Xây dựng quy trình nuôi cấy virus cúm a(h1n1) trên tế bào mdck bằng hệ thống vi hạt

TRẦN NGỌC THỦY TIÊNXÂY DỰNG QUY TRÌNH NUÔI CẤY VIRUS CÚM AH1N1 TRÊN TẾ BÀO MDCK BẰNG HỆ THỐNG VI HẠT Chuyên ngành: Di Truyền Học Mã số: 60 42 70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG D

Trang 1

TRẦN NGỌC THỦY TIÊN

XÂY DỰNG QUY TRÌNH NUÔI CẤY VIRUS CÚM A(H1N1) TRÊN TẾ BÀO MDCK BẰNG HỆ THỐNG VI HẠT

Chuyên ngành: Di Truyền Học

Mã số: 60 42 70

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS CAO THỊ BẢO VÂN

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2010

Trang 2

Lời cảm ơn

Em xin chân thành cảm ơn Cơ TS Cao Thị Bảo Vân đã tận tình quan tâm, hướng dẫn

và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em trong suốt thời gian em thực tập và làm luận văn tại Labo Sinh học phân tử – Khoa Vi sinh Miễn dịch, Viện Pasteur TpHCM

Em xin chân thành cảm ơn Quý Thầy Cơ Phịng Đào tạo sau Đại học, Quý Thầy Cơ trong bộ mơn Di truyền – Khoa Sinh học Trường ĐH KHTN TpHCM, và Quý Thầy

Cơ giảng viên thỉnh giảng đã truyền đạt cho em nhiều kiến thức bổ ích

Em xin chân thành cảm ơn Cơ ThS Kim Dung và anh Thương – Labo Kiểm định – đã tạo điều kiện về hĩa chất, thiết bị và hỗ trợ kỹ thuật karyotyping cho em

Em xin chân thành cảm ơn Cơ TS Quế Hương và các anh chị thuộc Labo Arbovirus

đã hỗ trợ em thiết bị chụp ảnh nhiễm sắc thể

Chân thành cảm ơn các chị, các bạn của Labo Sinh học Phân tử, nhất là bạn Nhi và bạn Chỉnh, đã cùng trao đổi, chia sẻ nhiều kinh nghiệm quý báu và hỗ trợ, giúp đỡ Tiên trong suốt thời gian Tiên thực hiện luận văn và làm việc tại Phịng

Cảm ơn các anh chị và các bạn lớp CH Di truyền K16 cũng như các bạn Hương, Hiền,

Ý lớp 00CNSH đã cùng Tiên học tập và động viên Tiên hồn thành luận văn

… Me ohc sn6e9d me9d xa9d hna fam scuhp jhnah xgn7uhn fu6eihn jt6aht fav xem jhnam jc7ul jihgn, jc7ul jgn6o9d, jc7ul hnis fn6ougn n7o rmac! St6ahn jpus yus me ihk xgn7uhn me i7or rob gn6ohk fav, M6al Gn6on jn6eiv 7uht n6el me r7ohc hna fu6a9d fyagn xgn7uhn f7ut, auq m8an ab st6ous me n6eb n6oul xa9d hna n7o rmac!

Me rauc gn7o7uht u6ey fgnuc 6ov F6ot, hna n7o rmac

Cuối cùng, những tình cảm thiêng liêng nhất con xin dành cho bố Dũng, mẹ Châu

và chị hai Minh Anh – những người đã luơn dõi theo và kiên nhẫn ủng hộ mọi bước đường con đi…

Trang 3

Mục lục

Trang Trang phụ bìa

Lời cảm ơn

Mục lục i

Danh mục chữ viết tắt iv

Danh mục bảng v

Danh mục hình ảnh vi

Đặt vấn đề viii

Phần 1 Tổng quan tài liệu 1.1 Công nghệ nuôi cấy virus cúm trên tế bào 1

1.1.1 Ưu điểm của công nghệ nuôi cấy virus cúm trên tế bào 1

1.1.2 Hệ thống nuôi cấy tế bào với giá thể vi hạt sử dụng trong sản xuất virus 3

1.2 Tế bào MDCK 6

1.2.1 Định nghĩa 6

1.2.2 Lịch sử phát triển dòng tế bào MDCK 6

1.2.3 Một số ứng dụng của tế bào MDCK 6

1.2.4 Ưu điểm của tế bào MDCK 7

1.2.5 Đặc điểm của tế bào MDCK 8

1.2.5.1 Đặc điểm hình thái 8

1.2.5.2 Đặc điểm di truyền 8

1.2.5.3 Đặc điểm sinh lý 8

1.2.6 Điều kiện nuôi cấy tế bào MDCK 9

1.3 Virus cúm A(H1N1) mới 2009 10

1.3.1 Sơ lược về virus cúm A 10

1.3.2 Virus cúm A(H1N1) mới 2009 12

1.3.2.1 Các đặc điểm của virus cúm A(H1N1) mới 2009 12

Trang 4

Mục lục

Luận văn Thạc sĩ Sinh học – Trần Ngọc Thủy Tiên

ii

Phần 2 Vật liệu – Phương pháp

2.1 Vật liệu 20

2.1.1 Hóa chất và sinh phẩm 20

2.1.1.1 Hóa chất 20

2.1.1.2 Sinh phẩm 22

2.1.2 Dụng cụ 23

2.1.3 Thiết bị 24

2.2 Phương pháp 25

2.2.1 Kiểm tra sự hiện diện của mycoplasma trong dịch nuôi cấy tế bào 25

2.2.2 Xây dựng đường cong tăng trưởng của tế bào 25

2.2.3 Nuôi cấy tế bào và virus trên vi hạt Cytodex1 27

2.2.4 Định kiểu nhân (karyotyping) 29

2.2.5 Xác định hiệu giá virus bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu 31

2.2.6 Xác định hiệu giá virus bằng TCID50 theo Reed – Muench (1938) 32

2.2.7 Xác định liều gây nhiễm MOI 34

Phần 3 Kết quả và biện luận 3.1 Xây dựng đường cong tăng trưởng của tế bào MDCK trong môi trường M0643 [5% CO2, 10%FBS] 36

3.2 So sánh hiệu quả nuôi cấy tế bào MDCK trong các môi trường khi thay đổi nồng độ FBS và CO2 40

3.3 Khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ trypsin TPCK lên sự sống sót của tế bào MDCK 44

3.4 Khảo sát nhiệt độ nuôi cấy thích hợp cho virus NIBRG-121xp-E1 48

3.5 Xác định liều xâm nhiễm tối ưu của virus NIBRG-121xp-E1 55

3.6 Khảo sát thời gian bám và tăng trưởng của tế bào MDCK trên vi hạt Cytodex1 61

3.7 Ứng dụng các điều kiện nuôi cấy thích hợp đã được khảo sát để nuôi cấy virus NIBRG-121xp-E1 bằng vi hạt Cytodex1 65

Trang 5

3.8 Kiểm tra sự ổn định của tế bào MDCK sau nhiều đời cấy chuyền 68

Phần 4 Kết luận và đề nghị 4.1 Kết luận 75

4.1.1 Các điều kiện nuôi cấy tế bào MDCK trên vi hạt Cytodex1 75

4.1.2 Các điều kiện nuôi cấy virus NIBRG-121xp-E1 bằng vi hạt Cytodex1 75

4.1.3 Sự ổn định của tế bào MDCK sau nhiều đời cấy chuyền 76

4.1.4 Quy trình nuôi cấy virus NIBRG-121xp-E1 bằng hệ thống vi hạt 76

4.2 Đề nghị 77

Các công trình đã công bố 78

Tài liệu tham khảo 79

Phụ lục 87

Trang 6

Danh mục chữ viết tắt iv

Danh mục chữ viết tắt

ATCC : American Type Culture Collection (ngân hàng tế bào giống tại Hoa Kỳ)

BHK : Baby Hamster Kidney (tế bào thận chuột con)

BSA : Albumin from Bovine Serum (albumin từ huyết thanh bê)

CDC : Centers for Disease Control and Prevention

(Trung tâm Kiểm soát và Ngăn ngừa dịch bệnh)

CPE : Cytopathetic Effect (hiệu ứng hủy hoại tế bào)

DEAE : Diethylaminoethyl

ECACC : The European Collection of Cell Cultures (ngân hàng tế bào châu Âu)

EDTA : Ethylene-diamin-tera-acetic acid

FBS : Fetal Bovine Serum (huyết thanh bào thai bê)

HA : Haemagglutination Assay (phản ứng ngưng kết hồng cầu)

MDCK : Madin – Darby Canine Kidney (tế bào thận chó Madin – Darby)

MOI : Multiplicity Of Infection (liều xâm nhiễm)

PBS : Phosphate Buffered Saline (muối đệm phosphate)

PCR : Polymerase Chain Reaction (phản ứng khuếch đại gene)

