Nghiên cứu đặc điểm sinh học một số chủng Baccillus thuringiensis sinh protein tinh thể diệt côn trung bộ cánh cứng

Phân loại gen mã hóa protein độc tố diệt côn trùng từ Bacillus thuringiensis .... Bản chất của sự đặc hiệu này là do các gen mã hóa protein tinh thể diệt côn trùng trong tế bào của vi kh

TR¦êNG §¹I HäC KHOA HäC

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi Các số liệu và kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong công trình nghiên cứu khác

Thái Nguyên, ngày 20 tháng 04 năm 2013

Tác giả

Phùng Huy Trọng

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và thực hiện luận văn, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ, hỗ trợ của thầy cô, bạn bè, đồng nghiệp và gia đình Tôi xin trân trọng cảm ơn tất cả những tình cảm quý báu đó

Trước tiên, tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Ngô Đình Bính, người thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành luận văn này

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn KS Đặng Văn Tiến cùng toàn thể cán

bộ phòng Di truyền vi sinh, viện Công nghệ sinh học, viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời thời gian dài thực tập

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh, các giảng viên cùng các thầy cô giáo trường Đại học Khoa học đã nhiệt tình giúp

đỡ tôi trong suốt thời thời gian học tập tại trường và hoàn thành tốt luận văn của mình

Cuối cùng tôi xin cảm ơn bạn bè và gia đình, những người đã luôn ủng

hộ tôi trong suốt thời gian qua!

Thái Nguyên, ngày 20 tháng 04 năm 2013

Phùng Huy Trọng

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

BẢNG NHỮNG TỪ VIẾT TẮT TRONG KHOÁ LUẬN v

MỞ ĐẦU 1

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Đại cương vê Bacillus thuringiensis 3

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng Bacillus thuringiensis 3

1.1.2 Vị trí phân loại, đặc điểm hình thái 5

1.1.3 Phân biệt Bt với các loài khác trong nhóm Bacillus cereus 6

1.1.4 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 7

1.1.5 Đặc điểm phân loại 8

1.1.6 Đặc điểm gen mã hóa protein độc tố diệt côn trùng 13

1.1.7 Phân loại gen mã hóa protein độc tố diệt côn trùng từ Bacillus thuringiensis 14

1.1.8 Các loại độc tố của Bacillus thuringiensis 15

1.1.9 Cơ chế tác động của protein tinh thể độc lên côn trùng 17

1.1.10 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình hình thành bào tử và tinh thể độc 19

1.2 Tổng quan về gen cry3, Protein Cry3 và dưới loài Bacillus thuringiensis tenebrionis 20

1.2.1 Một số đặc điểm về gen cry3 20

1.2.2 Đặc điểm sinh hóa và huyết thanh học của Bacillus thuringiensis subsp tenebrionis 21

1.3 Tổng quan về côn trùng bộ cánh cứng (Coleoptera) 22

1.4 Tách dòng gen 26

1.4.1 Khái niệm 26

1.4.2 Vectơ tách dòng 26

PHẦN II : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 28

2.1 Vật liệu 28

2.1.1 Sinh phẩm 28

2.1.2 Hoá chất và thiết bị 28

2.1.3 Môi trường 29

2.2 Phương pháp nghiên cứu 31

2.2.1 Phương pháp phân lập 31

2.2.2 Phương pháp phân loại Bt bằng phản ứng huyết thanh 31

2.2.3 Phương pháp thử hoạt tính sinh học 32

2.2.4 Phương pháp tách DNA plasmid từ vi khuẩn Bt 33

2.2.5 Phương pháp PCR để khuyếch đại gen cry3A 34

2.2.6 Phương pháp tách dòng gen cry3A 34

PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

3.1 Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis mang gen cry3A có hoạt tính diệt côn trùng bộ cánh cứng 38

3.1.1 Kết quả phân lập vi khuẩn Bacillus thuringiensis 38

3.1.2 Hình dạng tinh thể của các chủng Bacillus thuringiensis 39

3.2 Kết quả phân loại dưới loài bằng phương pháp huyết thanh 40

3.3 Hoạt tính diệt mọt thóc đỏ 41

3.3.1 Xác định nồng độ bào tử 41

3.3.2 Thử hoạt tính sinh học với mọt thóc đỏ trưởng thành của các chủng Bt phân lập 41

3.4 Sàng lọc gen cry3A ở các chủng Bt bằng phương pháp PCR 43

3.5 Kết quả tách dòng gen và đọc trình tự gen cry3A 44

3.5.1 Kết quả tách dòng gen cry3A 44

3.5.2 Xác định trình tự đoạn gen cry3A 47

PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

BẢNG NHỮNG TỪ VIẾT TẮT TRONG KHOÁ LUẬN

4 Bt.t Bacillus thuringiensis subsp tenebrionis

5 DNA Deoxyribonucleotide acid

7 EDTA Ethylene diamine tetra - acetic acid

8 LB Môi trường Lauria Betani

9 PCR Polymerase chain reaction

10 SDS Sodium dodecyl sulphate

12 TAE Tris - Acetate - EDTA

13 X- gal 5 - Bromo - 4 Cloro - 3 indolyl ß - d galactoside

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Sự phân loại Bacillus thuringiensis dựa vào kháng nguyên tiên mao

H 9

Bảng 1.2 Phân loại gen cry mã hóa các protein độc tố Cry diệt côn trùng 14

Bảng 1.3 Các điểm trình tự tham khảo của vectơ pGEM - T easy 27

Bảng 3.1 Kết quả phân lập Bacillus thuringiensis trong các mẫu đất 39

Bảng 3.2 Hình dạng tinh thể của các chủng Bt phân lập 40

Bảng 3.3 Kết quả thử hoạt tính diệt âú trùng và mọt thóc đỏ trưởng thành của các chủng Bt sau 5 ngày thử nghiệm 42

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Tế bào vi khuẩn Bacillus thuringiensis 5

Hình 1.2 Tinh thể của vi khuẩn Bacillus thuringiensis 6

Hình 1.3 Cơ chế diệt sâu của vi khuẩn Bacillus thuringiensis 18

Hình 1.4 Cấu trúc không gian của protein Cry3A 21

Hình 1.5 Một số hình ảnh về côn trùng bộ cánh cứng 22

Hình 1.6 Ấu trùng và mọt thóc đỏ trưởng thành 23

Hình 1.7 Chu kỳ sống và phát triển của mọt thóc đỏ (Tribolium castaneum) 25 Hình 1.8 Vectơ tách dòng pGEM - T easy 27

