Phát triển hệ thống tái sinh In Vitro nhằm phục vụ chuyển gen ở Cây Lạc (Arachis Hypogaea L.)

Bảng 2.2 Thành phần các loại môi trường nuôi cấy dùng cho hệ thống tái sinh cây từ phôi soma 29 Bảng 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ BAP và tổ hợp BAP với NAA đến khả năng cảm ứng tạo chồi 3

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

PHẠM VIỆT HẢI

PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG TÁI SINH IN VITRO

NHẰM PHỤC VỤ CHUYỂN GEN Ở CÂY LẠC

(ARACHIS HYPOGAEA L.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN – 2013

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

PHẠM VIỆT HẢI

PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG TÁI SINH IN VITRO

NHẰM PHỤC VỤ CHUYỂN GEN Ở CÂY LẠC

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

THAI NGUYEN UNIVERSITY THE COLLEGE OF EDUCATION

-

PHAM VIET HAI

DEVELOPMENT OF REGENERATION SYSTEM IN VITRO TO SERVE THE GENE TRANSFER IN PEANUT

CULTIVARS (ARACHIS HYPOGAEA)

MASTER THESIS IN BIOLOGY Specialyty: GENETICS Code: 60 42 01 21

Scientific supervisor: Prof CHU HOANG MAU Ph.D

THAI NGUYEN – 2013

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố

Tác giả luận văn

Phạm Việt Hải

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS.TS Chu Hoàng Mậu đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Sau Đại học, Ban chủ nhiệm khoa Sinh –

Kỹ thuật Nông nghiệp và các thầy cô giáo, cán bộ của Khoa đã quan tâm giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Thị Tâm, TS Vũ Thị Thu Thuỷ, NCS Nguyễn Thị Thu Ngà, chị Trần Thị Hồng, chị Đào Thu Thủy và các thầy cô

Bộ môn Di truyền & Sinh học hiện đại, khoa Sinh – Kỹ thuật Nông nghiệp, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên

Tôi xin cảm ơn Trung tâm nghiên cứu và Phát triển đậu đỗ, Viện cây lương thực và cây thực phẩm - Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam đã cung cấp các giống lạc làm vật liệu cho các thí nghiệm của đề tài

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cha mẹ, mợ, anh chị và các em trong gia đình tôi đã giúp đỡ, động viên tôi rất nhiều trong quá trình học tập của mình

Tác giả luận văn

Phạm Việt Hải

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn iii

Mục lục iiii

Những chữ viết tắt v

Danh mục các bảng vi

Danh mục các hình viii

MỞ ĐẦU 1

Chương I Tổng quan tài liệu 3

1.1 Cây lạc 3

1.1.1 Nguồn gốc, phân bố, phân loại, đặc điểm sinh học cây lạc 3

1.1.2 Giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế của cây lạc…… ……… 5

1.1.3 Tình hình sản xuất lạc trên thế giới và Việt Nam 7

1.2 Hệ thống tái sinh in vitro ở cây lạc 11

1.2.1 Cơ sở khoa học của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 11

1.2.2 Ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật Error! Bookmark not defined.12 1.2.3 Tái sinh cây 13

1.2.4 Nghiên cứu hệ thống tái sinh phục vụ chuyển gen ở cây lạc 15

1.2.5 Hệ thống tái sinh và chuyển gen gián tiếp ở cây lạc ……… 18

Chương II Nguyên liêu và phương pháp nghiên cứu 23

2.1 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị 23

2.1.1 Nguyên liệu 23

2.1.2 Hóa chất và thiết bị 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu 23

2.2.1 Phương pháp nuôi cấy in vitro 24

2.2.2 Phương pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu 30

Chương III Kết quả và thảo luận 31

3.1 Ảnh hưởng của nồng độ các chất đến kết quả khử trùng hạt 31

3.2 Kết quả tái sinh cây lạc từ nách lá mầm 32

3.2.1 Môi trường tạo sự nảy mầm cho hạt lạc 32

3.2.2 Môi trường cảm ứng chồi ở nách lá mầm 32

3.2.3 Môi trường kéo dài chồi của hai giống lạc 38

3.2.4 Môi trường ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh 40

3.2.5 Nhận xét về môi trường tái sinh chồi từ nách lá mầm 41

3.3 Kết quả tái sinh từ mô sẹo phôi trục hạt lạc 42

3.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ 2,4D đến khả năng tạo mô sẹo từ phôi lạc 42

3.3.2 Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh cây từ mô sẹo phôi lạc 45

3.3.3 Môi trường tạo rễ của chồi tái sinh từ mô sẹo 48

3.3.4 Nhận xét về môi trường tái sinh cây lạc từ mô sẹo phôi 49

3.4 Kết quả tái sinh thông qua sự hình thành phôi soma 49

3.4.1 Môi trường cảm ứng tạo cụm phôi soma của phôi trục hạt lạc 49

3.4.2 Môi trường tái sinh cây từ phôi soma 53

3.4.3 Khả năng ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh từ phôi soma 56

3.4.4 Nhận xét về môi trường tái sinh cây lạc từ phôi soma 57

3.5 Ra cây và chế độ chăm sóc 57

3.6 So sánh hiệu quả tái sinh từ ba hệ thống sinh khác nhau trên cùng một giống lạc……… 59

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 61

TÀI LIỆU THAM KHẢO 63

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

2,4D 2,4-Dichlorophenoxy acetic acid

BAP 6 - Benzyl Amino Purin

cs Cộng sự

DNA Deoxyribonucleic acid

EM Môi trường phát triển phôi soma

GA3 Gibberellic acid

GM Môi trường nảy mầm hạt

IAA ß – indol axetic acid

IBA Indole butyric acid

KN Kinitin

MS Murashige – Skoog (1962)

NAA Naphthyl acetic acid

PM Môi trường tiền cảm ứng phôi soma

RIM Môi trường cảm ứng ra rễ của chồi

RM Môi trường ra rễ cho phôi soma

SEM Môi trường kéo dài chồi

SIM Môi trường cảm ứng tạo chồi

SM Môi trường nảy mầm phôi soma

TB Trung bình

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Tình hình sản xuất lạc trên thế giới ( 2002 - 2007) 7 Bảng 1.2 Các quốc gia sản xuất lạc nhiều nhất trên thế giới 9

Bảng 1.4 Diện tích, năng suất, sản lượng lạc của các vùng trọng

điểm ở Việt Nam năm 2009

11

Bảng 1.5 Một số báo cáo chuyển gen ở cây lạc thông qua vi

khuẩn A tumefaciens (trước năm 2000)

Bảng 2.2 Thành phần các loại môi trường nuôi cấy dùng cho hệ

thống tái sinh cây từ phôi soma

29

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ BAP và tổ hợp BAP với NAA

đến khả năng cảm ứng tạo chồi

35

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của tác động gây thương tổn đến khả năng

tạo đa chồi trên môi trường cảm ứng tạo chồi tốt nhất

37

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của BAP và tổ hợp của BAP với NAA đến

khả năng kéo dài chồi

độ 2,4-D Bảng 3.7 Ảnh hưởng của BAP và tổ hợp BAP với NAA đến tỷ lệ

tái sinh chồi từ mô sẹo (%)

46

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của BAP và tổ hợp BAP với NAA đến khả

năng tạo chồi ở mô sẹo lạc sau 4 tuần tái sinh

48

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của nồng độ khác nhau của 2,4-D đến khả

năng cảm ứng phôi soma của các giống lạc (%)

50

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của BAP và tổ hợp BAP với NAA đến khả

năng tái sinh cây của phôi soma sau 8 tuần

53

Bảng 3.11 Hiệu quả tái sinh của các hệ thống tái sinh 59

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 3.1 Hạt giống L26 nuôi cấy trên môi trường GM sau 7 ngày 32 Hình 3.2 Hình ảnh giống L23 nuôi cấy trên môi trường cảm ứng

chồi SIM

34

Hình 3.3 Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và NAA đến khả năng cảm

ứng tạo chồi của các giống lạc sau 6 tuần nuôi cấy

36

Hình 3.4 Mảnh lá mầm cảm ứng tạo đa chồi sau khi gây thương

tổn và không gây tổn thương

38

Hình 3.5 Chồi được tách ra khỏi cụm đa chồi để nuôi kéo dài chồi

ở giống lạc L23

39

Hình 3.6 Hình ảnh cây lạc ra rễ trên môi trường bổ sung 0,3mg/l

NAA (A) và 0,3mg/l IBA (B)

41

Hình 3.7 Hình ảnh mô sẹo phôi lạc sau 10 ngày nuôi cấy trên môi

trường có bổ sung 12mg/l 2,4D của giống L23 (A) và L26 (B)

