của cây, đặc biệt với cây đậu tương thì giai đoạn tạo hạt đặc biệt cần nước vì giai đoạn này quá trình tổng hợp protein diễn ra mạnh do đó nước cung cấp cho cây lúc này có ý nghĩa lớn quyết định năng suất Trước thực tế trên việc xác định các hướng nghiên cứu tăng cường tính chịu hạn của cây trồng là mục tiêu tạo giống chống chịu được quan tâm Trong những năm gần đây do ảnh hưởng của biến đổi khí hậu toàn cầu cũng như hạn hán đã làm ảnh hưởng tới tình hình phát triển cây đậu tương ở Việt Nam Từ năm 2007 đến nay, diện tích trồng đậu tương có sự biến động và có

xu hướng tăng vào năm 2012, 2013, nhưng năng suất và sản lượng đậu tương gần như không tăng đáng kể (Bảng 1.1)

Bảng 1.1 Sản xuất đậu tương ở Việt Nam từ 2007 đến 2013

1.1.1 Chọn giống đậu tương chịu hạn bằng đột biến thực nghiệm

Dựa vào nguồn tác động mà người ta phân ra thành đột biến tự nhiên hay đột biến nhân tạo (Kodym và đtg, 2003) [22], dựa vào tính chất biến đổi cấu trúc của cơ sở vật chất di truyền mà người ta chia đột biến thành đột biến gen hay đột biến nhiễm sắc thể Đột biến tự nhiên phát sinh với tần số thấp,

để khắc phục nhược điểm này người ta đã sử dụng các tác nhân gây đột biến (tác nhân vật lí, hóa học) nhằm làm tăng tần số lên hàng 100.000 lần để tạo nguyên liệu cho quá trình chọn lọc (Kodym và đtg, 2003) [22] Nghiên cứu cải tiến giống cây trồng bằng phương pháp đột biến thực nghiệm ra đời từ những năm đầu của thế kỷ 20, nhưng chỉ 30 năm gần đây mới phát triển mạnh

và có hiệu quả trong lĩnh vực tăng năng suất và phẩm chất giống cây trồng, góp phần không nhỏ vào đời sống con người Đối với cây đậu tương tại Việt Nam, Trần Đình Long và đtg (1995) [4] Tạo giống đột biến M103, ra từ giống đậu tương V70 bằng cách sử dụng phương pháp xử lý đột biến điểm bằng ethilenimin nồng độ 0,01% Sau đó, giống này đã được chọn thuần lại, khảo nghiệm và công nhận là giống quốc gia, trồng được cả 3 vụ trong năm nhưng thích hợp nhất là vụ hè Sau 7 năm khảo nghiệm liên tục (1998-2004) tại nhiều vùng sinh thái khác nhau, các tác giả Viện Di truyền nông nghiệp đã sản xuất thành công giống đậu tương chịu hạn mới – DT96 có khả năng chịu hạn tốt và năng suất cao Hiện nay giống đậu tương này đang được trồng phổ biến ở nhiều vùng canh tác và được Bộ NN&PTNN công nhận chính thức là giống quốc gia vào tháng 7/2004 Chu Hoàng Mậu (2001) [6] đã sử dụng tia gamma, hóa chất NMU, EI với các liều lượng khác nhau đã tạo được các đột biến về hình thái, sinh lý cũng như đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể, từ 60 dòng đột biến đậu tương đánh giá và chọn lọc qua 5 thế hệ đã thu được 4 dòng đậu tương với những đặc tính nông sinh học ưu việt như chín sớm (dòng ML59, ML 61), có khả năng chịu hạn (dòng ML48, ML61)

