Tạo dòng và biểu hiện enzyme trehalose synthase chịu nhiệt từ vi khuẩn meiothermus ruber phân lập từ suối nước nóng ở việt nam

Vì vậy, việc phân lập các chủng vi khuẩn chịu nhiệt này đồng thời tìm hiểu các enzyme chịu nhiệt của chúng sẽ mở ra một hướng mới trong việc ứng dụng các enzyme này trong cách lĩnh vực s

THÁI THIÊN MINH

TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN ENZYME

TREHALOSE SYNTHASE CHỊU NHIỆT TỪ

VI KHUẨN MEIOTHERMUS RUBER

PHÂN LẬP TỪ SUỐI NƯỚC NÓNG Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: Vi sinh

Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS.ĐỖ MINH SĨ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2011

Em xin gửi lời tri ân sâu sắc nhất đến cô, cố PGS.TS Trần Thu Hoa, đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện, tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức quí báu trong quá trình nghiên cứu tại trường cho dù cô không có được sức khỏe tốt

Em xin chân thành cảm ơn đến TS Đỗ Minh Sĩ đã hướng dẫn và giúp đỡ em hoàn thành luận văn này

Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô Khoa Sinh đã tận tình chỉ dạy trong suốt thời gian học tập ở trường

Xin gửi lời cảm ơn đến em Đỗ Xuân Hòa, đã giúp đỡ, hổ trợ rất nhiều trong quá trình thực hiện luận văn

Xin gửi lời cảm ơn đến các em Tố Nhi, Hà Giang, Quang Hữu, Bảo Quyên, Huyền Thanh và các em ở phòng thí nghiệm Vi sinh công nghệ dược, trường Đại học Y dược tp Hồ Chí Minh đã luôn quan tâm, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn

Con xin cảm ơn Mẹ, gia đình và bạn bè đã luôn ở bên cạnh

và ủng hộ trong suốt thời gian qua

MỞ ĐẦU

Các vi sinh vật chịu nhiệt được xếp trong nhóm vi sinh vật cực đoan phân bố nhiều ở các vùng suối nước nóng, các vùng địa nhiệt, miệng núi lửa Nhiệt độ cực thuận nhất cho sự hoạt động của các vi sinh vật chịu nhiệt này là từ 50 – 80°C Một

số vi sinh vật có thể hoạt động ở nhiệt độ 110°C hoặc cao hơn Những enzyme của những chủng vi khuẩn này được gọi là những enzyme chịu nhiệt Các enzyme chịu nhiệt này có những đặc tính về cấu trúc, chức năng khác thường cho sự chịu nhiệt

độ cao và hoạt động cực thuận của chúng Vì vậy, việc phân lập các chủng vi khuẩn chịu nhiệt này đồng thời tìm hiểu các enzyme chịu nhiệt của chúng sẽ mở ra một hướng mới trong việc ứng dụng các enzyme này trong cách lĩnh vực sinh hóa, thực phẩm và đặc biệt là trong lĩnh vực công nghệ sinh học phân tử

Trehalose là một trong những loại đường có nhiều công dụng đối với cuộc sống con người, đặc biệt đối với những người béo phì, những người mắc bệnh tiểu đường… Trehalose hiện nay đang được sử dụng như một loại đường thay thế trong công nghiệp sản xuất bánh kẹo, sữa…Trong khi đó việc tổng hợp trực tiếp trehalose rất phức tạp Do vậy việc tìm kiếm một phương pháp tổng hợp trehalose là hết sức cần thiết

Trehalose synthase là enzyme tổng hợp trehalose từ maltose Trehalose synthase được tìm thấy trong nhiều loại vi khuẩn, trong đó có vi khuẩn

Meiothermus ruber Đây là một chủng vi khuẩn chịu nhiệt trung bình Ở Việt Nam,

chúng được tìm thấy ở hầu hết trong các suối nước nóng có nhiệt độ trung bình từ 45-75oC Phân lập chủng vi khuẩn này đồng thời tạo dòng đoạn gen mã hóa enzyme Trehalose synthase chịu nhiệt của chúng không chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn có

ý nghĩa kinh tế xã hội Vì thế chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Tạo dòng và

biểu hiện enzyme trehalose synthase chịu nhiệt từ vi khuẩn Meiothermus ruber

phân lập từ vùng suối nước nóng ở Việt Nam”

NỘI DUNG CỦA ĐỀ TÀI

 Phân lập các chủng vi khuẩn chịu nhiệt Meiothermus ruber từ suối nước nóng ở Bình Châu ( Bà Rịa - Vũng Tàu)

 Định danh chủng vi khuẩn này dựa vào trình tự gen 16S rRNA

 Ly trích DNA bộ gen của chủng vi khuẩn Meiothermus ruber

 Phân lập đoạn gen mã hóa cho enzyme Trehalose synthase

 Tái tổ hợp đoạn gen này vào chủng E.coli và biểu hiện chủng E.coli tái tổ hợp

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Hàm lượng Trehalose và lượng thực phẩm tiêu thụ mỗi ngày 10

Bảng 2.1 Thành phần gel tách polyacrylamide 12% 36

Bảng 2.2 Thành phần gel gom polyacrylamide 4.5% 37

Bảng 3.1 Bảng tổng hợp các trình tự blast trên NCBI 49

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của Trehalose 7

Hình 1.2 Độ ngọt của đường trehalose so với maltose, glucose, sucrose 9

Hình 1.3 Độ hòa tan trong nước của trehalose so với sucrose 9

Hình 1.4 Sự phân bố các con đường sinh tổng hợp Trehalose trong tự nhiên 15

Hình 1.5 Các con đường tổng hợp Trehalose 16

Hình 1.6 Cơ chế sản xuất Trehalose từ tinh bột 19

Hình 2.1 Kích thước của thang MassRuler ladder Mix 28

Hình 2.2 Kích thước thang Multicolor Broad Range Protein Ladder 29

Hình 2.3 Vector Pjet1.2 blunt 33

Hình 2.4 Vector pET-22b 34

Hình 3.1 Khuẩn lạc (A) và hình dáng tế bào (B) vi khuẩn Meiothermus ruber 41

Hình 3.2 Điện di trên gel agarose sản phẩm PCR 42

Hình 3.3 Điện di trên gel agarose sản phẩm PCR colony các mẫu plasmid pJet-TreS ( 44

Hình 3.4 Vị trí cắt của Vsp 1 trên vector pJet1.2/blunt 42

Hình 3.5 Điện di trên gel agarose sản phẩm PCR các mẫu plasmid pET-TreS 46

Hình 3.6 Điện di trên gel agarose sản phẩm cắt plasmid pET-TreS 47

Hình 3.7 Vị trí các mồi giải trình tự 47

Hình 3.8 Điện di SDS-PAGE các dòng mang plasmid tái tổ hợp 50

Hình 3.9 Kết quả phân tích Western blot 51

Hình 3.10 Kết quả điện di SDS-PAGE plasmid pET-TreS với 2 chất cảm ứng 52

Hình 3.11 Kết quả điên di SDS-PAGE mẫu plasmid tái tổ hợp với các nồng độ IPTG khác nhau 53

Hình 3.12 Điện di SDS-PAGE thời giam cảm ứng 54

Hình 3.13 Điện di SDS-PAGE vận tốc lắc cảm ứng 55

Hình 3.14 Điện di SDS-PAGE nhiệt độ cảm ứng 56

Hình 3.15 Điện di SDS-PAGE điều kiện cảm ứng tối ưu 57

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

bp base pair (cặp base)

cDNA Complementary deoxyribonucleotide acid

DNA Deoxyribonucleotide acid

dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate

LB Luria-Bertani

MCS Multiple coding sequence (vùng tạo dòng)

OD Optical density (mật độ quang)

SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate - Polyacrylamid gel electrophoresis (điện di trên gel polyacrylamide)

PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi polymerase)

RE Restriction Enzym (enzym cắt giới hạn)

rpm Rotation per minute (vòng/ phút)

TreS Trehalose synthase

MỤC LỤC

Trang Trang phụ bìa

MỤC LỤC i

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC HÌNH vi

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 4

1.1 ĐẶC ĐIỂM CỦA VI KHUẨN CHỊU NHIỆT 5

1.1.1.Sự phân bố của vi khuẩn chịu nhiệt 5

1.1.2 Phát sinh loài 5

1.1.3 Vi khuẩn Meiothermus ruber 6

1.2 TREHALOSE 6

1.2.1 Cấu trúc của Trehalose 6

1.2.2 Bản chất sinh học của trehalose 7

1.2.3 Đặc tính hóa học của trehalose 9

1.2.4 Ảnh hưởng của Trehalose lên cơ thể vi sinh vật 10

1.2.4.1 Là một nguồn dự trữ năng lượng và carbon 10

1.2.4.2 Là một chất ổn định và bảo vệ của các protein và màng 11

1.2.5 Ảnh hưởng của Trehalose lên cơ thể con người 12

1.2.5.1 Ảnh hưởng của Trehalose đến sự chuyển hóa hydratcacbon 12

1.2.5.2 Vai trò thúc đẩy quá trình hấp thụ canxi của Trehalose 13

1.2.5.3 Ảnh hưởng của Trehalose đến hệ vi sinh vật trong khoang miệng 13 1.2.6 Con đường tổng hợp trehalose 14

1.2.7 Ứng dụng của trehalose 17

1.2.8 Sản xuất trehalose 18

1.2.9 Tình hình nghiên cứu enzyme trehalose synthase trên thế giới 19

1.3 KỸ THUẬT TẠO DÒNG 21

1.3.1 Chọn và xử lý vector 21

1.3.2 Xử lý DNA cần tạo dòng 21

1.3.3 Tạo vector tái tổ hợp 21

1.3.4 Chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào chủ 22

1.3.4.1 Hóa biến nạp 22

1.3.4.2 Điện biến nạp 22

1.3.5 Chọn lọc dòng tái tổ hợp: 22

Chương 2:VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 VẬT LIỆU 25

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 25

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 25

2.1.3 Môi trường làm thuần và cấy chuyền vi khuẩn ưa nhiệt 25

2.1.4 Hóa chất dùng cho tách chiết DNA 26

2.1.5 Hóa chất dùng cho phản ứng PCR: 27

2.1.6 Mồi dùng cho giải trình tự 27

2.1.7 Hóa chất dùng cho các phản ứng cắt, nối DNA 27

2.1.8 Hóa chất dùng cho điện di trên gel agarose 27

2.1.9 Môi trường, hóa chất dùng cho biến nạp và biểu hiện 28

2.1.10 Hóa chất dùng cho điện di trên gel polyacrylamide 28

2.1.11 Hóa chất dùng cho tinh chế DNA từ thạch agarose 29

2.1.12 Hóa chất dùng cho tinh chế plasmid 29

2.1.13 Hóa chất dùng cho phương pháp Western blot 29

2.2 PHƯƠNG PHÁP 30

2.2.1 Phương pháp thu mẫu 30

2.2.2 Phương pháp làm giàu và phân lập vi khuẩn Meiothermus ruber 30

2.2.3 Phương pháp định danh vi khuẩn Meiothermus ruber 30

2.2.3.1 Khảo sát hình thái tế bào 30

2.2.3.2 Giải trình tự gen 31

2.2.4 Phương pháp tách chiết DNA vi khuẩn 31

2.2.5 Phương pháp PCR 31

2.2.6 Phương pháp điện di trên gel agarose 32

2.2.7 Phương pháp tinh chế DNA từ thạch agarose 32

2.2.8 Phản ứng cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn 32

2.2.9 Phản ứng ghép nối đoạn DNA vào vector pJet1.2 blunt 33

2.2.10 Phản ứng nối đoạn DNA chèn vào vector pET-22b 33

2.2.11 Chuyển DNA vào E.coli bằng phương pháp hóa biến nạp 34

2.2.11.1 Nguyên tắc 34

2.2.11.2 Cách tiến hành 35

2.2.12 Ly trích DNA plasmid của E.coli theo phương pháp DNA-spin 35

2.2.13 Kiểm tra sản phẩm tạo dòng 35

2.2.14 Biểu hiện protein tái tổ hợp 36

2.2.15 Điện di phân tách protein trên gel polyacrylamide ( SDS-PAGE) 36

2.2.15.1 Nguyên tắc 36

2.2.15.2 Cách tiến hành 36

2.2.16.Phân tích protein bằng phương pháp Western blot 38

2.1.16.1 Nguyên tắc 38

2.1.16.2 Cách tiến hành 38

CHƯƠNG 3:KẾT QUẢ BÀN LUẬN 40

3.1 PHÂN LẬP CHỦNG VI KHUẨN MEIOTHERMUS RUBER Từ SUỐI NƯỚC NÓNG 41

3.2.THU NHẬN GEN MÃ HÓA ENZYME TREHALOSE SYNTHASE TỪ CHỦNG VI KHUẨN MEIOTHERMUS RUBER 42

3.3.TẠO DÒNG GEN MÃ HÓA ENZYME TREHALOSE SYNTHASE VÀO VECTOR pET- 22b 43

3.3.1 Chèn gen TreS vào pJet1.2 blunt 43

3.3.2 Chèn gen TreS vào pET-22b 44

3.4.BIỂU HIỆN TRÊN E.COLI BL21(DE3) 49

3.4.1.Chọn lọc dòng 49

3.4.2 Kết quả Western blot 51

3.4.3 Khảo sát các điều kiện cảm ứng tối ưu 51

3.4.3.1 Khảo sát chất cảm ứng 52

3.4.3.2 Khảo sát nồng độ chất cảm ứng 53

3.4.3.3 Khảo sát thời gian cảm ứng 54

3.4.3.4 Khảo sát vận tốc lắc cảm ứng 55

3.4.3.5 Khảo sát nhiệt độ cảm ứng 56

Chương 4:KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ: 58

4.1 Kết luận 59

4.2 Kiến nghị 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO 60

PHỤ LỤC 65

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 ĐẶC ĐIỂM CỦA VI KHUẨN CHỊU NHIỆT

1.1.1 Sự phân bố của vi khuẩn chịu nhiệt [33]

Các chủng vi sinh vật chịu nhiệt được định nghĩa là tất cả các loài có khả năng phát triển ở nhiệt độ trên 55oC Có thể chia làm 3 loại: các loài vi sinh vật chịu nhiệt trung bình phát triển ở trên 65oC, chịu nhiệt độ cao ở trên 75oC và chịu nhiệt cực đoan ở trên 90oC

Những vi sinh vật này, chủ yếu là vi khuẩn và cổ khuẩn, được phân lập ở hầu hết các môi trường trên cạn có chứa nước, các môi trường biển tự nhiên cũng như ở các môi trường nhân tạo Các môi trường trên cạn bao gồm các suối nước nóng và các khu vực núi lửa phun khí SO2 với 1 dãy pH rộng (0,5-9,0), độ mặn thấp (0,1-0,5%) và trong các tầng địa nhiệt sâu Còn trong môi trường biển tự nhiên chúng có thể phân bố ở các nơi có nồng độ muối cao (3%) và dãy pH từ 5,0 đến 8,5 như các

hệ thống thủy nhiệt sâu, hệ thống núi lửa ngầm dưới đáy biển Các môi trường nhân tạo mà ở đó các vi sinh vật chịu nhiệt được tìm thấy bao gồm các bãi than đá đang cháy âm ỉ, các dòng chảy nóng từ các nhà máy địa hạt nhân và địa nhiệt

