Nghiên cứu một số tính chất sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn chuyển hóa nitơ có khả năng tạo màng sinh học (biofilm) để ứng dụng trong công nghệ xử lý nước nhiễm amoni

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ---oOo--- HOÀNG THỊ HOA DIỄM NGHIÊN CỨU MỘT SỐ TÍNH CHẤT SINH LÝ, SINH HÓA CỦA VI KHUẨN CHUYỂN HÓA NITƠ CÓ KHẢ NĂNG TẠO MÀNG SINH HỌC BIOF

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

-oOo -

HOÀNG THỊ HOA DIỄM

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ TÍNH CHẤT SINH LÝ, SINH HÓA CỦA

VI KHUẨN CHUYỂN HÓA NITƠ CÓ KHẢ NĂNG TẠO MÀNG SINH HỌC (BIOFILM) ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ

XỬ LÝ NƯỚC NHIỄM AMONI

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên – 2013

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

-oOo -

HOÀNG THỊ HOA DIỄM

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ TÍNH CHẤT SINH LÝ, SINH HÓA CỦA

VI KHUẨN CHUYỂN HÓA NITƠ CÓ KHẢ NĂNG TẠO MÀNG SINH HỌC (BIOFILM) ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ

XỬ LÝ NƯỚC NHIỄM AMONI

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS HOÀNG PHƯƠNG HÀ

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu và kết quả nêu trong luận văn là một phần kết quả trong đề tài nghiên cứu của phòng Công nghệ sinh học môi trường, Viện Công nghệ sinh học Các kết quả này đảm bảo trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất cứ công trình nào khác

Thái Nguyên, tháng 08 năm 2013

Tác giả luận văn

Hoàng Thị Hoa Diễm

LỜI CẢM ƠN

Với tất cả sự kính trọng và lòng biết ơn trân thành, tôi xin gửi lời cảm

ơn sâu sắc tới TS Hoàng Phương Hà, PGS.TS Nghiêm Ngọc Minh, phòng Công nghệ Sinh học Môi trường, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, là những người thầy mẫu mực đã dành cho tôi những ý tưởng quý báu cũng như tận tụy hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị trong phòng Công nghệ Sinh học Môi trường đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong việc nghiên cứu

Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành đến ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi được học tập và nghiên cứu tại Viện trong suốt thời gian qua

Đồng thời tôi xin gửi lời cám ơn sâu sắc tới các thầy cô trong Khoa Khoa học sự sống, Trường Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên đã truyền đạt những kiến thức bổ ích và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường

Cuối cùng tôi muốn gửi lời cám ơn chân thành đến những người thân trong gia đình và bạn bè thân thiết đã luôn bên cạnh động viên, khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

16S rRNA 16S ribosomal Ribonucleic acid

DANH MỤC CÁC BẢNG

TRANG

Bảng 2.1 Tỉ lệ pha loãng dung dịch chuẩn ch a NH4+ với nước cất 23

Bảng 2.2 Tỷ lệ pha loãng dung dịch chuẩn + nước cất và hàm lượng N-NO2 25

Bảng 2.3 Tỉ lệ pha loãng dung dịch chuẩn + nước cất và hàm lượng N-NO3 26

Bảng 3.1 Khả năng oxy hóa amoni của nhóm vi khuẩn phân lập 32

Bảng 3.2 Khả năng tạo màng sinh học của của vi khuẩn oxy hóa amoni 33

Bảng 3.3 Khả năng oxy hóa nitrite của nhóm vi khuẩn được phân lập 35

Bảng 3.4 Khả năng tạo màng sinh học của các vi khuẩn oxy hóa nitrite 35

Bảng 3.5 Ảnh h PD60 và PD58 50

Bảng 3.6 Ảnh h 5NM 51

DANH MỤC CÁC HÌNH

TRANG

Hình 1.1 Tế bào của một số loài thuộc nhóm vi khuẩn oxy hóa amoni 9

Hình 3.1 Các chủng vi khuẩn phân lập trên môi trường Winogradsky 31

Hình 3.2 Khả năng tạo màng sinh học của vi khuẩn oxy hóa amoni 34

Hình 3.3 Khả năng tạo màng sinh học của các chủng oxy hóa nitrite 36

Hình 3.4 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của các chủng vi khuẩn nghiên cứu 38

Hình 3.5 Cây phát sinh chủng loại của vi khuẩn nitrate hóa PD60, PD58, 5NM và 2NM 40

Hình 3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt tính nitrate hóa của vi khuẩn nghiên cứu 42

Hình 3.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng tạo biofilm ng của vi khuẩn nghiên cứu 43

Hình 3.8 Ảnh hưởng của pH tới hoạt tính nitrate hóa của vi khuẩn nghiên cứu 45

Hình 3.9 Ảnh hư ng của vi khuẩn nghiên cứu 46

Hình 3.10 Ảnh hưởng của NaCl tới hoạt tính nitrate hóa của vi khuẩn nghiên cứu 48

Hình 3.11 Ảnh hư ng của các chủng vi khuẩn nghiên cứu 49

Hình 3.12 Ảnh hưởng của nồng độ nitơ ng của vi khuẩn nghiên c u 52

MỤC LỤC

TRANG

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT iii

DANH MỤC CÁC BẢNG iv

DANH MỤC CÁC HÌNH v

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Hiện trạng ô nhiễm và nguồn gốc phát sinh các hợp chất nitơ trong nước 3

1.1.1 Hiện trạng ô nhiễm các hợp chất nitơ trong nước 3

1.1.2 Tác hại của các hợp chất chứa nitơ đối với cơ thể con người 4

1.1.3 Nguồn gốc phát sinh các hợp chất chứa nitơ trong môi trường sống 5

1.2 Cơ sở của phương pháp khử nitơ sinh học 6

1.2.1 Cố định nitơ 6

1.2.2 Quá trình khoáng hóa 7

1.2.3 Quá trình nitrate hóa 7

1.2.4 Quá trình khử nitrate 7

1.3 Vi khuẩn nitrate hóa tự dưỡng 7

1.3.1 Vi khuẩn oxy hóa amoni nitroso) 8

1.3.2 Vi khuẩn oxy hóa nitrite (vi ) 11

1.4 Màng sinh học (Biofilm) 13

1.4.1 Khái niệm về biofilm 13

1.4.2 Thành phần của biofilm 13

1.4.3 Ảnh hưởng của một số điều kiện hóa lý đến sự hình thành và phát triển của biofilm 16

1.4.4 Màng sinh học của vi khuẩn nitrate hóa tự dưỡng 17

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1.Vật liệu, hóa chất và thiết bị máy móc 20

2.1.1 Vật liệu 20

2.1.2 Hóa chất và enzyme 20

2.1.3 Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm 20

2.2 Các môi trường nuôi cấy vi khuẩn 21

2.2.1 Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn nitrate hóa 21

2.2.2 Môi trường LB 21

2.3 Phương pháp nghiên cứu 21

2.3.1 Phân lập vi khuẩn nitrate hóa 21

2.3.2 Xác định hàm lượng amoni trong nước ngọt theo phương pháp Nessler 22

2.3.3 Xác định hàm lượng NO2- bằng phương pháp Griss 24

2.3.4 Xác định hàm lượng NO3 bằng phương pháp Salicylate 25

2.3.5 Phương pháp đánh giá khả năng tạo màng sinh của các chủng vi 26

2.3.6 Ảnh hưởng của một số điều kiện lên khả năng tạo màng sinh học và hoạt tính nitrate hóa 27

