nghiên cứu khả năng tăng trưởng của một số vi sinh vật trên bề mặt cellulose vi khuẩn (bc-bacterial cellulose)

KHOA MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC ---o0o--- ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TĂNG TRƯỞNG CỦA MỘT SỐ VI SINH VẬT TRÊN BỀ MẶT GIÁ ĐỠ CELLULOSE VI Tp... Thạch dừa thực chất là sin

Trang 1

KHOA MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

-o0o -

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TĂNG TRƯỞNG CỦA MỘT SỐ VI SINH VẬT TRÊN BỀ MẶT GIÁ ĐỠ CELLULOSE VI

Tp Hồ Chí Minh, Tháng 7 năm 2010

Trang 2

CHƯƠNG 1

MỞ ĐẦU

Trang 3

CHƯƠNG 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Trang 4

CHƯƠNG 3

VẬT LIỆU

VÀ PHƯƠNG PHÁP

Trang 5

CHƯƠNG 4

KẾT QUẢ

VÀ BIỆN LUẬN

Trang 6

CHƯƠNG 5

KẾT LUẬN

VÀ ĐỀ NGHỊ

Trang 7

PHỤ LỤC

Trang 8

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Trang 9

Trước tiên, em xin chân thành cảm ơn các Thầy Cô ngành Công nghệ Sinh học, khoa Môi Trường và Công nghệ Sinh học Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ TP Hồ Chí Minh đã giảng dạy và trang bị cho em những

kiến thức cơ bản trong suốt 4 năm Đại học

Con xin cảm ơn mẹ ba đã nuôi dạy con khôn lớn, tạo mọi điều kiện cho con yên tâm học tập

Con xin gởi lời cảm ơn chân thành nhất đến Thầy PGS.TS Phạm Thành

Hổ đã tận tình quan tâm, hướng dẫn và giúp đỡ con rất nhiều trong quá trình hoàn thành đồ án tốt nghiệp

Em xin cảm ơn Cô ThS Lê Thị Thanh Loan đã nhiệt tình hướng dẫn cho em trong suốt thời gian thực hiện đồ án

Em cảm ơn chị Hà Minh Nguyệt đã luôn động viên em

Em cũng gởi lời cảm ơn đến chị Phương, anh Hùng đã chỉ dẫn em, giúp

em tìm hiểu tài liệu cần thiết và thao tác, kỹ thuật thực hiện thí nghiệm

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến các bạn thân mến của tôi, những người luôn ủng hộ, giúp đỡ, chia sẻ và động viên tôi trong học tập cũng như trong cuộc sống

Thành phố Hồ Chí Minh, 07/2010

Lê Thanh Quỳnh Trang

Trang 10

Mục lục

Các chữ viết tắt

Danh mục bảng

Danh mục biểu đồ

Danh mục hình

Trang CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Đối tượng nghiên cứu 2

4 Phương pháp nghiên cứu 3

4.1 Phương pháp luận 3

4.2 Phương pháp xử lý số liệu 4

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 4

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1 Giới thiệu về cellulose vi khuẩn (Bacterial cellulose - BC) 5

1.1 Các vi khuẩn sản sinh BC 5

1.2 Vi khuẩn Acetobacter xylinum 6

1.3 Các đặc điểm của BC 7

1.4 Sinh tổng hợp BC 10

1.5 Nguyên liệu để nuôi Acetobacter xylinum nhằm thu BC 13

1.6 Các phương pháp sản xuất BC 14

1.7 Ứng dụng của BC 16

2 Giới thiệu về Saccharomyces cerevisiae 19

2.1 Đặc điểm của S cerevisiae 19

2.2 Ứng dụng của S cerevisiae 23

3 Giới thiệu về Rhodotorula 24

Trang 11

3.3 Ứng dụng của Rhodotorula trong sản xuất chất béo 27

3.4 Một số nghiên cứu về sinh tổng hợp carotenoid của Rhodotorula 29

4 Giới thiệu về vi khuẩn Azotobacter 29

4.1 Đặc điểm của vi khuẩn Azotobacter 29

4.2 Ứng dụng của Azotobacter trong sản xuất phân vi sinh 33

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 1 Vật liệu 36

1.1 Giống vi sinh vật 36

1.2 Dụng cụ và thiết bị 36

1.3 Môi trường 36

2 Phương pháp tiến hành 38

2.1 Nhân giống A xylinum để thu cellulose vi khuẩn (BC) 38

2.2 Khảo sát khả năng tăng trưởng của các chủng nấm men trên giá đỡ BC 40

2.3 Thử nghiệm khả năng tăng trưởng của các chủng nấm men trên BC tái sử dụng 42

2.4 Khảo sát khả năng tăng trưởng của các chủng Azotobacter trên giá đỡ

BC 43

2.5 Thử nghiệm khả năng tăng trưởng của các chủng Azotobacter trên BC tái sử dụng 44

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 1 Nhân giống A xylinum để thu cellulose vi khuẩn (BC) 45

2 Khảo sát khả năng tăng trưởng của các chủng nấm men trên giá đỡ BC 47

2.1 Xác định mật độ tế bào ban đầu của các chủng nấm men 47

2.2 Khảo sát tỉ lệ phối hợp giữa khối lượng BC với thể tích MT rỉ đường thích hợp cho sự tăng trưởng của các chủng nấm men 48