Số lượng các loài vi sinh vật chịu nhiệt đã được mô tả không ngừng gia tăng trong những năm qua và cùng với đó là số lượng bản đồ gen hoàn thành kể từ khi bắt đầu dự án giải trình tự gen trên thế giới Chỉ riêng đối với các loài vi sinh vật chịu nhiệt cực đoan, số được mô tả từ chỉ 2 loài vào năm 1972 đã tăng đến hơn 70 loài vào cuối năm 1999 và 14 dự án giải trình tự gen đã hoàn thành trong khi hơn 20 loài vẫn đang được tiếp tục

1.1.2 Phát sinh loài [33]

Cho đến những năm 1960, các công cụ phân loại đã không xác định được các mối quan hệ tiến hóa trong các nhóm vi sinh vật Việc nghiên cứu hình thái học và các bằng chứng hóa thạch đã không cho thấy một sự đóng góp sâu sắc đến sự phân loại của các nhóm vi sinh vật Và vì vậy, sự phân loại chính xác ở thời điểm đó chỉ

có thể là sự khác nhau các nhóm vi sinh vật là prokaryote và eukaryote Năm 1977, Carl Woese đã đề xuất một cơ sở phân loại dựa trên phân tử rRNA16S ở prokayote

và kết quả là sự hình thành cây phát sinh loài prokayote và sự hình thành một nhóm

vi sinh vật mới: cổ khuẩn Và cho đến bây giờ, cây phát sinh loài được cấu tạo bởi các trình tự rRNA 16S ở prokayote và rRNA 18S ở eukaryote đã phân sinh giới ra làm 3 nhóm chính: Vi khuẩn (Bacteria), Cổ khuẩn (Archaea) và sinh vật nhân thật (Eukarya)

Các vi sinh vật chịu nhiệt và chịu nhiệt cực đoan được tìm thấy ở cả 2 nhóm

cổ khuẩn và vi khuẩn Các vi sinh vật chịu nhiệt cực đoan chiếm vị trí cơ bản nhất

trong cây phát sinh loài Ở vi khuẩn, chỉ 2 loài Thermotoga và Aquifex là chịu nhiệt

cực đoan

1.1.3 Vi khuẩn Meiothermus ruber

Vi khuẩn Meiothermus ruber là vi khuẩn hiếu khí, hình que, gram âm, không

di động Vi khuẩn này được phân lập ở hầu hết các suối nước nóng có nhiệt độ từ

40oC đến 75oC Vi khuẩn Meiothermus ruber thuộc chi Meiothermus, họ

Thermaceace có chiều dài khoảng 3-6 μm, đường kính từ 0,5-0,8μm Trình tự DNA của chủng vi khuẩn này được nhận thấy là có sự tương đồng với chủng vi khuẩn

chịu nhiệt Thermus aquaticus [23]

1.2 TREHALOSE

1.2.1 Cấu trúc của Trehalose [5]

Năm 1974, quan điểm hiện hành về vai trò của trehalose đã cho rằng trehalose như là một kho dự trữ glucose, là một nguồn năng lượng hoặc là để tổng

hợp của các thành phần tế bào Kể từ đó, quan điểm về chức năng khác nhau của

đường khử đơn giản này đã mở rộng rất nhiều, hiện nay trehalose không chỉ đơn giản là một hợp chất lưu trữ Chẳng hạn ở một số sinh vật, nó có một vai trò cấu trúc, hoặc là vận chuyển Ttrong khi ở một số sinh vật khác nó liên quan đến việc truyền tín hiệu hoặc điều khiển, hoặc các chức năng để bảo vệ màng tế bào

và protein chống lại các tác động tiêu cực của stress, chẳng hạn như nhiệt, lạnh,

khô, và sự oxy hóa [13]

Trehalose còn được gọi là mycose hoặc tremalose là một đường đôi không khử bao gồm hai phân tử glucose liên kết với nhau bằng liên kết 1,1-glycosic Mặc

dù trehalose có có thể có ba anomer đó là α,β-1,1 , β,β-1,1 và α,α-1,1 nhưng chỉ loại

trehalose α,α được phân lập và và sinh tổng hợp trong sinh vật sống Vào năm 1832, H.A.L Wiggers phát hiện trehalose trong cựa của lúa mạch đen và năm 1859 Marcellin Berthelot cô lập nó từ manna trehala, một chất được tạo bởi mọt, và đặt tên là trehalose

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của Trehalose 1.2.2 Bản chất sinh học của trehalose [5], [31]

Trong tự nhiên, trehalose có thể được tìm thấy trong động vật, thực vật và vi

sinh vật Trehalose khá phổ biến ở nấm men và nấm nơi nó tồn tại trong bào tử [6],

và các tế bào thực vật Ví dụ, các bào tử và nang lớn của Dictyostelium mucoroides

đã được thấy có chứa tới 7% trehalose so với trọng lượng khô, và các bào tử nang

của Neurospora tetrasperma có nhiều hơn 10% trehalose Khi các bào tử nảy mầm,

trehalose nhanh chóng biến mất cho thấy đường này được dự trữ như một nguồn carbon, hoặc nguồn năng lượng Ngoài ra, trehalose cũng được tìm thấy ở một số

nấm khác, chẳng hạn như Lentinula edodes, Grifola fondosa, Pholiota nameko…với hàm lượng trehalose từ 1% đến 17% (do đó nó cũng được gọi đường

nấm) Trehalose cũng có mặt ở nồng độ cao trong nấm men của bánh mì và bia Trong những sinh vật này, hàm lượng trehalose phụ thuộc vào tuổi của các tế bào, cũng như giai đoạn tăng trưởng và tình trạng dinh dưỡng của chúng

Nhiều loài địa y và tảo cũng chứa đường đôi này, mặc dù ở nồng độ thấp hơn đáng kể so với trehalose tìm thấy trong nấm men Trehalose cũng hiện diện

trong nhiều loài thực vật bậc cao như trong hạt hướng dương, thực vật Selaginella

và tảo biển )

Trehalose cũng được tìm thấy ở một số loại vi khuẩn khác nhau như các loài

của Streptomyces chẳng hạn Streptomyces hygroscopicus, các loài mycobacteria khác nhau bao gồm Mycobacterium smegmatis và Mycobacterium tuberculosis và

corynebacteria Trong mycobacteria và corynebacteria, đường khử này đóng vai trò

như là một thành phần cấu trúc của vách tế bào Ở vi khuẩn Propionibacterium freudenreichii ssp, các điều kiện môi trường như nhiệt độ, pH, hàm lượng NaCl,

O2…cũng ảnh hưởng đến sự tổng hợp trehalose [9] Đối với vi khuẩn quang hợp

Rhodobacter sphaeroides trehalose được tích lũy như một chất bảo vệ chủ yếu trong

các đáp ứng với sự thay đổi của nồng độ muối [19] Trehalose cũng có mặt trong

Escherichia coli [15] và một số vi khuẩn khác, chẳng hạn như Rhizobium sp,

Sulfdolobus acidocaldarius, Pimelobacter sp R48, Arthrobacter sp Q36 Trong

nhiều những sinh vật này, chức năng của trehalose vẫn chưa được biết rõ ràng [6]

Trong thế giới động vật, trehalose lần đầu tiên được thấy trong côn trùng, nơi

mà nó hiện diện trong huyết tương và trong ấu trùng hay nhộng Trong côn trùng trưởng thành, hàm lượng trehalose giảm nhanh chóng trong các hoạt động cần năng lượng, chẳng hạn như bay cho thấy một vai trò cho đường khử này như một nguồn năng lượng glucose Ngoài côn trùng, trehalose cũng đã được tìm thấy trong trứng

của giun tròn Ascaris lumbricoides, trong đó nó có thể chiếm đến 8% trọng lượng khô, ở giun tròn trưởng thành và ấu trùng giun tròn Porrocae với hàm lượng

trehalose cao đến 6% trọng lượng khô Trehalose cũng phổ biến ở tôm, và ở các loại côn trùng khác như châu chấu, cào cào, bướm, ong…