TCID50 : 50% The Tissue Culture Infectious Dose

(liều xâm nhiễm của virus gây hủy hoại 50% số giếng tế bào)

TPCK : L-tosylamino-2-phenylethyl chloromethyl keton

Tolylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl keton

Vero : Vervet Monkey Origin (African green monkey kidney)

(tế bào thận khỉ xanh châu Phi)

WHO : World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới)

Trang 7

Danh mục bảng

Trang

Bảng 1.1 Một số loại vi hạt thương mại hiện hành 5

Bảng 1.2 Tóm tắt chức năng của các protein trong virus cúm A 11

Bảng 3.1 Nồng độ FBS và CO2 dùng để so sánh hiệu quả nuôi cấy tế bào MDCK

trong môi trường M0643 và M1018 40

Bảng 3.2 Các thông số về đặc điểm tăng trưởng của tế bào MDCK khi nuôi cấy

trong các môi trường 43

Bảng 3.3 CPE và hiệu giá (HA và TCID50) của virus NIBRG-121xp-E1 nuôi cấy

trên tế bào MDCK ở 37oC và 35oC 50

Bảng 3.4 Các liều xâm nhiễm (MOI) của virus NIBRG-121xp-E1 được dùng để

khảo sát liều xâm nhiễm tối ưu 55

Bảng 3.5 CPE và hiệu giá (HA và TCID50) của virus NIBRG-121xp-E1 nuôi cấy

trên tế bào MDCK trong các môi trường với các liều xâm nhiễm khác nhau 57

Bảng 3.6 Thể tích dịch virus NIBRG-121xp-E1dùng xâm nhiễm tế bào MDCK

nuôi cấy trên vi hạt Cytodex1 65

Bảng 3.7 Hiệu giá (HA và TCID50) của virus NIBRG-121xp-E1 nuôi cấy bằng hệ

thống vi hạt 66

Trang 8

Danh mục hình ảnh vi

Danh mục hình ảnh

Trang

Hình 1.1 Tế bào được nuôi cấy trên vi hạt Cytodex 4

Hình 1.2 Tế bào MDCK chụp dưới kính hiển vi điện tử (vật kính X10) 8

Hình 1.3 Virus cúm A: cấu trúc virus và 11 protein được mã hóa từ 8 mảnh RNA

11

Hình 1.4 Bộ gene tái tổ hợp của virus cúm A(H1N1) mới 2009 13

Hình 1.5 Hình thái của virus cúm A(H1N1) mới 2009 14

Hình 1.6 Chu trình xâm nhiễm của virus cúm A(H1N1) mới 2009 15

Hình 1.7 Tần suất xuất hiện của các phân type virus cúm trên thế giới từ ngày 19/4/2009 đến 14/8/2010 (WHO, 25/8/2010) 18

Hình 2.1 Tế bào được nhuộm bằng dung dịch trypan blue 21

Hình 2.2 Phương pháp đếm tế bào bằng buồng đếm Neubauer 26

Hình 2.3 Mô hình đường cong tăng trưởng của tế bào 27

Hình 2.4 Nhân tế bào được nhuộm với dung dịch acid citric-tím tinh thể 29

Hình 2.5 Nguyên tắc của phản ứng ngưng kết hồng cầu 31

Hình 2.6 Phương pháp thực hiện phản ứng HA trên plate 96 giếng đáy chữ V (hoặc U) 32

Hình 2.7 Phương pháp thực hiện TCID50 trên plate 96 giếng đáy bằng 34

Hình 3.1 Đường cong tăng trưởng của tế bào MDCK trong môi trường M0643 [5% CO2, 10% FBS] 37

Hình 3.2 Sự tăng trưởng của tế bào MDCK qua 7 ngày nuôi cấy (theo thứ tự từ trên xuống dưới) trong các môi trường với nồng độ CO2 và FBS khác nhau 39

Hình 3.3 Hiệu quả nuôi cấy tế bào MDCK của các môi trường khi thay đổi nồng độ FBS và CO2 41

Hình 3.4 Đường cong tăng trưởng của tế bào MDCK trong môi trường M1018 [0% CO2, 10% FBS] 43

Trang 9

Hình 3.5 Sơ đồ phân bố các nồng độ trypsin TPCK trên plate 12 giếng 44 Hình 3.6 Ảnh hưởng của các nồng độ trypsin TPCK lên sự sống sót của tế bào

MDCK trong môi trường M0643 (a) và M1018 (b) 47

Hình 3.7 Sơ đồ phân bố các bậc pha loãng virus NIBRG-121xp-E1 trên plate 6

Hình 3.13 Thời gian bám và tăng trưởng của tế bào MDCK trên vi hạt Cytodex1

với môi trường M0643 (a) và M1018 (b) 64

Hình 3.14 Kết quả nuôi cấy virus NIBRG-121xp-E1 bằng hệ thống vi hạt với môi

trường M0643 (a) và M1018 (b) 67

Hình 3.15 Tần suất xuất hiện các bộ nhiễm sắc thể của tế bào MDCK nuôi cấy

trong các môi trường 71

Hình 3.16 Kết quả định kiểu nhân và so sánh hình thái của tế bào MDCK sau

nhiều đời cấy chuyền (đời P12+8 và P12+20) trong môi trường M0643 (a) và M1018 (b) 74

Hình 4.1.Sơ đồ quy trình nuôi cấy virus NIBRG-121xp-E1 bằng hệ thống vi hạt 76

Trang 10

Đặt vấn đề viii

Đặt vấn đề

Từ năm 1995, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã khuyến nghị sử dụng tế bào động vật thay thế dần trứng gà trong nuôi cấy virus cúm nhằm tạo ra được một lượng sinh khối lớn virus đảm bảo chất lượng với thời gian sản xuất ngắn nhất và giá thành hợp

lý hơn Trong số các dòng tế bào thường trực đã được kiểm tra, đánh giá thì MDCK (tế bào thận chó), Vero (tế bào thận khỉ xanh châu Phi) và PER.C6 (tế bào võng mạc phôi người) là 3 dòng tế bào đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn để có thể được dùng trong sản xuất virus cúm Ngày nay, công nghệ nuôi cấy virus cúm trên tế bào MDCK đang được triển khai nghiên cứu ở nhiều quốc gia và được các hãng dược phẩm, hóa chất uy tín trên thế giới sử dụng để sản xuất các chế phẩm sinh học, chẩn đoán dựa trên những ưu điểm vượt trội của tế bào MDCK và các hệ thống nuôi cấy với giá thể vi hạt (microcarrier) Với hệ thống vi hạt, việc nuôi cấy tế bào/virus không những có thể được tiến hành ở quy mô hàng ngàn lít mà nó còn cho phép kiểm tra toàn diện và tự động hóa nhiều khâu trong quy trình sản xuất nên góp phần nâng cao chất lượng của sản phẩm tế bào/virus được nuôi cấy Tuy nhiên, so với hệ thống nuôi cấy huyền phù tế bào trong các bình lên men, công nghệ nuôi cấy tế bào/virus bằng hệ thống vi hạt hiện vẫn là 1 kỹ thuật còn khá mới mẻ ở Việt Nam

và cũng chỉ được sử dụng ở quy mô phòng thí nghiệm

Các trận dịch cúm dường như luôn xảy ra trong suốt lịch sử loài người Trong thế

kỷ 20, thế giới đã có 3 thảm họa cúm (1918 – 1929; 1957 – 1958; 1968 – 1969) làm thiệt mạng hàng triệu người Vào tháng 04/2009, dịch cúm đầu tiên của thế kỷ 21 do virus cúm A(H1N1) mới 2009 đã xuất phát từ Mexico, và chỉ sau 2 tháng, WHO đã công bố đại dịch mức 6 khi virus cúm H1N1/2009 đã lan rộng toàn cầu Tính đến ngày 06/08/2010, đã có trên 214 quốc gia và vùng lãnh thổ xác nhận có trường hợp nhiễm virus cúm H1N1/2009 với số ca mắc lên đến hàng trăm ngàn người và 18449 người tử vong Theo báo cáo của Bộ Y tế, đến ngày 20/03/2010, Việt Nam đã xác định được 11202 trường hợp dương tính với virus cúm A(H1N1) mới 2009 tại

Trang 11

60/64 tỉnh, thành phố, và bệnh nhân tử vong gần đây nhất vào tháng 08/2010 đã nâng tổng số trường hợp tử vong của cả nước lên 60 người