1.1.2 Chọn dòng đậu tương chịu hạn bằng công nghệ tế bào thực vật

Cơ sở khoa học đầu tiên của chọn dòng tế bào thực vật là tính toàn năng của tế bào Mỗi một tế bào bất kỳ của cơ thể thực vật đều mang đầy đủ thông tin di truyền để phát triển thành một cơ thể hoàn thiện Cơ sở thứ hai là môt hoặc quần thể tế bào muôi cấy bao gồm một số lượng lớn các tế bào không đồng nhất Vì thế quần thể tế bào nuôi cấy có thể xem như quần thể thực vật mà ở đó cũng diễn ra những thay đổi về kiểu gen, kiểu hình và tuổi Khi những tế bào được tái sinh thành cây sẽ thể hiện thay đổi đó ở mức độ cơ thể Thậm chí có những quần thể tế bào phát triển từ một tế bào ban đầu nhưng trong suốt quá trình sinh trưởng và phát triển tế bào đến khi hình thành một cơ thể hoàn chỉnh có thể diễn ra nhiều thay đổi di truyền do ảnh hưởng của các yếu tố môi trường nuôi cấy, đặc biệt là các chất điều hòa sinh trưởng

Tế bào nuôi cấy in vitro có tỉ lệ biến dị di truyền lớn vì thế có thể chọn được

các cá thể đột biến nhanh hơn và hiệu quả hơn so với các phương pháp chọn giống thông thường khác áp dụng trên cây nguyên vẹn Kỹ thuật nuôi cấy mô

và tế bào còn cho phép làm giảm đáng kể thời gian cần thiết để chọn được những cá thể mang tính trạng mong muốn (Nguyễn Đức Thành, 2000) [8]

Hệ thống nuôi cấy sử dụng trong chọn dòng tế bào soma bao gồm nuôi cấy mô sẹo, nuôi cất tế bào huyền phù và nuôi cấy tế bào trần Hạn chế lớn nhất trong chọn dòng bằng nuôi cấy mô sẹo là chọn lọc không triệt

để do kích thước khối mô lớn và không đồng nhất Để đạt được hiệu quả cao người ta phải sử dụng các khối mô có kích thức nhỏ và đều nhau, kích thước thường dùng các khối mô sẹo có đường kính 1- 3nm để xử lý và chọn dòng chống chịu (Lê Trần Bình và đtg, 1998) [1]; Đinh Thị Phòng,

2001 [7]; Dix và đtg, 1986 [17]

Người ta đã sử dụng các phương thức chọn dòng tế bào như chọn trực tiếp, chọn gián tiếp và chọn tổng thể Hướng nghiên cứu chọn dòng tế bào chống chịu ở thực vật đã thu được nhiều thành tựu, trong đó đã có sự thành công tạo ra dòng cây chịu hạn, chịu lạnh, chịu nóng

1.1.3 Chọn dòng đậu tương chịu hạn bằng kỹ thuật chuyển gen

Có nhiều phương pháp chuyển gen ở thực vật đã được nghiên cứu và thành công trên nhiều đối tượng giống cây trồng như: chuyển gen thông qua

Agrobacterium tumefacins (A tumefaciens), chuyển gen trực tiếp bằng hóa

chất, xung điện, súng bắn gen, chuyển gen bằng vi tiêm, chuyển gen qua ống phấn, chuyển gen bằng ủ dung dịch hạt khô với dung dịch DNA … Nhưng hai phương pháp chuyển gen thành công nhất là chuyển gen trực tiếp bằng

súng bắn gen và chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn A tumefaciens

Những nghiên cứu về đậu tương chuyển gen trên thế giới chủ yếu tập trung vào các nhóm tính trạng, như tính kháng thuốc diệt cỏ, tính kháng sâu bệnh, tính chịu hạn hay việc tạo ra các giống đậu tương có hàm lượng các amino acid chứa lưu huỳnh cao, cải thiện chất lượng protein của đậu tương (Zeng P và đtg, 2004) [16] Với rất nhiều nghiên cứu này cùng những kết quả đã đạt được, đậu tương trở thành một trong những cây trồng biến đổi gen được thương mại hóa mạnh nhất Vào năm 1997, cây đậu tương kháng thuốc diệt cỏ glufosinate và gen tăng hàm lượng axit oleic lần đầu tiên được thương mại hóa Trong số diện tích đậu tương chuyển gen thì 75% được trồng ở Bắc Mỹ Riêng ở Mỹ, diện tích đậu tương kháng thuốc diệt cỏ chiếm 85% diện tích trồng cây đậu tương Còn ở châu Á, đậu tương kháng thuốc diệt cỏ chiếm 6% tổng sản phẩm cây trồng biến đổi gen Năm