2.3 Thử nghiệm khả năng tăng trưởng của các chủng nấm men trên BC tái sử dụng 56

Trang 12

3.1 Xác định mật độ tế bào ban đầu của các chủng Azotobacter 65

3.2 Khảo sát tỉ lệ phối hợp giữa khối lượng BC với thể tích MT Ashby

thích hợp cho sự tăng trưởng của các chủng Azotobacter 65 3.3 Thử nghiệm khả năng tăng trưởng của các chủng Azotobacter trên BC

tái sử dụng 74 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

1 Kết luận 86

2 Đề nghị 86 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Trang 13

 PTS: system of phosphotransferase (hệ thống của phosphotransferase)

 UDPGlc: uridine diphosphoglucose

 UGP: pyrophosphorylase uridine diphosphoglucose

 1PFK: fructose-1-phosphatekinase

Trang 14

Biểu đồ 4.1: Sinh khối S cerevisiae khô (g) thu được trên BC với các tỉ lệ theo

thời gian nuôi cấy 49

Biểu đồ 4.2: Sinh khối S cerevisiae khô (g) thu được trong MT rỉ đường sục

khí với các tỉ lệ theo thời gian nuôi cấy 51

Biểu đồ 4.3: Sinh khối S cerevisiae khô (g) giữa trên BC và trong MT rỉ

đường sục khí 51

Biểu đồ 4.4: Sinh khối Rhodotorula khô (g) thu được trên BC với các tỉ lệ theo

thời gian nuôi cấy 53

Biểu đồ 4.5: Sinh khối Rhodotorula khô (g) thu được trong MT rỉ đường sục

khí với các tỉ lệ theo thời gian nuôi cấy 54

Biểu đồ 4.6: Sinh khối Rhodotorula khô (g) giữa trên BC và trong MT rỉ

Trang 15

Biểu đồ 4.17: Sinh khối A1 khô (g) thu được trong MT Ashby sục khí với các

tỉ lệ theo thời gian nuôi cấy 69

Biểu đồ 4.18: Sinh khối A1 khô (g) giữa trên BC và trong MT Ashby sục

khí 69

Biểu đồ 19: Sinh khối A2 khô (g) thu được trên BC với các tỉ lệ theo thời gian nuôi cấy 71

Biểu đồ 4.20: Sinh khối A2 khô (g) thu được trong MT Ashby sục khí với các tỉ lệ theo thời gian nuôi cấy 72

Biểu đồ 4.21: Sinh khối A2 khô (g) giữa trên BC và trong MT Ashby sục

khí 73

Biểu đồ 4.22: Sinh khối khô (g) giữa chủng A1 và A2 trên BC 74

Biểu đồ 4.23: Sinh khối A1 khô (g) giữa các lần sử dụng 77

Biểu đồ 4.24: Sinh khối A1 khô (g) ở tỉ lệ 1:1 giữa các lần sử dụng 77

Biểu đồ 4.26: Sinh khối A1 khô (g) ở tỉ lệ 1:2,5 giữa các lần sử dụng 78

Biểu đồ 4.28: Sinh khối A2 khô (g) giữa các lần sử dụng 82

Biểu đồ 4.31: Sinh khối A2 khô (g) ở tỉ lệ 1:2,5 giữa các lần sử dụng 83

Trang 16

Bảng 2.1: Cấu trúc cellulose của một số vi sinh vật 5

Bảng 2.2: Một số sản phẩm từ màng BC của Acetobacter xylinum 16

Bảng 3.1: Tỷ lệ phối hợp giữa khối lượng BC với thể tích MT rỉ đường 41

Bảng 3.2: Thể tích MT rỉ đường sục khí 42

Bảng 3.3: Tỷ lệ phối hợp giữa khối lượng BC với thể tích MT Ashby 43

Bảng 3.4: Thể tích MT Ashby sục khí 44

Bảng 4.1: Xử lý miếng BC 46

Bảng 4.2: Mật độ tế bào nấm men ban đầu và sau khi pha loãng 47

Bảng 4.3: Sinh khối S cerevisiae khô (g) thu được trên BC với các tỉ lệ theo thời gian nuôi cấy 49

Bảng 4.4: Sinh khối S cerevisiae khô (g) thu được trong MT rỉ đường sục khí với các tỉ lệ theo thời gian nuôi cấy 50

Bảng 4.5: Sinh khối Rhodotorula khô (g) thu được trên BC với các tỉ lệ theo thời gian nuôi cấy 53

Bảng 4.6: Sinh khối Rhodotorula khô (g) thu được trong MT rỉ đường sục khí với các tỉ lệ theo thời gian nuôi cấy 54

Bảng 4.7: Sinh khối S cerevisiae khô (g) thu được trên BC tái sử dụng lần 1 với các tỉ lệ theo thời gian nuôi cấy 57

Bảng 4.8: Sinh khối S cerevisiae khô (g) thu được trên BC tái sử dụng lần 2 với các tỉ lệ theo thời gian nuôi cấy 58

Bảng 4.9: Sinh khối Rhodotorula khô (g) thu được trên BC tái sử dụng lần 1 với các tỉ lệ theo thời gian nuôi cấy 62

Bảng 4.10: Sinh khối Rhodotorula khô (g) thu được trên BC tái sử dụng lần 2 với các tỉ lệ theo thời gian nuôi cấy 63

Bảng 4.11: Mật độ tế bào Azotobacter ban đầu và sau khi pha loãng 65

Bảng 4.12: Sinh khối A1 khô (g) thu được trên BC với các tỉ lệ theo thời gian nuôi cấy 67

Trang 17

Bảng 4.14: Sinh khối A2 khô (g) thu được trên BC với các tỉ lệ theo thời gian nuôi cấy 71