Hình 3.1 Hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus thuringiensis trên môi trường MPA phân lập từ đất Nha Trang nuôi cấy ở 280 C sau 3 ngày 38

Hình 3.2 Hình dạng tinh thể của các chủng Bt phân lập được khi nhuộm fushin và soi dưới kính hiển vi điện tử 39

Hình 3.3 Hình ảnh ngưng kết của chủng ĐNT 9.5 phân lập với type huyết thanh dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần 41

Hình 3.4 Hình ảnh thử hoạt tính diệt ấu trùng và mọt thóc đỏ trưởng thành của các chủng Bt phân lập………43

Hình 3.5 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% 43

Hình 3.6 Khuẩn lạc xanh, trắng xuất hiện trên môi trường LBA sau khi nuôi cấy qua đêm 44

Hình 3.7 Điện di sản phẩm cắt DNA plasmide tách chiết từ các dòng khuẩn lạc ĐNT 9.5 trên agarose 1% 46

Hình 3.8 Kết quả PCR DNA plasmid các dòng khuẩn lạc của chủng ĐNT 9.5 đã biến nạp băng mồi mồi đặc hiệu gen cry3A 47

Hình 3.9: So sánh trình tự đoạn gen cry3A của chủng ĐNT9.5 với mã 2 trình tự có mã số M37207.1 và EU 332160.1 49

MỞ ĐẦU

Côn trùng bộ cánh cứng (Coleoptera) là bộ được biết đến với số lượng loài lớn nhất và đã có trên 250.000 loài đã được mô tả Trong đó, rất nhiều loài

thuộc bộ cánh cứng là những côn trùng gây hại như: Anomala, Tenebrio

molitar… Chúng phá hoại mùa màng, nông sản, làm giảm chất lượng nông sản

phẩm, và đặc biệt là lương thực sau thu hoạch Bên cạnh đó có nhiều loài côn trùng thuộc bộ cánh cứng phá hại lâm sản làm thiệt hại rất lớn cho ngành công

nghiệp sản xuất gỗ: Anobiidae (họ mọt gỗ), Cerambycidae (họ xén tóc),

Bostrychidae (họ mọt dài)… Theo các báo cáo thống kê của nhiều nước trên

thế giới thì côn trùng thuộc bộ cánh cứng được xếp vào một trong những loài gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng nhất

Có rất nhiều biện pháp hoá học và sinh học được áp dụng để khắc phục tình trạng trên Tuy nhiên các biện pháp hoá học lại thường gây ra tính kháng thuốc trên côn trùng, đồng thời thuốc hoá học còn gây ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng, góp phần làm mất cân bằng sinh thái và ô nhiễm môi trường Vì vậy, tổ chức Nông lương thế giới (FAO), tổ chức Y tế thế giới (WHO) và tổ chức Môi trường thế giới đã khuyến cáo hạn chế đến mức tối đa việc sử dụng các hoá chất và tăng cường sử dụng thuốc trừ sâu sinh học Trong số các loại thuốc trừ sâu sinh học đã và đang được sử dụng thì loại thuốc có nguồn gốc từ

vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) là có hiệu quả diệt sâu cao nhất Hiện nay thuốc trừ sâu sinh học Bt chiếm hơn 90% thị phần thuốc trừ sâu sinh học trên

thế giới, và ngày càng được sử dụng một cách rộng rãi

Thuốc trừ sâu sinh học Bt có rất nhiều ưu điểm tuy nhiên nhược điểm vẫn chưa khắc phục được của chế phẩm Bt là có phổ tác dụng hẹp - chỉ đặc

hiệu với một vài loài côn trùng Bản chất của sự đặc hiệu này là do các gen mã hóa protein tinh thể diệt côn trùng trong tế bào của vi khuẩn quyết định Trong

số 70 nhóm gen cry đã được phát hiện thì gen cry3 là một trong số gen có thể

mã hóa protein tinh thể diệt côn trùng bộ cánh cứng, một loài côn trùng rất khó

tiêu diệt hiện nay Việc nghiên cứu sâu về gen này là hết sức cần thiết Xuất phát từ mục đích này chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài:

“Nghiên cứu đặc điểm sinh học một số chủng Bacillus thuringiensis

sinh protein tinh thể diệt côn trùng bộ cánh cứng”

Nhiệm vụ của đề tài:

- Phân lập các chủng Bacillus thuringiensis từ các mẫu đất, mẫu lá ở Nha Trang

và Quảng Nam

- Sàng lọc các chủng Bt có hoạt tính diệt ấu trùng và mọt thóc đỏ trưởng thành

- Phát hiện gen cry3A bằng phương pháp PCR

- Tách dòng gen cry3A mã hoá protein tinh thể diệt côn trùng bộ cánh cứng

- Xác định trình tự đoạn gen cry3A và so sánh với trình tự trên ngân hàng gen

quốc tế

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cương vê Bacillus thuringiensis

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng Bacillus thuringiensis

1.1.1.1 Trên thế giới

Trong hơn một trăm năm qua, vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt)

được coi là vi khuẩn được nghiên cứu nhiều nhất trong số các tác nhân vi sinh vật gây bệnh cho côn trùng

Năm 1870, Louis Pasteur đã phát hiện thấy một loại vi khuẩn gây bệnh ở

tằm và đặt tên là Bacillus bombycos

Năm 1901, nhà khoa học Nhật Bản Ishitawa tiếp tục nghiên cứu về bệnh

ở tằm dâu, đã phát hiện ra nguyên nhân gây bệnh cho tằm là do một loại vi

khuẩn thuộc chi Bacillus Ông đặt tên vi khuẩn này là Bacillus sotto

Năm 1911, Berliner (người Đức) đã phân lập được một loại vi khuẩn gây bệnh từ xác ấu trùng bướm phấn Địa Trung Hải ở vùng Thuringien và ông đã

