Nghiên cứu giải mã trình tự hệ Genome của chủng Virus xoăn lá thuốc lá (TLCV) phân lập tại Việt Nam

DANH MỤC CÁC BẢNG 1.1 Một số bệnh virus hại cây trồng quan trọng trên thế giới và đã được xác định có ở Việt Nam ……….... Tuy nhiên, với những đặc điểm sinh học của mình, thuốc lá là cây

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

CAO DUY PHÚC

NGHIÊN CỨU GIẢI MÃ TRÌNH TỰ HỆ GENOME CỦA CHỦNG VIRUS XOĂN LÁ THUỐC LÁ

(TLCV) PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số: 60 42 0201

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS LÊ VĂN SƠN

Thái Nguyên – 2013

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu

sắc tới TS Lê Văn Sơn, Phòng Công nghệ Tế bào thực vật, Viện Công nghệ

sinh học - người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, dìu dắt, giúp đỡ tôi trong

thời gian học tập và hoàn thành khóa luận này

Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới PGS TS Chu Hoàng Hà, ThS

Phạm Thị Vân, Ks Nguyễn Thị Thu Hiền, CN Nguyễn Văn Đoài cùng tập thể

cán bộ Phòng công nghệ Tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học đã nhiệt

tình giúp đỡ, truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt thời gian

làm khoá luận

Tôi xin cảm ơn phòng đào tạo và các thầy cô giáo tại Cơ sở đào tạo sau

đại học Đại học khoa học - Đại học Thái Nguyên đã luôn quan tâm, tạo điều

kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập

Cuối cùng, tôi xin dành cho những người thân trong gia đình và bạn bè

lòng biết ơn sâu sắc, những người thân yêu đã luôn bên tôi, động viên và góp ý

cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khoá luận

Tôi chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quí báu đó./

Hà Nội, ngày tháng năm 2013

Tác giả luận văn

Cao Duy Phúc

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC TỪ VIẾT TẮT

EDTA Ethylene Diamine tetra-acetate acid

DANH MỤC CÁC BẢNG

1.1 Một số bệnh virus hại cây trồng quan trọng trên thế giới và đã

được xác định có ở Việt Nam ……… 4

1.2 Một số bệnh trên cây thuốc lá do virus gây ra……… 11

2.1 Nguồn gốc các mẫu thuốc lá nghiên cứu……… 23

2.2 Trình tự và thông số của hai mồi……… 25

2.3 Thành phần phản ứng PCR cặp mồi prV324N/prC889N………… 26

2.4 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR cặp mồi prV324N/prC889N…… 26

2.5 Thành phần phản ứng PCR cặp mồi TYLCV-A-R……… 27

2.6 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR cặp mồi TYLCV-A-R………… 27

2.7 Thành phần phản ứng ghép nối……… 29

2.8 Thành phần phản ứng colony-PCR……… 31

2.9 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng colony-PCR……… 31

2.10 Thành phần phản ứng cắt vector tái tổ hợp bằng enzyme BamHI 32 2.11 Mã số, nguồn gốc đất nước và cây chủ của một số thể phân lập, chủng Begomovirus trên GenBank……… 33

3.1 Kích thước và vị trí các gen trên vòng DNA-A……… 41

3.2 Hệ số tương đồng và sai khác giữa trình tự nucleotit vòng DNA-A của 3 thể phân lập HN, BG, LS với các trình tự trên ngân hàng gen thế giới ……… 47

DANH MỤC CÁC HÌNH

1.1 Cấu trúc genome của Begomovirrus có một vòng DNA (A) và

cấu trúc genome của TLCV có 2 vòng DNA (B)……… 14

1.2 Cấu trúc vòng DNA-β ……… 17

1.3 Cây thuốc lá bị nhiễm bệnh xoăn lá ……… 18

1.4 Bọ phấn Bemisia tabaci 20

2.1 Mô hình minh họa vị trí các mồi trên genome TLCV……… 25

2.2 Cấu tạo vector pBT ……… 28

3.1 Kết quả điện di DNA tổng số tách chiết từ lá bị bệnh xoăn lá 35

3.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân vòng DNA-A ……….……… 36

3.3 Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5α……… 38

3.4 Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR……… 38

3.5 Ảnh plasmid đã làm sạch để đọc trình tự ……….……… 39

3.6 Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid mang gen V1 và A bằng BamHI 40

3.7 Kết quả so sánh trình tự nucleotit vòng DNA-A giữa 3 thể phân lập HN, BG, LS … 44

3.8 Kết quả BLAST trình tự vòng DNA-A của thể phân lập HN…… 45

3.9 Kết quả BLAST trình tự vòng DNA-A của thể phân lập BG…… 46

3.10 Kết quả BLAST trình tự vòng DNA-A của thể phân lập LS……… 46

3.11 Cây phát sinh chủng loại ……… 49

MỤC LỤC

Trang phụ bìa

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 VIRUS THỰC VẬT 3

1.1.1 Các bệnh do virus thực vật gây ra hiện nay 3

1.1.2 Cách phòng chống bệnh do virus thực vật gây ra 5

1.1.3 Cấu trúc của virus thực vật 7

1.2 MỘT SỐ VIRUS GÂY BỆNH TRÊN CÂY THUỐC LÁ 8

1.2.1 Virus gây bệnh khảm thuốc lá (Tobacco mosaic virus, TMV)……… 8

1.2.2 Virus gây bệnh khảm dưa chuột (Cucumber mosaic virus, CMV)… 9

1.2.3 Virus gây bệnh héo đốm cà chua (Tomato Spotted Wilt Virus, TSWV) 10 1.3 VIRUS XOĂN LÁ THUỐC LÁ (Tobacco leaf curl virus, TLCV) 12

1.3.1 Đặc điểm hình thái, cấu tạo và phân loại 12

1.3.2 Cấu trúc genome và chức năng của các protein 14

1.3.3 Triệu chứng và cơ chế lây bệnh 18

1.3.4 Một số nghiên cứu và ứng dụng hệ gen Begomovirus trong tạo cây trồng chuyển gen kháng Begomovirus 20

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 23

2.1.1 Nguồn vật liệu 23

2.1.2 Chủng vi sinh vật, plasmid và các bộ kit 23

2.1.3 Hóa chất, máy móc và thiết bị 23

2.1.4 Địa điểm nghiên cứu 24

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.2.1 Tách chiết DNA tổng số 24

2.2.2 Phản ứng PCR 25

2.2.3 Phương pháp điện di phân tích DNA trên gel agarose 27

2.2.4 Phương pháp thôi gel 28

2.2.5 Gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pBT 28

2.2.6 Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt 29

2.2.7 Phản ứng colony-PCR 30

2.2.8 Phương pháp tách chiết plasmid 31

2.2.9 Phản ứng cắt vector tái tổ hợp bằng enzyme BamHI 32

2.2.10 Xác định trình tự và so sánh trình tự gen thu được với các trình tự tương ứng trên GenBank 33

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

3.1 KẾT QUẢ TÁCH DÒNG GEN VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE ……… 35

3.1.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số 35

3.1.2 Kết quả nhân gen bằng phản ứng PCR 36

3.1.3 Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α 37

3.1.4 Kết quả chọn lọc plasmid tái tổ hợp bằng kỹ thuật colony-PCR 38

3.1.5 Tách plasmid tái tổ hợp và cắt kiểm tra sự có mặt của gen tách dòng 39

3.1.6 Kết quả xác định trình tự 41

3.2 ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN 44

3.2.1 Kết quả so sánh trình tự nucleotide 44

3.2.2 Đánh giá tính đa dạng của các thể phân lập BG, HN, LS thông qua cây phát sinh chủng loại 48

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

MỞ ĐẦU

Lý do chọn đề tài

Thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) là cây công nghiệp ngắn ngày được trồng

nhiều nơi trên thế giới và có giá trị kinh tế cao Không chỉ để sản xuất thuốc lá,

nó còn được sử dụng làm nguyên liệu sản xuất nicotin, axit hữu cơ, dùng làm thuốc trừ sâu hay chiết xuất dầu thực vật từ hạt Ngoài ra với khả năng dễ tái sinh và chấp nhận gen ngoại lai thuốc lá còn được xem là cây mô hình quan trọng trong nghiên cứu công nghệ sinh học cây trồng

Tuy nhiên, với những đặc điểm sinh học của mình, thuốc lá là cây trồng mẫn cảm với nhiều bệnh hại, đặc biệt là các bệnh do virus gây nên, ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và chất lượng cây thuốc lá Trong đó có bệnh xoăn

lá do virus xoăn lá thuốc lá (Tobacco leaf curl virus, TLCV) gây nên Khi cây

mắc bệnh virus, thiệt hại về năng suất có thể lên tới 95-100% Cho đến nay chưa có một loại thuốc bảo vệ thực vật nào có khả năng chống lại bệnh do virus gây ra trên cây trồng Con người chỉ có thể hạn chế tác hại của virus và kiểm soát nó ở mức độ nhất định