Hình 3.14 Sự sinh trưởng của cây tái sinh trong ống nghiệm 58

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Cây lạc (Arachis hypogaea L.) là cây công nghiệp ngắn ngày được trồng phổ

biến ở nước ta và nhiều vùng trên thế giới Sản phẩm thu từ hạt lạc có giá trị dinh dưỡng cao nên lạc đã được sử dụng làm thực phẩm cho người, chế biến thức ăn cho gia súc và dùng làm nguyên liệu cho nhiều ngành công nghiệp chế biến khác Những năm gần đây, việc tổng kết kinh nghiệm thực tiễn trong canh tác và nhân giống thông thường đã góp phần cải thiện đáng kể năng suất lạc Tuy nhiên,

do tính chất áp dụng giới hạn của nó, nhiều đặc điểm nông sinh học quan trọng vẫn chưa được cải thiện như: khả năng chống côn trùng, tuyến trùng, sâu bệnh phá hại, kháng các loại virus, vi khuẩn, nấm gây bệnh; khả năng chống chịu của giống trước tác động bất lợi của các tác nhân phi sinh học như: nóng, hạn, mặn, lạnh, thuốc diệt cỏ,… Ngoài ra, một vấn đề khác cũng cần được quan tâm đó là việc nâng cao chất lượng dinh dưỡng trong hạt lạc bằng sự tăng cường thành phần của các loại amino acid không thay thế và các loại acid béo chưa no Việc kết hợp giữa chọn giống truyền thống với công nghệ sinh học hiện đại thực sự là chìa khóa cho việc cải thiện, nâng cao hay tạo ra các giống lạc có khả năng chống chịu tốt hơn với điều kiện bất lợi của ngoại cảnh đồng thời vẫn giữ lại các phẩm chất tốt sẵn có của giống như năng suất và chất lượng cao, đây là điều rất khó hoặc không thể thực hiện được bằng phương pháp lai tạo giống truyền thống

Chuyển gen là kỹ thuật cho phép đưa một hay một số gen nhất định nào đó vào hệ gen của cây chủ được quan tâm để tạo ra những cây trồng biến đổi gen nhằm cải thiện một số đặc tính hay tính trạng theo hướng có lợi cho con người Chuyển gen đang là hướng nghiên cứu có nhiều triển vọng, đã được tiến hành thực nghiệm trên nhiều đối tượng cây trồng như: cà chua, ngô, bông, lúa, đậu tương

và đã được ứng dụng ở nhiều nước trên thế giới Trong đó, chuyển gen gián tiếp

thông qua vi khuẩn Agrobacterium Tumefaciens (A Tumefaciens) tỏ ra có ưu thế

hơn các kỹ thuật chuyển gen khác do ít tốn kém, quy trình đơn giản, nhanh chóng,

dễ dàng áp dụng trên nhiều đối tượng cây trồng Ở nước ta việc chuyển gen nhờ vi

khuẩn A tumefaciens vào cây trồng đã được tiến hành trên các đối tượng cây lúa,

thuốc lá, đậu tương, cà chua còn đối với cây lạc, việc nghiên cứu phát triển hệ thống tái sinh và chuyển gen vẫn đang là điều khá mới mẻ Từ những lý do trên,

chúng tôi đã chọn đề tài: “Phát triển hệ thống tái sinh in vitro nhằm phục vụ chuyển gen ở cây lạc (Arachis hypogaea L.)”

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Xây dựng quy trình tái sinh đa chồi tối ưu in vitro từ nách lá mầm lạc Ra rễ, tạo cây hoàn chỉnh và chuyển cây lạc tái sinh in vitro ra môi trường tự nhiên

- Xác định môi trường tối ưu tái sinh in vitro cây lạc từ mô sẹo phôi trục và từ

phôi soma có nguồn gốc từ phôi trục hạt lạc, so sánh hiệu quả của các hệ thống tái sinh khác nhau trên cùng một giống lạc

3 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu điều kiện khử trùng tối ưu cho hạt lạc sử dụng trong các thí nghiệm

nuôi cấy mô in vitro

- Khảo sát môi trường tạo đa chồi từ nách lá mầm, môi trường kéo dài chồi, ra rễ

và tạo cây hoàn chỉnh

- Khảo sát môi trường tạo mô sẹo từ phôi trục hạt lạc, tái sinh cây từ mô sẹo, ra rễ

và tạo cây lạc hoàn chỉnh in vitro

- Khảo sát môi trường cảm ứng phôi soma, tái sinh cây lạc hoàn chỉnh từ phôi soma

- Tìm điều kiện tốt nhất chuyển cây lạc tái sinh in vitro ra môi trường tự nhiên

- Đánh giá hiệu quả tái sinh của các hệ thống tái sinh khác nhau ở cây lạc

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY LẠC

1.1.1 Nguồn gốc, phân bố, phân loại, đặc điểm sinh học cây lạc

Cây lạc (Arachis hypogaea L.) tên tiếng Anh là peanut, groundnut Ở Việt

Nam, lạc còn có cái tên khác là đậu phộng, đậu phụng Lạc có nguồn gốc ở Nam

Mỹ, từ vùng đất này hạt của nó đã được đưa đi đem trồng ở nhiều nơi trên thế giới Nó nhanh chóng thích ứng với các vùng nhiệt đới, Á nhiệt đới, các vùng có khí hậu ẩm và đã trở thành một loại cây trồng phổ biến trên thế giới và Việt Nam [4] Các tài liệu nghiên cứu về lạc đều cho rằng cây lạc có thể được nhập từ Trung Quốc vào nước ta từ thế kỷ XVII – XVIII [7]

Loài lạc trồng có tên khoa học là Arachis hypogaea L., có bộ nhiễm sắc thể 2n= 40, thuộc họ đậu Fabacaea, phân họ cánh bướm Papillionaceae, chi: Arachis, dạng cây thảo hàng năm Phân loại dưới loài của loài lạc trồng gồm 2 loài phụ với

+ Thứ Vulgaris: Dạng Spanish (Gregory,1951), (trồng ở Guaranian, Goias

và Minas Gerais; Tây bắc Bzaxin)

Ở Việt Nam, các giống lạc được tuyển chọn từ nhiều nguồn khác nhau và chúng đều thuộc dạng Spanish, có tập tính sinh trưởng thành cụm [3]

Về đặc điểm hình thái, cây lạc có các bộ phận chính là: Rễ, thân, lá, hoa và quả:

Rễ cây lạc thuộc loại rễ cọc bao gồm rễ chính và rễ bên Bộ rễ hoàn chỉnh

có thể ăn sâu 18cm – 30cm và rộng khoảng 30cm – 40cm Rễ lạc có đặc điểm không có biểu bì, không có lông hút thật Sau khi gieo từ 15 – 30 ngày, những

nốt sần đầu tiên xuất hiện do loại vi khuẩn Rhizobium cộng sinh với hệ rễ,

lượng nốt sần đạt cực đại vào thời kỳ ra hoa – hình thành quả và hạt Tại nốt sần xảy ra quá trình cố định đạm từ nitơ không khí và cung cấp chất dinh dưỡng cho cây [3], [6], [7]

Thân cây lạc mềm thuộc loại thân thảo ít gỗ Khi còn non thân thường tròn và đặc, khi thân già có hình góc cạnh và rỗng giữa Thân cây lạc thường cao 15 – 70cm, trên thân có lông với số lượng và màu sắc tùy giống Tốc độ tăng trưởng của thân tăng dần và đạt cao nhất ở thời kỳ ra hoa rộ Cây lạc phân cành ngay từ gốc với nhiều cấp (1,2,3 ) và chia làm hai loại cành: cành sinh dưỡng và cành sinh sản Cành cấp 1 được mọc từ gốc thường có nhiều hoa, cành cấp 2 được mọc từ cành cấp 1 và thường có ít hoa hơn Số cành/cây khác nhau tùy theo giống và có ảnh hưởng trực tiếp đến số hoa và quả của cây [2], [5], [6], [7]

Lá lạc thuộc lá kép lông chim chẵn, gồm 2 đôi lá chét Cuống lá dài 9cm, ở chân lá kép và lá chét có mô tế bào có khả năng trữ nước, làm lá ban ngày xòe ra, ban đêm cụp lại Số lượng lá của một cây thay đổi tùy thời vụ, giống và chế độ chăm sóc Hai lá mầm có vai trò cung cấp chất dinh dưỡng cho cây ở giai đoạn đầu Hai lá kèm hình mũi mác có nhiệm vụ bảo vệ mầm,

4-lá thật có màu xanh thẫm Diện tích 4-lá đạt tối đa ở thời kỳ hình thành quả và hạt nhưng lại giảm nhanh và có thể đạt giá trị âm vào thời kỳ chín Khi hoa tắt thì lá không mọc nữa Hoa tắt được vài ngày bộ lá chuyển sang màu vàng Lúc quả chín bộ lá chuyển sang màu đen và rụng [6], [7]