đặt tên là Bacillus thuringiensis năm 1915

Ngay từ những năm 20 của thế kỉ 20, Bt đã được đưa vào thử nghiệm trên đồng ruộng ở Châu Âu: Năm 1920, lần đầu tiên Bt được sử dụng để sản xuất chế phẩm sinh học trừ sâu ở Đức Ở Pháp, năm 1938 Bt được sử dụng để diệt sâu hại lúa mỳ Ở Mỹ, Bt được sử dụng vào năm 1950

Năm 1970, các nhà khoa học đã chứng minh được rằng Bt có khả năng

diệt được côn trùng thuộc bộ cánh vảy là do nội độc tố  Cũng chính thời điểm

này, công nghiệp sản xuất Bt phát triển mạnh khi phát hiện ra chủng Btk HD1

có hoạt tính diệt sâu cao

Năm 1977, Goldberg và Margarit đã phát hiện dưới loài Bt subsp

israelensis diệt ấu trùng muỗi và ruồi thuộc bộ hai cánh Phát hiện này đã

chứng tỏ phổ hoạt tính của Bt không chỉ bó hẹp trong bộ cánh vảy

(Lepidoptera) mà còn với cả bộ hai cánh (Diptera)

Năm 1983, phổ hoạt tính của Bt lại được nâng lên khi Krieg và cộng sự phát hiện ra dưới loài Bt subsp tenebrionis diệt bộ cánh cứng (Coleoptera) Chủng này được phân lập từ bộ cánh cứng Tenebrio molitar

Năm 1985, gen cry của Bt được chuyển vào cây trồng để diệt sâu và đến

năm 1995 các cây chuyển gen đầu tiên đã được đưa vào sản xuất và ứng dụng

Từ năm 1987-1992, người ta cũng đã phát hiện thấy Bt có khả năng diệt

giun tròn thực vật, diệt ve bét, mạt thuộc bộ Trematoda và diệt kiến thuộc bộ Hymenoptera

Năm 1995, cây chuyển gen thương phẩm đầu tiên được đưa vào sản xuất,

từ đó mở ra một chương mới về ứng dụng của Bt vào cây trồng nông nghiệp,

cây trồng công nghệ sinh học và thực phẩm chuyển gen [1]

Năm 2003, Sakai và cộng sự đã công bố protein tinh thể của Bt diệt tế bào

ung thư

Năm 2005, Ohba M và Binh, N.D đã phát hiện protein của 4 dưới loài Bt

phân lập ở Việt Nam chống tế bào ung thư cổ tử cung của người [45]

Trên thế giới từ lúc phát hiện ra vi khuẩn Bt mang gen mã hóa tinh thể

protein diệt côn trùng, đã có rất nhiều nghiên cứu và ngày càng phát hiện ra

nhiều gen cry mới góp phần vào sự đa dạng của ngân hàng gen Bt thế giới

1.1.1.2 Ở Việt Nam

Việt nam đã có rất nhiều nghiên cứu về vi khuẩn Bacillus thuringiensis Trong 35 năm nghiên cứu và phát triển thuốc trừ sâu sinh học Bacillus

thuringensis (Bt) các nhà khoa học Việt Nam đã đạt được nhiều thành tựu trong

nghiên cứu, sản xuất và đưa những kết quả nghiên cứu đó ứng dụng vào đời sống, góp phần giảm thiệt hại kinh tế cho ngành nông, lâm nghiệp

Ở Việt Nam, thuốc trừ sâu Bt được ứng dụng đầu tiên tại Viện bảo vệ

thực vật năm 1971

Năm 1973, Nguyễn Công Bình và cộng sự lần đầu tiên nghiên cứu sản

xuất chế phẩm Bt phòng thí nghiệm bằng phương pháp lên men trên mấy lắc và

có chế phẩm diệt sâu rất tốt

Năm 1973-1976, Bt được sản xuất chủ yếu trên môi trường đặc với giá

thể là agar tự chế tạo từ rong câu và các nguyên liệu khác như: Bã khô lạc, bột đậu tương, bột cá, Các chủng sử dụng để sản xuất ở thời kỳ này có nguồn gốc chủ yếu từ Trung Quốc Các chế phẩm này đã được sử dụng cho vùng trồng rau

ở ngoại thành Hà Nội và đã thu được các kết quả tốt đẹp Năm 1982, Viện

Công nghiệp Thực phẩm cũng sản xuất chế phẩm Bt theo phương pháp lên men

chìm với dung tích nồi lên men là 5 m3

Từ năm 1984-1993, việc sản xuất chế phẩm Bt đã giảm sút bởi vì các chế phẩm Bt sản xuất ra có chất lượng không cao do vậy tốc độ tiêu thụ giảm Trong khoảng 10 năm trở lại đây, việc ứng dụng Bt được mở rộng hơn Hiện đã có rất nhiều cơ quan đi sâu vào nghiên cứu Bt như: Viện Công nghệ

Sinh học, Viện Bảo vệ Thực vật, Viện Công nghệ Sau Thu hoạch, Viện Công nghiệp Thực phẩm Tuy vậy cho tới nay ở nước ta vẫn chưa có cơ sở sản xuất thuốc trừ sâu Bt trên quy mô công nghiệp

1.1.2 Vị trí phân loại, đặc điểm hình thái

Bacillus thuringensis (Bt) là vi khuẩn đất, có khả năng diệt côn trùng,

được xếp vào nhóm I, chi Bacillus, họ Bacillaceae, ngành Firmicutes

Tế bào có dạng hình que, có kích thước 3-6m, có thể đứng riêng rẽ hoặc

tạo thành chuỗi Vi khuẩn Bt hô hấp hiếu khí hoặc kị khí không bắt buộc, bắt

màu Gram dương, có khả năng di động nhờ có tiêm mao mọc trên bề mặt tế bào

Hình 1.1 Tế bào vi khuẩn Bacillus thuringiensis

Khuẩn lạc của Bt có màu trắng sữa, hình tròn, bề mặt xù xì, viền khuẩn

lạc nhăn, đường kính có thể đạt tới 8-10 m Một số chủng Bt xuất hiện khuẩn

lạc dạng trơn nhẵn

Mỗi tế bào Bt khi trưởng thành có khả năng sinh bào tử và tinh thể độc

có bản chất protein có khả năng diệt côn trùng Bào tử có dạng hình trụ hoặc hình trứng, kích thước 1,6-2 m Bào tử được hình thành trong điều kiện môi trường bất lợi như nhiệt độ cao, môi trường nghèo chất dinh dưỡng… Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử có thể nảy mầm thành tế bào sinh dưỡng