2.3.7 Các phương pháp sinh học phân tử 29

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 31

3.1 Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn nitrate hóa 31

3.1.1 Phân lập 31

3.1.2.Khả năng nitrate hóa và tạo màng sinh học (Biofilm) 32

36

, sinh tr sinh học 41

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

MỞ ĐẦU

Nước là dạng vật chất rất cần cho tất cả các sinh vật sống trên Trái Đất Khoảng 71% với 361 triệu km2

bề mặt trái đất được bao phủ bởi nước Nước

có nhiệt hoá hơi, đóng băng và ngưng kết tương đối gần nhau, vì vậy nước tồn tại trên Trái Đất ở cả ba dạng: rắn, lỏng và hơi Người ta đã phát hiện thấy khoảng 80% loại bệnh tật của con người có liên quan đến chất lượng của nguồn nước dùng cho sinh hoạt [48].Vì vậy chất lượng nước có vai trò hết sức quan trọng trong sự nghiệp bảo vệ và chăm sóc sức khoẻ cộng đồng Các nguồn nước được sử dụng chủ yếu là nước mặt và nước ngầm đã qua xử lý hoặc sử dụng trực tiếp Phần lớn chúng đều bị ô nhiễm bởi các tạp chất với thành phần và mức độ khác nhau tuỳ thuộc vào điều kiện địa lý, đặc thù sản xuất, sinh hoạt của từng vùng và phụ thuộc vào địa hình mà nó chảy qua hay

vị trí tích tụ Ngày nay, với sự phát triển của nền công nghiệp, quá trình đô thị hoá và bùng nổ dân số đã làm cho nguồn nước tự nhiên ngày càng cạn kiệt và ngày càng ô nhiễm Hoạt động nông nghiệp gắn liền với sử dụng các loại phân bón trên diện rộng Các loại nước th công nghiệp, sinh hoạt giàu hợp chất nitơ thải vào môi trường làm cho nước ngầm ngày càng bị ô nhiễm

Amoni

do làm tăng sự hình thành glutamate và glutamine chuyển hoá nitrit và nitrate là yếu tố gây độc Các hợp chất nitrit và nitrate hình thành do quá trình oxi hoá vi sinh vật trong quá trình xử lý, tàng trữ và chuyển tải nước đến người tiêu dùng Vì vậy việc xử lý amoni trong nước là đối tượng rất đáng quan tâm

Để giải quyết tình trạng này, các nước tiên tiến trên thế giới đã nghiên cứu và đề xuất áp dụng các kỹ thuật loại nitơ bằng biện pháp hóa lý và sinh học Trong đó biện pháp sinh học được quan tâm hơn cả Một trong các

phương pháp xử lý sinh học đem lại hiệu quả cao, đó là sử dụng màng sinh học (Biofilm) do các vi sinh vật tạo ra

Tại Việt Nam, trong những năm gần đây các công nghệ loại bỏ các hợp chất chứa nitơ bằng biện pháp sinh học đã và đang được quan tâm Một trong

số đó là công nghệ ứng dụng sự hình thành màng sinh học của nhóm các vi khuẩn nitrate hóa Ở nước ta những nghiên cứu về màng sinh học của nhóm vi

khuẩn này còn rất mới mẻ Vì vậy: chúng tôi đề xuất đề tài: “Nghiên cứu một

số tính chất sinh lý, sinh hoá của vi khuẩn chuyển hoá nitơ có khả năng tạo màng sinh học (biofilm) để ứng dụng trong công nghệ sử lý nước ô nhiễm amoni”

Mục tiêu: Lựa chọn một số chủng vi khuẩn có hoạt tính nitrate hóa cao

và tạo màng sinh học

Nội dung nghiên cứu:

* Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu một số vi khuẩn nitrate hóa tiêu biểu

* Phân loại vi khuẩn tuyển chọn bằng kỹ thuật sinh học phân tử

* Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính nitrate hóa, sinh trưởng và tạo màng sinh học của các chủng vi khuẩn tuyển chọn

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Hiện trạng ô nhiễm và nguồn gốc phát sinh các hợp chất nitơ trong nước 1.1.1 Hiện trạng ô nhiễm các hợp chất nitơ trong nước

Có thể đánh giá mức độ ô nhiễm bằng cách so sánh nồng độ các hợp chất nitơ trong nước thải hoặc nước ngầm với qui chuẩn [1]

Theo kết quả quan trắc tài nguyên nước dưới đất năm 2011 của Trung tâm Quy hoạch và điều tra tài nguyên nước – Bộ tài nguyên và môi trường, phần lớn nước ngầm ở vùng đồng bằng bắc bộ như Hà Nội, Hải Phòng, Thái Bình, Hải Dương… đều bị nhiễm bẩn amoni (NH4+) rất nặng vượt tiêu chuẩn nhiều lần Hàm lượng amoni tính theo nitơ trên toàn bộ số mẫu lấy từ tầng nước ngầm trên (cách mặt đất khoảng 25 – 40m) vào mùa khô năm 2011 gấp 92,4 lần tiêu chuẩn cho phép [8]

Xác suất các nguồn nước ngầm nhiễm amoni ở vùng đồng bằng Bắc bộ

có nồng độ cao hơn tiêu chuẩn là 100% Ngoài amoni, không ít nguồn còn chứa khá nhiều chất hữu cơ Như vậy, tình trạng nhiễm bẩn Amoni và hợp chất hữu cơ trong nước ngầm ở Đồng bằng Bắc Bộ đã đến mức báo động [8] Theo kết quả khảo sát chất lượng nước của bộ Xây dựng cho thấy, hàm lượng amoni trong nguồn nước ngầm tại một số địa bàn Hà Nội dao động trong khoảng 30 mg/l Hầu hết, các khu vực đều nhiễm amoni, trong đó có các khu vực nhiễm nặng như: Pháp Vân, Định Công, Hạ Đình, Kim Giang, Tương Mai, Bạch Mai, Bách Khoa, Kim Liên, Quỳnh Mai Một số khu vực nhiễm nhẹ như Lương Yên, Yên Phụ, Ngô Sĩ Liên, Đồn Thủy Ngoài ra, một

số khu vực cũng đã có dấu hiệu nhiễm như Ngọc Hà, Mai Dịch Nhìn chung, các khu vực bị nhiễm nặng amoni tập trung nhiều hơn ở khu vực phía Nam thành phố và khu Trung tâm Cao nhất là khu vực Pháp Vân, Định Công (~ 20 mg/l), sau đó là khu vực Hạ Đình (~12 mg/l), Tương Mai (~10 mg/l) [3]

Tầng nước ngầm dưới (cách mặt đất từ 45m đến 60m) là nguồn cung cấp cho các nhà máy cũng bị nhiễm bẩn Đề tài “ nghiên cứu xử lí nước ngầm nhiễm bẩn amoni” do sở giao thông công chính Hà Nội vừa nghiệm thu cho thấy: do cấu trúc địa chất , nước ngầm nhà máy nước Pháp Vân, Hạ Đình, Tương Mai có hàm lượng sắt và amoni (NH4) vượt quá tiêu chuẩn cho phép khá nhiều Tại nhà máy Tương Mai: Hàm lượng NH4 là 6 – 12, có khi 18 mg/l; Hạ Đình: 12 -20, có khi 25 mg/l; Pháp Vân: 15 – 30, có khi 40 mg/l [3] Như vậy tình trạng nước ngầm bị ô nhiễm amoni đã đến mức báo động