Trong nghiên cứu này, chúng tôi bước đầu xây dựng quy trình nuôi cấy virus cúm A(H1N1) chủng NIBRG-121xp-E1 bằng hệ thống vi hạt sử dụng tế bào MDCK và

vi hạt Cytodex1

Vì virus NIBRG-121xp-E1 là 1 chủng virus mới với các khảo sát ban đầu cho thấy chủng virus này nhân lên rất yếu ngay cả trên trứng gà, và hệ thống vi hạt là 1 phương pháp nuôi cấy mới; do đó, chúng tôi lần lượt tiến hành các thí nghiệm cơ bản nhằm chuẩn hóa lại từng điều kiện nuôi cấy cho tế bào MDCK và chủng virus NIBRG-121xp-E1 Điều này có ý nghĩa hết sức quan trọng vì đây là cơ sở để có thể đưa quy trình nuôi cấy này từ quy mô phòng thí nghiệm ra sản xuất lớn

Mục tiêu của đề tài

• Chuẩn hóa các điều kiện nuôi cấy tế bào MDCK nhằm nâng số lượng tế bào lên tối đa

• Thích ứng và chuẩn hóa các điều kiện nuôi cấy chủng virus E1 trên tế bào MDCK

NIBRG-121xp-• Áp dụng các điều kiện đã chuẩn hóa để nuôi cấy virus NIBRG-121xp-E1 bằng hệ thống vi hạt Cytodex1

• Kiểm tra sự ổn định của tế bào MDCK sau nhiều đời cấy chuyền

Thời gian và địa điểm nghiên cứu

• Thời gian nghiên cứu: đề tài được thực hiện từ tháng 12/2009 đến tháng

8/2010

• Địa điểm nghiên cứu: đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh học

Phân tử, Khoa Vi sinh Miễn dịch, Viện Pasteur TpHCM

Trang 13

1.1 Công nghệ nuôi cấy virus cúm trên tế bào

1.1.1 Ưu điểm của công nghệ nuôi cấy virus cúm trên tế bào

Từ hơn 50 năm qua, hầu hết sinh khối virus cúm đã và vẫn đang được sản xuất trên trứng gà có phôi [14], [42], [44], [46], [57] Tuy nhiên, từ năm 1995, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã khuyến khích việc phát triển sản xuất sinh khối virus cúm trên

tế bào thay cho trứng gà [18], [57] Một trong những lý do của sự khuyến nghị này

là nhu cầu sinh khối virus dùng cho các chế phẩm sinh học, chẩn đoán có thể gia tăng rất nhanh nếu có dịch cúm xảy ra trong khi việc cung cấp số lượng lớn trứng

gà sạch có phôi trong một khoảng thời gian ngắn là hoàn toàn không thể [18], [22], [46],[57]

Ngoài khả năng sản xuất nhanh số lượng lớn virus khi có nhu cầu, việc nuôi cấy virus cúm trên tế bào còn có nhiều ưu điểm khác so với việc nuôi cấy virus cúm trên trứng gà có phôi Những ưu điểm này bao gồm:

• Nguồn cung cấp trứng gà cần được dự trù trước khoảng 1 năm và có thể bị gián đoạn nếu xảy ra dịch cúm gia cầm [14],[22], [42], [44],[46], [47], [57] Trong khi đó, quá trình nuôi cấy tế bào có thể đáp ứng nhanh hơn, tức thời hơn và nguồn tế bào không bị giới hạn [14],[42], [46]

• Quy trình nuôi cấy virus cúm trên trứng gà đòi hỏi nhiều nhân công và hiệu suất của phương pháp này tương đối thấp [42], [57] Trong khi đó, hệ thống nuôi cấy virus cúm trên tế bào có thể giảm 40% chi phí nhân công và hiệu suất được cải thiện gấp 3 lần so với nuôi cấy virus trên trứng [46]

• Chất lượng thay đổi của trứng gà có thể tạo ra những tác động bất lợi đến chất lượng của virus được sản xuất [18] Trong khi đó, các hệ thống nuôi cấy

tế bào ngày nay thường hiện đại và có thể kiểm soát được chất lượng đồng nhất của tế bào [42]

• Trứng gà thường chứa các loại retrovirus và các tác nhân bất lợi khác nên có thể có khả năng các tác nhân này sẽ hiện diện trong sản phẩm virus [18], [22], [44], [46], [47] Trong khi đó, các dòng tế bào đã được kiểm tra đạt các

Trang 14

1 Tổng quan tài liệu

2

tiêu chuẩn của WHO hoàn toàn không chứa tác nhân xâm nhiễm nên sản phẩm virus thu nhận được ít có sự hiện diện của các protein ngoại nhiễm, đồng thời rất đồng nhất và ổn định giữa các lô [18], [46], [47]

• Các loại môi trường không huyết thanh có thể được sử dụng để nuôi cấy tế bào và virus cúm nhằm ngăn ngừa sự dị ứng với các protein có trong huyết thanh hay trứng gà Điều này giữ vai trò đặc biệt quan trọng đối với việc sử dụng virus cúm sống trong các chế phẩm sinh học bởi vì các protein trong trứng gà rất khó được tinh sạch hoàn toàn [14],[18]

• Đã có những bằng chứng cho thấy một số chủng virus cúm (bao gồm virus cúm người) khi được phân lập và cấy chuyền trên trứng gà có thể bị mất 1 trong số các domain trên kháng nguyên hemagglutinin làm cho virus được tạo ra khác với virus hoang dại; điều này dẫn đến sự không chính xác của các đáp ứng miễn dịch, làm giảm độ đặc hiệu và hiệu quả bảo vệ của các chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ sản phẩm virus này đối với chủng virus gây dịch đang lưu hành Trong khi đó, việc phân lập và cấy chuyền các chủng virus cúm trên tế bào MDCK (tế bào thận chó) không ghi nhận được hiện tượng biến đổi này, virus được tạo ra không có sự khác biệt so với virus hoang dại nên các chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ sản phẩm virus này có

độ đặc hiệu và hiệu quả bảo vệ tốt hơn, các thử nghiệm lâm sàng cũng an toàn hơn [14],[18], [42], [44], [47]

• Một số chủng virus cúm gia cầm không thể tăng sinh trên trứng gà nếu không được biến đổi di truyền nhưng lại có thể tăng sinh trên tế bào, nhờ vậy việc nuôi cấy các chủng virus này trên tế bào cho phép sản xuất được các chế phẩm sinh học đối với các chủng virus nói trên [47]

Tế bào lưỡng bội tiên phát (primary diploid cell) và tế bào thường trực (continuous cell) là hai loại tế bào thường được dùng để nuôi cấy virus Tuy nhiên, với các ưu điểm như: được mô tả đầy đủ các đặc điểm di truyền; được kiểm soát hầu hết các tác nhân bất định; chất lượng ổn định; có thể nuôi cấy trên quy mô lớn trong các nồi lên men với giá thể vi hạt (microcarrier) hay nuôi cấy huyền phù; nhạy cảm với các

Trang 15

biến thể của cùng 1 loài virus và bảo tồn được các đặc tính di truyền của virus sau nuôi cấy;… mà hiện nay các dòng tế bào thường trực được WHO công nhận và cho phép ứng dụng rộng rãi hơn so với tế bào lưỡng bội tiên phát [44]

Trong số các dòng tế bào thường trực đã được kiểm tra, đánh giá thì MDCK, Vero (tế bào thận khỉ xanh châu Phi) và PER.C6 (tế bào võng mạc phôi người) là 3 dòng

tế bào đáp ứng đủ các tiêu chuẩn để có thể được dùng trong sản xuất virus cúm A, B [14], [42], [46], [47] Gần đây, việc phát triển các chế phẩm sinh học chứa virus cúm bất hoạt có nguồn gốc từ sản phẩm virus được nuôi cấy trên tế bào MDCK hoặc Vero đã gặt hái được nhiều tiến bộ đáng kể với các hệ thống nuôi cấy tế bào bằng chai xoay hay các bình khuấy dung tích lớn sử dụng giá thể vi hạt [18], [57]

1.1.2 Hệ thống nuôi cấy tế bào với giá thể vi hạt sử dụng trong sản xuất virus

Cho đến nay, các dòng tế bào cần giá bám vẫn được nuôi cấy bằng chai MD, flask

T, chai Roux và chai xoay Tuy nhiên, với các phương pháp truyền thống này, khi quy mô sản xuất được mở rộng thì số lượng chai nuôi cấy sẽ tăng lên rất nhiều dẫn đến sự tốn kém nhiều nhân công, thời gian và chi phí sản xuất Vì vậy, từ những năm 1967, nhiều phương pháp nuôi cấy tế bào mới đã được phát triển tập trung vào việc gia tăng năng suất nuôi cấy như: hệ thống nuôi cấy mô đa diện (Schleicher và Weiss, 1968), hệ thống mao dẫn bán thấm (Knazek cùng cộng sự, 1972), khối tế bào (aggregate) – tế bào lớp đơn tụ lại thành khối có đường kính 20 – 500µm (Tolbert và Feder, 1978), sự bao nang hóa (encapsulation) – tế bào được giữ lại bên trong các hạt làm từ agarose, karageenan, calcium alginate,… (Nilsson và Mosbach, 1980) Đặc biệt, với sự phát triển của các vi hạt vào năm 1967 bởi van Wezel và sự cải tiến của các vi hạt được làm giảm khả năng trao đổi ion vào năm 1979 bởi Levine cùng cộng sự, việc sản xuất các chế phẩm sinh học từ nuôi cấy tế bào đã trở thành 1 “giấc mơ có thật” [66]