2004, đậu tương kháng thuốc diệt cỏ đạt đến diện tích 48,4 triệu ha chiếm 60% diện tích cây trồng biến đổi gen

Ở Việt Nam, ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trên cây đậu tương mới chỉ tập trung nghiên cứu quy trình chuyển gen đối với một số giống đậu tương trong nước và nhập khẩu (Trần Thị Cúc Hòa (2007) [2], tạo cây chuyển gen

mang cấu trúc gen P5CS của Nguyễn Thị Thuý Hường năm 2009 [3], …

1.2 Gen liên quan đến tính chịu hạn và gen GmEXP1 ở cây đậu tương

1.2.1 Các gen liên quan đến tính chịu hạn của cây đậu tương

Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, việc ứng dung kỹ thuật di truyền nhằm nâng cao khả năng chống chịu

vớ các điều kiện bất lợi của ngoại cảnh đã và đang thu được các kết quả khả quan của cây trồng Việc sử dụng các gen liên quan đến chống chịu đã được thiết kế chuyển vào hệ thống thực vật, cải thiện mức độ chống chịu các điều kiện bất lợi của một số giống cây trồng Gần đây các nghiên cứu

đã phát hiện rằng sự tác động của tác nhân bất lợi có liên quan đến sự biểu hiện của một số gen đó là: nhóm gen mã hóa protein chức năng liên quan trong trao đổi các chất thẩm thấu, các protein bảo vệ,… Nhóm nhân tố điều hòa sự phiên mã (transcription factors) và nhóm nhân tố tín hiệu (singnaling factors) Ở thực vật khi bị thiếu hụt nước sẽ xảy ra sự hoạt hóa phosphoryl hóa các protein Một số protein kinase đã được mô tả như nhân

tố truyền tín hiệu (singnal transduction factor) liên quan đến phản ứng thẩm thấu ở thực vật Trong đó, SnRK2 (SNF1 – related protein kinase 2)

là protein liên quan đến các phản ứng thích nghi với điều kện bất lợi của môi trường và nó điều hòa hoạt động bởi ABA (Umezawa và đtg, 2004 [29]; Hiroaki Fujii và đtg, 2009) [20] Một số nghiên cứu cũng đã chứng minh được rằng SnRK2.8 (SRK2C) có liên quan đến phản ứng điều kiện khô hạn của cây trồng (Umezawa và đtg, 2004) [29]

Protein chịu nóng (Hsp) chịu nóng, muối và nhiệt độ cao, tích tụ nước, đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ tế bào (Vierling và đtg,

1992 [30], Thomashow 1998) [28] Hsp có 5 loại: Hsp100, Hsp90, Hsp70, Hsp 60 và sHsp sHsp không chỉ được nhấn mạnh trong phản ứng với độ nóng mà còn với nước, muối, quá trình oxi hóa và nhiệt độ thấp (Sabehat

và đtg, 1998 [26], Hamilton và đtg, 2001) [18] sHsp và Hsp đóng vai trò thấp (Sabehat và đtg, 1998 [26], Hamilton và đtg, 2001) [18] sHsp và Hsp đóng vai trò quan trọng trong việc tăng khả năng chống chịu trong điều kiện bất lợi của môi trường