Hoa lạc mọc ở nách lá thành từng chùm từ 3-5 hoa/chùm Khi cây có từ 9-10

lá thật thì hoa nở, hoa tự thụ phấn nghiêm ngặt, tỷ lệ ngoại phấn 0,25% Khi hoa

nở là đã thụ phấn xong, sau đó cuống nhụy mọc dài, nghiêng xuống, đầu bầu nhụy

cắm vào đất Như vậy hoa nở trên cành còn làm quả ở dưới đất Quá trình phân hóa hoa kéo dài nên quá trình nở hoa cũng kéo dài [6], [7]

Quả lạc là loại quả khô hình kén, thường có 2 hạt có thể có 1 hoặc 3 hạt Quả lạc bao gồm gốc quả, mỏ quả và eo quả Eo rõ hay không rõ, vỏ quả có gân hay không có gân là đặc điểm khác nhau giữa các giống [6], [7]

Căn cứ vào thời gian sinh trưởng của cây lạc, người ta chia thành giống chín sớm (thời gian sinh trưởng 90-105 ngày) và chín muộn (140-160 ngày) Nhiệt độ thích hợp cho cây lạc ra hoa là 24-330C, nhiệt độ giới hạn dưới cho hạt nảy mầm

là 120C và cho thụ tinh là 170C Về ánh sáng, các giống lạc trồng ở Việt Nam

thuộc chủng Spanish không mẫn cảm với độ dài ngày và thích hợp với điều kiện

ánh sáng ít Thời kỳ nảy mầm, ánh sáng làm giảm tốc độ hút nước của hạt và giảm

sự sinh trưởng của rễ phôi và trụ phôi Đất thích hợp nhất cho trồng lạc là đất có màu sáng, thoát nước nhanh, dễ vỡ, lượng canxi, lân, chất hữu cơ vừa phải, mùn ít hơn 2%, pH= 6,0-6,4 Cây lạc cần các nguyên tố khoáng đa lượng như: N, P, K,

Ca, Mg, S và vi lượng như: Bo, Mo, Cu, Mn, Zn,Fe Yêu cầu độ ẩm đối với lạc tương đối cao, từ 60 – 70%, lương mưa phân bố đều Cây lạc chỉ có khả năng chịu hạn tương đối ở một số thời kỳ sinh trưởng nhất định, ngoài ra thiếu nước đều ảnh hưởng xấu đến năng suất lạc [1], [6], [7]

1.1.2 Giá trị dinh dƣỡng và giá trị kinh tế của cây lạc

Sản phẩm thu từ hạt lạc rất có giá trị về mặt dinh dưỡng, hạt lạc có tỷ lệ dầu rất lớn (43-55%), tỷ lệ protein cao (25-28%) [46] Trong dầu lạc, các loại axit béo chưa no chiếm một lượng lớn (khoảng 80%) đây chính là loại dầu thực phẩm rất tốt không chứa choresterol nên việc sử dụng chúng có tác dụng phòng chống một

số bệnh huyết áp cao, béo phì, hiện tượng xơ vữa mạch máu, Bên cạnh đó, trong hạt lạc còn chứa 8 amino acid không thay thế và các loại vitamin quan trọng khác như vitamin E, B, D, PP Vì giá trị dinh dưỡng cao như vậy nên lạc là một trong những cây thực phẩm quan trọng trong trong đời sống của người dân [1], [5], nó

có thể được sử dụng trực tiếp (quả non luộc, quả già rang, nấu ) hoặc ép làm dầu

ăn thực vật hoặc làm nguyên liệu trong các ngành công nghiệp chế biến

Gần đây ngành công nghiệp thực phẩm phát triển, người ta đã chế biến rất nhiều mặt hàng thực phẩm có giá trị từ lạc như rút dầu, bơ lạc, pho mát lạc, sữa lạc, kẹo lạc Bên cạnh đó cũng phải kể đến việc lạc còn được sử dụng trong chăn nuôi, từ lạc người ta có thể sử dụng khô dầu, thân lá xanh và cả cám vỏ quả lạc để làm thức ăn cho gia súc, góp phần quan trọng trong việc phát triển chăn nuôi Khô dầu lạc là nguồn thức ăn giầu protein, hiện nay khô dầu lạc trên thế giới đứng hàng thứ 3 trong các loại khô dầu thực vật dùng trong chăn nuôi (sau khô dầu đậu tương và bông) Thân lá lạc (sau thu hoạch quả) làm thức ăn xanh trong chăn nuôi đại gia súc Vỏ quả lạc cũng có thể nghiền thành cám, cám vỏ quả lạc có thành phần dinh dưỡng tương đương với cám gạo dùng trong chăn nuôi rất tốt [1], [5] Ngoài giá trị sử dụng như là một nguồn thực phẩm giàu dinh dưỡng đối với người và gia súc, cây lạc còn là một cây trồng có giá trị bồi dưỡng và cải tạo đất trong hệ thống luân canh, đặc biệt là trên đất bạc màu nghèo dinh dưỡng Cây lạc

là cây trồng có khả năng thích ứng rộng, có khối lượng sinh khối cao, thân lá lạc là nguồn phân xanh quan trọng, có thể cày vùi ngay tại ruộng hoặc ủ làm phân Điều

đặc biệt quan trọng là ở rễ lạc có nốt sần do vi khuẩn cố định đạm Rhizobium tạo

nên, có khả năng cố định nitơ khí quyển tổng hợp thành đạm Nhờ khả năng cố định đạm này mà sau khi thu hoạch thành phần hóa tính của đất trồng được cải thiện rõ rệt, lượng đạm trong đất tăng (sau một vụ, lạc sẽ để lại trong đất 40-60kg N/ha) và khu hệ vi sinh vật hiếu khí trong đất được tăng cường có lợi đối với cây trồng vụ sau Lạc cũng là cây trồng có khả năng tạo ra tính đa dạng hoá cho sản xuất nông nghiệp bằng các hình thức trồng thuần, xen canh, gối vụ để nâng cao hiệu quả cho sản xuất nông nghiệp [4]

Về mặt kinh tế, cây lạc là cây công nghiệp ngắn ngày, một trong những cây trồng kinh tế chủ yếu trên thế giới Khoảng 75% lạc sản xuất toàn cầu được sử dụng để chiết xuất dầu và còn lại 25% được tiêu thụ làm thực phẩm Ở nước ta,

hạt lạc là mặt hàng nông sản xuất khẩu đem lại lợi nhuận cao, nó là mặt hàng nông phẩm quan trọng xếp thứ 18 về giá trị hàng hóa trong tổng số 20 mặt hàng thực phẩm và nông sản quan trọng nhất của cả nước [48] Chính vì có giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế cao nên cây lạc luôn là một trong những chương trình được ưu tiên phát triển trong nước

1.1.3 Tình hình sản xuất lạc trên thế giới và Việt Nam

Trong các cây họ đậu, lạc có diện tích, sản lượng đứng thứ hai sau đỗ tương

và được trồng khắp các châu lục, phần lớn lạc được canh tác ở các vùng nhiệt đới

và Á nhiệt đới của thế giới Trong năm 2001, tổng diện tích trồng lạc của thế giới

là trên 24,8 triệu ha và sản xuất hơn 32,8 triệu tấn, với năng suất trung bình tương đương với 1.32 tấn mỗi ha [67] Tuy nhiên từ năm 2002 đến 2007 đã có những sự thay đổi liên tục về diện tích gieo trồng, năng suất và sản lượng lạc trung bình thu được Trong những năm từ 2002 - 2007 diện tích đất trồng lạc của thế giới có xu hướng giảm nhưng năng suất trung bình và sản lượng thu được lại tăng lên trông thấy Năm 2002 diện tích trồng lạc khoảng 23.518,30 triệu ha , năng suất trung bình là 14,15 tạ/ha, sản lượng đạt 33.265,30 triệu tấn Năm 2004 diện tích tăng đột biến lên tới 26.375,76 triệu ha, năng suất tăng nhẹ lên 13,67 tạ/ha, sản lượng đạt 36.057,28 triệu tấn Đến năm 2007 diện tích đất trồng lạc giảm xuống đột ngột chỉ còn khoảng 23.105 triệu ha, nhưng năng suất lại tăng cao đạt 16,08 tạ/ha và sản lượng đạt 37.114,13 triệu tấn [49] (Bảng 1.1)

Bảng 1.1 Tình hình sản xuất lạc trên thế giới ( 2002 - 2007)

(triệu ha)

Năng suất (tạ/ha)

Sản lƣợng (Triệu tấn)

2007 23.105,41 16,08 37.114,13

(Nguồn: Số liệu thống kê FAOSTAT, 2008)