Đường này cũng có ở một số động vật không xương sống Sự hiện diện đa dạng của trehalose trong các vi sinh vật sống như vậy chứng tỏ sinh vật phân bố rộng rãi của nó và cho thấy rằng nó đóng một vai trò quan trọng trong thế giới sinh học

1.2.3 Đặc tính hóa học của trehalose [10]

Trehalose là một đường tự nhiên với chức năng tương tự như sucrose, nhưng với sự ổn định hơn và vị ngọt nhẹ hơn Vị ngọt tương đối của nó là 45% so với sucrose Quan trọng hơn, trehalose có tính chất tương tự chức năng sucrose và có thể được sử dụng trong thực phẩm và sản phẩm nước giải khát kết hợp với số lượng lớn sucrose và các chất ngọt khác để tối ưu hóa vị ngọt qua đó hương vị của các sản phẩm được đánh giá cao hơn

Hình 1.2 Độ ngọt của đường trehalose so với maltose, glucose, sucrose [10]

Trehalose dễ dàng hòa tan trong nước Độ hòa tan của nó thấp hơn ở nhiệt độ thấp nhưng cao hơn ở nhiệt độ cao so với sucrose

Hình 1.3 Độ hòa tan trong nước của trehalose so với sucrose [10]

Do cấu trúc hóa học độc đáo, trehalose ổn định ở nhiệt độ cao và ở dãy pH rộng Vì vậy, trehalose là một trong những loại đường ổn định nhất Khi 4% dung

dịch trehalose ở pH 3,5-10 được đun nóng ở 100°C trong 24 giờ, không có sự thoái

hóa của trehalose được quan sát trong mọi trường hợp Vì là đường không khử nên

trehalose không tham gia phản ứng Maillard với hợp chất amin như amino acid

hoặc protein trong quá trình chế biến và lưu trữ Và không giống như các đường

đôi khác, bao gồm sucrose, trehalose sẽ không dễ dàng bị thủy phân hóa thành

glucose Trong các sản phẩm thực phẩm và nước giải khát, sự ổn định cao trehalose

cho phép các đặc tính sản phẩm gốc được giữ lại ngay cả sau khi xử lý nhiệt và lưu

trữ lâu dài [31]

Bảng 1.1 Hàm lượng Trehalose và lượng thực phẩm tiêu thụ mỗi ngày [16]

Trehalose (%)

Lượng thực phẩm tiêu thụ mỗi ngày (g/ngày) Kem 10 16

1.2.4 Ảnh hưởng của Trehalose lên cơ thể vi sinh vật [5]

1.2.4.1 Là một nguồn dự trữ năng lượng và carbon

Như đã nói ở trên, hàm lượng trehalose có thể khác nhau rất nhiều trong các

tế bào nhất định tùy thuộc vào giai đoạn của tăng trưởng, tình trạng dinh dưỡng, và

các điều kiện môi trường hiện hành Trong côn trùng, trehalose là đường có nhiều

nhất trong huyết tương (80-90%) và các cơ ngực Trehalose là phân tử tích trữ năng lượng lớn carbohydrate được sử dụng bởi côn trùng cho các chuyến bay

Trehalose cũng là một thành phần quan trọng trong bào tử nấm Trong quá trình nảy mầm sự thủy phân trehalose được xem như là một nguồn cacbon để tổng hợp và nguồn glucose cho năng lượng

Ở vi khuẩn E coli, trehalose cũng được xem là một nguồn carbon và năng

độ trehalose cao Người ta đã thấy rằng khi các giun tròn Aphelenchus avenae từ từ

mất nước, nó chuyển đổi đến 20% trọng lượng khô của nó thành trehalose Khả năng của sinh vật này và những sinh vật khác tồn tại khi không có nước đã thể hiện một sự tương quan mạnh mẽ với sự tổng hợp của trehalose Việc nuôi cấy ở giai đoạn pha log của nấm men có nồng độ thấp của trehalose và rất dễ bị mất nước, nhưng khi chúng bước vào giai đoạn tăng trưởng với sự gia tăng hàm lượng trehalose chúng có thể tồn tại trong tình trạng mất nước

Khi gấu nước (tardigrades) thiếu nước, lượng đường glucose trong cơ thể chúng thay đổi thành trehalose khi chúng vào một trạng thái gọi là cryptobiosis - một trạng thái mà ở đó chúng xem như đã chết Tuy nhiên, khi chúng nhận được nước, chúng sống lại và trở về trạng thái trao đổi chất của chúng Người ta cũng cho

rằng lý do ấu trùng ngủ chironomid của Polypedilum vanderplanki và Artemia có

thể chịu được mất nước là vì chúng lưu trữ trehalose trong các tế bào của nó Ngay

cả trong giới thực vật, Selaginella (đôi khi được gọi là thực vật sống lại) như

Selaginella dophylla-lepi và Myrothammus flabellifolius, phát triển ở khu vực sa

mạc, miền núi, có thể bị nứt và khô, nhưng sẽ chuyển sang màu xanh trở lại và phục hồi sau một cơn mưa vì chức năng của trehalose

Bảo vệ chống lại nhiệt: Một nghiên cứu invivo và invitro quan trọng cho

thấy trehalose bảo vệ tế bào từ nhiệt bằng cách ổn định các protein ở nhiệt độ cao Sử dụng hai loại protein nhạy cảm nhiệt độ khác nhau, các nhà khoa học cho thấy các enzyme thể giữ lại hoạt động được tốt hơn trong quá trình sốc nhiệt trong các tế bào sản xuất được trehalose Trong khi đó, nghiên cứu về sự phát triển ở

nhiệt độ cao của vi khuẩn Salmonella enterica đã cho thấy một sự tích lũy ở nồng

độ cao hàm lượng trehalose, cụ thể các tế bào phát triển ở nhiệt độ 45oC thì hàm lượng trehalose tạo ra cao gấp 5 lần so với các tế bào phát triển ở 30oC [8]

Bảo vệ tế bào khỏi các tác nhân oxi hóa: Ảnh hưởng của các gốc oxy vào

các tế bào là phá hủy axit amin trong protein của tế bào và sự hiện diện của nồng độ cao của trehalose trong các tế bào sẽ ngăn ngừa các tác động này Các đột biến khiếm khuyết trehalose cho thấy một một lượng protein bị hư hỏng cao hơn ngay cả

sau khi tiếp xúc chỉ thời gian ngắn với các tác nhân oxy hóa [21]

Là một thành phần cấu trúc của các tế bào vi khuẩn: Trong mycobacteria

và corynebacteria, trehalose là thành phần cơ bản của lớp glycolipid thành tế bào dưới dạng trehalose glycolipid Tuy nhiên ngoài chức năng về cấu trúc, thì chức năng của các lipid này vẫn chưa được biết rõ

1.2.5 Ảnh hưởng của Trehalose lên cơ thể con người

1.2.5.1 Ảnh hưởng của Trehalose đến sự chuyển hóa hydratcacbon

Trehalose không hoặc rất ít bị thủy phân bởi hệ enzyme đường ruột nên khi

ăn lượng đường hòa tan trong máu không bị biến động Trong gan, hoạt lực của enzyme trên tăng lên nếu chỉ ăn saccharose nhưng sẽ được bình thường hóa bởi sự cung ứng trehalose Như vậy, trehalose có vai trò khá tích cực trong việc phòng và chữa bệnh tiểu đường xét về góc độ bệnh lý liên quan đến sự gia tăng của lipoprotein trong máu Vì thế trehalose hiện nay được dùng nhiều như một chất thấp năng lượng đặc biệt dành cho các đối tượng bị bệnh tiểu đường