Ở Việt Nam, cây thuốc lá đang được trồng phổ biến ở các tỉnh miền núi và trung du phía Bắc, các tỉnh Nam Trung Bộ, Tây Nguyên và miền Đông Nam Bộ

và được đánh giá là một trong những cây công nghiệp ngắn ngày, đem lại hiệu quả kinh tế cao cho nông dân và thu nhập quốc gia Song bệnh hại (đặc biệt là bệnh do virus) cũng đang đe dọa nghiêm trọng đến năng suất và phẩm chất cây thuốc lá Nghiên cứu hiểu rõ vật liệu di truyền của virus tác nhân gây bệnh trên cây thuốc lá là vấn đề rất cần thiết, kết quả này sẽ có định hướng trong phòng chống đúng loại virus bằng việc tạo cây trồng chuyển gen kháng bệnh

Hiện nay, với những tiến bộ trong lĩnh vực sinh học, người ta đã tạo ra được một số loại cây trồng kháng được bệnh do virus gây ra thông qua biện pháp tạo cây trồng chuyển gen mang các gen hoặc đoạn gen có nguồn gốc từ chính virus gây bệnh [15] Cho tới những năm cuối thế kỷ 20, cấu trúc dạng kẹp tóc (ihpRNA) hay kỹ thuật RNAi được xem là một kỹ thuật hiện đại và hữu hiệu nhất trong việc chống lại các bệnh do virus gây ra ở thực vật

Vì vậy, giải trình tự toàn bộ genome của TLCV cho từng vùng khác nhau

là cần thiết Genome của nhiều chủng TLCV đƣợc phân lập từ các vùng khác nhau trên thế giới nhƣ Hawaii, Mexico, Brazil, Thái Lan, Đài Loan, đã đƣợc công bố chi tiết Tuy nhiên thông tin về toàn bộ trình tự genome TLCV gây bệnh trên cây thuốc lá ở Việt Nam chƣa nhiều, mà chủ yếu tập trung trên các loài cây cà chua, ớt [20]

Xuất phát từ những cơ sở trên tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu giải mã trình tự hệ genome của chủng virus xoăn lá thuốc lá (TLCV) phân lập tại Việt Nam”

Mục tiêu nghiên cứu

- Xác định trình tự toàn bộ genome của virus xoăn lá thuốc lá (TLCV)

Nội dung nghiên cứu

- Tách chiết DNA tổng số của TLCV

- Thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu

- Tách dòng gen

- Đọc trình tự gen và phân tích trình tự

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 VIRUS THỰC VẬT

1.1.1 Các bệnh do virus thực vật gây ra hiện nay

Cho tới nay, hơn 2000 virus đã được phát hiện và công nhận, trong đó

khoảng 1000 là các virus gây hại thực vật Các virus thực vật nhìn chung không

làm chết cây nhưng chúng ảnh hưởng nghiêm trọng đến sinh trưởng, phát triển

của cây, năng suất và chất lượng nông phẩm Nhiều trường hợp, bệnh do virus

gây có thể là một trong các nguyên nhân chính cản trở sản xuất của một cây

trồng nào đó Ở cây lâu năm, một số virus sau khi gây bệnh nặng trong mùa khi

có thời tiết và nhiệt độ ôn hòa, nhưng khi nhiệt độ thấp hay quá cao thường gây

nên hiện tượng mất triệu chứng (latent period) làm cho người sản xuất bị nhầm

lẫn, không phát hiện được cây bị bệnh và mức nguy hiểm của bệnh, chỉ đến lúc

nào đó cây không còn khả năng phục hồi theo chu kỳ bệnh nữa, hoàn toàn tàn

lụi, khi đó mới biết thì đã quá muộn.Virus cũng có thể gây nên những thiệt hại

nặng nề và nhanh chóng ngay trong vụ trồng của các cây thường năm như Rice

grassy stunt virus gây bệnh lùn lúa cỏ, Rice tungro spherical virus và Rice

tungro bacilliform virus gây bệnh tungro (hại lúa), Tomato yellow leaf curl

virus gây bệnh xoăn vàng lá (hại cà chua) [44] Các virus hại khoai mì đã từng

hủy diệt hàng chục vạn hecta ở châu Á và châu Phi [43] trong một thời gian

ngắn chưa tới 30 ngày từ một cánh đồng xanh tươi trở thành vàng úa, chết lụi

Thiệt hại quan trọng thứ hai của virus là ảnh hưởng của bệnh tới phẩm

chất của các sản phẩm nông nghiệp Hạt lúa bị bệnh virus thường bị lép không

cho thu hoạch, trong trường hợp được thu hoạch hạt thường rất nhỏ và hạt gạo bị

đen, khi ăn có vị đắng Khoai tây bị virus gây hại làm cho cây cằn cỗi, lá khảm

loang lổ, củ khoai nhỏ, hàm lượng tinh bột và các chất dinh dưỡng đều thấp Có

trường hợp bệnh do một chủng đặc biệt của virus làm vỏ quả, củ có vết loét, bẩn

giảm giá trị thương phẩm, như khi khoai tây bị nhiễm một chủng Potato virus Y

[7] Ở cà chua bị xoăn lá, quả bé, múi khô và hoa rụng, năng suất và phẩm chất

đều rất thấp

Comment [SCD1]: VIRUS

Citrus tristeza virus [41] hại cam quýt rất nặng tại vùng bờ biển Địa

Trung Hải, Trung Mỹ và Đông Nam Á Bệnh làm cho quả cam chín ép và rụng sớm, quả còn non đã úa vàng vỏ, nước cam nhạt không mùi vị

Bệnh virus còn nguy hiểm do virus ký sinh bắt buộc trong tế bào cây ký chủ Vì vậy khi tế bào bị hủy hoại, chết, virus mới bị mất hoạt tính Khi tế bào non phát triển mạnh, virus cũng phát triển mạnh, tạo ra những triệu chứng rất điển hình trên cây non hay bộ phận non của một cây Chính vì vậy khi nhân giống vô tính trong phòng thí nghiệm, virus có khả năng lây lan rất lớn trong việc phát triển công nghệ sinh học và các vùng trồng trọt công nghệ cao

Cho tới nay, 52 virus thực vật thuộc 52 loài đã được xác định ở Việt Nam (Bảng 1.1), phần lớn đã được giải trình tự Trong số này, đa số là các virus

thuộc 2 chi Begomovirus (22 virus) và Potyvirus (18 virus) Đây cũng là 2

chi virus thực vật lớn nhất với mỗi chi chiếm khoảng 20 % tổng số virus thực vật toàn thế giới Ngoài ra, nhiều virus có ý nghĩa kinh tế, chẳng hạn các virus gây bệnh trên lúa như bệnh lùn xoắn lá (Rice ragged stunt virus, RRSV), bệnh lúa cỏ hay còn gọi là bệnh vàng lùn (Rice grassy stunt virus), bệnh lúa lùn sọc đen (Southern rice black streaked dwarf virus, SRBSDV) cũng mới được xác định chính xác [20]

Bảng 1.1: Một số bệnh virus hại cây trồng quan trọng trên thế giới và đã

được xác định có ở Việt Nam STT Tên bệnh

1 Bệnh xoăn vàng lá cà chua do nhiều begomovirus

2 Bệnh chùn ngọn chuối do banana bunchytop virus (BBTV)

3 Bệnh đốm hình nhẫn đu đủ, bầu bí do papaya ring spot virus (PRSV)

4 Bệnh tàn lụi cây có múi do citrus tristeza virus (CTV)

5 Bệnh khảm lá khoai tây trên khoai tây do potato virus Y (PVY)

6 Bệnh khảm lá cây họ đậu do bean common mosaic virus virus (BCMV)

7 Bệnh tungro hại lúa như bệnh tungro do phức hợp 2 virus là rice tungro bacilliform virus (RTHN) và rice tungro spherical virus (RTSV)

8 Bệnh vàng lùn (lúa cỏ) hại lúa do rice grasy stunt virus (RGSV)

9 Bệnh lùn xoắn lá (táp lá) hại lúa do rice ragged stunt virus (RGSV)

10 Bệnh lùn sọc đen hại lúa, ngô do southern rice black streaked dwarf virus

(SRBSDV)

11 Bệnh vàng lụi (vàng tạm thời, vàng lá di động) trên lúa do rice yellow

stunt virus (RYSV)