Tính đến năm 2009, lạc được trồng trên gần 23,95 triệu ha trên toàn thế giới với tổng sản lượng là 36,45 triệu tấn và năng suất trung bình là 1,52 tấn/ha Các nước đang phát triển ở Châu Á, Châu Phi và Nam Mỹ chiếm trên 97% diện tích trồng và sản xuất khoảng 95% tổng sản lượng lạc toàn cầu Trong đó Châu Á đang dẫn đầu với 50% diện tích trồng và 64% sản lượng toàn cầu, tiếp theo là châu Phi với diện tích trồng chiếm khoảng 46% và sản lượng chiếm khoảng 28%, Nam Mỹ chiếm một phần nhỏ còn lại [48] Trong các nước trồng lạc phải kể đến thì Trung Quốc là nước có sản lượng lạc lớn nhất thế giới, thứ hai là Ấn Độ, thứ ba là Nigeria, Mĩ đứng ở vị trí thứ tư còn Việt Nam đứng thứ 10 trong bảng xếp hạng các quốc gia sản xuất lạc lớn nhất trên thế giới [49] (bảng 1.2)

Diện tích trồng lạc ở Đông Nam Á không nhiều, chỉ chiếm 12,61% diện tích thu hoạch và 12,95% sản lượng lạc của toàn Châu Á Trong số các nước có trồng lạc ở khu vực này thì Myanmar là nước có diện tích trồng và sản lượng lạc lớn nhất, tiếp theo là Indonesia, thứ ba là Việt Nam Về năng suất, nhìn chung năng suất lạc trong khu vực còn ở mức thấp, trung bình là 1,17 tấn/ha Malaysia là nước

có diện tích trồng lạc không lớn (khoảng 6000 ha) nhưng năng suất cao nhất khu vực, trung bình đạt 2,33 tấn/ha [17]

Ở Việt Nam, do cây lạc là cây trồng nhiệt đới và á nhiệt đới, hơn nữa yêu cầu

về đất đai không quá khắt khe nên nó được trồng rộng rãi hầu hết ở các tỉnh, thành trong cả nước Theo số liệu thống kê năm 2010 của tổng cục thống kê (bảng 1.3),

từ năm 2000 đến năm 2009 diện tích trồng lạc ở nước ta chỉ dao động trong khoảng 244,9 đến 269,6 nghìn ha, nhưng năng suất và sản lượng lạc không ngừng tăng Năm 2000, diện tích trồng lạc là 244,9 nghìn ha, năng suất trung bình lúc đó

là 14,5 tạ/ha, sản lượng chỉ đạt 355,3 nghìn tấn Đến năm 2009 diện tích trồng lạc

ở nước ta cũng chỉ khoảng 245 nghìn ha, nhưng năng suất trung bình đã tăng lên

tới 20,85 tạ/ha, sản lượng đạt 510,9 nghìn tấn [11]

Bảng 1.2 Các quốc gia sản xuất lạc nhiều nhất trên thế giới

(Nguồn: Số liệu thống kê FAOSTAT, 2009)

Cũng theo số liệu thống kê năm 2010 của cục thống kê Việt Nam hiện nay có

5 vùng trồng lạc chính (Bảng 1.4) Trong đó vùng Bắc Trung Bộ và duyên hải

miền Trung có diện tích lớn nhất (108,1 nghìn ha) năng suất đạt 19,49 tạ/ha gần bằng năng suất trung bình của cả nước, sản lượng lớn nhất so với cả nước đạt 210,7 nghìn tấn Vùng Đồng Bằng Sông cửu Long, có diện tích trồng lạc thấp nhất chỉ khoảng 12.6 nghìn ha nhưng năng suất đạt 33.09 tạ/ha - cao nhất so với cả nước tuy nhiên sản lượng đạt thấp (41,7 nghìn tấn) do diện tích ít Vùng Trung du

và miền núi phía Bắc có năng suất thấp nhất so với cả nước (17,17 tạ/ha) [11]

Bảng 1.3 Diễn biến sản xuất lạc ở nước ta Chỉ tiêu

Năm

Diện tích (nghìn ha)

Năng suất (tạ/ha)

Sản lƣợng (nghìn tấn)

(Nguồn: Niên giám thống kê 2004-2010)

Nhìn chung năng suất lạc nước ta còn thấp do chất lượng giống, trình độ canh tác hạn chế và đặc biệt do những tác động của biến đổi khí hậu toàn cầu đã ảnh hưởng tới năng suất cây trồng nói chung và cây lạc nói riêng [7] Các vùng sản xuất lạc của nước ta lại không đồng đều về mặt điều kiện tự nhiên cũng như trình

độ sản xuất (nhất là về mặt thâm canh để tăng năng suất) vì thế năng suất cao tập trung chủ yếu ở vùng đồng bằng sông Hồng, đồng bằng sông cửu Long, Đông Nam Bộ và Vùng Bắc Trung Bộ và duyên hải miền Trung

Bảng 1.4 Diện tích, năng suất, sản lượng lạc của các vùng trọng điểm ở Việt năm 2009

Bắc Trung Bộ và duyên hải miền

Trung

(Nguồn: Niên giám thống kê năm 2010)

1.2 HỆ THỐNG TÁI SINH IN VITRO Ở CÂY LẠC

1.2.1 Cơ sở tế bào học của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

Tất cả các tế bào của một cơ thể đều mang bộ máy thông tin di truyền giống nhau Do đó chúng có tiềm năng tổng hợp nên các protein giống nhau Các tế bào được lấy từ bất kỳ mô sống nào của cơ thể thực vật (bao phấn, đỉnh sinh trưởng, lá mầm, đoạn thân, rễ…) đều có thể được kích thích để tái sinh thành cây hoàn chỉnh đặc trưng cho loài, phát triển và ra hoa kết quả bình thường, thông qua phát sinh cơ quan hoặc hình thành phôi vô tính, miễn là chúng được nuôi cấy trong điều kiện dinh dưỡng thích hợp và bổ sung các chất kích thích sinh trưởng cần thiết [57] Các loại mô đã phân hoá tách từ cơ thể thực vật có khả năng tái sinh trực tiếp thành cây hoàn chỉnh, hoặc là chúng phát triển thành tế bào mô sẹo (callus) Đó là loại tế bào không phân hoá, phân chia liên tục và có khả năng phân hoá thành phôi, chồi để tạo cây hoàn chỉnh Khả năng

đó gọi là tính toàn năng của tế bào Tính toàn năng là chính là cơ sở của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào, là cơ sở của công nghệ tế bào thực vật đang ngày càng phát triển và hoàn thiện

1.2.2 Ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật

Người ta đã phát hiện thấy 5 nhóm chất điều tiết sinh trưởng ở thực vật đó là auxin, cytokinin, ethylen, giberelin, axit absixic Những chất này được phân thành các nhóm dựa vào tính tương đồng về cấu trúc và chức năng sinh lý, tuy nhiên về chức năng nhiều khi chúng có tác động chồng chéo và hỗ trợ nhau Còn một số nhóm khác điều khiển từng giai đoạn sinh trưởng nhất định Trong nuôi cấy mô tế bào người ta thường sử dụng ba nhóm chất điều tiết sinh trưởng là dẫn xuất của auxin, cytokinin và giberelin [16], [18]

Nhóm auxin là nhóm kích thích sinh trưởng chính được các nhà sinh lý học thực vật phát hiện và quan tâm sớm nhất Auxin là những hoocmon thực vật

có tác dụng kích thích sinh trưởng, kéo dài tế bào và phân hoá cơ quan, kiểu tác động của nó liên quan đến làm chuyển đổi và mềm hoá màng tế bào Nhóm auxin bao gồm các chất sau: 2,4 Diclorophenoxy axetic axit (2,4D), α – naphtylaxetic axit (NAA), Indolaxetic axit (IAA), trong đó 2,4D dễ gây độc nhưng

có tác dụng kích quá trình phân chia tế bào và thường được sử dụng nhiều nhất, NAA có tác dụng tạo rễ cho cây con [16], [18]

Nhóm giberelin là nhóm được phát hiện qua nghiên cứu bệnh nấm lúa von

Nó tác động làm tế bào dãn ra và phân chia, làm cây lùn có thể cao lên được, như ngô lùn thành ngô cao, đậu dạng bụi thành dạng đứng Đại diện cho nhóm này là axit giberilic (GA3), được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp[16], [18]

Nhóm cytokinin là nhóm chất hoá học có ảnh hưởng quyết định đến kích thích phân chia tế bào Đại diện cho nhóm cytokinin gồm: Kinetin; 6 – Benzyl amino purine (BAP); 6- Dimethylalylamino purine (2iP); Zeatin Hiện nay một thế

hệ mới của chất điều hòa sinh trưởng, chẳng hạn như thidiazuron (TDZ) - một

cytokinin thuộc các phenylureas, đang nổi lên như là một thay thế thành công cho tái sinh trực tiếp với tần số cao của phôi vô tính [44][61]

Ethylen là nhóm có ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và phát triển của cây nhưng gần đây nó mới được coi là một hoocmon thực vật Ethylen thường được sử dụng để làm chín quả ở chuối, ra hoa đồng loạt ở dứa, nó cũng ảnh hưởng đến quá trình phân bào Đối với cà chua trong điều kiện ethylen nồng độ cao sẽ kéo dài khoảng ra rễ của thân [16], [18]