Cùng với quá trình tạo bào tử, các tinh thể protein độc tố cũng được tổng hợp Tinh thể có kích thước 0,6-2 m, có hình dạng không cố định có thể là hình lập phương, hình lưỡng tháp hoặc hình cầu Tinh thể có thể chiếm tới 30%

trọng lượng khô của tế bào Khi nhuộm tế bào Bt bằng thuốc nhuộm fushin và quan sát dưới kính hiển vi nhận thấy tinh thể Bt bắt màu hồng sẫm còn bào tử

thì bắt màu hồng nhạt [1, 3, 4]

Hình 1.2 Tinh thể của vi khuẩn Bacillus thuringiensis

1.1.3 Phân biệt Bt với các loài khác trong nhóm Bacillus cereus

Các loài thuộc nhóm B cereus gồm B cereus, B thuringiensis, B

anthracis, B mycoides, B megaterium Gần đây có phát hiện thêm 2 loài B weihenstephanensis và B pseudomycoides [19] Việc sinh ra protein tinh

thể là một đặc tính để phân biệt Bacillus thuringiensis, tuy nhiên đó chỉ là

một chỉ tiêu dùng trong mục đích phân loại

Bào tử Tinh thể

Bảng 1.1 Một số đặc điểm phân biệt các loài trong nhóm 1 chi Bacillus

Đặc điểm Bc Bt Bmy Ba Bme

Khả năng chuyển động +/-(b) +/- -(c) - +/- Phản ứng khử nitrate + +/ + + -(d)Phân hủy tyrosine + + +/- -(d) +/-

1.1.4 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

Bt không lên men sinh axit trong môi trường có chứa đường arrabinose,

xylose, manitol, nhưng tạo axit ở môi trường có chứa đường glucose Có khả năng thuỷ phân tinh bột, khử nitrat thành nitrit, phát triển được ở môi trường có chứa 0,001% lysozyme, 7% NaCl với pH = 5.7, có phản ứng với lòng đỏ trứng

gà Không có khả năng khử amin của phenylalamin, không sử dụng axit citric, không khử muối sulphate

Bt có khả năng sinh trưởng phát triển ở nhiệt độ dao động từ 15 - 450C Nhiệt độ tối ưu là 28 - 300

C Bt không mẫn cảm đặc biệt với pH, pH tối ưu cho

sự phát triển của Bt là pH = 7 Bt có khả năng oxy hoá hydrocacbon đến axit

hữu cơ và dioxit cacbon theo chu trình Embden - Meyerhoff - Panas [1]

1.1.5 Đặc điểm phân loại

Có rất nhiều phương pháp phân loại Bacillus thuringiensis khác nhau

- Phân loại Bt dựa trên đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh hóa

- Phân loại theo type huyết thanh kháng nguyên - H

- Phân loại bằng thực khuẩn thể dựa trên tính mẫn cảm khác nhau với các thực khuẩn thể khác nhau

- Phân loại theo type huyết thanh kháng protein tinh thể

- Phân loại theo loại hình enzyme lipase

- Phân loại theo nguồn bệnh

Tuy nhiên, các phương pháp phân loại này vẫn còn tồn tại những mặt hạn chế Năm 1962, Barjac và Bonnefoi đã đưa ra một phương pháp phân loại mới

cho Bt bằng phản ứng huyết thanh, mô tả 27 type huyết thanh chính có hoạt

tính diệt côn trùng thuộc bộ cánh vảy, hai cánh, cánh cứng, nguyên sinh động vật, động vật chân khớp,… Phương pháp phân loại theo type huyết thanh H được sử dụng chủ yếu do đơn giản và có tính đặc hiệu cao Phương pháp phân loại này, dựa trên phản ứng ngưng kết giữa kháng nguyên tiêm mao H của vi khuẩn với kháng huyết thanh tương ứng Số lượng các type huyết thanh và các chủng phân loại theo huyết thanh tăng cùng với tổng số các chủng phân lập được Cho đến năm 2003, người ta đã phát hiện được 69 type huyết thanh bao

gồm 82 thứ huyết thanh khác nhau của Bacillus thuringiensis Dưới đây là bảng phân loại theo type huyết thanh H được trung tâm quốc tế Bacillus

thuringiensis đặt tại viện Pasteur ở Paris khuyến cáo sử dụng cho tất cả các

phòng thí nghiệm Bt trên thế giới từ năm 1982 [2]

Bảng 1.1 Sự phân loại Bacillus thuringiensis dựa vào

kháng nguyên tiên mao H Kháng

nguyên H

Thứ huyết thanh

Code Người đầu tiên nghiên cứu

1 Thuringiensis THU Berliner 1915; Heimpel & Angus 1958

3a, 3c Alesti ALE Toumanoff & Vago 195; Heimpel & Angus

1958 3a, 3b, 3c Kurstaki KUR de Barjac & Lemille 1970

3a, 3d Sumiyoshiensis SUM Ohba & Aizawa 1989

3a, 3d, 3e Fukuokaensis FUK Ohba & Aizawa 1989

4a, 4b Sotto SOT Ishiwata 1905 ; Heimpel & Angus 1958

4a, 4c Kenyae KEN Bonnefoi & de Barjac 1963

5a, 5b Galleriae GAL Shvetsova 1959; de Barjac & Bonnefoi

1962 5a, 5c Canadensis CAN de Barjac & Bonnefoi 1972

8a, 8b Morrisoni MOR Bonnefoi & de Barjac 1963

8a, 8c Ostriniae OST Ren et al 1975

8b, 8d Nigeriensis NIG Weiser & Prasertphon 1984

9 Tolworthi TOL Norris 1964; de Barjac & Bonnefoi 1968

10a, 10b Darmstadiensis DAR Krieg de Barjac & Bonnefoi 1968

10a, 10c Londrina LON Arantes et al (Không công bố)