Bảng 4.15: Sinh khối A2 khô (g) thu được trong MT Ashby sục khí với các tỉ

lệ theo thời gian nuôi cấy 72 Bảng 4.16: Sinh khối A1 khô (g) thu được trên BC tái sử dụng lần 1 với các tỉ

lệ theo thời gian nuôi cấy 82

Trang 18

Hình 2.1: Tế bào Acetobacter xylinum 6

Hình 2.2: Cấu trúc của cellulose vi khuẩn và cellulose thực vật 8

Hình 2.3: Sự hình thành vi sợi bởi A xylinum 9

Hình 2.4: Con đường dự đoán của quá trình sinh tổng hợp và tiết ra cellulose khi glucose được tế bào A xylinum hấp thụ từ bên ngoài 12

Hình 2.5: Con đường sinh tổng hợp BC ở Acetobacter xylinum 12

Hình 2.6: Miếng BC được hình thành từ lên men tĩnh 15

Hình 2.7: Hạt BC được hình thành từ nuôi cấy lắc 15

Hình 2.8: Sản phẩm trị bỏng da Biofill thương mại làm từ màng BC 17

Hình 2.9: Ứng dụng BC làm giá thể nuôi cấy cụm chồi thuốc lá 17

Hình 2.10: Ứng dụng BC trong vật liệu mới làm tấm xốp 17

Hình 2.11: Tế bào nấm men S cerevisiae 19

Hình 2.12: Khuẩn lạc S cerevisiae trên môi trường Hansen 20

Hình 2.13: Khuẩn lạc Rhodotorula trên môi trường Hansen 25

Hình 2.14: Các sắc tố của nấm men Rhodotorula 26

Hình 2.15: Khuẩn lạc Azotobacter trên môi trường Ashby (hình trái) và hình dạng Azotobacter dưới kính hiển vi (hình phải) 30

Hình 2.16: Nang Azotobacter dưới kính hiển vi 30

Hình 2.17: Chế phẩm phân Azotobacterin ở Ấn Độ 34

Hình 4.1: Hoạt hóa A xylinum sau 24 giờ 45

Hình 4.2: Nhân giống cấp 2 (hình trái), nhân giống cấp 3 (hình phải) 45

Hình 4.3: Miếng BC sau 4 ngày lên men tĩnh, chưa xử lý 46

Hình 4.4: Miếng BC đã qua xử lý 47

Hình 4.5: Sinh khối S.cerevisiae ở tỉ lệ 1:2 sau 5 ngày 48

Hình 4.6: Sinh khối S.cerevisiae ở tỉ lệ 1:2,5 sau 5 ngày 48

Hình 4.7: Sinh khối S.cerevisiae ở tỉ lệ 1:3 sau 5 ngày 48

Hình 4.8: Hệ thống nhân sinh khối nấm men trong MT rỉ đường sục khí 50

Hình 4.9: Sinh khối Rhodotorula ở tỉ lệ 1:2 sau 4 ngày 52

Trang 19

Hình 4.12: Sinh khối S.cerevisiae trên BC tái sử dụng lần 1 ở tỉ lệ 1:2 sau 4

ngày 56

Hình 4.13: Sinh khối S.cerevisiae trên BC tái sử dụng lần 1 ở tỉ lệ 1:2,5 sau 4 ngày 57

Hình 4.14: Sinh khối S.cerevisiae trên BC tái sử dụng lần 1 ở tỉ lệ 1:3 sau 4 ngày 57

Hình 4.16: Sinh khối S.cerevisiae trên BC tái sử dụng lần 2 ở tỉ lệ 1:2,5 sau 4 ngày 58

Hình 4.18: Sinh khối Rhodotorula trên BC tái sử dụng lần 1 ở tỉ lệ 1:2 sau 4 ngày 61

Hình 4.19: Sinh khối Rhodotorula trên BC tái sử dụng lần 1 ở tỉ lệ 1:2,5 sau 4 ngày 61

Hình 4.22: Sinh khối Rhodotorula trên BC tái sử dụng lần 2 ở tỉ lệ 1:2,5 sau 4 ngày 62

Hình 4.24: Sinh khối chủng A1 ở tỉ lệ 1:1 sau 6 ngày 66

Hình 4.26: Sinh khối chủng A1 ở tỉ lệ 1:2,5 sau 6 ngày 66

Hình 4.28: Hệ thống nhân sinh khối Azotobacter trong MT Ashby sục khí 68

Trang 20

Hình 4.31: Sinh khối chủng A2 ở tỉ lệ 1:2,5 sau 6 ngày 70

Hình 4.33: Sinh khối A1 trên BC tái sử dụng lần 1 ở tỉ lệ 1:1 sau 6 ngày 74

Hình 4.35: Sinh khối A1 trên BC tái sử dụng lần 1 ở tỉ lệ 1:2,5 sau 6 ngày 75

Trang 21

SVTH: Lê Thanh Quỳnh Trang 1

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Ở Việt Nam, thạch dừa (Nata-de-coco) là một loại thực phẩm phổ

biến Thạch dừa thực chất là sinh khối của vi khuẩn Acetobacter xylinum (nuôi

trên môi trường nước dừa già), mà thành phần chủ yếu là cellulose nên được

gọi là cellulose vi khuẩn (Bacterial cellulose - BC) Ngoài giá trị thực phẩm

như thạch dừa, các nhà khoa học của nhiều nước trên thế giới (Nhật, Brasil,

Phillipines …) đã phát hiện cellulose vi khuẩn có nhiều ứng dụng độc đáo

khác như: màng trị bỏng trong y học, giá thể nuôi cấy mô thực vật, tác nhân

kết dính, giá đỡ để nhân sinh khối tế bào vi sinh vật, màng lọc nước, màng

rung truyền âm thanh …

Trong tất cả các quy trình lên men VSV đều cần giống ban đầu, tức là

phải có đủ số lượng tế bào cần thiết cho thực hiện phản ứng sinh học trong lên

men Khâu này phải đảm bảo 2 điều kiện: đủ số lượng tế bào cần thiết, các tế

bào có số lượng lớn nhưng hoạt tính không thay đổi

Muốn có giống ban đầu đủ số lượng tế bào cần thiết cho quy trình thì phải tiến

hành sản xuất sinh khối vi sinh vật Việc sản xuất sinh khối VSV là một giai

đoạn quan trọng trong rất nhiều quy trình:

- Sản xuất men bánh mì: men bánh mì là sinh khối tế bào nấm men

Saccharomyces cerevisiae nuôi trong môi trường mật rỉ đường Ngoài ra, nấm

men còn được ứng dụng trong sản xuất rượu, bia, trong lĩnh vực nông nghiệp

và y dược

- Phân vi sinh là sinh khối tế bào vi khuẩn Azotobacter Nó có khả năng

biến đổi nitơ không khí thành NH3, acid amin và protein; có ý nghĩa quan

trọng trong việc làm giàu nitơ cho đất

- Chế phẩm diệt côn trùng

- Probiotic

- Công nghiệp sản xuất vaccine

- Sản xuất protein đơn bào

Trang 22

Trước đây, người ta thu sinh khối VSV bằng phương pháp lên men

sục khí Tuy nhiên, phương pháp này không cho năng suất cao và tốn nhiều

năng lượng Cho nên, người ta nghĩ đến việc nhân sinh khối VSV trên bề mặt

một giá đỡ tiếp xúc trực tiếp với không khí Bên cạnh đó, BC có những đặc

tính như: độ tinh khiết cao, khả năng giữ ẩm tốt, có độ đàn hồi, độ bền cao, dễ

phân hủy… Như vậy, ứng dụng BC làm giá đỡ để nhân sinh khối tế bào vi

sinh vật mang ý nghĩa quan trọng và nó có những ưu điểm vượt trội hơn so với

phương pháp nhân sinh khối trong môi trường lỏng có sục khí (phương pháp

truyền thống):

 Tiết kiệm được điện năng vì không sử dụng máy sục khí

 Thu sinh khối vi sinh vật đơn giản hơn vì sinh khối tạo thành sẽ bám

trên bề mặt miếng BC nên khi thu nhận chỉ cần cạo lớp sinh khối bám trên bề

mặt mà không mất nhiều năng lượng và thời gian vì không qua giai đoạn ly

tâm hoặc lắng lọc để tách nhiều nước

 Lượng nước thải ra môi trường không đáng kể và BC có khả năng

phân hủy sinh học vì vậy không ảnh hưởng đến con người và môi trường xung

quanh và ít tốn chi phí cho việc xử lý chất thải góp phần bảo vệ môi trường

Xuất phát từ những ưu điểm trên của BC, chúng tôi tiến hành nghiên

cứu đề tài “Nghiên cứu khả năng tăng trưởng của một số vi sinh vật trên bề

mặt giá đỡ cellulose vi khuẩn (BC – Bacterial cellulose)”

2 Mục tiêu nghiên cứu

 So sánh khả năng tăng trưởng của vi sinh vật trên môi trường giá đỡ

BC và trên môi trường lỏng có sục khí

 Thử tái sử dụng miếng BC nhằm tận dụng lượng giống còn lại và

nguồn dinh dưỡng sẵn có để giảm lượng chất thải ra môi trường

3 Đối tượng nghiên cứu

Vì thời gian thực hiện đề tài chỉ trong 12 tuần, đề tài chỉ tập trung

nghiên cứu ở những đối tượng sau:

Trang 23

 Cellulose vi khuẩn (BC – Bacterial cellulose) do vi khuẩn Acetobacter

xylinum tổng hợp từ nguyên liệu nước dừa già

 Nấm men Saccharomyces cerevisiae và Rhodotorula

 Vi khuẩn Azotobacter

4 Phương pháp nghiên cứu

4.1 Phương pháp luận

Trước khi bắt đầu thực hiện đồ án, tôi đã tham khảo các nghiên cứu từ

trước đến nay về vi khuẩn Acetobacter xylinum, BC do Acetobacter xylinum

tổng hợp và các ứng dụng của BC

Trong các ứng dụng của BC, tôi đã tìm hiểu và chọn ứng dụng BC

làm giá đỡ nhân sinh khối tế bào vi sinh vật để thực hiện đồ án

Sơ đồ tiến trình thí nghiệm như sau:

Trang 24

4.2 Phương pháp xử lý số liệu

Sử dụng phần mềm Excel vẽ đồ thị biểu diễn

Sử dụng phần mềm Statgraphics để xử lý thống kê

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Khảo sát khả năng tăng trưởng của vi sinh vật trên giá đỡ BC

Giảm năng lượng cho việc sục khí

Giảm lượng chất thải ra môi trường

Nhân giống A xylinum

Khảo sát tỉ lệ phối hợp giữa

m BC : V MT thích hợp cho sự tăng trưởng của vi sinh vật

Nhân sinh khối vi sinh

vật trong môi trường lỏng

có sục khí

So sánh đưa ra kết luận Tái sử dụng giá đỡ BC để

tiếp tục nhân sinh khối vi

Trang 25

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 Giới thiệu về cellulose vi khuẩn (bacterial cellulose - BC)