Axit absixic là hợp chất ức chế sinh trưởng thực vật tự nhiên ảnh hưởng đến tính ngủ nghỉ của hạt, mầm và rụng lá, tăng cường ra hoa cho một số cây ngắn ngày thông qua hiệu quả tổng hợp ARN và protein [16], [18]

1.2.3 Tái sinh cây

Tái sinh cây được xem là khâu mấu chốt quyết định thành công trong nuôi cấy

mô và chuyển gen ở thực vật, nhiều nhà nghiên cứu thực nghiệm thu được các tế bào sống sót nhưng lại không tái sinh được cây hoàn chỉnh Nguyên nhân là chưa xác định một cách đầy đủ đặc điểm quá trình phân hoá hình thái của sự tái sinh cây Rudrabhatla Sairam (2005) đã tổng hợp các kết quả nghiên cứu phát triển kỹ thuật tái sinh ở cây một lá mầm và cây hai lá mầm và cho rằng sự tái sinh cây có thể được

thực hiện bằng nuôi cấy in vitro từ phôi soma hoặc từ một bộ phận khác độc lập trên

cơ thể và điều đó còn phụ thuộc vào genotype của giống [71]

Tái sinh thực vật trong ống nghiệm thông qua hai con đường đó là: “Phát

sinh cơ quan” (organogenesis) điều này có thể xảy ra do sự phát triển chồi trực tiếp trên bề mặt của mẫu mô nuôi cấy [55] hoặc có thể bị xen giữa bởi một giai đoạn mô sẹo còn gọi là sự phát sinh chồi từ mô sẹo [21] và con đường thứ hai đó

là “Hình thành phôi vô tính” (embryogenesis), nơi mà thường có một tế bào hoặc

một cụm nhỏ các tế bào trải qua sự phản biệt để tạo phôi soma (phôi vô tính) phát triển thành cây hoàn chỉnh tương tự như phôi hữu tính (phôi zygotic) Sự phát sinh

cơ quan hoặc hình thành phôi vô tính có thể xảy ra trực tiếp từ mẫu mô đem nuôi cấy hoặc gián tiếp thông qua sự hình thành một mô sẹo phản biệt hóa từ mẫu mô

cấy [31] Trong phát sinh cơ quan, phần chồi thường được tạo thành đầu tiên, sau

đó rễ được tạo ra từ gốc của chồi, có sự kết nối mạch rất tốt giữa các chồi với mẫu cấy ban đầu Trong tái sinh từ phôi soma, chồi và rễ của cây tái sinh đều có nguồn gốc từ phôi soma, do cấu trúc lưỡng cực của phôi soma Trong trường hợp này thì không có mạch kết nối giữa các phôi soma và mẫu cấy [37] Sự tái sinh tạo ra toàn

bộ cây thông qua nuôi cấy mô được cho là phát sinh từ các tế bào đơn lẻ và khi đưa các gen lạ từ bên ngoài vào các tế bào này thì nó sẽ khôi phục lại cây chuyển gen mà không bị khảm

Một trong những phương thức tái sinh chồi trực tiếp đang được cho là thành công nhất trong các loại cây họ đậu là tái sinh thông qua phát sinh chồi trực tiếp từ nuôi cấy nách (mấu) lá mầm dẫn đến sự phục hồi tốt của cây chuyển gen [20] Mô phân sinh nách tại phần tiếp giáp lá mầm và trục phôi là nơi có chứa các tế bào toàn năng và vì thế có thể sẽ là mục tiêu hữu ích cho chuyển gen Các mắt lá mầm

từ hạt giống trưởng thành đã nảy mầm được chứng minh là thành công nhất cho sự cảm ứng đa chồi thông qua phát sinh cơ quan trực tiếp trong số các loại mô cấy thuộc cây họ đậu [31]

Phương thức tái sinh cây gián tiếp từ mô sẹo phụ thuộc vào nguồn gốc

mô sẹo và mô sẹo dạng phôi có nguồn gốc từ đỉnh sinh trưởng dễ tái sinh thành cây hơn [68], ngoài ra khả năng tái sinh cây cũng chịu ảnh hưởng lớn bởi thành phần và nồng độ các chất kích thích sinh trưởng thực vật được bổ sung vào môi trường nuôi cấy Phần lớn khả năng tái sinh cây từ mô sẹo có hiệu quả cao ở nhiều đối tượng cây trồng khi bổ sung các chất sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin

Hình thành phôi soma là một con đường quan trọng đối với sự tái sinh của

cây trồng từ hệ thống nuôi cấy tế bào in vitro và nó cũng là một phương pháp

thường được sử dụng trong sản xuất quy mô lớn hạt giống thực vật nhân tạo [62] Phôi soma là kết quả của một quá trình phát triển đó là từ các tế bào soma phát triển thành những cấu trúc tương tự như phôi zygotic (tức là lưỡng cực và không

có kết nối mạch với mô cấy ban đầu) thông qua một chuỗi tuần tự các giai đoạn đặc trưng phôi học mà không có sự hợp nhất của các giao tử [51] Cả hai loại phôi (phôi soma và phôi zygotic) đều phải trải qua các giai đoạn phát triển cơ bản, cụ thể là hình cầu, hình tim, hình ngư lôi, mọc lá mầm và trưởng thành Phôi soma được ưa thích dùng trong vi nhân in vitro bởi vì tiềm năng chuyển đổi thành cây

và tính phổ biến của nó là rất cao đồng thời sự xuất hiện của cây trồng khảm có thể được giảm thiểu đáng kể [80]

Theo Raghava và Nabors (1985) [66] cần phải chú ý đến các yếu tố sau khi tiến hành tái sinh:

(1) Nguồn mẫu vật nuôi cấy có tế bào sinh trưởng với tốc độ nhanh (mô phân sinh, phôi non…)

(2) Môi trường và điều kiện nuôi cấy: pH, chiếu sáng, nhiệt độ…

(3) Nồng độ và tỷ lệ thích hợp của auxin và cytokinin

(4) Số lần cấy chuyển

Khả năng tái sinh cũng chịu ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy

Sử dụng các chất chống hoại tử như một phương pháp xử lý được chứng minh là

có vai trò quan trọng trong việc làm giảm sự oxy hóa của mẫu Khả năng tự phát

triển độc lập của cây con tăng đáng kể khi xử lý mẫu cấy bằng phương pháp này

Khả năng sinh trưởng và tái sinh cây cũng tăng lên ở các mô sau khi xử lý các điều kiện cực đoan đã được nhiều tác giả đề cập (Nabors và cộng sự (cs), 1990) [58] Nguyên nhân của hiện tượng này có thể là dưới tác động của các điều kiện cực đoan

ở một mức độ và thời gian nhất định những mô hay tế bào “yếu” thường chết, chỉ còn những tế bào có sức sống cao mới sống sót và cho hiệu quả tái sinh cao

1.2.4 Nghiên cứu hệ thống tái sinh phục vụ chuyển gen ở cây lạc

Một phương thức tái sinh tốt là một điều kiện tiên quyết để đạt được thành công trong các nghiên cứu chuyển đổi di truyền Vì tái sinh thành công của cây

chuyển gen phụ thuộc vào hiệu quả của vi nhân in vitro và phương thức

chuyển gen [75] Việc nghiên cứu chuyển gen ở cây lạc cũng sẽ khó thành công

nếu trước hết không tiến hành việc tái sinh hoàn chỉnh cây lạc Nhiều khó khăn trong chuyển đổi di truyền ở lạc bao gồm các yếu tố như: tái sinh kém, thời gian tái sinh dài, thường thông qua một giai đoạn mô sẹo, và chịu ảnh hưởng của kiểu gen trên các hệ thống tái sinh vì vậy một phương pháp tái sinh có thể tránh những vấn đề này là cần thiết [27]

Tái sinh cây lạc thông qua sự hình thành phôi soma đã được thử nghiệm trên các loại mô cấy như: Lá của cây non [22], [55], [82]; phôi non hạt lạc [60]; phôi trục [56]; lá chét của phôi trục [34], [85]; trụ dưới lá mầm [83], Trong số các chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin được sử dụng cho cảm ứng sinh phôi soma đậu phộng, 2,4-D tỏ ra là có hiệu quả nhất và nó đã được sử dụng thường xuyên cho cảm ứng phôi soma Venkatachalam (1997, 1999), khi nghiên cứu sự tạo thành phôi từ nuôi cấy các lá chét và trụ dưới lá mầm tách ra từ cây giống đậu phộng khi có sự hiện diện của một trong hai chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin là 2,4-D và NAA trong môi trường nuôi cấy đã báo cáo rằng đối với sự cảm ứng phôi cũng như sản xuất phôi soma thì 2,4-D là hiệu quả hơn [82], [83] Tuy nhiên trong hầu hết các nghiên cứu đã được báo cáo thì sự chuyển đổi phôi soma thành cây con là khá thấp do sự xuất hiện hình thái bất thường tại vùng mô phân sinh đỉnh của phôi soma, điều này dẫn đến việc bị hạn chế sử dụng tái sinh thông qua phôi soma trong các nghiên cứu chuyển đổi di truyền [88] Mặc dù vậy đây vẫn là một trong những phương pháp tái sinh đầy hứa hẹn có thể phục vụ rất tốt cho các nghiên cứu chuyển đổi di truyền ở cây lạc