Kháng

nguyên H

Thứ huyết thanh

Code Người đầu tiên nghiên cứu

11a, 11b Toumanoffi TOU Krieg 1969

11a, 11c Kyushuensis KYU Ohba & Aizawa 1979

12 Thompsoni THO de Barjac & Thompson 1970

13 Pakistani PAK de Barjac, Cosmao Dumanoir, Shaik &

Viviani 1977

15 Dakota DAK De Lucca, Simonson & Larson 1979

16 Indiana IND De Lucca, Simonson & Larson 1979

17 Tohokuensis TOH Ohba, Aizawa & Shimizu 1981

18a, 18b kumamotoensis KUM Ohba, Ono, Aizawa & Iwanami 1981

18a, 18c Yosoo YOS Lee, H H et al 1995

19 Tochigiensis TOC Ohba, Ono, Aizawa & Iwanami 1981

20a, 20b Yunnanensis YUN Wan-Yu, Qi-Fang, Xue-Ping & You-Wei

1979 20a, 20c pondicheriensis PON Rajagopalan et al (Không công bố)

21 Colmeri COL De Lucca, Palmgren & de Barjac 1984

24a, 24b Neoleonensis NEO Rodriguez-Padilla et al 1988

24a, 24c Novosibirsk NOV Burtseva, Kalmikova et al 1995

Kháng

nguyên H

Thứ huyết thanh

Code Người đầu tiên nghiên cứu

27 Mexicanensis MEX Rodriguez-Padilla and Galan-Wong (Không

công bố) 28a, 28b Monterrey MON Rodriguez-Padilla et al (Không công bố)

28a, 28c Jegathesan JEG Seleena, Lee, H L & Lecadet 1995

30 Medellin MED Orduz, Rojas, Correa, Montoya & de Barjac

1992

32 Cameroun CAM Jacquemard 1990; Juarez-Perez et al 1994

37 andaluciensis AND Aldebis, Vargas-Osuna & Santiago-Alvarez

1996

40 Huazhongensis HUA Dai Jingyuan et al 1996

42 Jinghongiensis JIN Li Rong Sen et al (in press)

Kháng

nguyên H

Thứ huyết thanh

Code Người đầu tiên nghiên cứu

43 Guiyangiensis GUI Li Rong Sen et al (in press)

45 Roskildiensis ROS Hinrinschen, Hansen and Daamgaard

(Không công bố)

48 Balearica BAL Caballero et al (Không công bố)

50 Navarrensis NAV Caballero et al (Không công bố)

51 Xiaguangiensis XIA Jian Ping Yan (Không công bố)

52 Kim KIM Kim et al (Không công bố)

53 Asturiensis AST Aldebis, Vargas-Osuna & Santiago-Alvarez

1996

54 Poloniensis POL Damgaard et al (Không công bố)

55 palmanyolensis PAL Santiago-Alvarez et al (Không công bố )

57 Pirenaica PIR Caballero et al (Không công bố)

58 Argentinensis ARG Campos-Dias et al (Không công bố)

59 Iberica IBE Caballero et al (Không công bố)

Kháng

nguyên H

Thứ huyết thanh

Code Người đầu tiên nghiên cứu

61 Sylvestriensis SYL Damgaard (Không công bố)

63 Bolivia BOL Ferrộ-Manzanero et al (Không công bố)

64 Azorensis AZO Santiago-Alvarez et al (Không công bố)

65 Pulsiensis PUL Khalique F and Khalique A (Không công

bố)

66 Graciosensis GRA Santiago-Alvarez et al (Không công bố)

67 Vazensis VAZ Santiago-Alvarez et al (Không công bố)

68 Thailandensis THA Chanpaisaeng et al (Không công bố)

69 Pahangi PAH Seleena and Lee H L (Không công bố)

1.1.6 Đặc điểm gen mã hóa protein độc tố diệt côn trùng

Kích thước hệ gen của vi khuẩn Bacillus thuringiensis vào khoảng 2,4

-5,7 triệu bp Trên thế giới người ta đã mô tả được bản đồ cấu trúc gen tự nhiên

của một số chủng Bacillus thuringiensis [10] Hầu hết các chủng Bacillus

thuringiensis phân lập mang nhân tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể (NST), các

nhân tố di truyền này có thể đóng vòng hoặc không đóng vòng [11] Trong một thời gian dài người ta cho rằng các protein tinh thể được mã hóa chung trên các

plasmid lớn Khi sử dụng kĩ thuật lai DNA với các mẫu dò cho gen cry đã nhận

thấy chúng xuất hiện cả trên NST [12]

Từ những năm đầu thập kỉ 80, nhiều nghiên cứu tập trung vào sự tồn tại

của các gen mã hóa protein tinh thể diệt sâu ở các loài phụ Bt khác nhau Các

phương pháp xử lí plasmid, tiếp hợp và các thí nghiệm tách dòng gen đã chứng

minh rằng các gen mã hóa protein diệt côn trùng thường nằm trên các plasmid lớn có hệ số copy thấp Theo điều tra của Carlton và Gonzalez thì plasmid có

mặt trong hầu hết các chủng Bacillus thuringiensis số lượng plasmid dao động

từ 2 đến 12 trong các chủng nghiên cứu [13, 14] Các thí nghiệm lai gen đã cung cấp bằng chứng về sự tồn tại các gen tổng hợp nhiều độc tố trong một tế

bào Bacillus thuringiensis

1.1.7 Phân loại gen mã hóa protein độc tố diệt côn trùng từ Bacillus thuringiensis

Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, Bacillus thuringiensis có khả

năng sinh ra 3 loại độc tố diệt côn trùng chính là Cry (Crystal δ - endotoxin)

được mã hóa bởi các gen cry khác nhau, Cyt (Cytolysin) mã hóa bởi các gen

cyt và Vip (Vegetative insecticidal Protein) được mã hóa bởi các gen vip khác

nhau

1.1.7.1 Gen cry

Gen cry mã hóa cho các độc tố Cry khác nhau Đây là gen độc tố quan trọng nhất của vi khuẩn Bt, tính đặc hiệu diệt côn trùng là do các protein độc

mà nó tạo ra Tính đến năm 2013 thì người ta đã phát hiện được hơn 610 gen

cry khác nhau thuộc về 70 nhóm (từ cry1 - cry72) Mỗi nhóm gen lại có những

Hoạt tính diệt côn trùng

cry1A - 1M Lưỡng tháp 130 - 138 Cánh vảy Lepidoptera

Hai cánh Diptera

cry3A -cry3C Lập phương 73 - 74 Cánh cứng Coleoptera

Gen vip mã hóa cho các độc tố Vip (Vegetative insecticidal protein) Độc

tố Vip đƣợc Estruch và cộng sự phát hiện đầu tiên vào năm 1996 bao gồm

Vip3A và Vip3B [1]