Cellulose là đại phân tử tồn tại phổ biến nhất trên trái đất, là thành phần chính của sinh khối thực vật cũng như đại diện cho các polymer ngoại bào của

vi sinh vật Cellulose vi khuẩn (bacterial cellulose - BC) là sản phẩm trao đổi chất sơ cấp và chủ yếu tạo màng bảo vệ

1.1 Các vi khuẩn sản sinh BC

- BC đuợc tổng hợp bởi một số loài vi khuẩn Trong đó Acetobacter

xylinum sinh tổng hợp BC hiệu quả nhất và được nghiên cứu nhiều nhất Cấu

trúc của BC được tổng hợp khác nhau ở các loài vi khuẩn khác nhau

Bảng 2.1 : Cấu trúc cellulose của một số vi sinh vật [7]

- Trong đó chủng Acetobacter đặc biệt là Acetobacter xylinum (A aceti

ssp xylinum, A xylinus) là vi sinh vật tạo cellulose hữu hiệu nhất và được sử

dụng phổ biến nhất trong việc sản xuất thạch dừa vì năng suất tạo BC cao, cấu trúc BC phù hợp cho nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau [7]

Trang 26

1.2 Vi khuẩn Acetobacter xylinum

- Loài : Acetobacter xylinum

Gần đây, A xylinum đã được xếp vào giống mới Gluconacetobacter, bao gồm các loài là G xylinus, G hansenii, G europaeus, G oboediens và G

intermedius [7]

1.2.2 Đặc điểm hình thái A xylinum:

- A xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể di động hoặc

không và không sinh bào tử Chúng là vi khuẩn gram âm nhưng gram của chúng có thể bị biến đổi do tế bào già đi hay do môi trường Tế bào đứng riêng

lẻ hay xếp thành chuỗi A xylinum thuộc loại vi khuẩn hiếu khí bắt buộc vì

thế chúng tăng trưởng ở bề mặt tiếp xúc giữa môi trường lỏng và môi trường khí và có khả năng tạo màng cellulose trên môi trường nuôi cấy [7]

Hình 2.1: Tế bào Acetobacter xylinum

Trang 27

- Trên môi trường rắn sau khoảng 3 – 7 ngày nuôi cấy, khuẩn lạc A

xylinum có dạng nhỏ, nhày, có màu kem, hơi trong nhưng sau một tuần thì

khuẩn lạc to, đục, màu cà phê sữa, khô dần

- Trên môi trường lỏng sau 24 giờ nuôi cấy thì xuất hiện một lớp màng đục dày, sau 36 – 48 giờ hình thành một lớp màng trong và ngày càng dày [11]

1.2.3 Đặc điểm sinh lý và sinh hóa của A xylinum

- Phản ứng catalase dương tính

- Oxi hóa ethanol thành CO2 và H2O

- Không tăng trưởng trên môi trường Hoyer

- Không tạo sắc tố nâu

- Vi khuẩn hiếu khí hoàn toàn

- Chuyển hóa glucose thành acid

- Chuyển hoá glycerol thành dihydroxyaceton

- Tổng hợp cellulose

- A xylinum sử dụng nhiều nguồn đường khác nhau và tùy thuộc vào

chủng mà nguồn đường nào được sử dụng tốt nhất Chúng có thể chuyển hóa glucose thành acid gluconic, điều này làm cho pH môi trường giảm từ 1 - 2 đơn vị

- Nhiệt độ tối ưu để A xylinum phát triển là từ 25 - 30°C và pH từ 5,4 – 6,3 A xylinum có thể phát triển trong phạm vi pH từ 3 – 8, nhiệt độ từ 12 -

Trang 28

được ổn định bởi các nối hydrogen BC khác với PC về chỉ số kết chặt, về mức độ polymer hóa

Hình 2.2: Cấu trúc của cellulose vi khuẩn và cellulose thực vật [44]

- Hai dạng kết tinh phổ biến của cellulose trong tự nhiên là I và II, được phân biệt bởi các kỹ thuật phân tích bằng tia X, quang phổ và tia hồng ngoại Tùy thuộc vào điều kiện môi trường nuôi cấy và giống vi khuẩn mà cellulose dạng nào chiếm ưu thế Cellulose I và II đều được tổng hợp trong tự nhiên trong đó celulose I phổ biến hơn Cellulose I có thể được chuyển thành cellulose II, nhưng cellulose II thì không thể chuyển thành cellulose I Rất ít tế

bào Eukaryote tổng hợp cellulose II A xylinum thì tổng hợp được cả 2 loại

cellulose I và II

- Cellulose I: được tổng hợp bởi đa số thực vật và A xylinum ở môi

trường tĩnh Các chuỗi β-1,4-glucan được sắp xếp song song với nhau theo một trục Năm 1984 Atalla và Vander Hart đã xác định được cấu trúc cellulose

Iα và cellulose Iβ

- Cellulose II: thường được tổng hợp trong môi trường nuôi cấy lắc Các chuỗi β-1,4-glucan xếp một cách ngẫu nhiên, hầu như không song song và nối với nhau bởi một số lượng lớn nối hydrogen, làm cho cellulose II có độ bền về nhiệt [7][24]

Trang 29

Hình 2.3: Sự hình thành vi sợi bởi A xylinum [Iguchi và cộng sự, 2000] 1.3.2 Chức năng sinh lý của cellulose đối với Acetobacter xylinum

- Tế bào A xylinum được bẫy bên trong mạng lưới polymer Mạng lưới

này là vật chống đỡ cho quần thể vi sinh vật luơn ở bề mặt tiếp giáp giữa mơi trường lỏng và khơng khí Cellulose cịn cĩ vai trị tích trữ và cĩ thể được sử dụng khi vi sinh vật này bị thiếu nguồn dinh dưỡng Sự phân hủy cellulose được xúc tác bởi enzyme exo-glucanase hay endo-glucanase