Để tăng tần số phục hồi cây hay khắc phục tỷ lệ chuyển đổi nghèo nàn của phôi soma thành cây con, các nỗ lực đã được thực hiện bằng cách cho các phôi nảy mầm trên môi trường nảy mầm , sau đó kích thích sự hình thành chồi từ đọt cây non của phôi bằng cách bổ sung BAP và KIN [14], [35] hoặc BAP và NAA [82], [83], [86] Trong báo cáo của mình, Chengalrayan (1997) đã thu được kết quả là 92% cây được phục hồi từ phôi soma có hình thái bất thường khi bổ sung TDZ trong môi trường MS cơ bản và để cho rễ phôi soma tiếp xúc với TDZ, cây

phục hồi có hình thái rễ còi cọc và chồi có lá không mở rộng hoàn toàn, tổng thời gian quy trình tái sinh là 28-32 tuần (tương đương 7-8 tháng) [36] Tác giả Bùi Văn Thắng và cộng sự (2004) sau khi thí nghiệm nuôi cấy phôi trục hạt lạc trên môi trường 2,4-D cũng đã tạo ra được phôi soma phát triển bình thường với tỷ lệ rất thấp là 1,4%, phần lớn phôi còn lại phát triển dị thường Sau đó tác giả đã tiến hành phục hồi được 82% các phôi soma nảy mầm bị dị thường khi sử dụng môi trường phục hồi chứa tổ hợp chất điều khiển sinh trưởng gồm 2mg/l BAP và 3mg/l kinetin [14] Trong hầu hết các thí nghiệm về tái sinh thông qua hình thành phôi soma đậu phộng trước đây, các tác giả mới chỉ nghiên cứu sự ảnh hưởng của nồng

độ 2,4D đến khả năng cảm ứng phôi soma của mô cấy mà không thử nghiệm hiệu quả của thời gian ủ mẫu trên môi trường cảm ứng phôi (chứa 2,4D), để từ đó xem xét mức độ ảnh hưởng của thời gian ủ mẫu đến hình thái phôi và sự chuyển đổi của phôi soma thành cây con Các mẫu cấy chỉ được nuôi cấy theo một thời gian mặc định là trong 4 tuần [23], [34], [36], [40], [82], [83], [86] Sau này, tác giả Raghavan (2005) phát hiện ra rằng: tùy vào thời gian tiền xử lý mẫu cấy với 2,4-

D, các phôi soma được tạo thành biểu hiện hình thái khác nhau trong quá trình tăng trưởng tiếp theo trong môi trường cơ bản Tác giả đã kết luận, thời gian xử lý tối ưu của 2,4-D cũng thúc đẩy sự trưởng thành của phôi soma để hình thành chồi một cách bình thường [66] Filippov (2006) cũng báo cáo rằng thời gian tiếp xúc với auxin có ảnh hưởng đáng kể đến tính hiệu quả của tạo phôi soma phát triển bình thường [43] Tác giả Shweta Singh (2009) đã tái sinh hoàn chỉnh cây lạc từ phôi soma phát triển bình thường được tạo ra trên các đối tượng lá chét, và vùng

mô phân sinh nách chồi mầm phôi trục hạt lạc với tần suất tương đối cao lần lượt

là 53% và 32,3% sau khi tăng thời gian tiếp xúc ban đầu (tiền cảm ứng phôi soma) của mẫu cấy với 2,4-D lên 6 tuần so với 4 tuần trong các quy trình trước đây của Chengalrayan (1997) Tác giả kết luận rằng ủ lá chét và vùng mô phân sinh nách phôi trục hạt lạc trên môi trường cảm ứng phôi soma (chứa 2,4-D nồng độ 20mg/l) trong 6 tuần và nuôi cấy tiếp trên môi trường phát triển phôi ( chứa 2,4-D nồng độ

3mg/l) là tối ưu để hình thành và thúc đẩy sự phát triển phôi soma có sinh lý bình thường Cây con với chồi và rễ hoàn chỉnh được khôi phục chỉ thông qua 3 bước: tiền cảm ứng phôi soma, phát triển phôi và nảy mầm phôi mà không có sự tham gia của bất kỳ cytokinin trong môi trường nuôi cấy Sau khi thử nghiệm, tỷ lệ phôi

có hình thái bất thường giảm xuống, quy trình tái sinh in vitro được rút ngắn

xuống chỉ còn 22 tuần Đây là một điều rất có ý nghĩa vì việc giảm bớt các khâu cấy chuyển trung gian giúp hạn chế phát sinh các biến dị trong vật chất di truyền của đối tượng nghiên cứu Tác giả cũng đã khẳng định, tối ưu nồng độ và thời gian tiếp xúc với auxin là quan trọng cho sự hình thành và phát triển của phôi soma[77]

Gần đây, việc nghiên cứu tái sinh cây lạc in vitro thường được tiến hành trên

các loại mô cấy là: lá mầm, mắt lá mầm, phôi trục, lá non thông qua con đường tái sinh trực tiếp do có lợi thế là nhanh chóng hình thành phôi, chồi và không yêu cầu phải cấy chuyển thường xuyên Hệ thống tái sinh trực tiếp này được ưu tiên vì khả

năng tiếp cận dễ dàng và thuận lợi cho việc chuyển đổi di truyền qua trung gian A Tumefaciens Trong các hướng nghiên cứu đó, Venkatachalam (2000) sử dụng lá

mầm như một nguồn mô cấy đã đạt được tần số cao (86%) trong việc chuyển đổi phôi soma thành cây đậu phộng [86], [87] Sharma và Anjaiah (2000) cũng đã thành công khi thu được tần số cao (90%) tái sinh chồi trực tiếp từ nuôi cấy lá mầm trưởng thành của các giống lạc khác nhau [75] Tuy nhiên hệ thống tái sinh thành công nhất trong các loại cây họ đậu dẫn đến sự phục hồi tốt của cây chuyển gen được ghi nhận chính là tái sinh chồi từ mắt lá mầm và phôi trục của hạt [20], trong đó mắt (nách) lá mầm đã được xem là thành công hơn đối với sự cảm ứng đa chồi thông qua sự phát sinh cơ quan trực tiếp trong số các loại cây họ đậu [31]

mắt lá mầm của giống lạc JL-24 với tỷ lệ tái sinh là 82%, trung bình thu được 6 chồi/ 1 mẫu cấy [79] Nuôi cấy nách lá mầm và phôi trục có thể cho một tần số tái sinh trực tiếp tương đối cao bởi vì những mẫu cấy này có mô phân sinh đỉnh hoặc

nách là nguồn dự trữ các tế bào toàn năng và được coi là những mục tiêu tốt nhất

để chuyển gen Có thể nói đây là đối tượng nuôi cấy rất có tiềm năng để tái sinh cây hoàn chỉnh so với nuôi cấy các loại mô khác

1.2.5 Hệ thống tái sinh và chuyển gen gián tiếp ở cây lạc

Các phương pháp chuyển gen có thể được sử dụng cho việc chuyển đổi di

truyền ở cây lạc đó là chuyển gen thông qua trung gian A Tumefaciens hoặc

thông qua các phương pháp chuyển giao DNA trực tiếp như xung điện hoặc bắn gen bằng vi đạn , từ đó những gen mới có thể được đưa vào các tế bào mô lạc và biểu hiện tích cực Trong lịch sử, cả hai phương pháp bắn gen bằng vi đạn và

chuyển gen thông qua A Tumefaciens đã được sử dụng để chuyển DNA, chúng

cùng được tiến hành trong cả hai hệ thống tái sinh là phát sinh cơ quan và hình thành phôi vô tính ở lạc Tuy nhiên phương pháp chuyển gen qua trung gian

Agrobacterium được áp dụng rộng rãi hơn ở cây lạc bởi mô lạc dễ bị nhiễm các chủng A Tumefaciens [54], thời gian tái sinh cây chuyển gen ngắn hơn, kết quả các locus gen chuyển từ việc nhiễm khuẩn A Tumefaciens ít phức tạp hơn (không

tích hợp một lúc nhiều bản sao gen chuyển) so với việc được tạo ra bằng các phương pháp chuyển gen trực tiếp, do đó làm giảm nguy cơ tái sắp xếp gen chuyển và bất hoạt gen [63]