1.1.2 Cách phòng chống bệnh do virus thực vật gây ra

Có nhiều biện pháp phòng trừ bệnh virus hại thực vật đã được áp dụng

như loại bỏ nguồn bệnh, tiêu diệt côn trùng môi giới, diệt cỏ dại, luân canh cây

trồng, dùng giống sạch bệnh hoặc giống chống bệnh, chịu bệnh Dựa vào đặc

điểm của từng loài virus gây hại, đặc tính của cây trồng người ta đã đề ra những

biện pháp phòng trừ cho từng nhóm bệnh theo khả năng truyền lan và sự tồn tại

của nguồn bệnh

*Sử dụng giống cây trồng có khả năng kháng bệnh virus

Phương pháp này đem lại hiệu quả

tạo được cây sạch bệnh Tuy nhiên biện pháp

Phương pháp này áp dụng đối với các virus truyền qua vật liệu giống (hạt

giống, các cây nhân giống vô tính) Vật liệu giống sạch bệnh có thể được tạo ra

bằng một số cách như: Chọn giống từ nguồn sạch (ruộng không bị bệnh, khu

vực không bị bệnh), xử lý nhiệt, xử lý hóa chất để tiêu diệt virus tồn tại trên vỏ

hạt, nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tạo giống in vitro, sử dụng hóa chất (ribavirin) để

tiêu diệt virus trong nuôi cấy mô

*Biện pháp canh tác

Comment [SCD2]: in vitro

Tuy nhiên, nhiều loại virus như TMV lây truyền qua đường cơ giới, virus lây lan trực

: chỉ cần 1 con rầy nâu/cây lúa đã có thể truyền virus lùn lúa cỏ (RGSV)

*Sử dụng giống kháng bệnh mang gen kháng của cây

Quan hệ gen-đối-gen: đối với mỗi gen qui định tính kháng trong cây ký chủ có một gen tương ứng qui định tính không độc trong ký sinh và 2 gen này tương tác đặc hiệu với nhau Quan hệ gen-đối-gen cho tới nay đã được chứng minh là tồn tại trong rất nhiều loại bệnh do hầu hết các nhóm tác nhân gây bệnh (nấm, vi khuẩn, virus, tuyến trùng, mollicus ) gây ra Các gen cây ký chủ qui định tính kháng được gọi chung là gen R (Resistance) Các gen ký sinh qui định tính không độc của ký sinh được gọi chung là gen Avr (Avirulence) Tính kháng của cây trồng tuân theo quan hệ gen-đối-gen được gọi là tính kháng gen-đối-gen Tính kháng gen-đối-gen thường là tính kháng đặc hiệu ký chủ, tính kháng đơn gen, tính kháng gen chủ, tính kháng không bền vững Hậu quả của một phản ứng kháng gen-đối-gen thường là phản ứng siêu nhạy/apoptosis

Cho tới nay, rất nhiều gen kháng R của cây đã được xác định Sản phẩm của các gen này gọi là các protein kháng R Hiện nay, các protein kháng R được chia thành 5 lớp dựa trên đặc điểm cấu trúc và vị trí hoạt động của chúng trong

tế bào ký Các protein trong cùng lớp nhìn chung khá bảo thủ Các protein kháng

R của cây chống virus phần lớn thuộc 2 lớp CNL và TNL Đây là 2 lớp chiếm số lượng lớn nhất trong tất cả các loại protein kháng R của thực vật Cả 2 lớp CNL

và TNL còn được xếp vào chung một họ protein kháng gọi là họ NB-LRR Số lượng gen kháng của họ này đươc xem là chiếm số lượng lớn nhất trong các họ protein

*Sử dụng giống kháng bệnh dùng gen virus

Gen qui định tính kháng là gen virus Tính kháng này được gọi là tính kháng từ tác nhân gây bệnh, (Pathogen Derived Resistance, PDR) Tính kháng PDR được chia làm 2 nhóm: (i) Tính kháng thông qua protein (của virus); (ii) Tính kháng thông qua RNA (của virus)

(i) Tính kháng thông qua protein: Trong những năm 1980 - 1990, nhiều nghiên cứu chuyển gen virus vào cây đã được thực hiện Các gen virus có thể khác nhau như gen CP, gen replicase, gen vận chuyển MP, gen thể vùi NIa/b của potyvirus , tuy nhiên phần lớn là gen CP Đặc điểm nhóm này là tính kháng hình thành khi gen chuyển được biểu hiện thành protein trong cây chuyển gen Hai ví dụ điển hình là cây thuốc lá chuyển gen CP của TMV kháng được virus TMV [33] và cây đu đủ chuyển gen CP của PRSV kháng được virus PRSV

(Golsalves et al., 2004)

(ii) Tính kháng thông qua RNA: tính kháng của virus thông qua RNA đã được chứng minh là do cơ chế câm gen (RNA silencing) hay là cơ chế kiểm soát RNA (RNA interference) của các sinh vật nhân chuẩn [15] Việc phát hiện ra cơ chế RNAi là cơ sở quan trọng cho kỹ thuật RNAi trong tạo giống cây trồng kháng bệnh virus

1.1.3 Cấu trúc của virus thực vật

Virus hại thực vật là những nucleoprotein rất bé nhỏ Những virus dạng

cầu nhóm Luteovirus kích thước chỉ từ 23-24 nm Những virus dạng cầu nhóm

Ilarvirus có kích thước biến động từ 26-35 nm Hơn mười nhóm virus khác cũng

có kích thước biến động trong khoảng 30-34 nm Virus lớn nhất dạng cầu là

Tomato spotted wilt virus cũng chỉ có đường kính 80 nm Nhóm Rhabdoviridae

là virus dạng vi khuẩn to nhất (135-380 x 45-96 nm) Virus dài nhất là các virus

dạng sợi nhóm Closterovirus dài 2000 x 12 nm Chúng nhỏ bé như vậy nên việc

tìm kiếm phát hiện đòi hỏi phải có những phương pháp đặc biệt

Virus có cấu tạo rất đơn giản, chúng có 2 thành phần chính là protein và nucleic acid Lõi nucleic acid ở bên trong được bao bằng một lớp vỏ protein (capsid) Hầu hết virus thực vật có genome RNA sợi đơn mạch (+) và nhiều dạng có capsid hình que, các protein capsomer hình xoắn Ví dụ: Tobacco mosaic virus (TMV) Genome TMV là RNA sợi đơn Genome của chúng mã hoá