Vi hạt là những cấu trúc hình cầu có kích thước 100 – 180µm, thường được làm từ DEAE sephadex, cellulose, thủy tinh, gelatine, collagen Chúng cung cấp 1 diện tích bề mặt nuôi cấy lớn trong 1 thể tích/diện tích nuôi cấy nhỏ Hệ thống nuôi cấy

Trang 16

4

tế bào với giá thể vi hạt là sự kết hợp của hình thức nuôi cấy huyền phù và nuôi cấy lớp đơn Đối với vi hạt cứng, tế bào bám dính và tăng trưởng trên bề mặt vi hạt ở

dạng lớp đơn (Hình 1.1) Đối với vi hạt xốp, còn gọi là macrocarrier, tế bào phát

triển bên trong vi hạt nên không bị tác động bởi lực khuấy trong bình nuôi cấy [66]

Hình 1.1 Tế bào được nuôi cấy trên vi hạt Cytodex [66]

Hệ thống nuôi cấy tế bào với giá thể vi hạt có nhiều lợi thế so với các hệ thống nuôi cấy quy mô lớn khác, bao gồm:

• Cung cấp diện tích bề mặt nuôi cấy lớn trong 1 thể tích/diện tích nuôi cấy nhỏ và có thể gia tăng diện tích bề mặt nuôi cấy bằng cách gia tăng nồng độ

vi hạt, nhờ đó mà mật độ tế bào nuôi cấy được gia tăng và hiệu suất sản phẩm từ nuôi cấy trên tế bào cũng gia tăng

• Quá trình nuôi cấy tế bào được tiến hành trên 1 hệ thống năng suất cao thay cho việc dùng nhiều chai nuôi cấy năng suất thấp, nhờ đó mà môi trường nuôi cấy được sử dụng hiệu quả và tiết kiệm hơn

• Dễ dàng theo dõi và kiểm soát được các điều kiện nuôi cấy như pH, nồng độ

O2, CO2,… do môi trường nuôi cấy luôn được khuấy đều

• Dễ dàng lấy mẫu tế bào

• Dễ dàng thu nhận tế bào cũng như các sản phẩm từ nuôi cấy tế bào do các vi hạt có thể nhanh chóng lắng xuống đáy bình nuôi cấy

• Dễ dàng mở rộng quy mô sản xuất khi kết hợp vi hạt với các nồi lên men, các bình phản ứng sinh học (bioreactor) dung tích lớn

Trang 17

Nhờ các ưu điểm nói trên, hệ thống nuôi cấy tế bào với giá thể vi hạt là lựa chọn phổ biến của các nhà sản xuất các chế phẩm sinh học Ngoài ra, hệ thống này còn là

1 công cụ tuyệt vời để nghiên cứu các khía cạnh khác nhau của sinh học tế bào, sự biệt hóa và trưởng thành của tế bào, các quá trình biến dưỡng,… [66]

Bảng 1.1 Một số loại vi hạt thương mại hiện hành [66]

Loại vi hạt Tên thương mại Thành phần cấu tạo

1 Dextran Cytodex-1 DEAE dextran

Cytodex-2 Dextran được phủ lớp amine bậc 4 Superbeads DEAE dextran Microdex DEAE dextran Dormacell DEAE dextran nhị phân

2 Nhựa Biosilon Polystyrene tích điện

Biocarriers Polyacrylamide /

4-Dimethylaminopyridine (DMAP) Cytospheres Polystyrene tích điện

3 Gelatin Cytodex-3 Dextran được phủ lớp gelatin

Gelibeads Gelatin

4 Thủy tinh Bioglas Nhựa được phủ lớp thủy tinh

Ventreglas Nhựa được phủ lớp thủy tinh

5 Cellulose DE-52/53 DEAE – Cellulose

Một số loại vi hạt thương mại hiện hành được liệt kê ở Bảng 1.1 Việc lựa chọn loại

vi hạt thích hợp để sử dụng phụ thuộc vào mục đích nuôi cấy và hình thái của tế bào Ví dụ như để nuôi cấy virus và thu nhận các sản phẩm từ tế bào thì vi hạt dextran là tốt nhất; nếu tế bào cần được làm bong khỏi bề mặt nuôi cấy thì vi hạt gelatin hay thủy tinh là lựa chọn ưu tiên; nếu tế bào có khả năng bám dính thấp thì cần lưu ý loại vi hạt cho phép bám dính lượng tế bào tối đa Nếu tế bào có hình thái giống nguyên bào sợi thì vi hạt có lớp phủ điện tích trên bề mặt sẽ giúp tế bào bám dính tốt hơn; nếu tế bào có hình thái giống tế bào biểu mô thì vi hạt có lớp phủ gelatin là lựa chọn phù hợp [66]

Trang 18

độ cao nhưng dòng tế bào MDCK này đã có thể được cấy chuyền một cách dễ dàng

[73]

Ít năm sau, một số dòng tế bào MDCK khác đã được phát triển như dòng tế bào MDCK-NIH (1961) và dòng tế bào MDCK-USD (1963) [68] Đến năm 1965, tế bào MDCK được gửi vào Ngân hàng chủng giống Hoa Kỳ ATCC [22] Hiện nay, nhiều dòng tế bào MDCK thích hợp cho những mục đích nghiên cứu khác nhau đang được các ngân hàng tế bào cung cấp cho các phòng thí nghiệm trên toàn thế giới [70], [71]; trong đó, được sử dụng nhiều nhất là 3 dòng: MDCK CCL34 (ATCC), MDCK 84121903 (ECACC) và MDCK 33016 (nuôi cấy huyền phù) [16]

1.2.3 Một số ứng dụng của tế bào MDCK

Tế bào MDCK được sử dụng phổ biến trong những chương trình giám sát sức khỏe cộng đồng, nghiên cứu virus học lâm sàng và được dùng tại các phòng thí nghiệm trên toàn thế giới để phân lập và nuôi cấy virus cúm type A, B [22], [73]

Trang 19

Bên cạnh đó, tế bào MDCK cũng thường được dùng làm mô hình cho những khảo sát về các đặc tính tổng quát của tế bào biểu mô [19],[22], [69] và các cơ chế vận chuyển ion cơ bản trong các dạng tế bào [11], [19]

Ngoài ra, tế bào MDCK còn được sử dụng trong nhiều nghiên cứu khác nhau như nghiên cứu sự điều hòa thể tích tế bào [40], sự vận chuyển thuốc qua biểu mô ruột [19], đánh giá tính thấm của màng tế bào [19],… dựa trên các đặc tính hình thái, sinh lý của chúng

1.2.4 Ưu điểm của tế bào MDCK

Tế bào MDCK thường được sử dụng để phân lập virus cúm và được cân nhắc để dùng trong việc sản xuất sinh khối virus cúm nhờ vào những ưu điểm vượt trội của

nó, như:

• Khả năng nhân sinh khối tế bào lớn và nhanh [68]

• Khả năng tạo ngân hàng tế bào và các đặc tính của dòng tế bào này đã được nghiên cứu thấu đáo, chi tiết [68]

• Có thể tăng trưởng trong 1 phổ pH rộng và dễ dàng khôi phục sức sống sau thời gian trữ lạnh [16]

• Ít nhạy cảm khi được chuyển sang môi trường không huyết thanh [16]nên có thể thích ứng với điều kiện nuôi cấy không huyết thanh [22], [46], [47], [68]

• Có thể nuôi cấy trên quy mô lớn bằng các hệ thống nuôi cấy năng suất cao như hệ thống phản ứng sinh học, hệ thống vi hạt [42] do không quá nhạy cảm với tốc độ khuấy cũng như các thiết bị cung cấp khí CO2 [16]

• Có khả năng kháng với sự xâm nhiễm của prion [16]

• Thích hợp cho sự tăng trưởng của virus cúm do sự mất hoạt tính trypsin và

sự tích lũy các chất ức chế trypsin ở tế bào MDCK thấp nên không làm ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của virus trong những điều kiện bình thường [21], [46], [68]

• Sản xuất được virus với số lượng lớn và hiệu giá đủ cao để có thể dùng trong sản xuất các chế phẩm sinh học thương mại [14],[42], [46], [47]

Trang 20

8

• Nhạy cảm với một phổ rộng các chủng virus cúm khác nhau [22]

1.2.5 Đặc điểm của tế bào MDCK

[73]

1.2.5.3 Đặc điểm sinh lý

MDCK là dòng tế bào thường trực và có số lần phân chia vô hạn

Các tế bào MDCK liên kết với nhau rất vững chắc và bám dính mạnh vào bề mặt nuôi cấy [34], [61]

Thông thường, tế bào MDCK chỉ phát triển ở dạng lớp đơn và tính thấm qua các lớp đơn tế bào MDCK tương đối chậm (tính chất này thay đổi giữa các dòng tế bào

Trang 21

khác nhau) [69] Tuy nhiên, tùy vào mục đích sử dụng mà tế bào MDCK cũng có thể được biến đổi để thích ứng với dạng nuôi cấy huyền phù tế bào [70].