Sử dụng nước ngầm bị nhiễm amoni cho mục đích ăn uống sẽ làm ảnh hưởng rất lớn đến đến sức khỏe cộng đồng Chính vì vậy trên thế giới cũng như Việt Nam đã và đang nghiên cứu và tạo ra các công nghệ loại bỏ các hợp chất chứa nitơ có trong các nguồn nước, đặc biệt là nước ngầm

1.1.2 Tác hại của các hợp chất chứa nitơ đối với cơ thể con người

Trong những thập niên gần đây, nồng độ các hợp chất chứa nitơ trong nước uống tăng lên đáng kể Chúng có thể tồn tại dưới dạng các hợp chất hữu

cơ, amoni, nitrite và nitrate Amoni thực ra không quá độc đối với cơ thể con người Ở trong nước ngầm amoni không thể chuyển hóa được do thiếu oxi Nhưng khi khai thác lên, vi sinh vật trong nước nhờ oxi trong không khí chuyển amoni thành các nitrit (NO2-

), nitrat (NO3

-) tích tụ trong nước Bản thân NO3

methaemoglobin làm giảm khả năng vận chuyển oxy trong máu tới các tế bào

và cơ quan trong cơ thể, làm xuất hiện bệnh da xanh [6]

 Ung thư tiềm tàng

Ở Việt Nam khác với nhiều nước trên thế giới, nước ngầm bị nhiễm

NH4+ rất nặng Tuy NH4+ không độc nhưng dưới tác động của vi khuẩn hiếu khí, nó dễ dàng chuyển hóa thành NO2-

NO2 -

có thể chuyển hóa thành axit nitric (HNO2) trong điều kiện pH axít Axit nitric là một tác nhân nitro hóa mạnh, khi với các thành phần thực phẩm, kể cả các axit amin dễ tạo thành nitrosamine là một tác nhân gây ung thư [41] Rất nhiều nghiên cứu trên động vật như chuột, chó, thỏ… cho thấy các hợp chất N-nitroso được đưa vào theo đường ăn uống trực tiếp sẽ gây tổn thương hoại tử ở ruột, gan và tạo nên xung huyết của phổi Phức hợp N-nitroso-methylurea cũng gây xung huyết và tổn thương dạ dày, ruột, tụy và làm ảnh hưởng đến tủy sống Các nghiên cứu tác động của nitrosamin tới các động vật có vú, chim, cá và một số loài động vật lưỡng cư khác cho thấy sự phát triển của tế bào ung thư và chúng thường xuất hiện ở gan, thực quản, hệ hô hấp, thận…[41]

Ngoài ra, amoni có mặt trong nước ngầm làm giảm hiệu quả của khâu khử trùng bằng clo, do nó phản ứng với clo để tạo thành các cloramin, có tác dụng sát khuẩn yếu hơn nhiều so với clo (khoảng 1000 lần) Mặt khác, nó còn giảm khả năng xử lý sắt, mangan bằng công nghệ truyền thống Amoni là nguồn dinh dưỡng, tạo điều kiện cho các vi sinh vật nước, kể cả tảo, phát triển nhanh, làm ảnh hưởng đến chất lượng nước thương phẩm, đặc biệt là độ trong, mùi, vị, nhiễm khuẩn [7]

1.1.3 Nguồn gốc phát sinh các hợp chất chứa nitơ trong môi trường sống

Nitơ luôn tồn tại ở dạng các hợp chất vô cơ hoặc hữu cơ trong cơ thể sống của động thực vật hay trong các sản phẩm công nghiệp và tự nhiên Các dạng hợp chất này bao gồm amoni/ammoniac (NH4+

/NH3); khí nitơ (N2); dinitơ oxit (N2O); nitơ oxit (NO); nitrite (N-NO2); nitơ dioxit (NO2); nitrate

(N-NO3) [5] Sự tích lũy các hợp chất này ngày một tăng do sự bùng nổ dân

số đã gây ô nhiễm ngày càng nặng nề đối với các thành phố lớn Chất thải từ các nhà máy công nghiệp và các trang trại chăn nuôi gia súc, các lò giết mổ… [2] đã tăng đáng kể các chất gây ô nhiễm có nguồn gốc từ nitơ Ngoài ra, sự lạm dụng phân bón hóa học cho sản xuất nông nghiệp cũng là nguyên nhân chính dẫn đến ô nhiễm các hợp chất nitơ trên các diện tích canh tác và nước ngầm Theo ước tính, người dân sử dụng lượng phân bón hóa học cho nuôi trồng rất lớn Trong điều kiện bình thường chỉ có 50 – 70% lượng NO3- có trong lượng phân bón hóa học như NaNO3, KNO3, Ca(NO3)2, NH4NO3 được cây sử dụng, 15 – 20% bị giữ lại trong đất và 20 – 10% bị rửa trôi xâm nhập vào nước ngầm, nước mặt [7] Quá trình phân hủy các hợp chất hữu cơ ngay trong tầng chứa nước cũng làm ô nhiễm nước ngầm Đây là các nguyên nhân chính làm tăng các hợp chất chứa nitơ trong nước ngầm [2]

1.2 Cơ sở của phương pháp khử nitơ sinh học

Phương pháp khử nitơ sinh học dựa vào chu trình chuyển hóa nitơ của

vi sinh vật trong tự nhiên Vòng tuần hoàn của nitơ bao gồm cố định nitơ, quá trình khoáng hóa của vi khuẩn, quá trình nitrate hóa và quá trình khử nirate

1.2.1 Cố định nitơ

Sự sống của vạn vật trên trái đất đều có nhu cầu đối với các hợp chất nitơ để tạo ra các hợp chất cơ bản như protein và các acid nucleic Trong không khí, nitơ chiếm 79%, nhưng chỉ rất ít sinh vật sử dụng nitơ ở dạng này Quá trình cố định nitơ dưới các hình thức: cố định trong khí quyển, cố định nitơ hóa học dưới điều kiện nhiệt độ và áp xuất không khí cao (T0C khoảng

5000C, áp xuất khí quyển khoảng 200at) và cố định nitơ sinh học Quá trình

cố định nitơ sinh học được thực hiện chủ yếu nhờ một số loài vi khuẩn Ngoài các vi khuẩn hay sinh vật cố định nitơ tự do trong đất, có một vài nhóm sinh vật sống cộng sinh với thực vật như cây họ đậu, trong khi đó một số nhóm

lam cũng có thể cố định nitơ Sự cố định nitơ sinh học đòi hỏi một phức hệ enzyme và nhu cầu sử dụng ATP tương đối lớn [42]

1.2.2 Quá trình khoáng hóa

Là tạo ra nitơ vô cơ, như amoni bằng cách phân hủy các chất còn lại của cây

trồng, các chất hữu cơ có trong đất bởi vi sinh vật Tốc độ tạo ra nitơ vô cơ phụ thuộc vào lượng các chất phân hủy, phụ thuộc vào nhiệt độ và độ ẩm của đất Quá trình khoáng hóa có thể diễn ra hàng tuần, hàng tháng và hàng năm Theo thời gian nitơ được tạo ra từ các hữu cơ trong đất, nhưng sẽ nhanh hơn từ một số chất thải của mùa màng, xác động vật, chất thải sinh học, các sản phẩm của quá trình nông nghiệp