ít nhất 4 chuỗi polypeptid Protein 130 và 180 kDa được dịch mã trực tiếp từ

cùng một codon bắt đầu trên RNA bộ gene Hai protein khác, 30 kDa và protein

vỏ được dịch mã từ đoạn RNA Protein 130 và 180 kDa liên quan với sao chép

virus, trong khi đó protein 30 kDa cần cho sự di chuyển của virus từ tế bào này

đến tế bào khác Vì vậy 3 loại protein này cần cho sự nhân lên của virus trong

toàn bộ cây Các virus DNA Virus thực vật có bộ gene DNA rất hiếm, chỉ gồm 2

nhóm: tuy nhiên 2 nhóm virus thực vật được nghiên cứu nhiều nhất có chứa

genome DNA: Cauliflower mosaic virus (CaMV) và gemini virus

Cauliflower mosaic virus: CaMV được nghiên cứu nhiều nhất trong nhóm

Caulimovirus Đây là nhóm virus dạng cầu, chứa genome DNA vòng tròn, mạch

kép, kích thước khoảng 8 kb Caulimovirus gây ra một số bệnh làm thiệt hại

kinh tế cấy trồng Chúng có phổ vật chủ hạn chế, chỉ nhiễm cây 2 lá mầm.DNA

của CaMV có cấu trúc không bình thường, có 3 điểm gián đoạn trên sợi kép, hai

điểm trên một sợi và một điểm trên sợi còn lại với những vùng trình tự overlap

Ngoài ra DNA CaMV có ribonucleotide gắn với đầu cuối 5’ của điểm gián đoạn

Từ các nghiên cứu ở CaMV [22], [30] cho rằng sao chép CaMV liên quan với

phiên mã ngược qua trung gian RNA của bộ gene Chu trình sao chép giống với

retrovirus và hepatitis B virus

Gemini virus: Gemini virus là nhóm virus có phổ xâm nhiễm rộng, cả cây

một lá mầm và 2 lá mầm.Virus sọc vằn lá ngô (Maize streak virus, MSV) là một

gemini virus lây nhiễm qua lá, được truyền do côn trùng Bộ gene của

geminivirus chứa phân tử DNA vòng tròn sợi đơn Sao chép DNA virus được

nghĩ là xảy ra nhờ trung gian DNA và genome của virus sao chép cho nhiều bản

sao trong nhân của những tế bào tăng sinh nhanh Virus gây ra sự ức chế sinh

trưởng và lá có sọc vàng của những cây ngô bị nhiễm

1.2 MỘT SỐ VIRUS GÂY BỆNH TRÊN CÂY THUỐC LÁ

1.2.1 Virus gây bệnh khảm thuốc lá (Tobacco mosaic virus, TMV)

TMV thuộc loại Tobamovirus là một trong những virus gây hại trên thực

vật được mô tả sớm nhất bởi Mayer (1886) Tuy nhiên, bản chất bất thường của

tác nhân gây bệnh vẫn không được nhận biết mãi đến những nghiên cứu của

Beijerinck (1898), TMV là virus đầu tiên được nhận biết Từ đó, đã có nhiều

khám phá quan trọng về TMV, tác động tích cực đến sự phát triển của nghành

virus học TMV phân bố rộng khắp thế giới và gây bệnh cho ít nhất 199 loài của

Comment [SCD3]: kDa Comment [SCD4]: kDa Comment [SCD5]: kDa

Comment [SCD6]: virus

Comment [SCD7]: Maize streak virus, MSV

Comment [SCD8]: Virus Comment [SCD9]: Tobacco mosaic virus

30 họ thực vật [37] TMV tấn công vào những cây có tầm quan trọng về kinh tế

như: cà chua, thuốc lá, ớt, cà tím gây thiệt hại nghiêm trọng TMV là virus

đơn dương (ssRNa) có hình cuộn xoắn, dạng que hoàn chỉnh của TMV có 2130

đơn vị capsid (capsomeres), cứ 16 capsomeres tạo thành một vòng xoắn Mỗi

capsomeres có 158 amino acid và có trọng lượng 1800 Daltons Virion có

chiều dài 300 mm và đường kính là 18mm Các tiểu đơn vị protein liên kết

chặt chẽ tạo thành cấu trúc dạng xoắn (độ khoảng 2,3 nm hay 16 + 1/3 tiểu đơn

vị/vòng) xung quanh một ống trụ có bán kính khoảng 2nm Một sợi đơn RNA

dài 6395 nucleotide, có cấu trúc xoắn tương tự (49 nucleotide/vòng hay 3

nucleotide/tiểu đơn vị) có bán kính khoản 4nm, và liên kết với bề mặt trong của

tiểu đơn vị protein Virus có thể phân tách thành acid nucleic và vỏ protein và

cũng có thể hợp nhất lại thành dạng virus gây bệnh bền vững

TMV có thể gây bệnh trên rất nhiều loại cây trồng và cây dại khác nhau

nhưng nhiều nhất là trên cây thuốc lá Đây là bệnh rất phổ biến trên cây thuốc lá,

gây hại nghiêm trọng đến năng suất và chất lượng của lá thuốc, nhất là đối với

thuốc lá sợi vàng Bệnh còn có tên là bệnh hoa lá vàng Bệnh có thể tấn công

cây con, cây trưởng thành và cả cây đời tái sinh Bệnh nặng và phân bố rộng ở

nhiều nơi và vào bất kỳ mùa vụ nào trong năm Bệnh xuất hiện càng sớm thì

càng ảnh hưởng đến năng suất Tuy nhiên, phẩm chất của lá thuốc thường bị tác

hại nghiêm trọng hơn so với tác hại về năng suất: lá thuốc bị bệnh, sau khi sấy,

lá sẽ bị nâu đen, dòn, dễ bị nát vụn ra, không có mùi vị thơm ngon và hút nặng

Khi cây bị bệnh các lá non đều biến màu thành dạng khảm bao gồm các

vùng xanh nhạt xanh đậm không đều xen lẫm nhau, hình loang lổ như da ếch,

hay còn gọi là dạng khảm TMV được lan truyền bằng đường cơ giới do tiếp xúc

virus thâm nhập vào các tế bào qua vết thương và qua khí khổng lá, thân hoặc

rễ TMV rất bền như ở dạng kết tủa cồn, ở lá khô virus vẫn còn hoạt tính gây

bệnh sau một năm

1.2.2 Virus gây bệnh khảm dưa chuột (Cucumber mosaic virus, CMV)

CMV thuộc loại Cucumovirus, họ Bromoviridae được Price phát hiện lần

đầu tiên vào năm 1934 ở Mỹ Loài virus này phân bố khắp nơi trên thế giới, phổ

biến ở vùng có khí hậu ôn hòa CMV là loại virus thực vật có phổ gây bệnh rộng

nhất với số loại cây có thể bị lây nhiễm lên đến 1000 loài [18], [29] bao gồm 85

Comment [SCD10]: Cucumber mosaic virus,

CMV

họ thực vật CMV có khả năng thích ứng cao, biến đổi hệ gen rất nhanh nên nó trở thành mối đe dọa cho nông nghiệp thế giới Quan sát dưới kính hiển vi điện

tử CMV có dạng hình cầu, đường kính 28-30nm, trọng lượng phân tử từ 6,7.106 Da Virion của CMV không có vỏ, có nhiều loại virion nhưng kích thước tương đối giống nhau Genome của CMV bao gồm 3 sợi RNA đơn dương (RNA1, RNA2 và RNA3) chứa 5 khung đọc mở (ORF): ORF 1a và 2a nằm trên RNA 1 và 2, tách biệt và là những thành phần của enzym sao chép replicase; ORF 2b là một gen gối lên ORF 2a, nằm trên subgenome RNA4A và mã hóa một suppressor của quá trình câm gen sau phiên mã [9] ORF 3a và CP nằm trên RNA3, trong đó ORF 3a mã hóa cho protein 3a-protein di chuyển của virus (MP) còn ORF CP mã hóa cho protein vỏ (CP); CP được biểu hiện từ subgenome RNA4 [29] Trong ba RNA của CMV, RNA3 xảy ra sự tái tổ hợp thường xuyên hơn RNA1 và RNA2 Vì vậy có rất nhiều nghiên cứu dựa trên RNA3 để đánh giá bảng đa dạng di truyền và xây dựng cây phát sinh của chủng CMV Đầu tận cùng 3’ của 4 loại RNA 1-4 có trình tự tương tự nhau và chia sẻ một cấu trúc bậc hai giống như tRNA Virus có thể chứa nhứng phân tử RNA vệ tinh sợi đơn, nhỏ (332-405 nucleotide), nó cần thiết cho sự sao chép của CMV, phụ thuộc vào CMV để có hoạt tính sinh học Đến nay xác định được trình tự nucleotide của hơn 40 RNA vệ tinh

5,0-Khi cây bị bệnh có biểu hiện các lá non ngả màu vàng nhạt, lá nhỏ lại, các ngọn bị chùn lại, không phát triển được Trên các mặt lá có biểu hiện các vết khảm loang lổ, màu sắc chỗ đậm, chỗ nhạt Ngoài ra còn có những biểu hiện khác như: Phiến lá nhăn nheo, lồi lõm, do các gân lá bị kìm hãm sinh trưởng trong khi thịt lá vẫn phát triển, kích thước lá bị thu nhỏ lại Bệnh nặng thì cây cằn cỗi, chết dần từ ngọn xuống

1.2.3 Virus gây bệnh héo đốm cà chua (Tomato Spotted Wilt Virus, TSWV)

TSWV là virus thuộc loại Tospovirus họ Bunyaviridae, được phát hiện lần

đầu tiên vào năm 1915 khi gây thiệt hại lớn trên cà chua trồng ở Australia TSWV có phổ ký chủ rất rộng, trên 600 loài và 70 họ thực vật, trải dài trên khắp

các lục địa Trong số đó, cỏ dại là nguồn chứa TSWV chính [2] Tospovirus

được đánh giá là một trong mười nhóm virus gây bệnh cây nghiêm trọng nhất Virus thuộc họ này có vật liệu di truyền là ssRNA Genome của TSWV gồm ba

phần: Một sợi RNA âm tính và hai sợi ambisene Ba sợi RNA này khác nhau về kích thước và được gọi là Large (L), Middle (M), Short (S) Mỗi RNA được bao bọc bởi nhiều bản copy của 1 tiểu đơn vị Nucleocapside (N) và 10 – 20 bản sao của protein lớn (L) là polymerase của virus [5] Giữa các đoạn L, M, S có trình

tự kết thúc như nhau TSWV hình cầu, đường kính 80 – 110 nm TSWV được truyền từ cây này sang cây khác thông qua nhiều loài bọ trĩ khác nhau