Tế bào MDCK thể hiện dương tính với keratin khi được nhuộm bằng thuốc nhuộm immunoperoxidase [71] và phép phân tích bằng huỳnh quang miễn dịch giúp khẳng định tế bào MDCK có nguồn gốc từ thận chó [73]

Tế bào MDCK thích hợp cho sự tăng trưởng của một phổ rộng các virus động vật như: virus cúm type A và B, virus viêm miệng mụn nước (vesicular stomatitis virus, VSV, chủng Ấn Độ), virus viêm gan lây nhiễm ở chó (infectious Canine Hepatitis), virus mụn nước ngoại ban ở heo (vesicular exanthema virus of swine, SVEV), virus viêm tủy xám type 2 ở người (Poliovirus), virus vaccine (Vaccinia), Coxsackie B5, Adenovirus và Retrovirus [59],[60],[71], [73]

Ngoài ra, một số đặc tính sinh lý khác như sự đáp ứng với các stress ưu trương, khả năng trao đổi các ion,… của tế bào MDCK cũng đã được Devuyst cùng cộng sự (1994) [11], Rindler cùng cộng sự (1979) [34], Stefan cùng cộng sự (1998) [40], Stephanie cùng cộng sự (1998) [41] nghiên cứu và mô tả chi tiết Với các stress ưu trương, tế bào MDCK đáp ứng bằng sự điều hòa gia tăng thể tích tế bào trong một thời gian ngắn (nhờ vào việc thu nhận các chất điện phân vô cơ) và bằng sự điều hòa gia tăng thể tích tế bào trong một thời gian dài (nhờ vào việc tích lũy các chất thẩm thấu hữu cơ) [40] Tế bào MDCK còn giữ một vai trò trong sự điều hòa acid-base nhờ vào khả năng trao đổi các ion Cl––HCO3–, Cl– [11]

1.2.6 Điều kiện nuôi cấy tế bào MDCK

Tế bào MDCK không yêu cầu những điều kiện nuôi cấy đặc biệt Để đạt được sự tăng trưởng tối đa, tế bào MDCK chỉ cần được nuôi cấy trong các môi trường cơ bản có bổ sung 2mM glutamine, 1% các amino acid không thiết yếu và 10% huyết thanh bào thai bê Các bình nuôi cấy cần được cung cấp 5% CO2 và giữ ở 37oC [59],[60],[71], [73]

Tế bào MDCK có thể được bảo quản bằng nitơ lỏng ở -196oC trong môi trường tăng trưởng (95%) và DMSO (5%) [71]

Trang 22

10

Do tính chất liên kết chặt với nhau và bám dính mạnh vào bề mặt nuôi cấy, nên tế bào MDCK cần được rửa bằng PBS ít nhất 2 lần trước khi ủ với dung dịch trypsin/EDTA 0,25% trong khoảng 10 – 15 phút ở 37oC để được làm bong khỏi bề mặt nuôi cấy [59],[60],[71]

1.3 Virus cúm A(H1N1) mới 2009

1.3.1 Sơ lược về virus cúm A

Virus cúm thuộc họ Orthomyxoviridae, là những virus có vỏ bao với bộ gene phân

đoạn gồm các mảnh RNA (-) mạch đơn (không bắt cặp) và hầu hết mỗi mảnh chỉ

mã hóa 1 loại protein của virus (Bảng 1.2) [8], [32], [36], [50]

Căn cứ vào sự khác nhau của các protein lõi gồm 2 protein cấu trúc, protein nền (M)

và nucleoprotein (NP) của chúng mà virus cúm được chia thành 3 type riêng biệt: virus cúm type A, virus cúm type B, virus cúm type C [36], [50]

Virus cúm type A: chỉ gồm 1 loài là virus cúm A [63] và được phân lập lần đầu tiên

từ heo vào năm 1930 [13], [33], [39], [56] Virus cúm A được chia thành các phân type dựa trên 2 glycoprotein kháng nguyên bề mặt chính của chúng là hemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA) (phân bố theo tỉ lệ 4:1) với 16 phân type HA và 9 phân type NA [8], [29], [32], [50], [63], [64] Virus cúm A có phổ truyền nhiễm rộng bao gồm thủy cầm, người, gia cầm, heo, ngựa, chó và động vật biển hữu nhũ [32], [50], [64] Đối với các loài thủy cầm, virus cúm A nhân lên ở ruột non và được bài tiết qua phân; chim không biểu hiện bệnh và làm lan truyền virus trên diện tích rộng [50] Viruscúm A có sự biến đổi di truyền lớn xảy ra giữa các chủng và chúng gây ra nhiều đại dịch làm hàng triệu người chết trên toàn thế giới [29], [50], [63], [64] Các virion của virus cúm A có vỏ bao, có thể có hình cầu (đường kính khoảng 100nm) hoặc hình sợi (chiều dài khoảng 300nm) [8] Với các chủng virus cúm A phân lập từ lâm sàng và chưa trải qua nhiều lần cấy chuyền trên trứng hay tế bào thì virion thường có hình sợi, trong khi với các chủng virus cúm A được nuôi cấy trong các phòng thí nghiệm thì virion hình cầu lại chiếm đa số [63]

Tổng kích thước bộ gene của virus cúm A là 13588 base [63] (Hình 1.3)

Trang 23

Bảng 1.2 Tóm tắt chức năng của các protein trong virus cúm A [8]

PB2 Tiểu phần polymerase; nhận diện mũ chụp mRNA

PB1 Tiểu phần polymerase; kéo dài RNA, hoạt tính endonuclease

PB1-F2 Protein phụ; hoạt tính pro-apoptotic

PA Tiểu phần polymerase; hoạt tính protease

HA Glycoprotein bề mặt; kháng nguyên chính, hoạt tính gắn kết

với thụ quan và dung hợp màng tế bào chủ

NP Protein gắn RNA; điều hòa vận chuyển vào nhân

NA Glycoprotein bề mặt; hoạt tính sialidase, giúp phóng thích virusM1 Protein nền; tương tác với vRNP, điều hòa vận chuyển RNA ra

khỏi nhân, giúp virus nẩy chồi M2 Kênh ion; giúp virus tháo vỏ và lắp ráp các thành phần

NS1 Protein gây phản ứng interferon, điều hòa sự biểu hiện gene

của vật chủ NEP (NS2) Vận chuyển RNA virus ra khỏi nhân

Cách gọi tên virus cúm: Type virus / vật chủ (nếu vật chủ là người thì không ghi) /

vị trí địa lý phân lập đầu tiên / số chủng phân lập / năm phân lập (phân type HA và

NA nếu là virus cúm A) Ví dụ: A/Chicken/Hong-Kong/220/97 (H5N1) [8], [36],

[50]

Trang 24

12

1.3.2 Virus cúm A(H1N1) mới 2009

1.3.2.1 Các đặc điểm của virus cúm A(H1N1) mới 2009

Virus cúm A(H1N1) mới 2009 cũng là 1 virus cúm A thuộc họ Orthomyxoviridae

có bộ gene gồm 8 mảnh RNA (-) mã hóa các protein PB1, PB1-F2, PB2, PA, NP,

HA, NA, M1, M2, NS1 và NS2

a Bộ gene

Bằng phương pháp giải trình tự và định type gene (genotyping), các nhà khoa học

đã xác định virus cúm A(H1N1) mới 2009 là dòng virus hoàn toàn mới với bộ gene

là sự tái tổ hợp giữa 3 nguồn virus cúm heo, gia cầm và người (Hình 1.4)

• Gene PB2 và PA xuất phát từ dòng virus cúm heo tái tổ hợp, với nguồn gốc ban đầu là virus cúm gia cầm xâm nhiễm vào quần thể heo tại Bắc Mỹ vào năm 1998 [10], [13], [29], [32], [39], [51]

• Gene PB1 xuất phát từ dòng virus cúm heo tái tổ hợp, với nguồn gốc ban đầu là virus cúm gia cầm xâm nhiễm người năm 1968, sau đó dòng virus từ người này tiếp tục xâm nhiễm vào heo năm 1998 [10], [13], [29], [32], [39], [51]

• Gene HA, NS và NP xuất phát từ dòng virus cúm heo cổ điển, có quan hệ gần gũi với gene HA, NS và NP của virus cúm A(H1N1) gây đại dịch chết người năm 1918 Virus cúm H1N1/1918 được cho là cũng đã xâm nhiễm vào heo trong khoảng năm 1918, sau đó lan truyền trong các dòng virus cúm heo cổ điển và tái tổ hợp [10], [13], [29], [32], [39], [48], [51]