1.2.3 Quá trình nitrate hóa

Là quá trình chuyển amoni thành nitrate Amoni tồn tại trong thiên nhiên một

phần thẩm thấu trực tiếp vào rễ cây, còn phần lớn được vi sinh vật oxy hóa để tạo

thành nitrate thông qua hai bước: vi khuẩn (chủ yếu thuộc chi Nitrosomonas) oxy hóa

amoni để tạo thành nitrite và nhóm vi khuẩn oxy hóa nitrite thành nitrate (chủ yếu

thuộc chi Nitrobacter) Đây là hai nhóm vi khuẩn đóng vai trò quan trọng trong chu

trình nitơ

1.2.4 Quá trình khử nitrate

Trong điều kiện thiếu hụt oxy sẽ diễn ra quá trình khử nitrate Trong đó nitrate

được các vi khuẩn sử dụng làm chất nhận điện tử và chuyển thành N2, trả lại nitơ cho

khí quyển Quá trình này xảy ra do các vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas, Achromobacter…

1.3 Vi khuẩn nitrate hóa tự dưỡng

Trước đây, phương pháp phân loại truyền thống đã xếp các chủng vi

khuẩn nitrate hóa chung vào cùng một nhóm thuộc họ Nitrobacteriaceae [51],

[52] Sau đó dựa vào khả năng oxy hóa các cơ chất vô cơ của vi khuẩn nitrate hóa mà người ta đã chia thành hai nhóm, đó là nhóm vi khuẩn oxy hóa amoni

và nhóm vi khuẩn oxy hóa nitrite Trong phân loại truyền thống, các nghiên

cứu về đặc điểm tế bào cũng như các tính chất sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn thuộc hai nhóm này đã cho thấy sự khác biệt về hình dạng, kích thước, sự sắp xếp màng trong tế bào, hình thức trao đổi chất… [52] Những nghiên cứu về phát sinh chủng loại bằng kỹ thuật sinh học phân tử lại càng khẳng định thêm

sự đa dạng của vi khuẩn nitrate hóa

1.3.1 Vi khuẩn oxy hóa amoni nitroso)

1.3.1.1 Đặc điểm sinh học của vi khuẩn oxy hóa amoni

Vi khuẩn oxy hóa amoni là nhóm vi khuẩn gram âm, hóa tự dưỡng và hiếu khí bắt buộc Vi khuẩn này lấy năng lượng từ quá trình oxy hóa amoni thành nitrite Quá trình oxy hóa amoni xảy ra theo phương trình sau:

2NH4

+

+ 3O2 → 2NO2

+ 2H2O + 4H+ + năng lượng cho tế bào sinh trưởng

Vi khuẩn oxy hóa amoni tự dưỡng lấy năng lượng và lực khử từ quá trình oxy hóa amoni để sinh trưởng và duy trì tế bào Nguồn cacbon chính mà các tế bào vi khuẩn sử dụng là CO2 trong khí quyển thông qua chu trình Calvin-Benson Các tế bào vi khuẩn sinh trưởng rất chậm, thời gian nhân đôi tế bào của vi khuẩn ít nhất là 7

- 8 giờ [16], [36] thậm chí kéo dài tới vài ngày [52]

Tế bào vi khuẩn oxy hóa amoni nói chung hình gậy, hình cầu, hình xoắn hay hình chia thùy (hình 1.1) [30] uyển động nhờ roi hoặc vành lông rung Hầu hết các chủng vi khuẩn sinh trưởng trong điều kiện hiếu khí, nhưng một số chủng có thể sinh trưởng trong điều kiện thiếu oxy [53] Những nghiên cứu về đặc điểm sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn oxy hóa amoni cho thấy, vi khuẩn oxy hóa amoni có thể tồn tại trong khoảng nhiệt độ từ 5 đến 35oC, pH từ 5,8 đến 8,5 [52] Nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng của chúng từ 25 đến 30o

C [35], pH tối ưu cho của vi khuẩn nitrate hóa từ 7,5 đến 8,0 [35] Nồng độ amoni tối ưu trong khoảng 2-10 mM [13] Độ ẩm và pH là những yếu tố có vai trò quan trọng ảnh hưởng tới sinh trưởng và hoạt tính chuyển hóa nitơ của vi khuẩn nitrate

Nitrosomonas Nitrosococcus

Hình 1.1 Tế bào của một số loài thuộc nhóm vi khuẩn oxy hóa amoni [30]

Một số chủng vi khuẩn oxy hóa amoni có thể thích nghi trong điều kiện môi

trường bị thiếu hụt oxy [11], [34] Trong điều kiện không có oxy, Nitrosomonas eutropha và Nitrosomonas europaea có thể oxy hóa amoni sử dụng nitrite làm chất

nhận điện tử với sự có mặt của piruvat để tạo ra các sản phẩm như NO, N2O, N2 [9]

Hoạt tính oxy hóa amoni của tế bào Nitrosomonas europaea nhanh chóng được phục hồi sau một thời gian dài thiếu lượng amoni khác biệt với tế bào Nitrosospira [46]

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh, có một vài chủng vi khuẩn oxy hóa amoni sinh trưởng theo hình thức tạp dưỡng, chúng có thể sinh trưởng trong môi trường muối khoáng vô cơ có bổ sung hợp chất cacbon hữu cơ như acetat, pyruvat, saccarose So với hình thức sinh trưởng tự dưỡng, các chủng vi khuẩn sinh trưởng theo hình thức tạp dưỡng này có thể làm tăng tỷ lệ oxy hóa amoni đến 130 % và số lượng tế bào có thể tăng từ 10-15 lần [36] Các chủng vi khuẩn oxy hóa amoni không thể sinh trưởng dị dưỡng [36], [35]

Vi khuẩn oxy hóa amoni phân bố rộng trong tự nhiên và được phân lập từ rất nhiều nguồn khác nhau như đất, đá, nước ngọt, môi trường biển, nước lợ và các hệ thống

xử lý nước thải[15] Các nghiên cứu của Watson et al., (1989) cho thấy, các chủng vi

khuẩn này có thể tồn tại trong những điều kiện khắc nghiệt như độ muối cao (halophilic = ưa mặn), pH cao (acidophilic = ưa acid), độ dinh dưỡng cao (eutrophilic) hoặc thấp, khả năng chịu nhiệt cao hoặc thấp Một nghiên cứu khác cho

thấy, loài Nitrosomonas cryotolerans được phân lập từ bờ biển Alaska có khả năng

sinh trưởng được ở -5o

C [33], một vài chủng vi khuẩn oxy hóa amoni khác lại được phát hiện thấy ở các hồ của vùng Nam cực, nơi mà mặt hồ luôn đóng băng [49]

1.3.1.2 Phân loại vi khuẩn oxy hóa amoni

Các chủng vi khuẩn oxy hóa amoni được phân lập từ cuối thế kỷ XIX đã cho thấy sự đa dạng của vi khuẩn oxy hóa amoni [24]