Cây nhiễm TSWV có triệu chứng chung là xuất hiện các vòng tròn đồng tâm, những đốm héo trên lá non do sự hoại tử của các mô, có đốm lấm chấm Đầu tiên những đốm này có màu vàng, nhưng sau đó những vùng bị chết

sẽ chuyển sang màu nâu đỏ Từ cây con đến cây trưởng thành đều có thể bị TSWV tấn công Khi bị nhiễm virus, cây trồng bị cằn cỗi, còi cọc, chồi phát triển nghiêng về một bên (ne ngọn) Hình thái của cây thay đổi: Lá cây nhăn nheo, vặn vẹo, như bóp nát, thân cây bị uốn cong, ngã, rủ xuống, phát triển bất thường Cây bị bệnh không phát triển trong nhiều tuần, lá rụng dần và chết Cây trồng bị nhiễm bệnh vào giai đoạn đang phát triển thì có thể không ra quả hoặc

có quả nhưng rất nhỏ, có các đốm nhỏ hay các vòng hoại tử hay thể khảm trên

vỏ quả Đặc điểm này làm giảm đi giá trị cảm quan khi sử dụng hay dùng thương phẩm Tuy nhiên, triệu chứng này có thể giống với các bệnh do các virus khác, vi khuẩn, nấm hay stress môi trường gây ra Vì thế cách chẩn đoán bệnh theo triệu chứng bên ngoài chỉ là cách xác định bệnh nhất thời nên có thể không chính xác Bên cạnh một số virus kể trên còn rất nhiều loài virus khác gây bệnh trên cây thuốc lá và gây thiệt hại đáng kể thể hiện ở bảng dưới đây

Bảng 1.2: Một số bệnh trên cây thuốc lá do virus gây ra

1 Khảm linh lăng Alfalfa mosaic virus (virus khảm linh lăng)

2 Quăn ngọn cúc tần Beet curty top virus (virus gây bệnh quăn ngọn cúc tần)

3 Ngọn cây bụi Tái tổ hợp Tobacco vein distorting virus (virus gây biến nạp gân

thuốc lá) và tobacco bushy top virus (virus ngọn cây bụi thuốc lá)

4 Khảm cà chua Cucumber mosaic virus (virus gây bệnh khảm dưa chuột)

5 Vàng hoại tử rau diếp Vàng hoại tử rau diếp (trong Nicotiana glutinosa)

6 Còi cọc cây lạc Peanut stunt virus

7 Bệnh hình hoa hồng Tái tổ hợp Tobacco vein distorting virus (virus gây bệnh biến

dạng gân lá thuốc lá) và tobacco mottle virus (virus gây đốm thuốc lá)

8 Kỵ axit thuốc lá Tobacco etch virus (virus gây bệnh kỵ axit thuốc lá)

9 Xoăn thuốc lá Tobacco leaf curl virus (virus gây xoăn thuốc lá)

10 Khảm thuốc lá Tobacco mosaic virus (virus gây bệnh khảm thuốc lá) và Satellite

tobacco mosaic virus (virus gây bệnh khảm thuốc lá vệ tinh)

11 Hoại tử thuốc lá Tobacco necrosis virus (virus gây hoại tử thuốc lá)

12 Bung hạt thuốc lá Tobacco rattele virus (virus gây bung hạt thuốc lá)

13 Đốm vòng thuốc lá Tobacco ring spot virus (virus gây bệnh đốm vòng thuốc lá)

14 Sọc thuốc lá Tobacco streak virus (virus gây bệnh sọc thuốc lá)

15 Còi cọc thuốc lá Tobacco stunt virus (virus gây bệnh còi cọc thuốc lá)

16 Vằn gân thuốc lá Tobacco vein mottling virus (virus gây bệnh vằn gân thuốc lá)

17 Héo đốm cà chua Tomato spotted wilt virus (virus gây bệnh héo đốm cà chua)

18 Viền gân lá Potato virus (virus Y khoai tây)

19 U vết thương Wound tumor virus (virus gây bệnh khối u vết thương)

(Nguồn: http://www.apsnet.org/online/comcom/names/tobacco.asp)

1.3 VIRUS XOĂN LÁ THUỐC LÁ (Tobacco leaf curl virus, TLCV)

1.3.1 Đặc điểm hình thái, cấu tạo và phân loại

Virus xoăn lá thuốc lá-Tobacco leaf curl virus (TLCV) là một trong

những virus gây bệnh trên các cây họ cà ở nhiều vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới trên thế giới Được Storey phát hiện đầu tiên vào năm 1931

TLCV thuộc chi Begomovirus, họ Geminiviridae Họ này gồm có 4 chi lớn đó là Begomovirus, Curtovirus, Mastrevirus và Topocovirus phân biệt nhau bởi cấu trúc genome, vector truyền bệnh và cây chủ ký sinh Geminiviridae là họ virus gây bệnh thực vật lớn thứ hai với khoảng trên 300 loài đã được xác định

Begomovirus là chi lớn nhất trong họ với khoảng 266 loài chủ yếu lây truyền

thông qua vector truyền bệnh là loài bọ phấn Bemisia tabaci [16] Người ta đã

phát hiện khoảng 18 loài gây bệnh xoăn lá và 11 loài gây bệnh xoăn vàng lá [23]

Hiện nay số loài mới phát hiện ngày càng nhiều có thể do sự tái tổ hợp lại giữa

các chủng virus

TLCV có dạng hình chày, kích thước khoảng 18 x 60nm Lớp protein vỏ

có trọng lượng khoảng 28-34 đvC, gồm hai capsom giống nhau, mỗi capsom

gồm 5 phân tử protein (Murphy et al., 1994) Khi soi dưới kính hiển vi thấy các

hạt virion thuần khiết luôn ở dạng cầu ghép đôi Mỗi hạt trong cặp chỉ chứa một

trong hai loại DNA có trình tự nucleotide khác nhau

Những loài Begomovirus phát hiện trước đây có hệ gen gồm các gen

trùm nằm trên cùng một vòng DNA-A sợi đơn kích thước khoảng 2,7 kb (thể

monopartite) Sau đó, người ta phát hiện nhiều chủng virus có hệ gen gồm 2

vòng DNA sợi đơn tách biệt với kích thước xấp xỉ nhau khoảng 2,6 - 2,8 kb là

DNA-A và DNA-B (thể bipartite) Gần đây, người ta còn phát hiện một số loài

thuộc nhóm một vòng gen ngoài vòng DNA-A còn có một hoặc hai vòng DNA

vệ tinh (DNAβ và DNA1) với kích thước xấp xỉ một nửa DNA-A có tác dụng

tăng cường biểu hiện triệu chứng bệnh trên cây chủ [8]; [11]; [20]

Dựa vào hệ thống phát sinh loài và sự sắp xếp các gen trong genome,

Begomovirrus được chia làm hai nhóm chính: (1) nhóm virus OldWorld (OW)

gồm những virus có nguồn gốc phát sinh từ các vùng Đông bán cầu, Châu Phi,

Châu Âu và một số khu vực thuộc Châu Á và (2) nhóm virus NewWorld (NW)

có nguồn gốc phát sinh ở Tây bán cầu và Châu Mỹ [28] Tất cả các virus thuộc

nhóm NW đều là thể bipartite trong khi cả hai thể monopartite và bipartite đều

xuất hiện trong nhóm OW Bên cạnh đó, DNA-A của các virus bipartite trong

nhóm NW đều thiếu khung đọc ORF của AV2 [40] Protein vỏ của chúng mang

một motif (vùng cấu trúc) có tên là PWRsMaGT ở đầu 5’ trong khi nhóm OW

thì không có Hầu hết các dẫn chứng về phát sinh chủng loại đều cho rằng các

virus NW phát sinh sau OW từ sau thời kỳ phân tách lục địa của Châu Mỹ từ

Gondwara [35] Tuy nhiên, gần đây các nhà khoa học đã phân lập một số chủng

virus thuộc khu vực OW nhưng có sự tương đồng chặt chẽ với virus NW Điều

này gợi ý rằng những virus NW có thể có mặt trong OW từ trước thời kỳ phân

tách lục địa [20]

Comment [SCD11]: Đơn vị Cacbon

1.3.2 Cấu trúc genome và chức năng của các protein

Hệ gen của Begomovirus gồm 6 gen chức năng (Hình 1.1) đó là các gen

CP (V1), preCP (V2), C1, C2, C3, C4 Các gen trong hệ gen của Begomovirus

có thể nằm trên cùng một vòng DNA-A hoặc hai vòng DNA-A và DNA-B riêng biệt ngăn cách với nhau bởi một vùng liên gen (IR-intergenic region) có độ dài khoảng 200 nucleotide Trên đó chứa điểm khởi đầu sao chép và vùng điều khiển cho sự tái bản vòng gen virus theo cả hai hướng Dạng trình tự điển hình nhất trong vùng IR là hai trình tự bảo thủ lặp lại đảo ngược của TAATATT/AC được định vị trên một cấu trúc vòng có liên quan tới việc tái bản sợi DNA mới

và một trình tự lặp cần thiết cho việc nhận biết và bám vào của protein Rep trong quá trình phiên mã [25]