Sự chuyển gen thành công qua trung gian Agrobactenum chịu ảnh hưởng rất nhiều bởi các các yếu tố như: kiểu gen của giống, mẫu mô nuôi cấy, chủng A Tumefaciens sử dụng, các plasmid mà vi khuẩn mang, điều kiện về thời gian đồng

nuôi cấy và hiệu quả của hệ thống tái sinh Đã có báo cáo sơ bộ về nghiên cứu tối ưu

hóa của đồng nuôi cấy, so sánh các chủng Agrobacterium và các giống đậu phộng

[42] và mô tả tiềm năng của các hệ thống tái sinh khác nhau để thích ứng với chuyển

đổi qua trung gian Agrobacterium [73]

Trước những năm 2000 đã có nhiều báo cáo của nuôi cấy mô và tái sinh cây lạc từ các loại mẫu mô nuôi cấy khác nhau với sự kết hợp khác nhau của các chất điều hòa sinh trưởng trong các môi trường nuôi cấy, tuy nhiên đã không đạt được

nhiều thành công với chuyển đổi di truyền ở lạc do thiếu các phương thức hiệu quả để có được cây hoàn chỉnh thông qua việc tái sinh chồi trong ống nghiệm [75] (bảng 1.5) Điều này đã khiến một số nhà nghiên cứu tiếp cận phương pháp nuôi cấy mô không phụ thuộc vào sự tái sinh chồi ngẫu nhiên để tạo ra cây lạc biến đổi gen Tác giả Rohini (2000) đã sử dụng phôi trục thiếu một lá mầm, sau khi gây tổn

thương và cho nhiễm với Agrobacterium, đồng thời xử lý với dịch chiết từ lá bị

thương của cây thuốc lá đã cho một tần số chuyển đổi di truyền ổn định 3,3% [70]

Bảng 1.5 Một số báo cáo chuyển gen ở cây lạc thông qua vi khuẩn A tumefaciens

(trước năm 2000)

Chuyển

Hiệu quả chuyển gen

Báo cáo

Embryonic axis uidA,

nptII

9% McKently et al., 1995

Leaf gus, nptII 0.2-0.3% Cheng et al., 1997

Leaf and Epicotyl uidA 12-36%

(leaves) 15-42%

(epicotyl)

Egnin et al 1998

Mature embryo axis

with one cotyledon

gus, nptII 3.30% Rohini and Rao 2000

Gần đây, nghiên cứu chuyển gen chủ yếu thực hiện trên các loại mẫu cấy là:

lá mầm (tử diệp), nách lá mầm, mô lá non, phôi trục hạt lạc Trong đó, lá mầm lạc

là một trong những đối tượng được nghiên cứu ứng dụng chuyển gen tương đối phổ biến Lá mầm lạc sau khi trải qua giai đoạn tiền nuôi cấy 2 ngày rồi đồng nuôi

nptII, sau đó chuyển lên môi trường cảm ứng phôi có chứa NAA, BAP, kanamycin, và cefotaxime Tỷ lệ lá mầm cảm ứng phôi trực tiếp cao và hiệu quả phôi chuyển đổi thành cây con đã tăng lên (47%) trên môi trường MS có BAP và kanamycin [87] Hệ thống tái sinh dựa trên nuôi cấy lá mầm cũng đã được phát triển bởi Sharma và Anjaiah (2000) và nó cũng cho hiệu quả cao với tần số chuyển đổi trên 55% [75] Tuy nhiên, tái sinh chồi từ mắt lá mầm sau khi tạo ra các vi vết

thương và đồng nuôi cấy với vi khuẩn Agrobacterium cũng đang được xem như

một phương pháp nhanh chóng và tương đối hiệu quả trong chuyển đổi di truyền ở một số các loài thuộc cây họ đậu [59] Sau khi sử dụng nách lá mầm giống lạc JL-

24 đồng nuôi cấy 3 ngày với A tumefaciens chủng GV2260 mang gen chỉ thị Gus

và nptII tác giả Swathi Anuradha cùng cộng sự cũng đã tạo được cây lạc chuyển gen hoàn chỉnh với tần số chuyển đổi di truyền là 3,54% [79] Các báo cáo cũng cho thấy, mỗi quy trình chuyển gen sẽ cho kết quả cụ thể với mỗi giống khác nhau trên các loại mô cấy khác nhau

Những phát triển trong chuyển đổi di truyền ở cây lạc đã khích lệ các nhà nghiên cứu theo đuổi ý tưởng phát triển cây lạc biến đổi gen mang các gen hữu ích

có khả năng sản xuất hạt với năng suất, chất lượng cao, có sức đề kháng cao với các bệnh khác nhau, kháng côn trùng gây hại, và áp lực phi sinh học Chẳng hạn như việc chuyển gen tổng hợp protein vỏ của virus thông qua trung gian

Agrobacterium đã tạo ra các cây lạc có khả năng kháng virus [76] Đây là phương

pháp phát triển giống lạc thương mại quan trọng có sức đề kháng cao với vi rút

gây bệnh đốm lá ở lạc Hay thông qua trung gian Agrobacterium để tạo ra các cây

lạc biến đổi gen biểu hiện protein hemagglutinin (H) – một loại protein ngưng kết

tố hồng cầu của virus gây bệnh dịch hạch ở trâu bò từ đó sử dụng cho việc cung cấp vaccine thông qua thức ăn - một phương pháp tiêm phòng cho động vật nhai lại đã được thuần hóa cũng như động vật hoang dã [53] Tác giả Chu (2007) bằng

phương pháp bắn gen đã tạo ra cây lạc biến đổi gen biểu hiện gen Bcl-XL và thấy

rằng một trong các dòng biến đổi gen được tăng cường khả năng chịu chất diệt cỏ,

thuốc diệt cỏ [38] Dodo (2008) bằng phương pháp sử dụng trung gian A Tumefaciens chủng EHA 105 đã phát triển lạc chuyển gen làm giảm dị ứng đậu phộng bằng cách sử dụng phương pháp can thiệp RNAi điều chỉnh gen Ara h2, điều này đã dẫn đến làm giảm biểu hiện gen Ara h2 và giảm việc gây dị ứng của

hạt lạc [39] Tương tự như vậy, Bhatnagar Mathur (2007) đã phát triển các cây lạc

biến đổi gen bằng cách thể hiện gen At DREB1A bằng promoter rd29A và đã

chứng minh rằng một trong những cây biến đổi gen đã cho thấy hiệu quả kiểm soát thoát hơi cao hơn 40% so với các cây trong cùng điều kiện hạn chế nước [29] Tác giả Beena (2008) đã phát triển đậu phộng biến đổi gen biểu hiện cùng lúc hai

gen, cryI E-C và a rice chitinase cDNA theo promotors CaMV35S bằng cách sử

dụng hệ thống mắt lá mầm để chuyển gen Các cây biến đổi gen cho thấy khả năng chống côn trùng spodoptera và đề kháng với nấm phaeoisariopsis personata, chúng là hai đối tượng gây bệnh nghiêm trọng trong canh tác đậu phộng [26] (bảng 1.6)

Bảng 1.6 Một số báo cáo chuyển gen ở cây lạc (từ năm 2000 - 2009)

Chuyển gen

Gen Chuyển

Báo cáo

Lá mầm A tumefaciens uidA, nptII Venkatachalam et al.,

2000 IPCV (coat protein) Sharma and Anjaiha

2000

H protein gene Khandelwal et al.,b2003

chủng EHA105 nptII Divya, 2008

Mô sẹo phôi

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU, HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ

2.1.1 Nguyên liệu

Hạt của các giống lạc: L23, L26 được cung cấp bởi Trung tâm nghiên cứu và phát triển đậu đỗ, Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm –Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam

2.1.2.2 Thiết bị máy móc

Cân phân tích điện tử (Thụy Sĩ), máy đo pH, nồi hấp khử trùng, tủ sấy Cabrolite (Anh), box cấy, Các thiết bị máy móc tại Phòng thí nghiệm Công nghệ

tế bào, khoa Sinh-KTNN - Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Thí nghiệm được thực hiện từ tháng 3 năm 2010 đến tháng 12 năm 2012 tại Phòng thí nghiệm công nghệ tế bào thực vật thuộc khoa Sinh - Kỹ thuật nông nghiệp, trường Đại học sư phạm - Đại học Thái Nguyên

Các bước nghiên cứu được tiến hành theo sơ đồ tổng quát được trình bày ở hình 2.1

Hạt lạc Khử trùng

Tạo đa chồi từ mắt lá mầm

Thăm dò môi trường nuôi cấy in vitro

Tạo mô sẹo Hình thành phôi soma

Tái sinh cây

Ra rễ

Ra cây và chế độ chăm sóc

Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát

2.2.1 Phương pháp nuôi cấy in vitro

2.2.1.1 Khử trùng hạt

Mẫu nuôi cấy là hạt lạc trưởng thành của giống lạc L23, L26 vừa mới được thu hoạch sau một thời gian ngắn được chuẩn bị theo các phương pháp khử trùng khác nhau:

- Phương pháp 1: Sau khi bóc lớp vỏ cứng của quả lạc đã được phơi khô, chọn những hạt to, mẩy, hạt lạc phải còn nguyên lớp vỏ lụa không bị nứt Sử dụng khoảng 100-150 hạt lạc được chọn tráng qua nước cất vô trùng hai lần sau đó khử trùng bề mặt bằng cách lắc nhẹ trong cồn 70 độ trong thời gian 2 phút, sau đó tráng sạch bằng nước cất khử trùng 3 lần Tiếp đến lắc với Javen trong 20 phút rồi rửa lại bằng nước cất khử trùng 4 đến 5 lần Thí nghiệm với nồng độ Javen khác nhau để tìm kết quả tốt nhất

- Phương pháp 2: Hạt lạc sau khi lắc nhẹ với cồn 70 độ và rửa bằng nước cất như trên thì được lắc với dung dịch thủy ngân clorua trong 7 phút rồi rửa lại bằng nước cất khử trùng 5 lần Thí nghiệm với nồng độ thủy ngân clorua khác nhau để tìm kết quả khử trùng tốt nhất

Khảo sát tỷ lệ mẫu nhiễm, tỷ lệ hạt nảy mầm, độ đồng đều của mầm để chọn

ra phương thức khử trùng tối ưu cho hạt giống nảy mầm in vitro

2.2.1.2 Phương pháp tái sinh cây từ hệ thống nuôi cấy nách lá mầm lạc (thực

hiện theo tác giả Swathi Anuradha và cs (2006) [79], có cải tiến)

Tạo sự nảy mầm cho hạt

Hạt sau khi khử trùng được ngâm trong nước cất khử trùng 2-4 giờ, sau đó được thấm khô bằng giấy thấm khử trùng và cấy vào bình tam giác chứa môi trường nảy mầm GM(bảng 2.1) Sau khi ủ trên môi trường nảy mầm GM 3 ngày trong tối, được đưa ra sáng 3-4 ngày ở nhiệt độ 25  2°C Ngày tuổi của hạt nảy

mầm được tính kể từ khi gieo hạt Khảo sát khả năng nảy mầm hạt sau 3 ngày và 7 ngày, theo dõi tỷ lệ nảy mầm của hai giống

Xử lý mẫu cấy và môi trường tạo đa chồi

Hạt lạc sau khi gieo nảy mầm (7-8 ngày tuổi) thì tiến hành dùng dao cắt bỏ phần thân và rễ mầm, vết cắt cách bên dưới mắt lá mầm khoảng 2 mm Tách đôi 2

lá mầm thành 2 mẫu cấy riêng biệt sao cho phần thân mầm còn lại được chia đều cho 2 lá mầm Cắt ngang bỏ phần đuôi lá mầm, tiếp đến hủy bỏ chồi chính và gây thương tổn ở nách lá mầm bằng cách dùng mũi dao nhọn chích nhẹ 5-7 lần vào vùng nách lá mầm Như vậy, từ một hạt giống nảy mầm cho ra 2 mẫu cấy Sau đó các mẫu cấy được cấy úp nghiêng 45 độ trên môi trường cảm ứng chồi SIM (bảng 2.1), nuôi cấy trong 8 tuần

Đánh giá tỷ lệ cảm ứng tạo đa chồi và số chồi / 1 mẫu cấy của 2 giống lạc sau

8 tuần nuôi cấy theo công thức:

% 100

t

cp i

N

N C

Trong đó:

Ci : Tỷ lệ tạo đa chồi

Ncp: Số mẫu cảm ứng đa chồi

Nt : Tổng số mẫu nuôi cấy

Môi trường kéo dài chồi

Các cụm chồi được tách riêng và cấy chuyển sang môi trường kéo dài chồi (SEM) trong 2 tuần (Bảng 2.1)

Môi trường ra rễ

Khi chồi đạt chiều cao 3-5 cm và có hai hoặc ba lóng, chúng được chuyển sang môi trường ra rễ RIM (Bảng 2.1) để tạo cây hoàn chỉnh Mỗi bình cấy từ 3-4 chồi Đánh giá khả năng hình thành và phát triển rễ của cây tái sinh sau 4 tuần

Các khâu nuôi cấy từ khi tạo cảm ứng đa chồi đến khi ra rễ được tiến hành ở nhiệt độ dao động trong khoảng 25  2°C, dưới ánh sáng đèn của phòng cây với cường độ 2000 lux, thời gian chiếu sáng 10/24 giờ

Bảng 2.1: Thành phần các loại môi trường nuôi cấy dùng cho hệ thống tái sinh

cây từ nách lá mầm

Loại môi trường hiệu Ký Thành phần cơ bản

Cảm ứng nảy mầm

của hạt GM MS*; sucrose 20g/l; agar 9g/l; pH 5,8

Cảm ứng tạo đa chồi SIM

MS*; BAP (3,4,5mg/l) hoặc BAP (3,4,5 mg/l) + NAA (0,1 ; 0,5mg/l); sucrose 30g/l; agar 9g/l; vitamin B5, pH 5,8

Cảm ứng kéo dài

MS*; BAP (1,5mg/l, 2mg/l, 2,5mg/l) hoặc BAP (1,5; 2; 2,5 mg/l) + NAA (0,1 ; 0,5mg/l); sucrose 30g/l; agar 9g/l; vitamin B5, pH 5,8 Cảm ứng ra rễ RIM MS*; NAA (0,1; 0,3; 0.5mg/l) hoặc IBA (0,1;

0,3; 0.5mg/l); sucrose 30g/l; agar 9g/l; pH 5,8

Chú thích: MS*: Môi trường cơ bản của Murashige và Skoog (1962) [57]

2.2.1.3 Phương pháp tái sinh cây từ hệ thống nuôi cấy mô sẹo phôi trục hạt lạc (thực hiện theo tác giả Nguyễn Thị Tâm và cs (2006) [13], có cải tiến)

Tạo mô sẹo từ phôi trục hạt lạc

Hạt lạc sau khi khử trùng được đặt lên đĩa có lót giấy thấm khử trùng, dùng panh và dao mỏng tách bỏ lớp vỏ và phần nội nhũ, để tách lấy phôi trục khỏi hai lá mầm Các phôi trục phải đảm bảo vẫn còn nguyên vẹn, không để phôi bị khô, loại

bỏ bất kỳ phôi bị nứt vỡ, hư hỏng hoặc đen, nâu Phôi trục của các giống lạc L23, L26 sau khi tách ra được đặt lên môi trường cảm ứng mô sẹo gồm: MS cơ bản; 2,4D (8, 10, 12, 14mg/L); sucrose 30g/l; agarose 9g/l; pH 5,8 Cấy mật độ 15 phôi/1 bình môi trường loại 250 ml Nuôi 1 tuần trong tối hoàn toàn và 3 ngày dưới ánh sáng đèn neol trong phòng nuôi cấy với cường độ 2000 lux, thời gian chiếu sáng 10/24 giờ, nhiệt độ dao động trong khoảng 25  2°C Đánh giá tỷ lệ tạo

mô sẹo của 2 giống lạc thu được sau 10 ngày nuôi cấy theo công thức:

% 100 (%)  cp 

i

N N C

Trong đó:

Ncp: Số phôi tạo mô sẹo

Nt : Tổng số phôi nuôi cấy

Ci : Tỷ lệ tạo mô sẹo Tính tốc độ sinh trưởng của mô sẹo bằng cách cân khối lượng các mô sẹo được tạo thành sau 10 ngày

Tái sinh chồi từ mô sẹo phôi trục hạt lạc

Mô sẹo tốt nhất tạo ra từ phôi trục trên môi trường cảm ứng được cấy chuyển sang môi trường tái sinh chồi gồm MS cơ bản; BAP (1,5mg/l; 2,0mg/l; 2,5mg/l; 3mg/l); sucrose 30g/l; agarose 9g/l; pH 5,8 Các mô sẹo được tái sinh ở các trạng thái khác nhau là : mô sẹo để nguyên khối, mô sẹo chẻ đôi, mô sẹo chẻ làm tư theo chiều dọc mô sẹo Nuôi cấy trong 4 tuần dưới ánh sáng đèn của phòng cây với cường độ 2000 lux, thời gian chiếu sáng 10/24 giờ, nhiệt độ dao động trong khoảng 25  2°C

Tỷ lệ mô tái sinh cây được tính theo công thức:

%100

sv

r c

N

N R

Trong đó:

Rc: Khả năng tái sinh cây

Nr: Số mô sẹo tái sinh cây

Nsv: Tổng số mô sẹo

Tạo cây hoàn chỉnh

Các chồi sau tái sinh đạt kích thước khoảng 2,0 – 2,5cm được chuyển sang môi trường ra rễ để tạo cây hoàn chỉnh Môi trường ra rễ là môi trường MS cơ bản; thạch agar 9g/l; đường sucrose 30g/l; NAA (0,3 mg/l); pH 5,8 Mỗi bình cấy trung bình từ 3-4 chồi Nuôi cấy dưới ánh sáng đèn của phòng cây với cường độ