- Nhờ tính dẻo và tính thấm nước của màng cellulose mà vi khuẩn kháng lại được những thay đổi bất lợi trong mơi trường sống như giảm lượng nước, thay đổi pH, xuất hiện chất độc và vi sinh vật gây bệnh Cellulose bao quanh

bảo vệ chúng khỏi tia cực tím Khoảng 23% số tế bào A xylinum được bao BC

sống sĩt sau 1 giờ xử lý tia cực tím Tách BC khỏi tế bào, khả năng sống chỉ cịn 3% [7]

1.3.3 Tính chất độc đáo của BC

- Độ tinh khiết cao: BC là cellulose sinh học duy nhất đuợc tổng hợp khơng cĩ chứa lignin hay hemicellulose Do đĩ BC cĩ thể bị vi khuẩn phân hủy hồn tồn và là nguồn nguyên liệu tái sinh

- Độ bền dai cơ học lớn: cellulose cĩ độ bền dai cao, chịu lực kéo cao, trọng lượng nhẹ, độ bền đáng kể

Vi sợi Cellulose Tiền sợi

Lỗ xuất cellulose

Cellulose II

LPS envelope Cellulose Synthase Cellulose I

Cytoplasmic Membrane

Trang 30

- Khả năng hút nước cực cao ở trạng thái ẩm: khả năng giữ nước đáng

kể, lực ẩm cao Màng cellulose vi khuẩn có khả năng giữ nước rất lớn, nó có thể hút 60 – 700 lần trọng lượng của nó

- Màng cellulose được hình thành trực tiếp trong quá trình sinh tổng hợp

vì vậy việc sản xuất giấy, sợi không cần qua các bước trung gian

- Màng cellulose được định hướng trong quá trình tổng hợp: có khả năng hình thành các sợi biến động, tạo các màng bền theo một trục Theo Brown và White (1989) có thể hình thành một găng tay cellulose không cần khâu bằng cách sử dụng một khối đất xốp mà không khí thấm qua được và dìm xuống

bên trong môi trường lỏng nuôi cấy A xylinum, tế bào vi khuẩn sẽ tập hợp

xung quanh đất xốp và hình thành cellulose theo hình dạng mong muốn

- Màng cellulose được biến đổi trực tiếp trong quá trình tổng hợp: khi thêm chất phụ gia hay cơ chất nhất định vào trong quá trình tổng hợp BC thì

có thể làm thay đổi những thuộc tính của BC Nếu cho thuốc nhuộm vào môi trường nuôi cấy có thể kiểm soát các tính chất vật lý của cellulose trong quá trình tổng hợp

- Tổng hợp trực tiếp các dẫn xuất của cellulose nhờ vào sự tác động lên gen liên quan đến quá trình tổng hợp cellulose từ đó giúp kiểm soát hình dạng cellulose, kiểm soát trọng lượng phân tử cellulose [11][31]

1.4 Sinh tổng hợp BC

- Sinh tổng hợp BC là một tiến trình bao gồm nhiều bước được điều hòa một cách chuyên biệt và chính xác, liên quan đến một số lớn enzyme, các phức hợp xúc tác và các protein điều hòa

- Cellulose được tổng hợp từ A.xylinum là sản phẩm cuối cùng của sự

biến dưỡng carbon, phụ thuộc vào trạng thái sinh lý của tế bào bao gồm cả chu trình pentose phosphate hoặc chu trình Krebs, kết hợp với quá trình tạo glucose Sự thủy phân glucose không hoạt động ở vi khuẩn acid acetic bởi vì chúng không tổng hợp được enzyme quan trọng của con đường này đó là

phosphofructose kinase Ở A.xylinum, sự tổng hợp cellulose liên hệ chặt chẽ

với quá trình dị hóa và tiêu thụ khoảng 10% năng lượng có nguồn gốc từ

Trang 31

những phản ứng dị hóa Sự tổng hợp BC không gây trở ngại cho các quá trình đồng hóa khác, bao gồm sự tổng hợp protein

- A.xylinum biến đổi nhiều phức hợp carbon như: hexose, glycerol,

pyruvate, dihydroxyacetone và các dicarboxylic acid thành cellulose với hiệu suất 50%

- Ngày nay con đường tổng hợp cellulose ở A.xylinum đã được hiểu rất

rõ Đó là một quá trình tổng hợp gồm nhiều bước liên tiếp nhau, gồm hai giai đoạn chính: giai đoạn polymer hóa, giai đoạn kết tinh

Giai đoạn polymer hóa: trong đó có sự tham gia của enzyme tổng hợp cellulose xúc tác Đầu tiên enzyme glucokinase (GK) xúc tác phản ứng phosphoryl hóa glucose thành glucose-6-phosphate (Glc-6-P) Tiếp theo Glc-6-P bị isomer hóa tạo thành glucose-1-phosphate (Glc-1-P) nhờ enzyme

pyrophosphorylase (UGP) xúc tác chuyển Glc-1-P thành UDPGlc, trong đó có

sự hiện diện của UTP Cuối cùng cellulose được tạo thành từ UDPGlc nhờ enzyme cellulose synthase và cyclic-di-GMP là yếu tố giúp hoạt hóa enzyme này