• 2 gene còn lại là NA và M xuất phát từ dòng virus cúm heo Á-Âu (Eurasian swine virus), với nguồn gốc ban đầu hoàn toàn từ virus cúm gia cầm xâm nhiễm vào quần thể heo Á-Âu vào năm 1979 [10], [13], [29], [32], [39], [48], [51]; sau đó tiếp tục lan truyền trong vùng Á-Âu và chưa từng được ghi nhận ngoài vùng Á-Âu [13]

Trang 25

Hình 1.4 Bộ gene tái tổ hợp của virus cúm A(H1N1) mới 2009 [13]

Một số điểm khác biệt giữa virus cúm A(H1N1) mới 2009 so với các chủng virus cúm độc lực cao (H1N1/1918 và H5N1) đã được ghi nhận Những khác biệt này cho thấy virus cúm H1N1/2009 sở hữu các amino acid theo dạng độc lực thấp [29]:

• Vị trí phân cắt HA của các chủng virus cúm H1N1/2009 không chứa nhiều amino acid có tính base trong khi các chủng virus độc lực cao đều sở hữu nhiều amino acid có tính base tại vị trí này [20], [29],[51]

• Tất cả các chủng virus cúm H1N1/2009 đều có 1 Glutamic acid tại vị trí 627

trên protein PB2 trong khi tất cả các chủng virus cúm người đã biết trước đây

lại có Lysine tại vị trí này và Glu627 là điển hình của virus cúm gia cầm [10], [13], [20], [29], [51]

• Protein PB1-F2 của các chủng virus cúm H1N1/2009 bị cắt ngắn bởi sự hiện

diện của 1 stop codon tại vị trí 12 trong khi protein này lại liên kết với tính sinh bệnh của virus cúm H1N1/1918 và H5N1 [10], [13], [29]

• Protein NS1 của các chủng virus cúm H1N1/2009 cũng bị cắt ngắn bởi 1 stop

codon tại vị trí 220 – điều này làm mất đi domain phối tử PDZ, một domain nhận diện protein-protein nằm trong 1 loạt các con đường truyền tín hiệu tế bào liên kết với tính sinh bệnh của virus cúm H1N1/1918 và H5N1 [10], [13], [29]

Trang 26

14

Bên cạnh đó, những thông tin nghiên cứu gần đây cũng cho thấy virus cúm A(H1N1) mới 2009 sở hữu các amino acid “giống với H1 của chủng virus cúm người” tại 2 vị trí 190 và 225 (đếm theo chuỗi H3) là Aspartic acid Điều này có thể giúp cho virus cúm H1N1/2009 lan truyền một cách hiệu quả trên người [29]

b Hình thái

Theo CDC, khi được nhuộm âm tính, virus cúm A(H1N1) mới 2009 có hình cầu Tuy nhiên, khi được nuôi cấy trên tế bào MDCK hay tế bào biểu mô phôi người, ảnh chụp dưới kính hiển vi điện tử quét cho thấy các virion của virus cúm

H1N1/2009 có dạng sợi đặc trưng với hầu hết sợi virion dài hơn 1µm (Hình 1.5)

[20], [29], [51]

Hình 1.5 Hình thái của virus cúm A(H1N1) mới 2009 A Hình dạng tròn đều của

virion cúm H1N1/2009 theo CDC B Hình dạng sợi của virion cúm

A/California/04/09 (H1N1) sau 24 giờ xâm nhiễm vào tế bào MDCK Chiều dài

thanh bar là 1µm [29]

c Chu trình xâm nhiễm

Chu trình xâm nhiễm của virus cúm H1N1/2009 cũng diễn ra tương tự như virus cúm thông thường với các bước: định hướng mô và tế bào chủ, gắn vào các thụ thể trên bề mặt tế bào chủ; xâm nhập vào tế bào chủ thông qua endosome; quá trình dung hợp, tháo vỏ virus (phụ thuộc vào pH) và phóng thích bộ gene của virus (ở dạng vRNP) vào tế bào chất; các vRNP được vận chuyển vào nhân để thực hiện việc sao chép; các mRNA mạch (+) của virus được vận chuyển ngược từ nhân ra tế

Trang 27

bào chất và tổng hợp protein; một số protein sau khi được tổng hợp ở tế bào chất lại được vận chuyển vào nhân để hỗ trợ sự sao chép RNA của virus và lắp ráp bộ gene của virus; cuối cùng, các vRNP được hình thành, ra khỏi nhân, lắp ráp với các thành phần khác của virus tại màng sinh chất của tế bào chủ, nẩy chồi và phóng thích

virus mới (Hình 1.6) [29], [45]

Hình 1.6 Chu trình xâm nhiễm của virus cúm A(H1N1) mới 2009 [29]

d Tính sinh đáp ứng miễn dịch

Một nét đặc trưng của dịch cúm H1N1/2009 là hầu hết các ca bệnh đều xảy ra ở trẻ

em và người trẻ tuổi [51] Một nghiên cứu bước đầu tại Mỹ cho thấy, mặc dù các bệnh nhân cúm H1N1/2009 được khảo sát có độ tuổi từ 3 – 81 tuổi nhưng đến 60% bệnh nhân ở tuổi 18 hoặc trẻ hơn [51], [64] Sự phân bố độ tuổi mắc bệnh này cho thấy có một sự miễn dịch không hoàn chỉnh tối thiểu ở những người lớn tuổi [51] Thật vậy, một số nghiên cứu huyết thanh học cho thấy 1/3 những người lớn hơn 60 tuổi có lượng kháng thể nhất định trung hòa chéo virus cúm H1N1/2009 [32], [51], [64]

Trang 28

16

e Biểu hiện lâm sàng và mức độ nghiêm trọng của bệnh cúm H1N1/2009 ở người

Virus cúm A(H1N1) mới 2009 gây bệnh khá nhẹ [32], [48], giới hạn bệnh ở hệ hô hấp trên với các triệu chứng sốt, ho và đau họng [51], [64] Khoảng 50% bệnh nhân

có thêm các triệu chứng ở hệ tiêu hóa như tiêu chảy, nôn mửa [32], [51], [64] Phổ biểu hiện lâm sàng dao động từ các ca không biểu hiện triệu chứng đến các ca viêm phổi sơ cấp gây thiểu năng hô hấp, suy hô hấp cấp tính, thiểu năng đa cơ quan và tử vong [51] Hầu hết, nhưng không phải tất cả, các bệnh nhân cúm H1N1/2009 phải nhập viện đều là người mắc các bệnh tim mạch và bệnh hô hấp như hen suyễn, rối loạn tự miễn, béo phì, tiểu đường, ung thư, đang điều trị ức chế miễn dịch, rối loạn thần kinh hoặc tim mạch Phụ nữ có thai, đặc biệt là ở thai kỳ thứ 2 và 3, là nhóm nguy cơ cao với biểu hiện bệnh nặng hơn [32], [51]

f Con đường lan truyền

Sự lan truyền của virus cúm H1N1/2009 được cho là có liên quan đến các giọt dịch tiết (dịch hô hấp hay dịch dạ dày-ruột) và những phần tử nhỏ được phát tán khi bệnh nhân ho Nhiều bệnh nhân cúm H1N1/2009 cũng mắc thêm bệnh tiêu chảy nên làm tăng nguy cơ lan truyền virus qua đường phân-miệng gây nôn mửa nghiêm trọng [51]

g Đặc điểm nuôi cấy

Virus cúm A(H1N1) mới 2009 có thể được phân lập trên tế bào MDCK trong sự hiện diện của trypsin (tương tự như với các chủng virus cúm mùa khác), tế bào biểu

mô khí quản phôi người (primary human airway epithelial cell) hoặc trên trứng gà

có phôi [32], [51] Hồng cầu gà, gà tây, chuột lang và người sẽ ngưng kết với virus cúm H1N1/2009 [32]

h Tính nhạy cảm với các thuốc kháng virus

Các phép phân tích kiểu gene và kiểu hình đã cho thấy virus cúm A(H1N1) mới

2009 nhạy với các chất ức chế neuraminidase là oseltamivir (Tamiflu) và zanamivir (Relenza) nhưng kháng với adamantane (amantadine và rimantadine) [13], [29], [32], [48], [51], [64] Ngoài ra, vẫn chưa tìm thấy 1 marker di truyền nào trên NA