Độc tố Vip đã thu hút đƣợc sự quan tâm của rất nhiều nhà khoa học do khả năng diệt côn trùng phổ rộng, hoạt tính diệt sâu cao mà đặc biệt chƣa phát hiện đƣợc côn trùng kháng độc tố này

Theo thống kê của Neil Crickmore năm 2013 thì có 105 gen vip thuộc 4 nhóm khác nhau từ vip1- vip4 [44], gen vip3A mã hóa protein 88 kDa, protein này có hoạt tính với nhiều côn trùng cánh vảy: Agortis ispilon, Spodoptera

fugipera, Spodoptera exigua Khi côn trùng mẫn cảm do ăn phải độc tố, Vip3A

là nguyên nhân gây phân giải tế bào biểu mô ruột giữa

1.1.8 Các loại độc tố của Bacillus thuringiensis

Bt có 4 loại độc tố: 3 ngoại độc tố và một nội độc tố

1.1.8.1 Ngoại độc tố 

Có khối lượng phân tử thấp, không bền nhiệt, có khả năng tan trong nước, tích tụ trong pha logarit của một vài loài phụ và được giải phóng ra môi trường khi tế bào tan rã

Ngoại độc tố  có bản chất là một enzyme gọi là photpholipase hoặc leucithinase, có hoạt tính với một vài loài ong cắn lá Tác dụng độc của ngoại độc tố  có liên quan tới sự phân huỷ photpholipid ở mô của côn trùng Nghiên cứu này được phát hiện bởi Toumanoff năm 1953

1.1.8.2.Ngoại độc tố 

Có trọng lượng phân tử thấp 707 - 850 kDa, là độc tố bền nhiệt, tan trong nước Ngoại độc tố  có tác dụng kìm hãm nuclease và RNA-polymease dẫn tới cản trở việc tổng hợp tRNA Ngoại độc tố  có phổ hoạt tính rộng, có hoạt tính với côn trùng thuộc bộ cánh vảy, côn trùng thuộc bộ cánh cứng và côn trùng thuộc bộ hai cánh

Qua nghiên cứu Brian Federici và Dongwu cũng nhận thấy rằng chế

phẩm Bt nếu chỉ sử dụng ngoại độc tố  thì hiệu quả diệt côn trùng chỉ đạt 20% trong khi đó nếu bổ sung thêm nội độc tố  thì hiệu quả diệt côn trùng sẽ tăng lên tới 75%

1.1.8.3 Ngoại độc tố 

Có trọng lượng phân tử thấp, mẫn cảm với nhiệt độ, ánh sáng và không khí, có khả năng tan trong nước Độc tố này thuộc nhóm photpholipase, có tác dụng lên photpholipid và giải phóng ra axit béo, rất mẫn cảm với nhiệt độ, ở nhiệt độ từ 600C trở lên trong vòng từ 10 - 15 phút đã bị vô hoạt

1.1.8.4 Nội độc tố 

Có bản chất là một protein gồm 1180 gốc axit amin, các axit amin chủ yếu là glutamine, asparagine, chiếm trên 20% tổng số axit amin trong phân tử protein, đây cũng là một nguyên nhân gây ra điểm đẳng điện thấp Lượng cysteine nhỏ hơn 20% tổng axit amin quy định sự không hoà tan của tinh thể, ngoài ra còn có các axit amin: Arginine, threonine, leucine, isoleucine

Ngoài protein tinh thể còn chứa các thành phần khác như: hydratcacbon, tuy nhiên cũng có thể hydratcacbon chỉ là thành phần phụ được pha tạp trong quá trình hình thành bào tử Xét về thành phần hoá học thì nội độc tố  chứa chủ yếu các nguyên tố C, H, O, N, S Ngoài ra còn có Ca, Mg, Si, Fe và một lượng nhỏ Ni, Ti, Zn, Al, Cu, Mn Tuy nhiên nguyên tố P hầu như không có

Nội độc tố  có đặc điểm không hoà tan trong các dung môi hữu cơ, chỉ tan trong môi trường có pH kiềm, không tan trong nước, rất bền nhiệt Khi đun

ở 650C trong một giờ không bị mất hoạt tính, chỉ khi đun ở 1000

C trong 30 - 40 phút thì tinh thể bị mất tính độc Mặc dù tinh thể độc có thể tan ở pH kiềm, nhưng không phải pH kiềm nào cũng thích hợp Qua nghiên cứu người ta nhận thấy rằng, pH quá cao hay quá thấp cũng đều ảnh hưởng tới độc tính của tinh thể Tuy nhiên lúc mới tách ra khỏi bào tử, nó có thể hoà tan trong pH rất kiềm

Sự tổng hợp tinh thể độc và bào tử xảy ra gần như đồng thời trong khoảng 3 giờ sau pha cân bằng

1.1.9 Cơ chế tác động của protein tinh thể độc lên côn trùng

Cơ chế tác động của protein tinh thể của Bacillus thuringiensis liên quan

tới sự hoà tan của tinh thể trong ruột giữa của côn trùng Các tinh thể độc đều được bắt nguồn từ một protein có khối lượng phân tử lớn khoảng 130-140 kDa, được gọi là “tiền độc tố” Tiền độc tố này phải được hoạt hoá thì mới gây ra tính độc Trong những điều kiện bình thường thì protein tinh thể không bị hoà tan, do vậy nó rất an toàn với người và động vật bậc cao Tuy nhiên trong môi trường pH cao (khoảng 9,5), protein tinh thể sẽ bị hoà tan Môi trường pH này

thường thấy trong ruột giữa của ấu trùng thuộc bộ cánh vảy Với lý do này, Bt

được xem là một tác nhân diệt côn trùng có tính đặc hiệu cao [16]