Để phân loại các chủng vi khuẩn theo phương pháp truyền thống, người ta thường dựa vào một số đặc điểm hình thái, khả năng dinh dưỡng, môi trường sinh sống, các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn Để phân loại chính xác các chủng

vi khuẩn đến loài, người ta thường dựa vào các đặc tính di truyền chứ không phải dựa vào kiểu hình [18] Các phương pháp sinh học phân tử giúp cho việc khẳng định vị trí và sự khác biệt về kiểu gen của các chủng vi khuẩn trong khóa phân loại

Năm 1972, theo khóa phân loại của Bergey, các chủng vi khuẩn oxy hóa amoni

được chia thành 4 chi: Nitrosomonas, Nitrosospira, Nitrosococcus và Nitrosolobus.[52]

Năm 1989, theo khóa phân loại của Bergey, các chủng oxy hóa amoni được chia thành 5 chi, ngoài 4 chi như đã công bố năm 1972 còn có thêm 1 chi là

Nitrosovibrio với loài Nv Tenuis [52]

Theo một số tác giả, các chi Nitrosolobus, Nitrosovibrio có quan hệ gần gũi với chi Nitrosospira [47], nên người ta coi chúng thuộc chi Nitrosospira Các chủng vi khuẩn thuộc 3 chi này có đặc điểm hình thái khác nhau, chi Nitrosospira có hình

dạng tế bào hình xoắn ốc, chi Nitrosolobus tế bào phân thùy còn chi Nitrovibrio có

hình dạng tế bào hình que, cong, mảnh Nhưng 3 chi này lại không thể phân loại dựa vào phân tích trình tự gen 16S rRNA [45]

Từ năm 2001 cho đến nay, trong hệ thống phân loại người ta chia nhóm vi khuẩn oxy hóa amoni thành 3 chi, dựa vào sự khác biệt về hình dạng tế bào, kiểu

hình và tổ chức nội bào Đó là Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosospira Sử dụng

Kỹ thuật xác định trình tự gen mã hóa 16S rRNA để phân loại cho thấy phần lớn các

chi đều thuộc phân lớp β-proteobacteria [49], chỉ có loài Nitrosococcus oceani, Nitrosococcus mobolis Nitrosococcus halophilus thuộc dưới lớp γ-proteobacteria Các kỹ thuật mới để xác định trình tự gen sau này như sử dụng gen chức năng amoA

(gen mã hóa tiểu đơn vị A của Amonia monooxygenase) đã bổ sung thêm các chủng

vi khuẩn oxy hóa amoni [18]

1.3.2 Vi khuẩn oxy hóa nitrite )

Nhóm vi khuẩn tham gia vào quá trình oxy hóa nitrite thành nitrate được gọi là vi khuẩn oxy hóa nitrite Đây là bước thứ 2 của quá trình nitrate hóa Nhóm vi khuẩn này đóng vai trò quan trọng trong việc chuyển đổi nitrite thành nitrate cần thiết cho ngành nông nghiệp khi sử dụng chúng làm phân bón nitơ Bên cạnh đó, nó còn

có vai trò chìa khóa để loại bỏ các hợp chất nitơ trong xử lý nước thải Do vậy, nhóm

vi khuẩn này đã và đang được các nhà khoa học tập trung nghiên cứu để ứng dụng

1.3.2.1 Đặc điểm sinh học của vi khuẩn oxy hóa nitrite

Nhóm các vi khuẩn oxy hóa nitrite tự dưỡng được biết đến như là vi khuẩn tự dưỡng hóa năng (chemoautotroph) hay tự dưỡng vô cơ (lithautotroph) [13], Gram

âm và hiếu khí Chúng có khả năng sử dụng nitrite như là chất cho điện tử, lấy năng lượng từ quá trình oxy hóa nitrite thành nitrate [13] Giống như vi khuẩn oxy hóa amoni, g sử dụng nguồn cacbon là CO2 từ không khí thông qua chu trình Calvin-Benson [16] nitrite hóa như sau:

2NO2- + 2O2 → 2NO3- + Năng lượng

Vi khuẩn oxy hóa nitrite sinh trưởng chậm , thời gian nhân đôi tế bào có thể từ

8 cho tới 59 giờ hoặc thậm chí kéo dài tới 140 giờ Ở một số loài, tế bào vi khuẩn có thể sử dụng nitric oxide (NO) thay cho NO2

-

như làmột nguồn cho điện tử [13] Tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn oxy hóa nitrite phụ thuộc vào nồng độ cơ chất, nhiệt độ, pH, ánh sáng và nồng độ oxy hòa tan Các chủng vi khuẩn oxy hóa nitrite tự dưỡng sinh trưởng tốt nhất ở nồng độ nitrite từ 2-30 mM, nồng độ quá cao

có thể ức chế sinh trưởng của tế bào [52] Vi khuẩn oxy hóa nitrite có thể sinh trưởng trung bình trong môi trường tự nhiên ở dải pH từ 6,5 đến 8,5 điều kiện tối ưu cho sinh trưởng là pH 7,5 – 8 [52], [13] Nhiệt độ lý tưởng cho sinh trưởng của chúng là 25 –

30oC trong môi trường thông khí Nitrobacter có thể sinh trưởng được trong môi

trường giới hạn oxy [14], nhưng trong điều kiện không có oxy tốc độ sinh trưởng của

vi khuẩn sẽ bị ức chế

Đặc điểm hình thái: Tế bào vi khuẩn thường có hình que, hình quả lê, hình cầu hay hình sợi xoắn Không có nội bào tử Màng trong tế bào có cấu trúc hình phiến mỏng hoặc dạng ống Một số tế bào vi khuẩn có thể chuyển động nhờ roi, một số khác không có khả năng chuyển động

Môi trường sống: có thể tồn tại trong những môi trường khác nhau như đất, đá, nước thải, biển và chủ yếu là nước lợ [53]

Một số loài thuộc chi Nitrobacter và Nitrospira có khả năng sinh

trưởng dị dưỡng hay tạp dưỡng [52], [15], các chủng sinh trưởng dị dưỡng thường sử dụng năng lượng và nguồn cacbon từ các hợp chất hữu cơ Sinh trưởng tạp dưỡng sử dụng nguồn cacbon hữu cơ như acetate, pyruvat và glycerol [29] Các chủng vi khuẩn sinh trưởng tạp dưỡng có thể sinh trưởng nhanh hơn gấp 10 lần so với vi khuẩn sinh trưởng tự dưỡng [23]

1.3.2.2 Phân loại vi khuẩn oxy hóa nitrite

Ngày nay, vi khuẩn oxy hóa nitite được phân loại thành 4 chi: Nitrobacter, Nitrospira, Nitrococcus và Nitrospina [52], [13], [27] Tế bào vi khuẩn thuộc chi

Nitrobacter có hình gậy ngắn, màng trong tế bào chứa mũ phân cực Tế bào vi khuẩn thuộc chi Nitococcus có hình tròn, màng trong tế bào hình ống Tế bào các vi khuẩn thuộc chi Nitrospina có hình gậy dài, màng trong tế bào dạng túi Tế bào các chủng vi khuẩn thuộc chi Nitrospira có hình xoắn và không xuất hiện màng trong tế bào