(1) Gen CP mã hóa cho protein vỏ AV1 (coat protein - CP) có khối lượng

phân tử xấp xỉ 30 kDa cần thiết cho tạo vỏ ngoài virus, sự vận chuyển và nhận ra vector truyền nhiễm; Protein vỏ có chức năng liên kết và bao bọc sợi DNA đơn,

nó khoanh vùng nhân tế bào bị lây nhiễm và thường được kết hợp với hạch nhân [32] Trình tự cần thiết cho chức năng protein vỏ liên quan đến sự lây nhiễm của TLCV được xắp xếp ở phía dầu N Còn yếu tố quyết định cho việc tổ hợp tiểu đơn vị CP được định vị ở cả đầu N và C Bên cạnh đó, CP còn giữ vai trò đảm bảo hệ thống dịch chuyển của hạt virion thông qua hệ mạch của cây chủ, protein

vỏ virus có thể tương tác với protein GroEl của vector và giúp cho sự lây nhiễm hiệu quả nhờ vector truyền bệnh

(2) Gen C1 (rep) mã hóa protein tái bản AC1 (protein Rep) có trọng

lượng khoảng 40 kDa cần thiết cho quá trình sao chép DNA genome virus bằng

Hình 1.1 Cấu trúc genome của Begomovirrus có một vòng DNA (A) và cấu

trúc genome của TLCV có 2 vòng DNA (B)

việc nhận biết điểm khởi đầu origin được định vị trong vùng IR Rep là protein

đa chức năng vừa khởi đầu, kết thúc tổng hợp DNA virus, đồng thời gây ra sự tích lũy nhân tố phiên mã vật chủ trong tế bào lây nhiễm Những nghiên cứu ban

đầu trên Begomovirus cho thấy AC1 có 3 motif bảo thủ là motif I, II và III ở đầu

N của protein Rep là cần thiết cho hoạt động chức năng Motif I (FLTY) cần thiết cho quá trình bám dsDNA đặc hiệu trong khi motif II (HLH) là một vị trí bám sửa có thể liên quan với protein tương thích và phân cắt DNA [3] Motif III (YxKD/E) là một vị trí xúc tác cho phân cắt DNA Trong tái bản DNA virus, protein Rep liên kết đặc hiệu với dsDNA tại một trình tự bảo thủ trong cấu trúc vòng của sợi con mới và hoạt động như tác nhân mở xoắn DNA virus trong suốt quá trình tái bản sợi mới [24], [27] Bên cạnh hoạt động xúc tác, motif chức năng phía đầu N cũng gián tiếp liên kết với trình tự đặc hiệu của dsDNA và đảm bảo sự nhận dạng các thành phần genome cùng họ đến một Rep đã định

Trong quá trình hoạt động, protein Rep tương tác với các protein khác Sự hình thành các phân tử protein Rep cùng họ cần thiết cho sự liên kết với ssDNA

và hoạt động của helicase [27] Rep tương tác với protein AC3 trong việc tăng cường tích lũy DNA virus và tương tác với protein vỏ trong việc giảm hoạt động

phân tách và kết nối in vitro Bên cạnh đó, Rep liên kết với một vài protein tế

bào chủ liên quan đến biểu hiện gen bao gồm PCNA (proliferating cell nuclear antigen - Protein tích lũy phiên mã) [4], RPA (protein bám sợi đơn), histon H3

và một số protein liên quan đến phân bào

(3) Gen C2 mã hóa protein AC2 (protein hoạt hóa phiên mã - TrAP

protein) có trọng lượng khoảng 15 kDa AC2 chứa một trình tự cấu trúc định vị nhân (NLS-nuclear localization signal), một hạch trung tâm với vùng cấu trúc dạng ngón tay kẽm được cấu thành bởi chất lắng histidin và cystein, và một tiểu phần hoạt hóa có tính chất acid riêng biệt phía đầu C [38] AC2 hoạt động như một nhân tố phiên mã cần thiết trong quá trình biểu hiện hệ gen virus tạo sản phẩm phục vụ trong giai đoạn cuối của quá trình lây nhiễm

AC2 là một protein đa chức năng mà sự tương tác của nó với các protein khác có thể làm thay đổi hoạt động của một số protein hay phức hệ protein trong

tế bào chủ và tự làm ảnh hưởng đến hoạt động của nó AC2 điều khiển biểu hiện gen virus bằng cách làm tăng cường khả năng biểu hiện của protein vỏ và tương

tác với các protein gen nhân AC2 hỗ trợ tăng cường hoạt động phiên mã của các promoter chiều sense trên DNA-A và promoter của HN1, BC1 trong DNA-

B của Begomovirus bipartite AC2 không cần thiết cho quá trình tái bản DNA và

trong một số trường hợp nó thậm chí không cần thiết cho sự lây nhiễm ví dụ như trường hợp TYLCSV trong thuốc lá [44]

Gần đây, các nghiên cứu còn cho thấy protein AC2 có thể ức chế quá trình câm gen (silencing) Sự ức chế silencing của AC2 có thể xảy ra dưới hai hình thức là phụ thuộc phiên mã và không phụ thuộc phiên mã Trong cách thức thứ nhất, AC2 liên quan đến hoạt động gen của tế bào chủ (ví dụ như WEL-1)

và có thể hoạt động như gen nội sinh, ức chế điều chỉnh của silencing Trong cách thức này, cần thiết có sự liên kết giữa NLS và tiểu phần hoạt động dạng ngón tay kẽm với nhân tố hoạt hóa bám DNA (DNA-binding activities) [42] Cách thức thứ hai không cần thiết tiểu phần hoạt động, các yếu tố có thể liên quan với AC2 sẽ tương tác với một adeosin kinase không hoạt động như ADK (một enzyme chủ yếu định vị trong tế bào chất) Do ADK cần thiết cho sự tạo

sản phẩm của hoạt động chuyển dịch nhóm methyl trong S-adenosinmethionine

nên thiếu hụt ADK làm giảm hoạt động chuyển nhóm methyl nội bào Mà methyl hóa DNA hoàn toàn đến RNA đích hoặc promoter đích sẽ kết hợp với quá trình điều hòa biểu hiện sau phiên mã và điều hòa phiên mã Vì vậy, sự có mặt của AC2 hoạt động là đích của quá trình RNA silencing có vai trò hoạt hóa

quá trình phiên mã gen CP, preCP và điều khiển biểu hiện gen của cả virus và tế

bào vật chủ

(4) Gen C3 mã hóa protein AC3 khối lượng phân tử khoảng 16 kDa

(protein tăng cường tái bản - REn protein) có vai trò hoạt hóa quá trình tái bản

và cùng với gen C1 tăng cường khả năng phân chia hệ gen virus; Protein REn

không trực tiếp cần thiết cho sao chép DNA của virus, nhưng nó có tác dụng làm tăng tích lũy số lượng dsDNA và ssDNA của virus trong suốt quá trình lây nhiễm và do đó gián tiếp ảnh hưởng đến mức độ biểu hiện triệu chứng Protein REn hoạt động có thể tương tác với một số protein như Rep, PRB và với chính

nó Điều này có ý nghĩa cho sự tồn tại của một mạng lưới phức tạp của các mối tương tác chức năng giữa Rep, REn, và PRB Protein REn cũng tương tác với một số protein mã hóa của tế bào chủ là PCNA và pRBR

(5) Gen C4 được nằm trùm trong gen C1 trên vòng DNA-A nhưng khác

khung đọc mã hóa cho protein AC4 có khối lượng khoảng 12 kDa Trình tự

amino acid của nó có độ bảo thủ kém nhất trong các protein của Begomovirus

AC4 có chức năng điều khiển chu kỳ sống và tham gia vào vận chuyển virus

Những thí nghiệm trước đây với TGMV (Tomato golden mosaic virus) đã chỉ ra rằng C4 không cần thiết cho lây nhiễm virus [14] nhưng bằng các thí nghiệm đột biến với C4 của TYLCSV (Tomato yellow leaf curl sardina virus) và ToLCV đã

chứng tỏ chức năng sinh học thích hợp của nó như là một yếu tố lây nhiễm nhân tạo