Trang 29

thể hiện tính giảm nhạy cảm với các chất ức chế neuraminidase [13], [32] Tuy nhiên, tính đến ngày 18/08/2010, đã có 304 chủng virus cúm H1N1/2009 kháng thuốc oseltamivir được phân lập trên toàn thế giới [55]

i Chẩn đoán virus cúm A(H1N1) mới 2009

Các mẫu thích hợp dùng để chẩn đoán phát hiện virus cúm A(H1N1) mới 2009 là các mẫu trích từ hệ hô hấp trên như khí mũi-họng (nasopharyngeal aspirate) hay phết mũi-họng (nasopharyngeal swab), phết mũi hay phết họng [32] Hiện nay, một

số phương pháp RT-PCR hoặc realtime PCR nhạy và chuyên biệt cho cúm H1N1/2009 và có thể phân biệt nó với cúm mùa (H1N1) cũng đã đang được sử dụng rộng rãi [32]

1.3.2.2 Tình hình dịch cúm A(H1N1) mới 2009 trên thế giới và tại Việt Nam

a Tình hình dịch cúm A(H1N1) mới 2009 trên thế giới

Ngày 11/06/2009, chỉ sau khoảng 2 tháng kể từ khi bắt đầu được phát hiện tại các quốc gia ở khu vực Bắc Mỹ (Mexico vào cuối tháng 01/2009; Hoa Kỳ vào giữa tháng 03/2009; Canada vào cuối tháng 04/2009), WHO đã chính thức thông báo đại dịch mức 6 đối với virus cúm A(H1N1) mới 2009 [20], [35], [51] Đây là đại dịch cúm đầu tiên của thế kỷ 21 với tốc độ lây lan nhanh chóng từ người sang người và lan rộng khắp các châu lục trên toàn thế giới

Theo thông báo số 112 của WHO, tính đến ngày 06/08/2010, đã có trên 214 quốc gia và vùng lãnh thổ xác nhận có trường hợp nhiễm virus cúm H1N1/2009 với số ca mắc lên đến hàng trăm ngàn người, trong đó, số lượng bệnh nhân tử vong là 18449 người [6], [52]

Ngày 10/08/2010, Tổng Giám đốc của WHO, tiến sĩ Margaret Chan, đã công bố giai đoạn hậu đại dịch đối với virus cúm A(H1N1) mới 2009 Tuy nhiên, các trận

dịch với quy mô lớn nhỏ khác nhau vẫn đang còn tiếp diễn (Hình 1.7) Theo thông

báo số 115 của WHO, tính đến ngày 27/08/2010, virus cúm H1N1/2009 đang hoạt động rất mạnh tại nhiều địa phương thuộc Ấn Độ cũng như khu vực ôn đới ở Nam bán cầu, đặc biệt là New Zealand và Australia [53]

Trang 30

Từ tuần 1 đến tuần 32 năm 2010

b Tình hình dịch cúm A(H1N1) mới 2009 tại Việt Nam

Việt Nam là nước thứ 54 trên thế giới thông báo phát hiện bệnh nhân nhiễm virus cúm H1N1/2009 [6] Ca dương tính virus H1N1/2009 đầu tiên tại Việt Nam được phát hiện vào ngày 30/05/2009 là một du học sinh từ Hoa Kỳ về [6] Kể từ đó, Việt Nam đã thực sự bước vào cuộc chiến chống virus cúm H1N1/2009 với chính sách thắt chặt việc rà soát thân nhiệt, cách ly và theo dõi đối với những người có biểu hiện thân nhiệt bất thường tại các cửa khẩu, sân bay, trường học Ngoài ra, những người từng tiếp xúc với trường hợp dương tính H1N1/2009 hay từ các vùng dịch tễ

về cũng đã được cách ly và theo dõi

Theo báo cáo của Bộ Y tế, đến ngày 20/03/2010, Việt Nam đã xác định 11202 trường hợp dương tính với virus cúm A(H1N1) mới 2009 tại 60/64 tỉnh, thành phố, trong đó có 20 địa phương ghi nhận có ca tử vong (gồm An Giang, TpHCM, Tây

Hình 1.7 Tần suất xuất hiện của các phân type virus cúm trên thế giới từ 19/4/2009 đến

14/8/2010 (WHO, 25/8/2010) [54].

Tuần – (Số quốc gia xác nhận có ca nhiễm)

Trang 31

Ninh, Đồng Nai, Tiền Giang, Bà Rịa Vũng Tàu, Cần Thơ, Bến Tre, Vĩnh Long, Bình Dương, Bạc Liêu, Sóc Trăng, Lâm Đồng, Trà Vinh, Long An, Kiên Giang, Hậu Giang, Bình Phước, Đồng Tháp, Cà Mau) [6] Trường hợp 1 bé gái ở TpHCM

tử vong liên quan đến cúm H1N1/2009 vào ngày 03/08/2010 đã nâng tổng số ca tử vong của cả nước lên 60 người với phụ nữ mang thai chiếm 23%, trẻ em dưới 10 tuổi chiếm 14,3% [6]

Hiện tại, cùng với tình hình chung trên toàn thế giới, sự lây lan cũng như mối nguy hiểm do virus cúm H1N1/2009 gây ra tại Việt Nam đã tạm lắng xuống Sự giám sát virus cúm H1N1/2009 cũng đã được thay đổi từ việc xét nghiệm đại trà trong cộng đồng thành việc chỉ giám sát các vùng nguy cơ và chỉ kiểm soát, ngăn chặn tại chỗ (không còn xét nghiệm từng cá nhân) [6]

Trang 32

Phần 2

2.1 Vật liệu

2.2 Phương pháp

Trang 33

2.1 Vật liệu

2.1.1 Hóa chất và sinh phẩm

2.1.1.1 Hóa chất

a Các hóa chất dùng trong nuôi cấy tế bào MDCK

• Môi trường M0643 (Minimum Essential Medium Eagle) (Sigma)

• Huyết thanh bào thai bê (Fetal bovine serum, FBS) (Gibco) đã bất hoạt ở

56oC trong 30 phút

b Các hóa chất dùng trong nuôi cấy virus NIBRG-121xp-E1

• Trypsin TPCK (T1426, Sigma)

• Dung dịch albumin từ huyết thanh bê (Albumin from bovine serum, BSA) 7,5% (Gibco)

c Các hóa chất dùng trong định kiểu nhân (karyotyping)

• Demecolcine solution (dung dịch colcemid, Sigma): làm ngừng quá trình phân chia tế bào ở kỳ giữa

• Dung dịch nhược trương (gồm hỗn hợp KCl 0,04M (Merck) và sodium citrate 0,025M (Merck)): làmphồng to nhân và tế bào chất của tế bào

• Dung dịch cố định (gồm hỗn hợp acid acetic glacial (Merck) và ethanol (Merck) theo tỉ lệ 1:3): duy trì trạng thái trương phồng của tế bào

• Thuốc nhuộm Giemsa (Merck) được pha loãng bằng PBS theo tỉ lệ 1:25 (2ml Giemsa trong 48ml PBS): nhuộm nhiễm sắc thể

• Dung dịch rửa lam kính (gồm hỗn hợp ethanol (Merck) và HCl (Merck) theo

tỉ lệ 1:1)

• Dung dịch bảo quản lam kính (gồm hỗn hợp ethanol (Merck) và diethyl ether (Merck) theo tỉ lệ 1:1)

Trang 34

2 Vật liệu – Phương pháp 21

d Các hóa chất dùng trong nuôi cấy tế bào trên vi hạt Cytodex1

• Sigmacote (Sigma): tráng các dụng cụ (pipette, bình khuấy,…) để tránh hiện

tượng vi hạt bám dính vào các dụng cụ này

• Dung dịch acid citric–tím tinh thể (gồm hỗn hợp acid citric 0,1M (Merck) và tím tinh thể 0,1% (Merck)): ly giải tế bào và nhuộm nhân

e Các hóa chất khác

• Phosphate buffered saline (PBS) (Sigma): rửa tế bào, pha các loại trypsin, pha loãng thuốc nhuộm Giemsa, chuẩn bị dung dịch hồng cầu gà và thực hiện phản ứng HA

• Trypsin/EDTA (1X, 0,05%) (Gibco): làm tróc tế bào khỏi bề mặt nuôi cấy

• Dung dịch trypan blue (0,4%) (Sigma): nhuộm tế bào khi đếm tế bào trên

buồng đếm Neubauer (Hình 2.1)

Tế bào sống

Tế bào chết

Hình 2.1 Tế bào được nhuộm bằng dung dịch trypan blue

• Dung dịch đệm Hepes (Hepes buffer) (1M) (Sigma): điều chỉnh pH của các môi trường nuôi cấy tế bào, virus

• Bột NaHCO3 (Merck) và dung dịch NaHCO3 (7,5%) (Gibco): bổ sung vào

môi trường nuôi cấy tế bào, virus và điều chỉnh pH cho các môi trường này

Trang 35

• Môi trường Brain Heart (Bio-Rad): kiểm tra vô trùng cho các hóa chất, môi trường