Giai đoạn kết tinh: các chuỗi bắt đầu được tổng hợp nối với nhau bằng liên kết β-1,4-glucan Các chuỗi glucan kết hợp với nhau bằng liên kết Van der Waals tạo nên lớp các chuỗi glucan Lớp này chỉ tồn tại trong một thời gian ngắn, sau đó các lớp này sẽ kết hợp với nhau bằng liên kết hydro tạo thành các sợi cơ bản thường gồm 16 chuỗi glucan Các sợi cơ bản tiếp tục kết hợp với nhau tạo thành vi sợi, rồi sau đó tạo thành các bó và thành các sợi Kích thước, hình dạng, độ trong suốt, tỷ lệ các dạng của cellulose tùy thuộc vào vị trí xúc tác của phức chất enzyme

Trang 32

Hình 2.4: Con đường dự đoán của quá trình sinh tổng hợp và tiết

ra cellulose khi glucose được tế bào A xylinum hấp thụ từ bên ngoài [43]

Chu trình Pentose phosphate

Chu trình Krebs

PGI

FK

Fru-6-P Fructose

PTS

Fru-1-P

ATP ADP

PGA G6PDH

(NAD, NADP)

Glucose

Glc-6-P

GK ADP

Trang 33

- UDPGlc pyrophosphorylase là enzyme quyết định sự tổng hợp cellulose vì vài kiểu hình đột biến không tổng hợp cellulose thiếu enzyme này (Valla et al.,1989)

- Hơn nữa, hoạt tính pyrophosphorylase khác nhau giữa những loài A

xylinum khác nhau và hoạt tính cao nhất thì được phát hiện trong những loài

sản xuất cellulose hiệu quả nhất như là A xylinum ssp sucrofermentans

1.5 Nguyên liệu để nuôi Acetobacter xylinum nhằm thu BC

1.5.1 Nước dừa già

- Nước dừa già là môi trường cổ điển để thu nhận BC từ A xylinum Đây

là môi trường chứa nhiều chất dinh dưỡng và các chất kích thích sinh trưởng: 1,3 diphenyllurea, hexitol, cytokinin, myo-inositol, sorbitol…

- Dừa sau khi thu hoạch thường được bảo quản từ 3 ngày rồi đem sử dụng làm môi trường lên men Nếu để lâu lượng đường trong nước dừa giảm, chất lượng dinh dưỡng của nước dừa cũng không đảm bảo Môi trường nước dừa cần cung cấp thêm nguồn cacbon (sucrose, glucose hoặc nguồn cacbon khác), nguồn nitơ (SA, DAP)

1.5.2 Rỉ đường

- Là phần nước đường không thể kết tinh hết cũng như còn lẫn các tạp chất sau khi ly tâm nhiều lần nước mía để tách lấy đường kết tinh Rỉ đường là một hỗn hợp khá phức tạp Ngoài lượng đường khá cao, rỉ đường còn chứa các hợp chất nitrogen, vitamin và các hợp chất vô cơ khác

- Thành phần của rỉ đường có chứa 15 – 20% nước, 80 – 85% chất khô hòa tan và nhiều loại vitamin như: thiamine, riboflavin, acid nicotinic, acid folic, biotin …

Trang 34

- Chất khô hòa tan trong rỉ đường gồm:

 Đường tổng số chiếm hơn 50%, trong đó saccharose chiếm 30 – 35%, đường khử chiếm 15 – 20% (gồm glucose, fructose) Chất khử không lên men thường chiếm 1,7%

 Thành phần chất khô còn lại chiếm dưới 50%, trong đó có 30 – 32% chất hữu cơ và chất vô cơ 18 – 20%

- Khi được bảo quản lâu ngày, chất lượng rỉ đường thường giảm Vì vậy cần có chế độ bảo quản hợp ý để quá trình lên men đạt hiệu quả cao

- Ngoài ra, còn sử dụng nước mía và các nguyên liệu khác từ công nghiệp thực phẩm để lên men thu BC [7]

1.6 Các phương pháp sản xuất BC

1.6.1 Nhân giống

- Giống vi khuẩn Acetobacter xylinum được giữa trong ống thạch

nghiêng trong điều kiện lạnh sâu Khi cần nuôi cấy thì tiến hành hoạt hóa chúng Khi lấy giống ra sử dụng cần cấy chuyền qua môi trường rắn

- Cấy khuẩn lạc vào ống nghiệm chứa môi trường lỏng đã hấp khử trùng, hoạt hóa ở nhiệt độ 28°C trong 18 – 24 giờ được giống cấp 1 Giống cấp 1 có thể tiếp tục được nhân giống cấp 2, 3… Tỉ lệ giống so với môi trường từ 1 – 10%

1.6.2 Lên men

 Lên men tĩnh: môi trường dinh dưỡng để lên men A xylinum

được cho vào các khay lên men có bề mặt thoáng rộng Trong quá trình lên men các khay được đậy bằng giấy báo có độ xốp, giúp tạo độ thông khí giữa môi trường lên men và môi trường bên ngoài nhưng vẫn tránh được khả năng nhiễm khuẩn Nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men 28 - 30°C Sợi cellulose mới được tổng hợp sẽ di chuyển lên bề mặt môi trường nuôi cấy tạo thành lớp màng cellulos nằm ở mặt phân cách giữa môi trường lỏng và không khí Cellulose tiếp tục được tổng hợp bám lên màng cellulose bên trên Sau 7 –