Tinh thể độc gây độc lên côn trùng thông qua con đường tiêu hoá Nhờ

có hệ Enzyme protease và môi trường pH kiềm ở ruột giữa của côn trùng mà tinh thể độc sẽ bị hoà tan Quá trình hoà tan này phụ thuộc vào pH của môi trường và thành phần cấu tạo của tinh thể Khi tan nó sẽ tạo ra các mảnh độc có khối lượng phân tử nhỏ Các mảnh độc này sẽ gắn với các thụ thể có ở trên màng biểu mô của tế bào ruột làm thủng tế bào Kết quả là ruột bị tê liệt, ấu

trùng ngừng ăn, pH ruột bị giảm do sự cân bằng với pH máu pH thấp là điều kiện thuận lợi cho bào tử vi khuẩn nảy mầm, vi khuẩn xâm nhập vào côn trùng gây ra sự nhiễm trùng máu và làm chết côn trùng

Khi các tinh thể độc được hoà tan trong môi trường kiềm nhân tạo mà không có protease thì hầu hết các tinh thể protein đặc biệt là loại 130 kDa không độc với các tế bào của côn trùng, vì vậy các tinh thể protein được gọi là

“Tiền độc tố” Các nghiên cứu gần đây về cấu trúc nội độc tố  đã chỉ ra rằng nội độc tố  được chia làm 3 vùng Cả 3 vùng này đều có những chức năng nhất định trong quá trình gây độc lên côn trùng

Vùng 1: Gắn toàn bộ hoặc gắn một phần vào màng tế bào ruột tạo ra các lỗ

thủng trên màng tế bào nhờ đó mà các ion có thể đi qua một cách dễ dàng

Vùng 2: Vùng này sẽ gắn vào các thụ thể có ở màng biểu mô của tế bào ruột Vùng 3: Có cấu trúc chặt chẽ, có chức năng bảo vệ phần cuối của độc tố, ngăn

cản sự phân chia thêm nữa bởi tác động của protease ở ruột [1]

Đặc điểm quan trọng nhất trong cơ chế tác động của độc tố lên côn trùng

là sự gắn kết của độc tố với thụ thể và sự hình thành lỗ rò (kênh ion)

Hình 1.3 Cơ chế diệt sâu của vi khuẩn Bacillus thuringiensis

Sâu hại bông Hoạt hóa thành nhân độc

Hòa tan tinh thể Tiêu

hóa Tinh

thể Bt

Tế bào ruột giữa sâu Độc tố Bt bám vào tế bào

ruột

Hình thành

lỗ rò trên màng tế bào

Tế bào chết

1.1.10 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình hình thành bào tử và tinh thể độc

Nhiều nhà nghiên cứu đã nhận thấy rằng các yếu tố ảnh hưởng tới quá

trình sinh trưởng phát triển của Bt đều ảnh hưởng tới quá trình sinh tổng hợp

độc tố

Nhiệt độ: Bt có khả năng sinh trưởng, phát triển trong khoảng nhiệt độ

20 - 400C Tuy nhiên nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng Bt là 28 - 320C Nếu nhiệt độ dưới 200

C và trên 320C đều có ảnh hưởng lên quá trình hình thành bào

tử Nếu nuôi cấy ở 200C thì chu kì phát triển cần 64 giờ, trong khi đó nuôi cấy

ở 350C thì thời gian cần cho chu kì phát triển giảm xuống còn 27 giờ và số bào

tử tăng lên Khi nuôi cấy Bt trên môi trường thạch ở điều kiện nhiệt độ >= 400

C

thì Bt vẫn có khả năng phát triển nhưng bào tử lại không được hình thành

Thêm vào đó nhiệt độ cũng có ảnh hưởng lớn tới quá trình hình thành tinh thể độc, ở nhiệt độ < 140C sau 360 giờ nuôi cấy không quá 10% tinh thể được hình thành, nhưng ở nhiệt độ 160C sau 168 giờ nuôi cấy lượng tinh thể tăng lên đạt tới 15%

pH: pH là một trong số các yếu tố có ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng

Bt, ảnh hưởng đến hoạt tính của Enzyme, ảnh hưởng đến điện tích màng tế

bào và sự hấp thu chất dinh dưỡng, ảnh hưởng tới khả năng cho nhận chất dinh dưỡng trong môi trường và tính độc của các vật chất có hại Do đó pH quá cao

hoặc quá thấp đều có hại tới Bt Với pH dao động trong khoảng 5,8 - 8,5 không

gây ảnh hưởng tới sự hình thành tinh thể độc Tuy nhiên sự thay đổi lớn yếu tố

pH lại làm thay đổi số lượng bào tử Thường thì Bt phát triển tối ưu ở pH = 7

Oxy: Bt là vi khuẩn hô hấp hiếu khí cho nên oxy là yếu tố không thể

thiếu trong quá trình sinh trưởng Bt Tùy từng giai đoạn sinh trưởng mà hàm

lượng oxy cần cung cấp khác nhau

Các nguồn dinh dưỡng: Bulla và Arcas và cộng sự đã nghiên cứu và

nhận thấy rằng các hợp chất amoni vô cơ như (NH4)2SO4 không có hiệu quả

trong việc thúc đẩy quá trình sinh trưởng của Bt Trong khi đó các nguồn nitơ

hữu cơ như cao thịt, bột cá, bột đâụ tương, là yếu tố thúc đẩy quá trình sinh

trưởng Các chủng Bt khác nhau cần các axit amin khác nhau Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng nguồn nitơ có ảnh hưởng rất lớn tới sinh khối Bt và các protein tinh thể độc Ngoài ra các ion khoáng như Ca, Mg, K, cũng được coi là nguồn dinh dưỡng cần thiết cho sự sinh trưởng Bt

Axit amin: Một số axitamin như leucine, isoleucine có tác dụng ức chế

sự sinh trưởng của Bt cũng như sự hình thành tinh thể độc, nhưng khi cho thêm

axit amin valine vào thì sự ức chế bị mất đi Điều đó chứng tỏ rằng axit amin có

ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và hình thành tinh thể độc của Bt

1.2 Tổng quan về gen cry3, Protein Cry3 và dưới loài Bacillus thuringiensis tenebrionis

1.2.1 Một số đặc điểm về gen cry3

Nhóm gen cry3 gồm 19 gen thuộc các họ gen cry3A, cry3B, cry3C mã hoá cho các protein có hoạt tính với các loài thuộc bộ cánh cứng Gen cry3A được tách dòng từ Bacillus thuringiensis subsp tenebrionis (Bacillus

thuringiensis subsp sandiago hoặc morrisoni) Gen cry3B được tách dòng từ Bacillus thuringiensis subsp tolworthi Gen cry3C được tách dòng từ Bacillus thuringiensis subsp galleriae [17]