Khi cây trồng gặp các điều kện ngoại cảnh bất lợi như: nóng, lạnh, phèn, mặn, hạn, … làm cho tế bào bị mất nước LEA (Late embryogenesis abundant protein) là loại protein được tổng hợp với số lượng lớn trong giai đoạn cuối của quá trình hình thành phôi, nó là một trong những nhóm protein quan trọng liên quan đến điều kiện mất nước của tế bào, nhóm gen mã hóa loại protein LEA còn đóng vai tròn quan trọng trong hạt Khi hiện tượng mất nước xảy ra, gen LEA phiên mã một lượng lớn mRNA và protein LEA được tổng hợp Ngoài ra LEA không những điều chỉnh quá trình mất nước sinh lý khi hạt chín, mà còn hạn chế sự mất nước bắt buộc do các điều kiện ngoại cảnh bất lợi gây ra (Trần Thị Phương Liên [5], close T.J, 1997 [10], Procel và đtg, 2005) [27] Mức độ phiên mã của gen LEA được điều khiển bởi axit absisic (ABA) và mức độ mất nước của tế bào, áp suất thẩm thấu trong tế bào Nhiều gen LEA đã được nghiên cứu, phân lập, xác định chức năng LEA được chia thành các nhóm sau: nhóm 2-D19, nhóm 2-D11 (còn gọi là dehydrin) ( Close T.J.1997) [10], nhóm 3- D7; nhóm 4- D113; nhóm 5-D29; nhóm 6-D95 (Trần Thị Phương Liên và đtg, 1999 [5], Close T.J, 1997 [10]) Khi điều kiện mất nước xảy ra, protein LEA được tổng hợp với số lượng lớn, trong đó dehydrin

có thể chiếm tới 1% tổng số protein hòa tan của hạt (Close T.J, 1997) [10]

Năm 2004, nhóm nghiên cứu gồm Huang và đtg của trường Đại học Tự

nhiên và Kỹ thuật Pingtung - Taiwan đã phân lập được gen P5CS ở đậu tương từ mRNA với kích thước 2148 bp Gen P5CS là nhân tố giới hạn cho nhịp độ tổng

hợp proline ở thực vật trong điều kiện bất lợi do hạn và do mặn gây nên [3]

Năm 1998, Ji Hoon Ahn và đtg phát hiện gen Sb-HRGP3 dài 1.353 bp ở

đậu tương mã hoá hydroxyproline giàu glycoprotein hoạt động mạnh trong

mô của vùng chuyển đổi cấu tạo sơ cấp sang cấu tạo thứ cấp của rễ Ở rễ thứ cấp, gen này hoạt động mạnh hơn so với các rễ chính Rất có thể, sự biểu hiện

của gen Sb-HRGP3 liên quan đến việc chấm dứt sự kéo dài của rễ [9]

Khi nghiên cứu về gen TCS (gen hai thành phần hệ thống có chức năng

chống hạn) ở đậu tương các tác giả Dung Tien Le, Rie Nishiyama, Yasuko Watanabe và đtg (2011) nhận thấy, cơ chế kháng hạn là một trong hai cơ chế liên quan đến rễ và chồi Khảo sát hình thái của 29 hệ rễ cây đậu tương các tác giả đã có nhận xét là sự phát triển của bộ rễ có sự tương quan mật thiết với các cơ chế kháng hạn Sự thích nghi linh hoạt của hệ rễ là một yếu tố quan trọng để duy trì sự sống trong điều kiện hạn hán

Ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu phân lập các gen liên quan đến tính chịu hạn, chịu nóng của cây đậu tương Nghiên cứu phân lập và đọc trình tự gen chaperonin từ giống đậu tương chịu lạnh Bonminori - Nhật Bản với kích thước phân tử 1,6 kb của Nông Văn Hải và đtg (1997) [25], của

Trần Thị Phương Liên và đtg (2003) phân lập gen chaperonin CCTδ từ giống

đậu tương địa phương chịu hạn Cúc Vàng, gen này gồm 1602 nucleotid mã hoá cho 533 axit amin [5] Nguyễn Thu Hiền và đtg (2005) phân lập gen dehydrin với kích thước 751 bp liên quan đến khả năng chịu hạn từ hai giống đậu tương vàng Mường Khương và Cao Bằng 4 Nguyễn Thị Thuý Hường và đtg đã phân

lập, tạo đột biến điểm ở gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn và thử nghiệm

chuyển vào cây đậu tương Việt Nam (2011) [3]

Hạn hán luôn là thử thách lớn đối với sự sinh trưởng, phát triển của cây đậu tương, ảnh hưởng lớn tới năng suất sinh học cũng như năng suất kinh tế của cây đậu tương Để khắc phục thực trạng trên thì việc nghiên cứu chọn tạo giống đậu tương theo hướng tăng cường khả năng biểu hiện của gen liên quan đến tính chịu hạn là biện pháp có tính hiệu quả cao Đã có nhiều gen liên quan