Một nghiên cứu của các nhà khoa học trên những người mắc bệnh tiểu

đường, nếu mỗi ngày mỗi người ăn 8g trehalose, lượng đường trong máu sẽ giảm

nhanh trong 14 ngày [16]

1.2.5.2 Vai trò thúc đẩy quá trình hấp thụ canxi của Trehalose

Trehalose có thể tăng cường sự hấp thụ canxi của tế bào và trehalose có thể tác động ức chế lên sự phát triển của loãng xương Những kết quả này xa hơn cho thấy nếu uống sử dụng thực phẩm có chứa trehalose hàng ngày có thể hữu ích cho

cả hai quá trình chuyển hóa xương và phòng ngừa chứng loãng xương [31]

Quá trình thúc đẩy hấp thụ canxi của Trehalose xảy ra trong ruột già Cơ chế thúc đẩy trên chưa được xác định rõ ràng nhưng các tác giả đều có một kết luận chung là do ba yếu tố sau:

 Đường Trehalose trong ruột già được các vi sinh vật sinh axit lên men, làm giảm pH của môi trường, dẫn đến sự tái hòa tan của các muối canxi

 Trong ruột già các vi khuẩn Bifidobacterium lên men mạnh khi môi trường

có chứa Trehalose sinh ra các axit mạch ngắn, các axit này khuếch tán vào

tế bào biểu bì thành ruột, từ đó thúc đẩy sự hấp thụ canxi

 Sự dịch chuyển Trehalose trong ruột già sẽ kéo theo sự dịch chuyển của hợp chất canxi – protein, nhờ đó canxi được tiếp xúc nhiều hơn với các tế bào thành ruột, tạo điều kiện tốt cho sự hấp thu vào máu Ngoài canxi, Trehalose đồng thời còn thúc đẩy sự hấp thụ cả magie Điều này thúc đẩy quá trình phát triển xương, tăng cường hàm lượng canxi trong xương

1.2.5.3 Ảnh hưởng của Trehalose đến hệ vi sinh vật trong khoang miệng

Bệnh sâu răng chủ yếu là do vi khuẩn streptococci đột biến và các liên cầu khuẩn gây nên Các vi sinh vật có rất nhiều trong khoang miệng của người và động vật Khi đưa thức ăn vào chúng sẽ lựa chọn thành phần dinh dưỡng thích hợp dễ lên men, phát triển và gây bệnh Vì thế nếu trong thành phần thức ăn của ta không chứa hoặc ít chứa chất thích hợp cho quá trình dinh dưỡng của loại vi sinh vật trên sẽ có thể ngăn ngừa được bệnh Để xét ảnh hưởng của Trehalose đến bệnh sâu răng người

ta đã tiến hành thí nghiệm trên cơ thể chuột Kết quả cho thấy nhóm chuột thí

nghiệm (ăn đường Trehalose) bị sâu răng ít hơn nhiều so với nhóm chuột đối chứng (ăn saccharose)

Các thí nghiệm nuôi cấy vi sinh vật phân lập từ khoang miệng lên môi trường Trehalose đã chứng tỏ cơ chế và khả năng phòng bệnh sâu răng của nó Đó

là do Trehalose không phải là môi trường thích hợp cho các vi sinh vật trên phát triển

Ngoài ra Trehalose còn có khả năng chữa bệnh sâu răng Vì thế ngày nay trên thế giới người ta còn dùng Trehalose thay thế cho đường kính trong thành phần

ăn hoặc trong chế biến bánh kẹo, đặc biệt là bánh kẹo cho trẻ em để phòng bệnh sâu

răng [16]

1.2.6 Con đường tổng hợp trehalose [7], [12]

Có ít nhất năm con đường sinh tổng hợp được biết đến với trehalose ( hình

1.5) Các con đường đầu tiên được phát hiện khoảng 50 năm trước, là phân phối

rộng rãi nhất Cơ chế này lần đầu tiên được mô tả trong nấm men (Cabib và Leloir, 1958) và từ đó đã được chứng minh và nó đã được tìm thấy trong sinh vật nhân thật, cổ khuẩn, nấm, côn trùng và thực vật Nó bao gồm hai bước enzyme xúc tác bởi synthase trehalose-6-phosphate (TPS) và trehalose-phosphatase (TPP) TPS xúc tác chuyển glucose từ glucose-UDP và glucose-6-phosphate tạo thành trehalose-6-phosphate (T6P) và UDP, trong khi enzyme TPP phosphoryl hóa khử T6P thành trehalose và phosphate vô cơ

Trong con đường sinh tổng hợp thứ hai, enzym trehalose synthase (TS) isomer hóa liên kết α1-α4 của maltose thành một kết α1-α1, tạo thành trehalose

Con đường thứ ba liên quan đến chuyển đổi maltodextrine (maltooligosaccharides, glycogen và tinh bột) thành trehalose Con đường này tồn

tại trong cổ ưa nhiệt Sulfolobus Những sinh vật này tổng hợp trehalose trong hai

bước enzyme xúc tác bởi enzym trehalose synthase maltooligosyl (Trey), được mã hóa bởi các gen Trey, thúc đẩy sự glycosyl hóa các phân tử glucose cuối cùng vào cuối chuỗi maltodextrins từ liên kết α1-α4 đến liên kết α1-α1 tạo thành

maltooligosyltrehalose Tiếp theo, enzyme maltooligosyl trehalose trehalohydrolase (TreZ), được mã hóa bởi các gen treZ, xúc tác sự thủy phân tạo thành trehalose

Trong con đường thứ tư, trehalose phosphorylase (TreP), hiện diện ở một số nấm, xúc tác sự thủy phân thuận nghịch của trehalose với sự hiện diện của phosphate vô cơ Việc chuyển một phân tử glucose và một phosphate để tạo ra glucose-1-phosphate và tạo ra các phân tử glucose khác Tuy nhiên, không có sự chắc chắn về sự tham gia của các enzyme TreP trong tổng hợp hoặc thoái hóa của trehalose, vì các phản ứng sinh tổng hợp chỉ được thể hiện trong ống nghiệm

Hình 1.4 Sự phân bố các con đường sinh tổng hợp Trehalose trong tự

nhiên [7]

Một con đường sinh tổng hợp mới cho trehalose được tìm thấy trong các cổ

khuẩn chịu nhiệt cực đoan Thermococcus litoralis, và liên quan đến enzyme

trehalose glycosyltransferring synthase (TreT) xúc tác hình thành thuận nghịch của trehalose từ ADP-glucose và glucose Nó cũng có thể sử dụng UDP-glucose và GDP glucose, mặc dù nó ít hiệu quả với các cơ chất khác

Trehalose được phân hủy bởi enzyme trehalase (TreH) thành hai phân tử glucose

Hình 1.5 Các con đường tổng hợp Trehalose [7]

Các trình tự hoàn chỉnh các gen mã hóa cho các enzyme sinh tổng hợp

trehalose được phân tích và đã cho thấy rằng các enzyme này phân bố rộng khắp

trong ba giới của sự sống và nhiều sinh vật có nhiều hơn một con đường để tổng

hợp trehalose (hình 1.4)

A Con đường TPS/TPP

UDP Glucose + Glucose 6-phosphate

Trehalose 6-phosphate Trehalose

Trehalose 6-phosphate synthase (TPS)

Trehalose 6 phosphate phosphatase (TPP )

B Con đường TS Maltose Trehalose

Trehalose synthase ( TS)

C Con đường TreY/TreZ

Maltooligosaccharides Tinh bột hoặc glycogen maltooligosyltrehalose Trehalose

Maltooligosyl trehalose synthase (Trey)