10 ngày có thể thu BC

Trang 35

Hình 2.6: Miếng BC được hình thành từ lên men tĩnh [24]

môi trường nuôi cấy lắc Cấy dịch huyền phù vi khuẩn đã được hoạt hóa vào môi trường nuôi cấy đã chuẩn bị sẵn trong các bình erlen rồi đem đi lắc trong các máy lắc ổn nhiệt ở 28 - 30°C, 180 – 200 vòng/phút BC được tạo từ môi trường lắc có dạng hạt nhỏ, hạt hình sao và các sợi dài, chúng phân tán rất tốt

sinh trưởng và khả năng tổng hợp BC của vi khuẩn A xylinum Do đó, quá

trình lên men đạt hiệu quả cao, các reactor có sục khí thường xuyên được sử dụng để lên men

Hình 2.7: Hạt BC được hình thành từ nuôi cấy lắc [24]

Trang 36

Tác nhân vận chuyển thuốc

Da nhân tạo Chất làm co mạch

Đánh móng dày và mỏng hơn

Hấp thu chất độc Quần áo, giày dép tự phân hủy

Trang 37

Tả lót có thể tái chế Màng rung động âm thanh Môi trường nuôi cấy mô thực vật

Hình 2.8: Sản phẩm trị bỏng da Biofill thương mại làm từ màng BC[7]

Hình 2.9: Ứng dụng BC làm giá

thể nuôi cấy cụm chồi thuốc

lá[7]

Hình 2.10: Ứng dụng BC trong vật liệu mới làm tấm xốp [7]

Trang 38

 Ứng dụng BC làm giá đỡ nuôi cấy tế bào vi sinh vật

 BC phù hợp với các yêu cầu cơ bản của giá đỡ trong kĩ thuật nuôi cấy tế bào vi sinh vật

 Phù hợp hình dạng thiết bị phản ứng sinh học: hình dạng, kích thước của sản phẩm BC rất đa dạng và có thể chủ động tạo ra hình dạng mong muốn Đây là ưu điểm của BC so với các giá đỡ khác

 BC có tính cơ lý bền và ổn định: độ chịu lực của BC khá cao Tính chất cơ lý bền và ổn định của BC giúp cho BC chịu được sự tác động của môi trường như khuấy trộn hoặc các áp lực

 BC không tan trong môi trường phản ứng

 Giá đỡ BC có độ trương nở tốt: độ trương nở cao giúp cho sự khuếch tán của cơ chất, sản phẩm Môi trường trong và ngoài giá đỡ không có

sự khác biệt giúp cho tế bào vi sinh vật giữ nguyên được các đặc điểm sinh hóa của tế bào tự do

 BC đã qua xử lý không gây tác động kìm hãm đến hoạt động sống của vi sinh vật vì sau giai đoạn xủ lý, BC chỉ là giá đỡ trơ về mặt hóa học và có độ trương nở tốt

 Giá thành BC: so với các vật liệu khác thì BC thấp hơn rất nhiều

 BC có khả năng tái sử dụng

 BC an toàn cho môi trường sống

Thuận lợi của việc sản xuất BC theo phương pháp lên men là: tốc độ sinh sản nhanh, trang thiết bị đơn giản, giá thành rẻ Tuy nhiên điểm hạn chế của nó là không thể nuôi cấy những vi sinh vật tạo ra cellulase vì bản chất của

BC là cellulose [12]

Trang 39

2 Giới thiệu về Saccharomyces cerevisiae

2.1 Đặc điểm của S cerevisiae

- S cerevisiae là tế bào nhân chuẩn đơn bào, được dùng làm đối tượng

mô hình cho nghiên cứu sinh vật nhân chuẩn

- Ứng dụng sớm trong lên men rượu và làm bánh mì Hiện nay ứng dụng trong công nghiệp lên men rượu với quy mô lớn

- Đối tượng sinh vật nhân chuẩn đơn bào dùng để sản xuất protein tái tổ hợp

2.1.1 Cấu tạo và sinh sản của S cerevisiae

- Phân loại:

Giới: Nấm

Ngành: Ascomycota Lớp: Saccharomycetes Bộ: Saccharomycetales Họ: Saccharomycetaceae Giống: Saccharomyces Loài: Saccharomyces cerevisiae

- Saccharomyces cerevisiae là sinh vật đơn bào, tế bào giống như ở động

Trang 40

Hình 2.12: Khuẩn lạc S cerevisiae trên môi trường Hansen

- Nhân của tế bào S cerevisiae có chứa 17 đôi nhiễm sắc thể Ngoài nhiễm sắc thể, trong nhân tế bào S serevisiae còn có thể có plasmid có cấu tạo

là 1 phân tử DNA vòng chứa 6300 đôi base và có kích thước 2μm, có khả năng sao chép độc lập, mang thông tin di truyền, có vai trò quan trọng trong thao tác chuyển gen của kĩ thuật di truyền[3]

- Cũng như các cơ thể sống khác, thành phần chủ yếu của tế bào nấm men là nước (chiếm khoảng 75% khối lượng chung) Thành phần sinh khối khô của nấm men :

- Chất khô của tế bào nấm men gồm 23 – 28% là chất hữu cơ và 5 – 7%

là chất tro Chất hữu cơ gồm: protein 13 – 14%, glycogen 6 – 8%, cellulose 1,8 – 2%, chất béo 0,5 – 2%

 Protein: nấm men có hàm lượng protein trung bình khoảng 50% (tính theo chất khô) và khoảng 45% chất khô protein hoàn chỉnh Các dẫn xuất của acid nucleic như base, purin, pyrimidin, các acid amin tự do đều được coi

là nguyên liệu

 Glycogen: là chất dự trữ nguồn cacbon Khi trong môi trường thiếu nguồn cacbon dinh dưỡng, glycogen sẽ được huy động tham gia vào quá trình tiêu hóa của nấm men và giải phóng ra nước, CO2

Định dạng
Số trang	156
Dung lượng	6,92 MB