Các nghiên cứu về trình tự gen 16S rRNA cho thấy chi Nitrobacter thuộc lớp

α Proteobacteria [54], [15], chi Nitrococcus thuộc lớp γ Proteobacteria [22], chi Nitrospina thuộc lớp δ Proteobacteria [47], còn chi Nitrospira lại thuộc lớp Nitrospira [53], [23]

Các số liệu phân tích trình tự gen 16S rRNA cho thấy, các chủng thuộc chi

Nitrobacter có quan hệ rất gần gũi với một số vi khuẩn quang dưỡng như Rhodopeudomonas palustris và vi khuẩn cố định N2

Bradyrhizobium japonicum [27]

1.4 Màng sinh học (Biofilm)

1.4.1 Khái niệm về biofilm

Cùng với những tiến bộ trong quá trình nghiên cứu, khái niệm về màng sinh h được đưa ra càng ngày càng hoàn thiện và đầy đủ hơn Hiện nay, khái niệm màng sinh được hiểu là tập hợp các quần xã vi sinh bám dính

và phát triển trên bề mặt môi trường khác nhau thông qua mạng lưới ngoại bào do chính chúng tạo ra [20] Màng sinh có thể hình thành trên bề mặt môi trường vô sinh hay hữu sinh và là hiện tượng phổ biến xuất hiện trong tự nhiên, trong đời sống hay trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau

1.4.2 Thành phần của biofilm

Biofilm trong tự nhiên gồm 2 thành phần chính: Thành phần tế bào (tập hợp các tế bào của một hay nhiều loài vi sinh vật khác nhau, bám dính trên bề mặt nhất định) và mạng lưới các hợp chất ngoại bào (extracellular polymeric substances – EPS) bao quanh các tế bào, tạo nên cấu trúc đặc trưng cho biofilm Về cơ bản biofilm có thể được hình thành từ một loài (biofilm đơn

chủng) hoặc nhiều loài vi khuẩn (biofilm đa chủng).v.v Dạng biofilm đa chủng thường chiếm ưu thế trong hầu hết các môi trường, còn biofilm đơn chủng thường xuất hiện trên các bộ phận cấy ghép giả trong cơ thể và là nguyên nhân gây nên các bệnh về nhiễm trùng Biofilm đa chủng thường tốt

hơn so với biofilm đơn chủng, sinh khối biofilm của 4 chủng Microbacterium phyllosphaerae, Shewanella japonica, Dokdonia donghaensis và

Acinetobacter lwoffii cao hơn 167% so với biofilm các chủng đơn tương ứng

Trong tế bào vi sinh vật 2- 5% tổng khối lượng của biofilm, 97% là nước, 3-6% còn lại là các hợp chất polimer ngoại bào và ion [10] Một tế bào riêng lẻ có thể tạo ra vài thành phần ngoại bào khác nhau tùy thuộc vào điều kiện môi trường, đặc tính của từng loài vi khuẩn cũng như cách thức khác nhau hình thành biofilm Quá trình tạo màng sinh cần có sự tham gia của nhiều yếu tố để hình thành nên cấu trúc đặc trưng của màng Tỷ lệ và mức độ bám dính của tế bào vi khuẩn vào một bề mặt phụ thuộc vào đặc tính kỵ nước của bề mặt tế bào, sự hiện diện của lông roi, tiêm mao và chất kết dính, ngoài

ra còn có protein màng tế bào và sự sản xuất mạng lưới ngoại bào [21]

1.4.2.1 Thành phần mạng lưới các hợp chất ngoại bào

Mạng lưới chất ngoại bào có hàm lượng cacbon chiếm 50 – 90% tổng lượng hữu cơ trong màng sinh , nó được xem như là vật liệu chính của màng sinh

Thành phần polymer ngoại bào rất đa dạng tùy loài vi sinh vật, dạng biofilm và điều kiện hình thành Nhưng về cơ bản đều bao gồm các polysaccharide chiếm khoảng 40 - 95%, 1 - 60% protein, 1 - 10% acid nucleic, 1 - 40% lipid [19] Các hợp chất này thay đổi theo không gian và thời gian tồn tại của biofilm Về cơ bản biofilm càng dày thì có hàm lượng chất ngoại bào càng nhiều và thời gian tồn tại càng lâu Mật độ tế bào tập trung cao nhất ở lớp bề mặt của biofilm và giảm dần theo độ sâu, nhưng thành phần chất ngoại bào lại phong phú hơn ở vùng phía trong biofilm Thành phần chất

ngoại bào trong hầu hết các biofilm cũng khác biệt so với các vi khuẩn ở dạng sống tự do Những thành phần chính được xem xét trong một biofilm bao gồm polysaccharide, protein và DNA

 Thành phần polysaccharide ngoại bào

Polysaccharide là thành phần quan trọng để tạo nên cấu trúc hoàn chỉnh của biofilm Các polysaccharide có thể rất đa dạng về đặc tính sinh lý, sinh hóa thông qua dạng liên kết glycosilic giữa các phân tử (β-1,4; β-1,3 hay α-1,6) hay đơn vị monomer cấu tạo nên Polysaccharide có thể là các đồng phân

tử cấu tạo bởi một đơn phân monosaccharide duy nhất như cellulose, dextran, hay dị phân tử cấu tạo bởi 2 đến 4 dạng đơn phân khác nhau như: alginate, emulsan, gellen Các monosaccharide phổ biến trong biofilm là D- glucose, D- galactose, D-mantose, L-fuctose Thành phần các đường đơn có ảnh hưởng đến đặc tính của cả mạng lưới biofilm [17]

 Protein ngoại bào

Protein màng tế bào được ghi nhận là có ảnh hưởng đáng kể trong sự bám dính, cũng như trong giai đoạn phát triển sớm của màng sinh Nghiên

cứu cho thấy sự gắn kết của E.coli lên bề mặt vô sinh dẫn đến những tương

tác vật lý của tế bào đối với bề mặt đã làm biến đổi các đặc tính bề mặt của lớp màng ngoại bào [40]

Những phương pháp di truyền và chụp ảnh hiển vi cung cấp thông tin về việc protein đóng vai trò như là một yếu tố kết nối tế bào Protein ngoại bào có khối lượng dao động từ 10 kDa đến 200 kDa

1.4.2.2 Thành phần tế bào

Biofilm có thể được hình thành bởi tập hợp các tế bào của một hoặc nhiều loài vi sinh vật khác như vi nấm, vi tảo, xạ khuẩn, vi khuẩn Trong biofilm các tế bào tập hợp thành các đơn vị cấu trúc là các vi khuẩn lạc Thành phần này đóng vai trò quan trọng trong quá trình hình thành biofilm đặc biệt là giai đoạn đầu bởi nó quy định đặc tính hình thành biofilm cho từng

loài vi sinh vật, đảm nhiệm chức năng tiết các hợp chất ngoại bào cũng như

có chứa các yếu tố phụ trợ tế bào như lông roi, lông nhung hỗ trợ cho việc bám dính của các tế bào khác lên bề mặt giá thể Để tồn tại trong những điều kiện khắc nghiệt (thiếu dinh dưỡng, nhiều áp lực ) vi sinh vật phải học cách bám lên bề mặt giá thể, liên kết với các loài khác để cộng sinh và tự bảo vệ mình [32], [55]

1.4.3 Ảnh hưởng của một số điều kiện hóa lý đến sự hình thành và phát triển của biofilm