đến tính chịu hạn đã được phân lập như P5CS, DREB2, DREB5, TCS, CCTδ,

Sb-HRGP3, GmEXP1, GmEXP2… đây sẽ là nguồn nguyên liệu làm cơ sở để

tạo cây chuyển gen nhằm nâng cao khả năng chịu hạn của cây đậu tương

1.2.2 Gen GmEXP1 và protein EXP1 ở cây đậu tương

Lee và đtg (2003) đã nghiên cứu phân lập gen GmEXP1 từ mRNA của

cây đậu tương với kích thước 1089 bp và năm 2011 ông và các cộng sự đã

nghiên cứu biểu hiện của gen GmEXP1 liên quan đến việc kéo dài rễ của cây

đậu tương Expensin là protein có chức năng mở rộng thành tế bào và đã được coi là protein chủ yếu có ảnh hưởng đến việc kéo dài tế bào rễ Nghiên cứu của Cosgrove et al (1993, 1996, 1998) [11, 12, 13] đã chỉ ra rằng expensin có vai trò làm tăng kích thước tế bào thực vật , làm nới lỏng thành tế bào Ngoài

ra enzyme và các tác nhân khác cũng làm tăng cường mở rộng thành tế bào [14, 15] Kéo dài tế bào gây ra bởi môi trường có tính acid và expansin với vai trò mở rộng thành tế bào đã tìm thấy ở nhiều đối tượng thực vật khác nhau, như tảo, rêu, dương xỉ, cây hạt trần và cây hạt kín, vì vậy có thể coi expansin giữ vai trò quan trọng trong việc làm giãn tế bào Các expensin thực vật trong họ expansin làm biến đổi thành tế bào có nguồn gốc tiến hoá như nào vẫn còn là bí ẩn [24] Nhiều gen đã được phân lập từ hệ gen của một loạt các loài thực vật và kết quả thu được đã chỉ ra rằng chúng tạo thành một họ

gen expansin [3] Li et al (2000) [24] Đã phân loại expansin thành ba họ α-, β- và γ-expansin, dựa vào mối quan hệ phát sinh loài của chúng Kết quả nghiên cứu của Kam et al (2005) [21] cũng cho thấy hai gen EXP1 và EXPB2 liên quan đến sự tăng trưởng và phát triển của rễ Lee et al (2003) [23] lần đầu tiên xác định được mối liên quan của expansin với sự kéo dài rễ

của cây đậu tương và cho biết mức độ biểu hiện của gen GmEXP1 rất mạnh

trong khoảng thời gian hạt nảy mầm từ 1 ngày đến 5 ngày tuổi và giai đoạn kéo

dài rễ diễn ra rất nhanh Phân tử mRNA của gen GmEXP1 có nhiều nhất trong

phần đầu rễ, nơi xảy ra sự kéo giãn tế bào và khan hiếm ở miền trưởng thành - nơi chấm dứt sự kéo giãn tế bào Bằng phép lai tại chỗ, tác giả nhận định, sản

phẩm phiên mã của gen GmEXP1 có nhiều trong các tế bào biểu bì và các lớp

tế bào miền sinh trưởng của cả rễ cọc và rễ bên Các kết quả nghiên cứu cho

thấy gen GmEXP1 đóng một vai trò quan trọng trong việc phát triển rễ của cây

đậu tương, đặc biệt là trong quá trình kéo dài của rễ chính và rễ thứ cấp [23] Protein EXP1 có hai vùng chức năng DPBB và Pollen allerg, số lượng

và trình tự amino acid của mỗi vùng có tính đặc trưng và quyết định mức độ hoạt động của expansin trong quá trình phát triển của rễ cây đậu tương vẫn chưa được làm sáng tỏ mặc dù đã được nghiên cứu nhiều Hướng tiếp cận nghiên cứu chức năng của họ gen expansin trong quá trình phát triển của rễ là

sự tham gia của các protein trong quá trình cải thiện thành tế bào trong các lớp tế bào biểu bì rễ, trong việc điều khiển hoạt động kéo dài và trưởng thành của cây cũng sẽ được quan tâm