• Dung dịch Alsever (gồm hỗn hợp 20,5g dextrose (Merck), 4,2g NaCl (Merck), 0,55g acid citric (Merck), 8g sodium citrate (Merck) hòa tan trong 1 lít nước cất; pH 6,1 ± 0,1): chống đông máu khi thu nhận máu gà tươi

• Nước cất pha tiêm (Mekophar): pha các môi trường, hóa chất và rửa lam kính

• Cồn 70o, 96o, Javel (VN): sát trùng bề mặt và ngâm rửa các dụng cụ có tiếp xúc với virus

• Gel agarose 1,5 % (Promega): điện di sản phẩm PCR kiểm tra định kỳ sự hiện diện của mycoplasma trong dịch nuôi cấy tế bào

2.1.1.2 Sinh phẩm

a Tế bào MDCK chuẩn thức ECACC 84121903

Từ ngân hàng tế bào (đời P12+6), khi sử dụng cho các thí nghiệm của nghiên cứu này, tế bào MDCK được cấy chuyền trong khoảng 15 đời nữa để hạn chế sự thoái hóa cũng như sự xuất hiện những biến đổi sau nhiều lần cấy chuyền (nếu có)

b Virus cúm A(H1N1) NIBRG-121xp (NIBSC code 09/166)

Virus cúm A(H1N1) NIBRG-121xp được tái tổ hợp bằng kỹ thuật di truyền ngược

từ 2 gene HA, NA của virus cúm A/California/7/2009 (H1N1) và 6 gene M, NS,

NP, PA, PB1, PB2 của virus cúm A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1) [30], [31], [49] Virus NIBRG-121xp được cấy chuyền 1 lần sang trứng gà sạch có phôi 10 ngày tuổi để tăng sinh và tạo ngân hàng virus NIBRG-121xp-E1 (bảo quản trong tủ đông sâu -80oC) Dịch virus NIBRG-121xp-E1 thu được có hiệu giá virus ban đầu là HA

> 1024 và TCID50/ml = 104.2

Từ ngân hàng virus NIBRG-121xp-E1 nói trên, khi sử dụng cho các khảo sát của nghiên cứu này, dịch virus được pha loãng bậc 10 tùy vào mục đích thí nghiệm

Trang 36

2 Vật liệu – Phương pháp

23

c Dung dịch hồng cầu gà (red blood cells) 0,5%

Dùng để thực hiện phản ứng ngưng kết hồng cầu (Hemagglutination test - phản ứng HA) để xác định hiệu giá virus

d Cặp mồi đặc hiệu cho mycoplasma (Sigma)

Dùng trong phản ứng PCR kiểm tra định kỳ sự hiện diện của mycoplasma trong dịch nuôi cấy tế bào

2.1.2 Dụng cụ

Vi hạt Cytodex1 (GE Healthcare)

Bình khuấy 1l (Spinner flask) (Wheaton)

Pipette thủy tinh các loại: 1ml, 2ml, 5ml, 10ml, 20ml, 25ml (Simplex, Kimax)

Pipette nhựa vô trùng các loại: 2ml, 5ml, 10ml (Corning)

Pipette Pasteur (Hirschmann)

Pipette aid (Eppendorf)

Multipipette: 8 kênh, 12 kênh (Eppendorf )

Micropipette: 10µl, 20µl, 200µl, 1000µl (Eppendorf)

Flask T (chai dẹt) (25cm2, 75cm2) (Corning, Nunc)

Plate (đĩa) 6 giếng, 12 giếng, 96 giếng đáy bằng (Corning)

Plate 96 giếng đáy chữ V hoặc U (Nunc)

Chai thủy tinh nắp vặn: 250ml, 500ml, 1l, 2l (Schott)

Đầu cone lọc vô trùng (10µl, 20µl, 200µl, 1000µl) (Greiner)

Buồng đếm Neubauer Improved (Assistent)

Tube ly tâm nhựa 50ml (Corning)

Tube ly tâm nhựa 15ml (Corning)

Tube ly tâm 1,5ml (Eppendorf)

Lam kính (Sail Brand)

Màng lọc 0,22µm; 0,45µm; 1µm (Advantec)

Quần áo bảo hộ (Danameco)

Khẩu trang 3 lớp (MediPro) và khẩu trang C80-N95 (Homark)

Trang 37

Găng tay không bột (Fantastik)

Becher (Schott), erlen (Schott), thanh khuấy từ (Brand), parafilm (Parafilm M), bông gòn (VN), đèn cồn (VN), giấy quỳ (Merck)

2.1.3 Thiết bị

Phòng an toàn sinh học cấp 2+

Tủ cấy an toàn sinh học cấp 2 AirStream (Esco) và BioStar Plus (Telstar)

Máy lọc môi trường (Milipore)

Máy khuấy từ có gia nhiệt (Velp Scientifica)

Máy ly tâm Centrifuge 5417C (Eppendorf) (dùng cho tube ly tâm 1,5ml)

Máy ly tâm EBA 12 (Hettich Zentrifugen) (dùng cho tube ly tâm 15ml)

Máy ly tâm lạnh Centrifuge 5804R (Eppendorf) (dùng cho tube ly tâm 50ml)

Máy trộn (vortex) LaborA (Bioblock Scientific)

Máy đo pH (Thermo)

Máy PCR System 9700 (GeneAmp)

Bộ nguồn điện di EC 105 (APPARATUS)

Thiết bị điện di Wide Mini-Sub® Cell BT (BIO-RAD)

Máy chụp hình gel ChemiDoc (BIO-RAD)

Bể ổn nhiệt Polystat (Bioblock Scientific)

Tủ ấm có CO2 (Sanyo) và không CO2 (Jouan)

Tủ đông sâu -80oC (Sanyo)

Kính hiển vi soi ngược có chụp hình CKX41 (Olympus)

Kính hiển vi có chụp hình Eclipse E200 (Nikon)

Bộ ghi hình DS-Ri1 (Nikon) đi kèm kính hiển vi Eclipse 80i (Nikon)

Tủ lạnh 4 – 8oC và -20oC (Sanyo)

Bình nitơ bảo quản tế bào (Locator)

Nồi hấp tiệt trùng (ALP)

Cân phân tích BP61 (Satorius)

Trang 38

Dựa vào kết quả điện di sản phẩm PCR với DNA tách chiết từ dịch nuôi cấy tế bào

để xác định có hay không có sự hiện diện của mycoplasma

• Điện di sản phẩm PCR bằng gel agarose 1,5%

• So sánh các vạch DNA xuất hiện trên bảng điện di với thang DNA chuẩn ứng với kích thước bộ gene của mycoplasma để xác định sự hiện diện của mycoplasma

2.2.2 Xây dựng đường cong tăng trưởng của tế bào

2.2.2.1 Định nghĩa – Nguyên tắc

Đường cong tăng trưởng của tế bào được xác định dựa vào sự gia tăng tổng số tế bào sống theo thời gian [26]

2.2.2.2 Các bước thực hiện

Tế bào MDCK được nuôi cấy trong các plate 12 giếng

• Sau mỗi 24 giờ, đếm số tế bào sống ở 1 giếng (đếm tổng số tế bào sống trong

4 ô lớn của buồng đếm Neubauer ngoại trừ những tế bào nằm trên các cạnh

có dấu gạch chéo như trên Hình 2.2)

• Tổng số tế bào sống trong dịch huyền phù (N) được tính theo công thức sau:

N = (n/4) x a x 104 x V [23] với * n: tổng số tế bào sống đếm được trong 4 ô lớn của buồng đếm

Trang 39

* a: hệ số pha loãng của huyền phù tế bào trong trypan blue

(do tế bào và trypan blue được trộn theo tỉ lệ 1:1 nên a = 2)

* 104: hệ số của buồng đếm

* V: thể tích của huyền phù tế bào đơn (ml)

(trong trường hợp này, V = 1ml)

Hình 2.2 Phương pháp đếm tế bào bằng buồng đếm Neubauer

Từ số tế bào sống đếm và tính toán được sau mỗi 24 giờ nuôi cấy, tiến hành vẽ đồ

thị đường cong tăng trưởng của tế bào (Hình 2.3)

Dựa vào đường cong tăng trưởng, các thông số về đặc điểm tăng trưởng của tế bào được xác định theo các công thức sau:

• Tốc độ phân chia: r = [3,32 x (logNH – logNI)] / (t2 – t1) [7], [43]

Trang 40

* NI: số tế bào tại thời điểm bắt đầu của pha tăng trưởng

* t1:thời điểm bắt đầu của pha tăng trưởng (giờ)

* t2: thời điểm cuối của pha tăng trưởng ((giờ)

a Nuôi cấy tế bào MDCK trên vi hạt Cytodex1

Vi hạt Cytodex1 sau khi được làm trương nở và hấp vô trùng theo hướng dẫn của nhà sản xuất [62] sẽ được dùng làm giá thể nuôi cấy tế bào MDCK

Định dạng
Số trang	109
Dung lượng	4,02 MB