1.4.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Các chất dinh dưỡng được chuyển hóa phụ thuộc vào các enzyme tham gia nên sự hình thành của một biofilm cũng phụ thuộc vào sự có mặt và tốc độ phản ứng của các emzym Nhiệt độ tương quan với tốc độ phản ứng của các enzyme vì vậy nó ảnh hưởng lên sự phát triển của các tế bào, từ đó tác động đến quá trình hình thành biofilm Ngoài ra, nhiệt độ môi trường còn ảnh hưởng đến các đặc tính vật lý của các hợp chất bên trong và xung quanh tế

bào [26] Khi quan sát biểu hiện của bề mặt vi khuẩn Listeria monocytogenes

phụ thuộc vào nhiệt độ , các tế bào ở 35oC thể hiện có 1 lông roi, trong khi ở 21oC chúng có 2 hoặc 3 lông roi, ở 10oC các tế bào này có thể biểu hiện tới một vài lông roi Như vậy, tương tác ban đầu giữa vi khuẩn và

bề mặt để hình biofilm tăng theo chiều giảm nhiệt độ do ở nhiệt độ thấp các polysaccharides có cấu trúc đồng nhất hơn [31]

1.4.3.3 Ảnh hưởng của pH

Khi pH thay đổi ảnh hưởng đáng kể đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Tế bào vi khuẩn có các kênh proton liên kết với màng vì thế mà các proton vận chuyển từ màng sinh chất tạo nên một lực đẩy proton Dòng vận chuyển proton theo gradient điện thế, đáp ứng với lực vận chuyển proton

để điều hòa pH trong bào tương Những đáp ứng vi khuẩn đến thay đổi pH

hợp các protein và liên quan đến nhiều quá trình tế bào khác nhau mà trực tiếp

là việc sản xuất các polymer ngoại bào Ở điều kiện trung tính, các polymer ngoại bào được sản xuất nhiều làm cấu trúc màng sinh học dày hơn và đồng đều hơn so với điều kiện có tính axit hoặc kiềm [31]

1.4.3.4 Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl

Nồng độ muối liên quan đến áp suất thẩm thấu của tế bào, tác động đến trao đổi chất của vi sinh vật, ảnh hưởng đến biểu hiện một số gene quy định

quá trình hình thành biofilm, ví dụ như đối với Staphylococcus aureus khi

nồng độ NaCl cao sẽ khởi động sự hình thành biofilm thông qua biểu hiện của gene liên quan đến sự điều khiển khả năng tích hợp các tế bào [37] Đa số vi khuẩn sinh trưởng tốt trong môi trường có nồng độ muối thấp hơn 2%, nhưng cũng có một số loại vi khuẩn sinh trưởng tốt trong môi trường chứa nồng độ

muối trên 3%, đó là các vi khuẩn ưa muối (halophilic) như Halobacterium, Natronococcus,.v.v [4 ] Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ muối đến sự

hình thành biofilm là rất quan trọng cho việc ứng dụng về sau

1.4.4 Màng sinh học của vi khuẩn nitrate hóa tự dưỡng

Lớp ngoài cùng của màng sinh học là lớp hiếu khí, bên trong là lớp kỵ khí Bề dày của lớp hiếu khí không thay đổi trong một điều kiện hoạt động nhất định, khi bề dày của lớp hiếu khí tăng theo tốc độ phát triển của vi sinh vật, phía trong của lớp hiếu khí sẽ chuyển thành kỵ khí vì thiếu oxy Một trong những vai trò của kỵ khí là hóa lỏng những chất rắn do màng sinh ra, góp phần làm giảm lượng bùn dư Sự tồn tại đồng thời của hai lớp màng hiếu khí và kỵ khí có khả năng loại bỏ nitơ trong nước thải, bởi vì đồng thời xảy ra quá trình nitrate hóa và khử nitrate Theo đó lớp hiếu khí đóng vai trò nitrate hóa và lớp kỵ khí đóng vai trò khử nitrate Một phần nitrate sản sinh ra trong lớp hiếu khí đi ra chất lỏng, phần còn lại bị lớp kỵ khí chuyển thành N2 Khi nồng độ oxy hoà tan cao, bề dày lớp hiếu khí lớn thì quá trình nitrate hóa nhanh và mạnh hơn, nhưng tỉ lệ khử nitrate giảm vì bề dày của màng kị khí

giảm đi Ngược lại, nếu nồng độ oxy hòa tan trong nước quá thấp thì khả năng khử nitrate lớn nhưng khả năng nitrate hóa bị giảm Do đó, lượng oxy hoà tan tối ưu trong nước thải sẽ cho khả năng loại bỏ nitơ tốt nhất Do vậy, cần phải

có sự sục khí thích hợp để quá trình loại bỏ nitơ đạt hiệu quả cao

Sự tạo màng sinh học của vi khuẩn nitrate hóa ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật trong màng và khả năng loại bỏ các hợp chất nitơ trong nước Khi các vi khuẩn này được cố định trên các giá thể nhờ màng sinh

sẽ tăng khả năng sống sót của chúng và tăng khả năng sinh trưởng Điều này cũng đồng nghĩa với việc tăng khả năng loại bỏ các hợp chất chứa nitơ Màng sinh còn giúp các vi khuẩn nitrate tồn tại được trong môi trường có nồng độ amoni, nitrite hay nitrate cao

1.5 Phân loại vi khuẩn bằng xác định trình tự gen mã hóa 16S rRNA

Ribosome là những hạt nhỏ hình cầu có kích thước khoảng 20-35 nm, là nơi sinh tổng hợp protein của tế bào, các RNA ribosome chiếm khoảng 80-90% RNA của tế bào Hiện nay các nhà khoa học cho rằng mức độ giống nhau về trình tự 16S rRNA phản ánh khoảng cách quan hệ giữa các cá thể vì cấu trúc của RNA ribosom chịu những áp lực rất lớn – hệ quả cần thiết để nó có cấu trúc bậc hai chính xác và tác động qua lại với các protein khác nhau tạo ra các ribosome chức năng Tần số thay đổi của trình tự gen 16S rRNA ít hơn so với

hệ gen và dựa trên trình tự này có thể xác định quan hệ họ hàng giữa các cá thể

Woese được coi là người đi tiên phong trong việc sử dụng trình tự RNA ribosome để khảo sát quan hệ tiến hóa ở vi khuẩn Theo Woese, trật tự nucleotide 16S rRNA là một chỉ số quan trọng trong xác định mối quan hệ chủng loại phát sinh giữa các nhóm vi khuẩn [54] Đồng thời trình tự gen 16S rRNA của vi sinh vật trong ngân hàng gen quốc tế khá nhiều và phong phú Chính vì vậy, phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA là phương pháp phân

Từ những năm 80, Woese và cộng sự lần đầu tiên sử dụng phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA trong nghiên cứu định loại vi khuẩn AOB

Vi khuẩn oxy hóa amoni được chia thành hai phân nhóm đồng nhất kiểu hình

β- và γ- proteobacteria Ngày nay, trình tự gen 16S rRNA đầy đủ của 14 loài AOB thuộc lớp β-proteobacteria đã được mô tả có thể làm dữ liệu để chứng

minh cho sự tiến hóa của nhóm [18], [49]