1.2.3 Vector chuyển gen ở thực vật

Cả A.tumefaciens và Agrobacterium rhizogenes đề được sử dụng để

chuyển DNA ngoại lai vào tế bào thực vật Nhiều vector biến nạp dựa trên plasmid đã được phát triển Các vector này không chứa bất kỳ trình tự ung thư

Ti-nào và vì vậy tế bào thực vật có thể sinh trưởng bình thường sau khi chuyển DNA vào nhân của nó Các vector này không gây ung thư hiện đang sử dụng

có thể chia làm hai loại là Cis và Trans, dựa vào việc có hay không các vùng T-DNA nằm ở mép các trình tự lặp trực tiếp 25 bp trên cùng đơn vị tái bản như các gen vir hoặc trên một plasmid phân tán Trước đây loại plasmid thường được đề cập đến là vector liên hợp, tuy nhiên gần đây vector nhị thể lại phổ biến hơn

Cis vector: là vector có nguồn gốc T-plasmid kiểu dại mà gen onc trên

T-DNA đã được loại bỏ và trong một số trường hợp được thay thế bằng một đoạn DNA đặc hiệu có vùng tương đồng với vector tạo dòng nhỏ mà chỉ có

thể tái bản ở E coli Chiến lược tạo vector này phụ thuộc vào sự liên hợp trong A.tumefaciens giữa các vùng tương đồng trên T-plasmid đã sửa đổi (hỗ trợ mang gen vir) và một vector tạo dòng nhỏ ở E.coli (vector trung gian)

mang gen marker chọn lọc sẽ hoạt động chức năng trong các tế bào thực vật

và các trình tự duy nhất cho việc xen DNA ngoại lai vào Vector trung gian

mang trình tự DNA ngoại lai thường được đưa vào A.tumefaciens bằng sự

tiếp hợp và bằng sự chọn lọc thích hợp sẽ thu được thể nhận tiếp hợp với DNA ngoại lai đã ổn định trong T-DNA là kết quả của tái tổ hợp tương đồng

Vector nhị thể: vector Trans hoặc vector nhị thể được dựa trên các

plasmid có thể tái bản cả ở E.coli và A.tumefaciens, các plasmid này có chứa

các trình tự biên của T-DNA Các vector này được thiết kế sao cho các trình

tự biên cạnh MCS cho phép xen các DNA ngoại lai vào và các marker cho phép chọn lọc trực tiếp các tế bào thực vật đã được biến nạp Plasmid có thể

được thao tác ở E.coli và được chuyển vào qua sự tiếp hợp với các dòng

Agrobacterium mang plasmid có chứa vùng vir nhưng thiếu T-DNA và các

trình tự lặp 25 bp các plasmid như thế thường là các thể đột biến mất đoạn

đơn giản của Ti-plasmid otopine kiểu dại hoặc kiểu nopaline Việc chuyển DNA ngoại lai trên vector tạo dòng và tế bào thực vật có thể được thực hiện

do hoạt động chức năng của vùng vir

Vector biến nạp sử dụng Agrobacterium rhizogenes: các vector này

sử dụng đầu tiên khi biến nạp vào các loại thực vật mà sự tái sinh toàn bộ cơ thể từ các tế bào đơn lẻ là khó khăn Ở một số loài, sự tái sinh có thể xảy ra từ

sự nuôi cấy rễ gây ra bởi Agrobacterium rhizogenes thông qua sự phát triển

phôi soma hoặc sự phát sinh cơ quan Cơ chế kiểu hình lông rễ bị ức chế làm phát sinh hình thái chồi hiện nay còn chưa rõ, thực vật tái sinh từ lông rễ thường bị biến đổi hình thái: lá bị gấp nếp, hệ thống rễ bị ăn nghiên, sinh trưởng cằn cỗi khả năng sinh sản kém

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Hình 2.1 Ảnh hạt của giống đậu tương SL1

Giống thuốc lá Nicotiana tabacum K326 do phòng Công nghệ tế

bào thực vật của, Phòng thí nghiệm trọng điểm quốc gia về công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ

Việt Nam cung cấp

Các vector và chủng vi khuẩn sử dụng

Vector pBT; vector pRTRA7/3; vector pCB301 do phòng Công nghệ

tế bào thực vật, Phòng thí nghiệm trọng điểm quốc gia về công nghệ gen,

Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam

cung cấp

Chủng vi khuẩn E.coli DH5α và Agrobacterium tumefaciens do phòng

Công nghệ tế bào thực vật của viện Công nghệ sinh học cung cấp

ClaI 5362 EcoRI 5343

HindIII 5295 HindIII 5355

NcoI 4187

NotI 99 PstI 5341

PstI 5311

PstI 3808 SmaI 5333

Plasmid pBT Plasmid pRTRA7/3 Plasmid pCB301

Hình 2.2 Sơ đồ cấu trúc các vector sử dụng trong nghiên cứu

2.1.2 Hoá chất và thiết bị

Hoá chất

Trizol Reagents Kit (của hãng Invitrogen) để tách chiết RNA; Plasmid Extraction Kit (của hãng Bioneer, Hàn Quốc); các enzyme hạn chế của hãng Fermentas (Hàn Quốc)

KCl, Tris HCl, MgCl2, MgSO4, EDTA, NaOH, CaCl2, NaCl, X- gal, Glycerol, Ethanol 70%, yeast extract, agarose, glucose, nước khử ion

Các loại kháng sinh: kanamycin, cefotaxim

Môi trường GM, MS đặc, RM, MS lỏng không đường

Các chất điều tiết sinh trưởng: BAP, IBA, …

Thiết bị

Máy PCR System 9700 (Appied Biosytem, Mỹ), máy điện di Powerpac300 (Bio-Rad, Mỹ), máy soi DNA (Mini – transllumminatior, Bio-

Rad, Mỹ), máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thụy Điển) máy vortex (Mimeshaker, IKA, Đức), máy hút chân không Speed – Vac 110A (Savant, Mỹ), máy li tâm, máy sung điện Gen Plulser, cùng nhiều trang thiết

bị khác của phòng Công nghệ tế bào thực vật, Phòng thí nghiệm trọng điểm quốc gia về công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu

Đề tài luận văn được hoàn thành tại Bộ môn Di truyền học & Sinh học hiện đại, các phòng thí nghiệm của khoa Sinh – KTNN, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên Các thí nghiệm của đề tài được thực hiện tại Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Phòng thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia về Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học - Viện hàn lâm và Khoa học Việt Nam

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phân lập gen

2.2.1.1 Phương pháp tách chiết RNA

Phương pháp tách chiết RNA tổng số: Sử dụng bộ kit Trizol Reagents (Hãng Invitrogen) để tách chiết RNA tổng số từ các mẫu rễ mầm đậu tương theo chỉ dẫn của nhà sản xuất gồm các bước:

Nghiền nhanh 100mg mẫu trong nito lỏng

Thêm 1ml Trizone Regents, đảo nhẹ đều trong 5 phút

Thêm 200 µl C: I ( 24:1), đảo đều ở nhiệt độ phòng trong 5 phút

Ly tâm 10.000 vòng/15 phút/40C

Thu 500 µl Isopropanol 40C đảo đều 15 phút ở 250

C

Li tâm 10.000 vòng/15 phút

Thu tủa bổ sung 700 µl cồn 70% (cồn pha nước DEPC 0.01%), li tâm

6000 vòng/phút trong 5 phút, Làm hai lần

Làm khô RNA ở nhiệt độ phòng

Bổ sung 40 µl nước + DEPC 0.01%, ủ ở nhiệt độ 550/15 phút

Kiểm tra sản phẩm RNA tổng số tách chiết được bằng điện di trên gel agarose 0,8%

Ủ ở 650C/5 phút sau đó cho ngay vào đá lạnh

Bổ sung: Reaction Buffer 4 µl; ReboleckTM Rnase Trizone Regents 1 µl; dNTP 2 µl; RTase 1µl

Cho vào máy PCR theo chu trình nhiệt: 250C/15 phút; 420C/60 phút;