Maltooligosyl trehalose trehalohydrolase (TreZ )

D Con đường TreP

Glucose 1-phosphate

+ glucose

Trehalose +

Trehalose + ADP

Trehalose glycosyltransferring synthase (TreT)

F Con đường TreH

Trehalose D-Glucose+

D-Glucose

Trehalase( TreH)

1.2.7 Ứng dụng của trehalose [10],[16]

Trehalose đã được chấp nhận như là một thành phần thực phẩm mới theo các điều khoản GRAS ở Mỹ và EU Trehalose, giống như các loại đường khác có thể được sử dụng không hạn chế trong một loạt các sản phẩm thực phẩm bao gồm sôcôla, đồ uống và bánh kẹo đường, các sản phẩm bánh, thực phẩm đông lạnh, ngũ cốc và các sản phẩm Trehalose được sử dụng trong nhiều loại sản phẩm là do những tác động nhiều mặt của trehalose, chẳng hạn như hương vị ngọt nhẹ của nó, tính chất bảo quản của nó trong việc duy trì chất lượng của ba chất dinh dưỡng chính (carbohydrate, protein, chất béo) và khả năng ức chế hương vị mạnh, và mùi của thực phẩm sống, thịt và thực phẩm đóng gói do đó làm tăng hương vị của sản phẩm mà không ảnh hưởng đến tuổi thọ sản phẩm

Ngoài ra, do tính ổn định cao, trehalose có thể được sử dụng ở nhiệt độ cao trong thời gian dài mà không có nguy cơ bị thủy phân, và màu sắc sản phẩm được duy trì

Nó cũng được dùng như một chất ổn định protein trong nghiên cứu Nó đặc biệt hiệu quả khi kết hợp với các ion phosphate Trehalose cũng đã được sử dụng trong công thức một số kháng thể đơn dòng: trastuzumab và bevacizumab, (tên thị trường là Herceptin và Avastin tương ứng), Genntech, và ranibizumab (tên thị trường Lucentis và Novartis)

Mỹ phẩm: Tận dụng khả năng giữ ẩm của trehalose, nó được sử dụng như một loại kem dưỡng ẩm trong nhiều vệ sinh cơ bản, chẳng hạn như các loại dầu tắm

1.2.8 Sản xuất trehalose [20], [26], [31]

Mặc dù hữu dụng của nó đã được công nhận, trehalose không được sản xuất trên quy mô công nghiệp cho đến năm 1994 Các phương pháp truyền thống để sản xuất, ví dụ chiết xuất từ nấm men hoặc cây quả, có năng suất quá thấp với chi phí quá cao để được sử dụng

Để thực hiện sản xuất công nghiệp trehalose, năm 1994, Hayashibara, một hãng sản xuất tinh bột ở tỉnh Okayama, Nhật Bản, đã phát hiện ra một phương pháp không tốn kém sản xuất trehalose đại trà từ tinh bột Họ đã nghiên cứu các hệ thống enzym mới và đã thành công trong việc cô lập một hệ thống enzyme mới từ một

dòng vi khuẩn thuộc chi Arthrobacter sp Q36 phân lập từ đất Hệ thống này đã

được tìm thấy bao gồm hai loại enzyme mới: malto-oligosyltrehalose synthase (MTSase) và malto-oligosyltrehalose trehalohydorolase (hoặc MTHase) Trong bước đầu tiên, MTSase xúc tác sự glycosyl hóa glucose ở vị trí khử của maltooligosaccharide từ liên kết -1,4 đến liên kết -1,1 sau đó malto- oligosyltrehalose được tạo ra Phân tử này có chứa nhóm trehalose ở cuối chuỗi saccharide Tiếp theo, trehalose được giải phóng từ malto–oligosyltrehalose bởi enzyme MTHase Con đường này không cần dẫn xuất đường năng lượng cao như đường phosphate hoặc đường nucleotide Và những enzym này có thể hoạt động lặp lại trên 1, 4 glucan để sản xuất trehalose với năng suất lên đến 80%

Hình 1.6 Cơ chế sản xuất Trehalose từ tinh bột [31]

Qui trình sản xuất trehalose được thể hiện trong hình 1.6 Đây là qui trình

sản xuất trehalose ở qui mô công nghiệp được áp dung duy nhất hiện nay.Tinh bột được hoá lỏng bởi một amylase chịu nhiệt và được phân tách bởi isoamylase Các amylose hình thành được chuyển đổi thành trehalose bởi hệ thống này Hệ thống này bao gồm hai loại enzyme mới, MTSase và MTHase, hoạt động trên amylose hoặc tinh bột để sản xuất trehalose hiệu quả Sử dụng quá trình này đã thành công trong việc giảm chi phí sản xuất của trehalose cho khoảng 100 lần so với chi phí ban đầu của nó

1.2.9 Tình hình nghiên cứu enzyme trehalose synthase trên thế giới

Qui trình sản xuất trehelose từ tinh bột có thể sản xuất ở qui mô công nghiệp

và làm giảm chi phí sản xuất nhiều lần Tuy nhiên, qui trình này trải qua nhiều giai

Tinh bột

Tinh bột được hóa lỏng

Dung dịch đường hóa

Dung dịch tinh sạch (chiếm hơn 85%)

Trehalose

α amylase chịu nhiệt

Isoamylase MTSae, MTHase

Khử khoáng Khử màu

Cô đặc

Kết tinh

Ly tâm Sấy khô

đoạn phức tạp và liên quan đến nhiều enzyme phức tạp Vì vậy, việc nghiên cứu một phương pháp đơn giản, hiệu quả để sản xuất trehalose là điều đang được quan tâm hiện nay Trong số các enzyme liên quan đến việc sản xuất trehalose, trehalose synthase được chú ý nhiều hơn cả

Trehalose synthase là enzyme xúc tác sự chuyển đổi qua lại của maltose và trehalose và enzyme này phù hợp cho sự sản xuất công nghiệp trehalose, vì phản ứng một bước đơn giản của nó và sử dụng nguyên liệu chi phí thấp Enzym trehalose synthase (TS) isomer hóa liên kết α1-α4 của maltose thành một kết α1-α1, tạo thành trehalose

Enzyme này lần đầu tiên được báo cáo ở vi khuẩn Pimelobacter sp Tsusaki

và cộng sự đã tạo dòng gen trehalose synthase từ chủng vi khuẩn Pimelobacter Sp

phân lập được từ đất [34] Việc phân tích trình tự đã cho thấy gen trehalose synthase

tạo dòng ở vi khuẩn này dài 1719bp và chứa khoảng 573 acid amin Sau đó, Tsujisaka và cộng sự đã tinh sạch và khảo sát một số hoạt tính, các yếu tố ảnh hưởng của enzyme đã được tạo dòng này Kết quả cho thấy enzyme này ổn định ở dãy pH từ 6.0 đến 9.0 ở 30oC trong 60 phút [22] Tốc độ biến đổi maltose thành

trehalose không phụ thuộc vào nồng độ maltose Năm 1997, Tsusaki và cộng sự đã tiếp tục tạo dòng thành công enzyme trehalose synthase từ chủng vi khuẩn

Thermusaquaticus ATCC33923 chịu nhiệt Enzyme này đã cho thấy khả năng ổn

định ở nhiệt độ đến 80oC trong 60 phút Sự ổn định nhiệt này thích hợp cho việc sản

xuất công nghiệp trehalose từ maltose [32]

Thành công trong việc tạo dòng enzyme trehalose synthase từ vi khuẩn

Pimelobacter sp đã tạo tiền đề cho các nhà khoa học trong việc tạo dòng enzyme này ở các chủng vi khuẩn khác Enzyme Trehalose synthase của Pseudomonas stutzeri CJ38, Torridus Picrophilus, Thermobifida fusca, Mycobacterium smegmatis, Grifola frondosa… đã được tạo dòng và biểu hiện trong E.coli