Việc định loại vi khuẩn oxy hóa amoni bằng cách so sánh trình tự 16S rRNA cho một cách nhìn tổng quan về phát sinh loài Các nghiên cứu về gen chức năng được khẳng định hơn vị trí của các loài vi khuẩn nói chung và vi khuẩn nitrate hóa nói riêng trong cây phát sinh chủng loại

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.Vật liệu, hóa chất và thiết bị máy móc

- Plasmid pTz57 R/T(hãng Qiagen) được sử dụng làm vector tách dòng

- Cặp mồi được sử dụng cho tách dòng gen 16S rRNA là cặp mồi 16Sf 5’- AGA GTT TGA TCA TGG CTCA - 3’ và 16Sr 5’- AAG GAG GTG ATC CAG CC - 3’ (Invitrogen)

2.1.2 Hóa chất và enzyme

Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu này là những hóa chất được nhập từ các hãng có uy tín trên thế giới có sẵn tại phòng Công nghệ sinh học môi trường, Viện Công nghệ sinh học

đo pH Meter Delta 320 (Mettler Toledo, Thụy Sỹ); máy ổn nhiệt Meter (Đức)

và máy lắc ổn nhiệt Metler (Đức)

2.2 Các môi trường nuôi cấy vi khuẩn

2.2.1 Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn nitrate hóa

Môi trường Winogradsky [43]:

- Môi trường cho vi khuẩn oxy hóa amoni (Winograsky I) bao gồm :

(NH4)2SO4 (0,5g/l), CaCO3 (5g/l), KH2PO4 (1g/l), MgSO4.7H2O (0,5g/l), FeSO4 (0,4g/l) Môi trường rắn nuôi cấy có bổ sung thạch với hàm lượng 20 g/l

- Môi trường cho vi khuẩn oxy hóa nitrite (Winograsky II) chứa các

thành phần tương tự như môi trường Winogradsky I chỉ thay thế thành phần (NH4)2SO4 (0,5g/l) bằng NaNO2(0,5g/l)

2.2.2 Môi trường LB

- Môi trường LB lỏng: Cao nấm men 0,5%; bacto-pepton 1%; NaCl 1%

- Môi trường LB thạch: môi trường LB lỏng bổ sung thêm bacto-aga 1,6%

- Môi trường có chất cảm ứng IPTG: Môi trường LB + IPTG 100 µg/ml

- Môi trường chọn lọc: Môi trường LB + Amp 100 µg/ml

(Các môi trường được khử trùng ở 1at trong 30 phút.)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phân lập vi khuẩn nitrate hóa

Mẫu bùn và nước sau khi lấy về được tiến hành làm giàu vi khuẩn nitrate trong môi trường Winogradsky I và II 10-15 ngày trước khi phân lập

Mẫu bùn và nước sau khi làm giàu, được pha loãng nhiều lần và cấy

i trên đĩa petri chứa môi trường Winogradsky I và II Sau 6-7 ngày ở

30oC xuất hiện khuẩn lạc có hình tròn, màu trắng đục, màu vàng nhạt hoặc màu vàng cam Các khuẩn lạc này tiếp tục được cấy ria trên

môi trường Winogradsky tương ứng và tiến hành thử hoạt tính oxy hóa amoni, nitrite Vi khuẩn được lựa chọn khả năng chuyển hóa amoni, nitrite nhiều hơn trong cùng một điều kiện nuôi cấy

2.3.2 Xác định hàm lượng amoni trong nước ngọt theo phương pháp Nessler [25]

 Nguyên tắc

Trong môi trường bazơ mạnh NH4

+

sẽ biến thành NH3 NH3 mới hình thành và NH3 sẵn có trong mẫu nước sẽ tác dụng với phức chất Indo mercurate kalium (K2HgI4), hình thành phức chất có màu vàng nâu, cường độ màu đậm hay nhạt tùy thuộc vào hàm lượng NH3 có trong mẫu nước

2 K2HgI4 + NH3 + 3KOH = Hg(HgIONH2) + 7KI + 2 H2O

để qua đêm và gạn lắng lấy phần nước trong Bảo quản trong chai thủy tinh màu da cam có nút màu

Pha loãng dung dịch gốc 100 lần, lấy 1ml dung dịch gốc với 99 ml nước cất Vậy hàm lượng NH4+

trong dung dịch chuẩn pha loãng là 0,1 mg

NH4

+/ml Tùy thuộc vào nồng độ được chọn làm chuẩn mà ta tiếp tục pha loãng theo các tỉ lệ khác nhau

Bảng 2.1 Tỉ lệ pha loãng dung dịch chuẩn NH4+ với nước cất

Tỉ lệ pha loãng dung dịch chuẩn với nước

cất (ml/ml)

Hàm lượng N-NH4+

trong dung dịch pha loãng (mg/l)

- Khử tạp chất: Cho vào bình tam giác (V=250 ml) 100ml dung dịch mẫu

nghiên cứu, thêm 1ml ZnSO4 10%, lắc đều, thêm 0,4-0,5 ml dung dịch NaOH 6N sao cho pH của dung dịch đạt 10,5 Để lắng vài phút sau đó lọc qua giấy lọc không amoni

- Phản ứng tạo màu của dung dịch nghiên cứu: Cho 25ml dung dịch mẫu

(hoặc một phần dung dịch mẫu được pha loãng với nước cất không amon với nồng độ thích hợp) vào bình 50ml Thêm lần lượt các dung dịch sau vào dung dịch mẫu: 1ml dung dịch phenol, 1ml dung dịch sodium nitroprusside, 2,5ml dung dịch oxy hóa, lắc đều Đậy bình bằng nắp nhựa hoặc màng paraphin, để yên mẫu ở nhiệt độ phòng 22 - 27oC trong 1 giờ Nếu trong dung dịch tồn tại

NH4

+

thì nó sẽ phản ứng tạo màu xanh đậm Cường độ màu tỷ lệ thuận với nồng độ NH4+. Xác định hàm lượng NH4+ bằng phương pháp soi màu trên máy quang phổ kế

Đo độ hấp thụ màu của dung dịch nghiên cứu và dung dịch chuẩn trên máy quang phổ bước sóng 420 nm Hàm lượng NH4+

trong dung dịch nghiên cứu được tính theo công thức:

Dung dịch chuẩn pha loãng: Pha loãng dung dịch gốc 100 lần Khi đó hàm lượng NaNO2 trong dung dịch pha loãng sẽ là 0,0075mg NaNO2/ml = 0,005 mg NO2

-/ml Tuỳ thuộc vào nồng độ được chọn làm chuẩn mà ta tiếp tục pha loãng theo các tỉ lệ sau

Bảng 2.2 Tỷ lệ pha loãng dung dịch chuẩn + nước cất và hàm lượng N-NO2

-Tỷ lệ pha loãng dung dịch chuẩn +

(mg/l)

dung dịch chuẩn gốc pha loãng

- Mẫu nghiên cứu 0,05 ml Griss 1 0,05 ml Griss 2 5 ml dung dịch nghiên cứu (pha loãng nếu cần)

Lắc đều hỗn hợp trên và để yên trong 15 phút Nếu dung dịch c

NO2

sẽ màu hồng với thuốc thử Cường độ màu tỷ lệ thuận với nồng độ

NO2- có trong dung dịch Đo độ hấp thụ của phản ứng màu của dung dịch nghiên cứu và dung dịch chuẩn trên máy đo quang phổ kế ở bước sóng 520

-/ml