(6) Gen V2 (preCP) mã hóa cho protein AV2 kích thước khoảng 13 kDa

(protein vận chuyển - MP protein) liên quan đến biến đổi hình thái virus và vận chuyển virus giữa các tế bào trong cây chủ Đột biến xảy ra trong gen này dẫn đến nhiễu loạn tỷ số ssDNA/dsDNA và ảnh hưởng đến biểu hiện bệnh trên cây

chủ [32] Những khám phá gần đây cho thấy trong các chủng Begomovirus

monopartite, ngoài DNA-A có thể có một hoặc hai vòng DNA sợi đơn với kích thước xấp xỉ một nửa DNA-A được gọi là

DNA vệ tinh (gồm DNA-β và DNA1)

DNA-β (Hình 1.2) được phát hiện lần đầu

tiên trong chủng virus gây bệnh xoăn lá

phân lập từ Astraulia vào năm 1997 với

kích thước khoảng 1350 nucleotide [13]

Trình tự vòng DNA-β khá bảo thủ Trên

đó bao gồm một vùng mã hóa cho protein

βC1 kích thước khoảng 14 kDa gồm 118

amino acid, một vùng rất giàu adenin

(A-rich) khoảng 240 nucleotide và một vùng

vệ tinh (SCR) khoảng 220 nucleotide có

trình tự rất bảo thủ ở hầu hết các DNA-β hiện biết Vùng SCR chứa cấu trúc vòng stem-loop mang đoạn trình tự khởi đầu tái bản TAAGTATT/AC giống như vùng liên gen (IR) của DNA-A [8]

Cơ chế phân tử liên quan đến chức năng phát sinh bệnh của vòng DNA-β

và protein βC1 trong virus vẫn chưa rõ ràng Tuy nhiên, DNA-β có tác dụng góp

Hình 1.2 Cấu trúc vòng DNA-β C1: vùng mã hóa protein βC1; A- rich: vùng giàu adenin; SCR: vùng vệ

tinh.

phần tăng cường biểu hiện triệu chứng bệnh trên cây chủ DNA- β có thể ảnh hưởng đến quá trình nhân bản virus bằng cách tạo sự thuận lợi cho việc mở rộng phạm vi hoặc bằng cách làm bất hoạt gen của cây chủ [36]

DNA1 (hay còn gọi là DNA α) cũng giống DNA-β có trình tự rất bảo thủ trong đó có chứa một đoạn gen mã hóa phức hợp protein tái bản có trọng lượng khoảng 36 kDa, một trình tự giàu adenin khoảng 200 nucleotide và một điểm khởi đầu tái bản nằm trên cấu trúc vòng sterm-loop chứa trình tự bảo thủ TAGTATT/AC giống như những nanovirus khác DNA1 có khả năng tự tái bản nhưng cần sự trợ giúp của virus cho quá trình biểu hiện và vận chuyển trong cây chủ DNA1 hiện

chưa xác định là có ảnh hưởng lên sự biểu hiện bệnh của cây chủ [8]

1.3.3 Triệu chứng và cơ chế lây bệnh

Ở cây bị bệnh sẽ phát triển chậm chạp, cây còi cọc và lùn thậm chí ngừng sinh trưởng Lá ngọn bị xoăn vào trong, méo mó biến dạng và thu nhỏ kích thước Lá ngoài thì cúp xuống và cứng, có hiện tượng lá bị biến dạng như gân lá trở nên dày, xoăn lại và các lá phía trên nhỏ cong queo (Hình 1.3) Do lá biến dạng các mạch dẫn bị tắc, phá vỡ sự vận chuyển tinh bột trong lá, hình thành các mạch dẫn mới xung quanh mô tượng tầng Sự phát triển vô tổ chức làm lá biến dạng sâu sắc mất đi sự khác biệt giữa mặt trên và mặt dưới của lá Hoa ít và thường bị thui, quả nếu có thường khô, chín không đều và chất lượng kém

Hình 1.3: Cây thuốc lá bị nhiễm bệnh xoăn lá

(Nguồn: http://www.forestryimages.org/browse/detail.cfm?imgnum=1402091)

Cơ chế lây bệnh:

Cũng giống như hầu hết các virus khác, Geminivirus không mã hóa cho

DNA polymerase vì vậy sự tái bản hệ gen chủ yếu nhờ bộ máy tế bào vật chủ và được thực hiện thông qua dsDNA trung gian Những virus xâm nhập vào các tế bào vật chủ đang trong pha G1 và ức chế hoạt động của những tế bào này sau đó

sẽ tái hoạt động quá trình tái bản phục vụ cho sự nhân lên của mình bằng cách đưa chu kỳ tế bào về pha S [21] Sự tái bản xảy ra trong nhân tế bào vật chủ theo kiểu vòng tròn xoay Đầu tiên DNA của virus đóng vòng thành dạng khởi đầu tái bản (RF - replicative form), sau đó RF làm khuôn tổng hợp nên sợi DNA

bổ sung dựa trên sợi DNA của virus dưới tác dụng của DNA-polymerase vật chủ [21] DNA sợi kép sau khi được tạo thành sẽ thực hiện 2 chức năng đồng thời là phiên mã để tổng hợp các protein thành phần virus và tổng hợp nên sợi DNA virus mới Sợi DNA mới được cắt ở vị trí có trình tự TAATATT/AC ở vùng liên gen Sau khi hoàn thành quá trình tái bản, các thành phần vỏ và DNA virus rời nhân ra tế bào chất, lắp ráp và hoàn thành chu kỳ tế bào Thể lây nhiễm virus sẽ lây lan sang tế bào bên cạnh thông qua hệ thống liên bào [17]

Geminivirus không lây truyền qua hạt, đất, hay bằng các va chạm cơ học Các virus này được lây nhiễm từ cây này sang cây khác nhờ loài bọ phấn

Bemisia tabaci (Hình 1.4) Đây là loài côn trùng nhỏ hút nhựa cây có mặt ở khắp

nơi trên thế giới, được phát hiện lần đầu tiên tại Australia năm 1889 trên cây thuốc lá và cho đến nay đã biết được khoảng hơn 1000 loài

Bọ phấn có chu kỳ sinh trưởng ngắn khoảng 18 - 28 ngày trong điều kiện thời tiết ấm áp và khoảng 30 - 48 ngày trong mùa đông Giai đoạn sinh trưởng của nó gồm: (1) trứng nở trong khoảng 7 đến 10 ngày; (2) giai đoạn bò kéo dài khoảng 3 - 4 ngày; (3) giai đoạn thiếu trùng kéo dài khoảng 6 - 12 ngày (trong giai đoạn này chúng thay lông 3 lần); (4) giai đoạn nhộng kéo dài 4 - 6 ngày và (5) con trưởng thành sống trong khoảng thời gian 9 - 16 ngày Con trưởng thành dài khoảng 1 mm màu trắng chúng hút nhựa bằng cách dùng miệng chích và hút Trong khi hút nhựa, chúng tiết ra dịch ngọt từ chỗ đó nấm đen phát triển rất nhanh làm đen lá và đen bề mặt quả Bọ phấn trưởng thành thường bay yếu tuy nhiên trong không khí, gió nó có thể di chuyển xa tới

2 km và làm lây lan bệnh rất nhanh [6]

Hình 1.4: Bọ phấn Bemisia tabaci

(Nguồn: http://ag.arizona.educropcottoninsectswfhorticultura0204.html

1.3.4 Một số nghiên cứu và ứng dụng hệ gen Begomovirus trong tạo cây

trồng chuyển gen kháng Begomovirus

Dựa vào phân tích phân tử, Việt Nam đã phát hiện được19 loài

begomovirus:

Loài đã được công bố: Squash leaf curl China virus (SLCCV) trên họ bầu

bí; Loofa yellow mosaic virus (LYMV) trên họ bầu bí (Revill et al.,2003);

Tomato yellow leaf curl VietNam virus (ToLCVV); Tomato yellow leaf curl

Kanchanaburi virus (TYLCKV) trên cây cà chua (Green et al., 2001); Papaya

leaf curl China virus (PaLCuCNV) trên cây thuốc lá; Lindernia anagallis yellow

vein virus (LaYVV) trên cây lữ đằng; Alternanthera yellow vein virus (AlYVV)

trên hoa dina, nhọ nồi; Sida leaf curl virus (SiLCV) trên cây cối xay; Ludwigia

yellow vein virus (LuYVV) trên cây rau mương

Loài chưa công bố: Corchorus golden mosaic virus (CoGMV) trên cây

rau đay; Kudzu mosaic virus (KuMV) trên cây sắn dây; Clerodendrum golden

mosaic virus (ClGMV) trên cây mò hoa trắng; Spilanthes yellow vein virus

(SpYVV) trên cây cúc nút áo; Mimosa yellow leaf curl virus (MiLVV) trên cây

trinh nữ móc; Sida yellow vein Vietnam virus (SiYVVNV) trên cây ké hoa

vàng; Tomato leaf curl Vietnam virus (TYLCVNV) trên cây cà chua; Erectites

yellow mosaic virus (ErYMV) trên cây rau tàu bay; Ludwigia yellow vein

Vietnam virus (LuYVVNV) trên cây rau mương [20]