[17],[18],[25],[36] Gần đây nhất các nhà khoa học Trung Quốc đã tạo dòng thành

công Trehalose synthase từ chủng vi khuẩn chịu nhiệt trung bình Meiothermus

ruber phân lập từ các vùng suối nước nóng [35],[37] Những thành công này không

chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn được được chứng minh là phù hợp cho việc sản xuất trehalose ở qui mô công nghiệp Ngày nay, mối quan hệ giữa cấu trúc và chức năng của Trehalose synthase cũng đã được nghiên cứu nhiều do đó hoạt động và tính ổn định của enzyme có thể được gia tăng.Ở Việt Nam, hiện vẫn chưa có một nghiên cứu chính thức nào về Trehalose và enzyme trehalose synthase cũng như tác động của đường này lên cơ thể con người

tổ hợp vào tế bào chủ và cuối cùng là chọn lọc vector tái tổ hợp

1.3.1 Chọn và xử lý vector

Việc chọn lọc vector phụ thuộc nhiều yếu tố: kích thước đoạn DNA muốn tạo dòng, mục đích tạo dòng…Trước hết, vector được cắt ở một vị trí xác định bằng một enzyme giới hạn Sau đó, hai đầu chỗ mối cắt được xử lý để chúng không thể

nối trở lại

1.3.2 Xử lý DNA cần tạo dòng

Trước hết cần chọn lọc sơ khởi các đoạn DNA có kích thước gần nhau và tương ứng với loại vector đã chọn Sau đó, hai đầu của các DNA này cần được xử

lý cho phù hợp với hai đầu chỗ mối cắt của vector

1.3.3 Tạo vector tái tổ hợp

Vector và DNA cần tạo dòng đã được xử lý sẽ được trộn chung theo một tỉ lệ nhất định với sự hiện diện của ligase Ligase xúc tác phản ứng nối vector với đoạn DNA tạo thành vector tái tổ hợp

1.3.4 Chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào chủ

Công đoạn này nhằm mục đích sử dụng bộ máy của tế bào chủ để sao chép vector tái tổ hợp thành một số lượng lớn bản sao Tùy thuộc vào loại tế bào chủ, người ta sử dụng một kỹ thuật chuyển thích hợp Tế bào chủ thông dụng nhất là các

tế bào vi khuẩn, thường là E.coli bởi vì khả năng sinh sản nhanh của nó cũng như

thao tác dễ dàng và ít tốn kém Có 2 kỹ thuật chuyển phổ biến nhất: hóa biến nạp và điện biến nạp

1.3.4.1 Hóa biến nạp

Hóa biến nạp là phương pháp sử dụng chất hóa học, tạo điều kiện để đưa

vector tái tổ hợp vào tế bào chủ Hiệu suất của phương pháp hóa biến nạp này vào

khoảng 105 đến 106 tế bào biến nạp trên 1mg DNA tái tổ hợp Người ta nhận thấy

nếu tế bào vi khuẩn được xử lý với CaCl2 lạnh thì khả năng đánh bắt DNA ngoại lai tăng lên rất nhiều Các tế bào khả nạp được trộn với DNA và cho shock nhiệt ở

42oC trong thời gian ngắn (khoảng 2 phút) rồi làm lạnh nhanh, khi đó nó sẽ thu nhận plasmid vào trong tế bào

1.3.4.2 Điện biến nạp

Đây là phương pháp rất hiệu quả để đưa DNA vào tế bào sinh vật gồm cả tế bào động vật có vú, thực vật, nấm men và vi khuẩn Hiệu suất từ 109 đến 1010 tế bào biến nạp cho 1mg DNA tái tổ hợp Trong phương pháp này, một shock điện cao thế (500-1500 V/cm) được truyền qua tế bào được treo giữa 2 điện cực trong một thời gian ngắn (2-20 giây) Shock điện có thể làm màng tế bào bị thủng vào để cho DNA lọt vào

Nhiệt tạo ra, sự thay đổi tính thấm của màng tế bào chất và các hiệu quả khác

có thể làm tổn thương tế bào, thậm chí chết Do vậy, điều kiện tiến hành phải được xác định bằng thực nghiệm đối với các loại tế bào khác nhau DNA dùng cho phương pháp này phải thật sự tinh khiết thì cho hiệu quả mới cao

1.3.5 Chọn lọc dòng tái tổ hợp:

Thông thường, việc nối DNA vào vector không bao giờ thành công hoàn toàn và đặc hiệu nên hỗn hợp nối sẽ có nhiều kết quả nối khác nhau ví dụ như;

DNA nối lẫn nhau, vector tự đóng vòng mà không mang đoạn chèn Do đó, sau khi đưa DNA vào tế bào tiến hành nuôi cấy và phân lập các dòng thu được để phát hiện các dòng mang DNA tái tổ hợp Nhìn chung có một số phương pháp chính như sau:

Sử dụng kỹ thuật bổ sung alpha: dựa vào sự hiện diện của β-galactosidase - chịu trách nhiệm thủy phân lactose thành galactose để tế bào có thể sử dụng Enzyme này có hai đơn vị, bộ gen của tế bào chủ chỉ mã hóa một đơn vị, còn đơn vị thứ hai (đoạn alpha) được mã hóa trên vector và vị trí chèn sẽ nằm trong vùng này

Do đó, nếu vector mang DNA tái tổ hợp thì đơn vị thứ hai của β-galactosidae không được tổng hợp và tế bào sẽ không sử dụng lactose

Sử dụng sự đề kháng với kháng sinh: vector mang hai gen kháng kháng sinh,

vị trí chèn nằm trong một gen kháng kháng sinh Nếu vector mang DNA tái tổ hợp dòng thu được sẽ mất khả năng đề kháng với một trong hai kháng sinh Do đó tao

có thể sử dụng phương pháp in dấu để phát hiện

Chọn lọc trực tiếp: đây là cách tốt nhất nhưng lại khó thực hiện trên thực tế Trong phương pháp này, đoạn chèn sẽ mang đến cho tế bào nhận được nó có đặc điểm kiểu hình mà các dòng khác không có và ta có thể dễ dàng nhận ra khi phân lập ví dụ đoạn chèn mang gen kháng kháng sinh

Lai khuẩn lạc (colony hybridization): áp dụng cho trường hợp đoạn chèn đã biết trình tự Các khuẩn lạc sau khi phân lập được in dấu trên màng nitrocellulose hay nylon, tế bào trên màng bị phá hủy để lộ bộ vật liệu di truyền Màng lọc lúc này được cho lai với đoạn dò được đánh dấu tương ứng với đoạn chèn Nếu khuẩn lạc nào mang đoạn chèn sẽ có tín hiệu, từ vị trí tín hiệu trên màng lọc suy ra khuẩn lạc tương ứng trên hộp thạch ban đầu

Chương 2:

VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Chủng vi khuẩn chịu nhiệt Meiothermus ruber được phân lập từ suối nước

nóng Bình Châu - Phước Bửu (Bà Rịa - Vũng Tàu) có nhiệt độ trong khoảng từ

2.1.3 Môi trường làm thuần và cấy chuyền vi khuẩn ưa nhiệt [3]

Đề tài sử dụng môi trường Castenholz Saltz, 2X–TYE (CS–TYE) do Thomas D Brock và Hudson Freeze thiết kế và đề nghị

Môi trường Castenholz Salt, 2X

Môi trường nuôi cấy được pha với tỷ lệ: 5 phần Castenholz salts, 2X + 1

phần 1% TYE + 4 phần nước cất Điều chỉnh pH: 7,0-7,5, hấp khử trùng ở

121oC/15’

2.1.4 Hóa chất dùng cho tách chiết DNA

 TE buffer: 10mM Tris-HCl mM EDTA, pH 8,0

 Dung dịch SDS (sodium dodecyl sulfate): 10% ( v/v)