700C/5 phút

2.2.1.3 Phương pháp PCR

cDNA của gen GmEXP1 được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR với cặp

mồi đặc hiệu theo thành phần phản ứng và chu trình nhiệt như sau:

Bảng 2.3 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR

Bước Phản ứng Nhiệt độ ( 0 C) Thời gian Chu kỳ

30

2.2.1.4 Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony – PCR)

Bảng 2.5 Chu trình nhiệt của phản ứng colony – PCR

30

2.2.1.5 Phương pháp thôi gel

Quá trình thôi gel, tinh sạch được thực hiện theo quy trình và bộ hóa chất sử dụng cho tinh sạch của hãng QIAGEN (QIAquick DNA Gel Extraction Kit), gồm các bước sau:

Thêm Buding buffer và sản phẩm PCR tỉ lệ 1: 1, ủ 550C/10 phút

Chuyển sang cột lọc li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút 30 giây

Bổ sung Wash buffer li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút 30 giây Chuyển cột lọc sang ống eppendorf 1,5 ml mở nắp 5 phút

Bổ sung nước khử ion để 5 phút li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút

30 giây thu dịch bảo quản ở - 200C

2.2.1.6 Phương pháp ghép nối gen đích vào plasmid

Bảng 2.6 Thành phần gắn gen GmEXP1 vào vector tách dòng pBT

Nuôi qua đêm ở 370

C

2.2.1.7 Phương pháp tách chiết plasmid tái tổ hợp

Phương pháp tách chiết plasmid được thực hiện theo Sambrook và đtg (2001)

Bảng 2.7 Thành phần hóa chất tách chiết plasmid

Các bước tiến hành tách plasmid:

Lấy 10 ml dung dịch vi khuẩn nuôi trong LB lỏng 12 - 16 giờ

Ly tâm 8000 v/p thu tế bào, có thể lặp lại 5 lần để thu hết cặn khuẩn của 10 ml dịch khuẩn

Bổ sung 200 µl Sol I hòa tan tế bào hoàn toàn

Bổ sung 400 µl Sol II trọn nhẹ trong 30 giây

Bổ sung tiếp 300 µl Sol III trộn nhẹ trong 30 giây

Bổ sung 900 µl chloroform : isoamin (24 : 1) trộn đều trong 3 phút

Ly tâm 13000v/p, hút nhẹ nhàng không cặn 900µl pha trên sang ống effendorf mới

Cho 900 µl isopropanol 100% để ở nhiệt độ -4o

C trong 30 – 180 phút,

ly tâm 13000 v/p, loại bỏ phần dịch lỏng, thu cặn

Cho 500 µl cồn 70% vào, ly tâm 7000 v/p trong 5 phút, sau đó loại bỏ cồn và làm đông khô trong 30 phút

Hòa tan sản phẩm trong 50 µl nước khử ion

Bổ sung RNase

Ủ ở 370

C trong 30 phút

Kiểm tra sản phẩm tách plasmid bằng điện di trên gel agarose 0,8%

2.2.1.8 Phương pháp xác định trình tự nucleotide của gen

Trình tự của gen được xác định trên máy đọc trình tự nucleotide tự động ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyzer (Applied Biosystem) sử dụng

bộ hoá chất sinh chuẩn BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing

2.2.2 Phương pháp chuyển gen vào cây thuốc lá

2.2.2.1 Quy trình biến nạp vector tái tổ hợp vào A tumefaciens

Rửa Cuvette bằng cồn 700, rửa lại bằng nước khử ion vô trùng rồi sấy khô

Tế bào khả biến đặt trong nước đá ( khoảng 40C), 15 phút

Bổ sung 1 µl plasmid vào 50 µl tế bào khả biến và trộn nhẹ

Chuyển tất cả hỗn hợp dịch tế bào khả biến và plasmid vào Cuvette Chỉnh thông số máy xung điện: 2,5 kV, 25 µF, 200 Ω

Tiến hành chạy xung điện

Lấy Cuvete ra bổ sung 500 µl LB lỏng và mix nhẹ

Chuyển sang ống eppendoff 2 ml

Nuôi lắc ở 280C trong 1 giờ