Comment [SCD12]: Vietnam

Vấn đề nghiên cứu đa dạng thành phần các loài Begomovirus được thực

hiện trên nhiều quốc gia như Mỹ, Trung Quốc, Thái Lan Trên thế giới hiện

nay đã phát hiện được hơn 200 loài Begomovirus trên nhiều đối tượng vật chủ

khác nhau Và gây thiệt hại kinh tế đáng kể đối với một số cây trồng quan trọng như: cà chua, thuốc lá, đậu, bông

Ở Việt Nam Begomovirus gây thiệt hại chủ yếu các đối tượng như cà chua, thuốc lá Việc sử dụng các giống thuốc lá kháng Begomovirus là cách tiếp cận tốt nhất để giảm thiệt hại do Begomovirus Tuy nhiên, cho đến nay việc tạo

ra cây thuốc lá chuyển gen kháng TLCV còn hạn chế Mặt khác đã có rất nhiều

nghiên cứu về loài Begomovirus khác như TYLCV (Tomato yellow leaf curl

virus) - virus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua Giống cà chua kháng TYLCV đầu

tiên được tạo ra là kết quả của lai giống gen kháng TY20 có nguồn gốc từ L

peruvianum [31], [34] Ngoài ra, gen kháng TY-1 cũng đã được sử dụng thành

công để kháng lại Tomato yellow mosaic virus (ToYMV) và Tomato mottle

virus (ToMoV) [20]

Các nhà nghiên cứu [45] đã thành công khi sử dụng gen C4 của TYLCV trên đối tượng cây cà chua Một số nghiên cứu khác [1] đã đưa ra những bằng chứng thuyết phục về sự hiệu quả của cơ chế câm gen sau phiên mã (PTGS) trong việc kháng lại virus gây bệnh xoăn lá cà chua TYLCV

Tuy nhiên, những giống kháng thương mại tạo ra bằng lai giống bị hạn chế bởi trong kiểu gen thường mang những gen không mong muốn và quá trình đưa một gen kháng từ một giống hoang dại vào một giống thương mại thường rất mất thời gian và phức tạp do liên quan đến cơ chế di truyền của toàn bộ genome

Hiện nay, chuyển gen tạo cây kháng đang là giải pháp hiệu quả nhất Cây kháng được tạo ra bằng kỹ thuật di truyền có nhiều lợi thế hơn các cây kháng thu được từ lai giống các gen của bộ gen thực vật Trong thực tế, một số cây trồng chuyển gen kháng virus đã được phát triển bằng cách sử dụng một trình tự của genome virus trong thay đổi vật chất di truyền cây trồng Khái niệm này được gọi là tính kháng có nguồn gốc từ tác nhân gây bệnh (PDR) [5] Cho đến nay, sử dụng PDR trong việc nâng cao sức đề kháng của thuốc lá chống lại

TLCV cũng như các Begomovirus khác đã cho thấy đây là một phương pháp

triển vọng Để tạo cây trồng kháng với TLCV có thể tác động vào các đích sau: (1) tác động đến protein vỏ [39] (2) tạo cây kháng thông qua ức chế protein vận chuyển [26], (3) làm thay đổi DNA, (4) sử dụng các gene antisense [12] và (5)

sử dụng các gen chức năng đã bị cắt ngắn hoặc đột biến để chuyển vào cây trồng [44], [45] Trong thực tế, một số giống kháng đã được tạo ra bởi cách tiếp cận này đã cho thấy khả năng xây dựng tính kháng có thể trở thành nền tảng cho các

chương trình quản lý Begomovirus trên toàn thế giới

Số hóa bởi trung tâm học liệu

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1 Nguồn vật liệu

Nguồn thực vật: Các mẫu lá thuốc lá nghi nhiễm bệnh xoăn lá được thu từ

3 tỉnh Bắc Giang, Hà Nội và Lạng Sơn do phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện Công nghệ sinh học cung cấp

Bảng 2.1: Nguồn gốc các mẫu thuốc lá nghiên cứu

STT Tên tỉnh thu mẫu Kí hiệu mẫu

- Kit tinh sạch DNA (QIAquick Gel Extraction Kit-QIAGEN)

- Kit tách chiết plasmid

- Vector pBT (Viện Công nghệ sinh học)

2.1.3 Hóa chất, máy móc và thiết bị

- Hóa chất: Bacto pepton, Yeast extract, NaCl, Agarose, KCl, Tris HCl, EDTA…

Ethanol 70%, Nước khử ion Kháng sinh Carbenicillin Enzyme giới hạn

BamHI, Taq DNA polymerase của các hãng Fermentas, Invitrogen, Merck,

Sigma, Amersham …

- Máy móc và thiết bị: Máy PCR System 9700 (Appied Biosystem, Mỹ), máy điện di Powerpac300 (Bio-Rad, Mỹ), máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thuỵ Điển), máy Vortex (Mimishaker, IKA, Đức), máy hút chân không Speed-Vac 110A (Savant, Mỹ), máy ly tâm cùng với các trang thiết bị khác của Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật và Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ Sinh học

2.1.4 Địa điểm nghiên cứu

Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm

Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt – Cầu Giấy – Hà Nội

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Các bước tiến hành thí nghiệm được tóm tắt theo sơ đồ sau

Sơ đồ thí nghiệm

2.2.1 Tách chiết DNA tổng số

DNA tổng số của lá thuốc lá nhiễm bệnh được tách theo phương pháp của Accotto và cộng sự (2000)

- Nghiền 0,15 g lá nhiễm bệnh trong nitơ lỏng

- Bổ sung 500 μl đệm chiết, đảo đều Ủ hỗn hợp ở 65oC trong 5 phút

- Bổ sung 500 μl Kaliacetat 5M Ủ 0oC trong 10 phút Li tâm 13.000 v/p trong 5 phút

- Chuyển khoảng 500 μl dịch nổi sang eppendorf mới

Tách chiết DNA tổng số

Phân tích trình tự và đánh giá đa dạng

di truyền Chọn dòng và tách plasmid

Thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi

đặc hiệu

Tạo vector tái tổ hợp và biến nạp vào

E.coli DH5α

Đọc trình tự gen

Số hóa bởi trung tâm học liệu

- Bổ sung 500 μl Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1) Đảo đều hỗn hợp, li

tâm 13.000 v/p trong 15 phút Chuyển 350 μl pha trên sang eppendorf mới

- Bổ sung thêm 350 μl Isopropanol lạnh, đảo đều Li tâm 13.000 v/p trong

5 phút

- Rửa DNA bằng 500 μl ethanol 70%

- Để khô tủa và hòa tan trong dH2O (có bổ sung Rnase)

*Đệm chiết: 100mM Tris HCl, pH=8; 50mM EDTA; 500 mM NaCl; 1%

SDS; 10mM β-mercaptoethanol, hoặc axit citric 10mM

2.2.2 Phản ứng PCR

Cơ sở lý thuyết

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction - phản ứng chuỗi polymerase)

dựa trên nguyên tắc bắt cặp đặc hiệu của các đoạn DNA có trình tự bổ sung và

phản ứng kéo dài đoạn trình tự mồi nhờ enzyme Taq DNA polymerase để khuếch

đại theo hàm mũ các đoạn DNA mục tiêu lên hàng triệu lần

Hình 2.1: Mô hình minh họa vị trí các mồi trên genome TLCV

Bảng 2.2: Trình tự và thông số của hai mồi (Chu Hoàng Hà et al., 2006)

Tên mồi Trình tự mồi Tgm Mục đích Kích thước

(Nucleotide) prV324R 5'-GCCYATRTAYAGRAAGCCMAN-3' 530C Nhân đoạn

gen V1

~500 prC889N 5'-GGRTTDGARGCATGHGTACATN-3'

TYLCV-A-F 5'-GGAACATCAGGGCTTTTGTA-3' 540C Nhân đoạn

gen A

~2300 TYLCV-A-R 5'-CACACAGAGAATGCTCTGTT-3'

TYLCV-F2 5'-CTCACCTGCATGTCCTCATCN 520C Đọc trình tự

(Trong đó các ký hiệu Y, R, M, D, H, N thay thế cho các loại nucleotide: Y (C hoặc T), R (A

hoặc G), M (A hoặc C), D (G hoặc C hoặc A), H (A hoặc C hoặc T), N (A hoặc G hoặc C

hoặc T))

Comment [SCD13]: Isoamyl alcohol