 Dung dịch NaCl 5M : cân 292 g NaCl hoà tan trong 1 lít H2O

 Dung dịch CTAB/NaCl: hòa tan 4,1 g NaCl trong 80 ml H2O và thêm từ từ 10 g CTAB (hexa-decyltrimethyl ammonium bromide) trong khi đun và khuấy Nếu cần thiết đun đến 65oC để làm tan Chỉnh thể tích cuối cùng đến 100 ml

 24:1 chloroform/ isoamyl alcohol

 25:24:1 phenol/chloroform/ isoamyl alcohol

 Isopropanol

 Ethanol 70%

dưới là vị trí cắt của EcoRI)

2.1.6 Mồi dùng cho giải trình tự

Mồi A: CCTACTACTGGCACCGCTTCTACCACCAC

Mồi B: ATCCCCGCTTCCGCATCAACCTGG

Mồi C: CTGGAGGAGGGTGAGGTAGAGGGGGGAC

Mồi D: TTCCACCAGAAGCCCAGCCCCTCCC

2.1.7 Hóa chất dùng cho các phản ứng cắt, nối DNA

Enzyme cắt giới hạn NdeI, EcoRI, enzyme nối T4 DNA ligase được cung cấp bởi hãng Promega

2.1.8 Hóa chất dùng cho điện di trên gel agarose

 Dung dịch đệm TAE 1X: pha từ dung dịch mẹ 50X (Tris base 242 g; acid acetic băng 55,1 ml; Na2EDTA 37,2 g; nước cất vừa đủ 1 lít)

 Agarose tinh khiết dùng cho điện di (Invitrogen)

 Dung dịch ethidium bromide 5 mg/ml (Sigma)

 Dung dịch đệm nạp mẫu (loading buffer) 10X (glycerol 50% trong

TE 1X, có 0,015% bromophenol blue, trộn và bảo quản ở -20oC trong từng phần nhỏ)

 Thang DNA chuẩn: MassRuler DNA Ladder Mix (Fermentas)

Hình 2.1 Kích thước của thang MassRuler ladder Mix 2.1.9 Môi trường, hóa chất dùng cho biến nạp và biểu hiện

 Môi trường SOC: Bacto tryptone 2 g, yeast extract 0,5 g, NaCl 10

mM, KCl 2,5 mM, MgCl 10 mM, MgSO4 10 mM, D-Glucose 20 mM

bổ sung nước vừa đủ 100 g

 Môi trường LB (Luria-Bertani) dùng nuôi cấy E.coli: Bacto-tryptone

10 g; Bacto yeast extract 5 g; NaCl 10 g; nước cất vừa đủ 1 lít; pH 7,4

 Để chọn lọc các vi khuẩn mang plasmid có tính đề kháng kháng sinh, môi trường LB được bổ sung kháng sinh chọn lọc ampicillin (Amp)

 Dung dịch đệm cho gel tách (Tris-HCl 1,5M pH 8,8)

 Dung dịch đệm cho gel gom (Tris-HCl 0,5M, pH 6,8)

 SDS 10%

 Amonium persulphate (APS) 10%

 Thang protein chuẩn: thang Multicolor Broad Range Protein Ladder

Hình 2.2 Kích thước thang Multicolor Broad Range Protein Ladder 2.1.11 Hóa chất dùng cho tinh chế DNA từ thạch agarose

Bộ kit Wizard SV Gel và PCR Clean-up system (Promega)

2.1.12 Hóa chất dùng cho tinh chế plasmid

Bộ kit DNA-spinTM Plasmid (Intronbio, mã số 17093)

2.1.13 Hóa chất dùng cho phương pháp Western blot

 Giấy thấm dày, màng nitrocellulose

 Dung dịch đệm chuyển màng (Tris 25 mM; glycine 192 mM, MeOH 20%, SDS 0,1%)

 Dung dịch khóa màng: 20 ml dung dịch đệm PBS 1X, 1 g sữa gầy (5%) và 100 ml Tween-20 (0,5%)

 Dung dịch rửa: dung dịch đệm PBS 1X có 0,1% Tween-20

 Kháng thể sơ cấp:kháng thể kháng his

 Kháng thể thứ cấp:protein A gắn peroxidase (GE)

 TMB dùng để hiện màu trên màng

2.2 PHƯƠNG PHÁP

2.2.1 Phương pháp thu mẫu

Tiến hành thu mẫu từ 3-5 mẫu khác nhau trong khu vực suối nước nóng,

việc tiến hành thu mẫu được tiến hành lặp lại tại các điểm Thu mẫu nước ở độ sâu

10 cm bằng các lọ thủy tinh (có dung tích 50 –100 ml), nút đậy bằng cao su đã khử

trùng Mẫu nước không giữ nhiệt và được xử lý trong vòng 24 giờ

2.2.2 Phương pháp làm giàu và phân lập vi khuẩn Meiothermus ruber

Nuôi tích lũy: chuyển 1 ml mẫu nước vào các bình tam giác 250 ml chứa môi trường dịch thể CS–TYE với pH 7,6 Ủ ở nhiệt độ 55°C, không lắc

Phân lập và làm thuần: huyền phù sinh khối vi khuẩn chịu nhiệt từ môi trường nuôi tích lũy được pha loãng và ria trên môi trường thạch CS–TYE có pH

tương ứng Đặt các đĩa thạch vừa cấy vào trong tủ ấm ở nhiệt độ 55°C Sau 2, 3 ngày chọn các khuẩn lạc có màu sắc khác nhau, huyền phù hóa từng khuẩn lạc trong nước muối sinh lý vô trùng và ria trên môi trường CS–TYE thạch để làm thuần vi

khuẩn ưa nhiệt

2.2.3 Phương pháp định danh vi khuẩn Meiothermus ruber

2.2.3.1 Khảo sát hình thái tế bào

Tế bào được nuôi trong môi trường dịch thể CS-TYE ở điều kiện nhiệt độ tối

ưu từ 3 đến 4 ngày Quan sát hình dạng tế bào ở trạng thái sống bằng kính hiển vi quang học Sau đó tiến hành nhuộm gram tế bào và quan sát với vật kính dầu

2.2.3.2 Giải trình tự gen

Tiến hành tách chiết DNA bộ gen của các chủng khảo sát, thực hiện phản ứng PCR để khuếch đại một đoạn gen đặc hiệu thuộc vùng 16S rRNA Sau đó giải trình tự các đoạn này và dùng phần mềm để so sánh với dữ liệu trên Gen Bank

2.2.4 Phương pháp tách chiết DNA vi khuẩn

 Ly tâm 1,5 ml dịch vi khuẩn trong 2 phút Bỏ dịch nổi

 Hoà cắn trong 567 µl đệm TE Thêm 30 µl SDS 10% và 3 µl proteinase K 20 mg/ml Trộn đều, ủ trong 1 giờ ở 37oC

 Thêm 100 µl NaCl 5M, trộn đều Thêm 80 µl dung dịch CTAB/NaCl, trộn và ủ trong 10 phút ở 65oC

 Thêm một luợng cân bằng chloroform/ isoamyl alcohol, trộn đều và ly tâm từ 4 đến 5 phút Chuyển dịch nổi sang 1 tube sạch

 Thêm một lượng cân bằng phenol/chloroform/isoamyl alcohol trộn đều và ly tâm trong 5 phút Chuyển dịch nổi sang 1 tube sạch

 Thêm 0,6 thể tích isopropanol ly tâm, bỏ dịch nổi Hòa cắn trong 1ml ethanol 70%

 Ly tâm trong 5 phút, loại bỏ dịch nổi và làm khô nhanh trong máy ủ nhiệt khô Hoà trong 100 µl đệm TE