Năm 1991, Li và cộng sự đã công bố cấu trúc của nội độc tố  của protein tinh thể diệt sâu Cry3A Cấu trúc bậc 3 của protein này được xác định bởi tinh thể học tia - X (X - ray crystallography) [1] Protein này gồm 3 vùng cấu trúc riêng biệt:

Vùng 1: Là một chuỗi polypeptit gồm 290 axit amin đây là vùng chứa đầu N

Vùng này gồm 7 chuỗi xoắn , 6 trong 7 chuỗi này được sắp xếp thành hình 6 cạnh bao bọc xung quanh chuỗi xoắn thứ 5 kị H2O Mặt bên của chuỗi xoắn thứ nhất và thứ 7 là các axit amin kị H2O và nó nằm liền kề với vùng 2

có cấu trúc tương đồng, song song và xếp ngược chiều nhau, trong đó tấm 1 và tấm 2 có tính tương đồng cao hơn Mỗi tấm bao gồm 4 mảnh  không song song, có cấu trúc chung Hai mảnh  ở phía trong tạo thành một dải  kéo dài ra

tận phía 2 mảnh  ở phía ngoài Tấm 3 có 3 mảnh  và 1 chuỗi xoắn  có chức năng duy trì cấu trúc cơ bản của tấm 1 và 2 Vùng 2 là vùng không bền vững của độc tố

cacboxyl và có cấu trúc bền vững [1]

Gen cry3A với kích thước 1060 bp mã hoá cho tinh thể protein được bắt

đầu từ codon thứ 48 Người ta đã nghiên cứu và nhận thấy rằng nếu loại bỏ 157 axit amin ở đầu N cũng không làm mất hoạt tính của Cry3A [18]

Hình 1.4 Cấu trúc không gian của protein Cry3A

1.2.2 Đặc điểm sinh hóa và huyết thanh học của Bacillus thuringiensis subsp tenebrionis

Năm 1981, deBarjac thông qua phương pháp phân loại theo huyết thanh

bởi kháng nguyên tiên mao H đã chỉ ra rằng Bt.t thuộc type huyết thanh Biovar

tenebrionis

Tinh thể của Bt.t có thể hoà tan trong các dung dịch đặc NaBr, KBr hoặc

NaI với pH = 10 - 12,5 Nội độc tố  đã hoà tan sau khi loại muối, sẽ làm thay đổi hoạt tính của tinh thể hoặc làm vô hiệu hoá tinh thể Nhờ phân tích SDS -

PAGE đã chỉ ra rằng các tinh thể protein có thể tách thành hai dưới đơn vị 68 kDa và 55 kDa (Bernhard 1986) hoặc 74 kDa và 68 kDa Các kết quả nghiên cứu khác cũng chỉ ra rằng, nội độc tố  chủ yếu là chuỗi peptide có khối lượng phân tử 67 kDa, còn lại có thể là các chuỗi polypeptid với khối lượng 46 kDa,

55 kDa, 73 kDa và 72 kDa Điều này tuỳ thuộc vào việc kiểm soát các giai đoạn sinh trưởng của quá trình hình thành bào tử

Quá trình hình thành bào tử được chia làm 6 giai đoạn Trong suốt giai đoạn 1 của quá trình hình thành bào tử chỉ có chuỗi peptid 73 kDa được tạo thành, trong khi đó thì ở giai đoạn 2 xuất hiện chuỗi peptid 67 kDa Ở các giai đoạn sau và sau khi tinh thể được giải phóng, số lượng chuỗi 67 kDa càng ngày càng tăng còn chuỗi peptid 73 kDa càng ngày càng giảm Khi thêm protease vào thì nó sẽ ức chế sự chuyển biến từ chuỗi peptid 73 kDa thành chuỗi peptit

67 kDa Trong môi trường có chứa trypsine thì nội độc tố  sẽ bị hoà tan tạo thành chuỗi 55 kDa

1.3 Tổng quan về côn trùng bộ cánh cứng (Coleoptera)

Đặc trưng phổ biến của côn trùng bộ cánh cứng là bộ xương ngoài có cấu tạo rất chắc và ôm sát cơ thể bảo vệ cho chúng trước các tác động cơ học bên ngoài Tuy nhiên, lớp vỏ này lại làm cản trở sự chuyển động của chúng Thông thường, hầu hết các loài bọ cánh cứng bay không xa và liên tục

Côn trùng bộ cánh cứng có đời sống dài và sinh sản nhanh hơn so với nhiều loài khác Chúng có vòng biến thái hoàn toàn: Trứng - sâu non - nhộng - trưởng thành và có thể phát triển ở mọi nơi từ vài tuần đến vài năm Tùy từng loài mà trứng của chúng sẽ được đẻ ở gần nguồn thức ăn như trong đất hay trên cây trồng chủ Số lượng trứng đẻ ra từ vài trứng đến vài trăm trứng, tùy thuộc từng loài Vòng đời của chúng kéo dài chưa đầy một năm hoặc có thể đến vài năm

Côn trùng bộ cánh cứng Coleoptera có khoảng 350.000 loài đã được định

tên thuộc 106 họ khác nhau: Chrysomelidae, Carabidae, Cerambycidae,

Curculiodae, Tenebrionidae… bọ cánh cứng gây hại đáng kể về mặt kinh tế,

trong số này có không ít loài gây hại, có loài phá hại cây trồng trên đồng ruộng

(Chrysomela scriptae hại bông, Anomala hại gừng, Tenebrio moliar hại khoai

tây…), có loài làm giảm chất lượng và sản lượng của nông sản phẩm, nhất là

nông sản sau thu hoạch (mọt thóc đỏ Tribolium castaneum…)

Hình 1.6 Ấu trùng và mọt thóc đỏ trưởng thành

Mọt thóc đỏ có tên khoa học là Tribolium castaneum Nó được biết đến

như là loại mọt cám Về mặt cơ bản mà nói chúng tấn công vào các sản phẩm

đã qua xay sát hoặc đã bị đập vỡ như bột mì, ngô, gạo Những loại hạt ngũ cốc

còn nguyên vẹn thì khả năng tấn công của chúng ít hơn hoặc là không đáng kể