Nghiên cứu sản suất chế tạo bào tử nấm kí sinh côn trùng từ chủng nấm LECANICILLIUM LECAIIL439 và đánh giá nhược điểm sinh học của chế phẩm

Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/Vì những lí do trên, tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sản xuất chế phẩm bào tử nấm kí sinh côn trùng từ chủng nấm Lecanicillium

Trang 1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

_o0o _

CHU HỒNG QUẢNG

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM BÀO TỬ NẤM KÍ

SINH CÔN TRÙNG TỪ CHỦNG NẤM LECANICILLIUM LECANII L439 VÀ ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC

CỦA CHẾ PHẨM

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên – 2013

Trang 2

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

_o0o _

CHU HỒNG QUẢNG

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM BÀO TỬ NẤM KÍ

SINH CÔN TRÙNG TỪ CHỦNG NẤM LECANICILLIUM

LECANII L439 VÀ ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA

CHẾ PHẨM

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS VŨ VĂN HẠNH

Thái Nguyên – 2013

Trang 3

Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/

MỞ ĐẦU

Lí do chọn đề tài:

Rệp (Aphidoidae) là nhóm côn trùng chích hút nhựa cây phổ biến nhất trên thế

giới, phân bố rộng rãi ở các vùng ôn đới, cận nhiệt đới và nhiệt đới Chúng kí sinh trên hơn 11000 loài cây thuộc 243 họ khác nhau, trong đó có nhiều cây trồng quan trọng như các loại ngũ cốc, bông, khoai tây, cà chua, họ cải [48] Chúng vừa hút cạn nguồn dinh dưỡng vừa làm cản trở quá trình hô hấp, quang hợp của cây, đồng thời truyền virus gây bệnh từ cây bị bệnh sang cây khỏe mạnh trên đồng ruộng [72] Theo thống

kê, rệp và côn trùng khác làm thiệt hại khoảng 15% sản lượng cây trồng trên thế giới [31] Biện pháp phòng trừ rệp hiện nay chủ yếu là dùng thuốc hóa học, thuốc có phổ tác dụng rộng trên nhiều đối tượng và hiệu quả tác dụng nhanh Tuy nhiên, thuốc hóa học có độc tính rất cao, khó phân hủy trong điều kiện bình thường, sẽ tích tụ lại trong đất, nước, không khí và các sản phẩm nông nghiệp, làm ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng xấu đến sức khỏe của con người và sinh vật có ích Ngoài ra, tính độc cao của thuốc trừ sâu hóa học có thể gây ra hiện tượng đột biến và kháng thuốc của rệp dẫn tới nguy cơ bùng phát dịch rệp hại trên nhiều loại cây trồng

Việc ứng dụng khống chế sinh học bằng các loài thiên địch và kí sinh trùng gây bệnh dùng để thay thế một phần cho thuốc hóa học bảo vệ thực vật trong trồng trọt có

ưu điểm vượt trội như an toàn đối với con người và môi trường sinh thái, góp phần duy trì sự phát triển bền vững của ngành nông nghiệp

Nấm kí sinh côn trùng Lecanicillium ssp là chi nấm có khả năng kí sinh tự

nhiên trên một số loài rệp và côn trùng Từ những năm 1960, trên thế giới đã có nhiều

công trình nghiên cứu ứng dụng nấm Lecanicillium ssp để diệt rệp hại cây trồng, một

vài sản phẩm đã được thương mại hóa tuy nhiên kết quả đạt được còn nhiều hạn chế

Vì vậy, việc tăng cường nghiên cứu và phát triển các chế phẩm diệt rệp từ

Lecanicillium ssp là cần thiết

Việc tối ưu môi trường lên men, sản xuất, bảo quản chế phẩm bào tử và thử nghiệm độc lực của bào tử là những vấn đề cần được giải quyết trong nghiên cứu này

Trang 4

Vì những lí do trên, tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sản xuất chế phẩm bào

tử nấm kí sinh côn trùng từ chủng nấm Lecanicillium lecanii L439 và đánh giá

đặc điểm sinh học của chế phẩm”, đề tài được thực hiện tại Phòng các chất Chức

năng sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Mục tiêu nghiên cứu: Sản xuất chế phẩm bào tử nấm diệt rệp hại cây trồng có

hiệu quả cao, an toàn, dễ sử dụng và có thể chuyển giao kĩ thuật cho hộ nông dân sản xuất và sử dụng

Nội dung nghiên cứu:

1 Tối ưu môi trường lên men

2 Sản xuất bào tử, phối trộn với chất phụ gia tạo chế phẩm và bảo quản

3 Thử nghiệm độc lực của chế phẩm trên rệp hại cây

Trang 5

NỘI DUNG Chương 1 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU

1.1 Giới thiệu về rệp hại cây trồng

1.1.1 Cấu tạo, phân loại rệp và đặc điểm sinh thái

Rệp (Aphidoidae) là một họ lớn thuộc lớp côn trùng thuộc ngành chân khớp – động vật không xương sống, cơ thể chia thành ba phần (đầu, ngực, bụng), có ba cặp chân phân đốt, mắt kép và có một cặp râu, cơ thể được bao bọc bởi bộ xương ngoài bằng chitin, chiều dài từ 1 – 10 mm (Hình 1.1) Rệp có một lớp biểu bì mềm, có cánh (dạng màng) hoặc không cánh Phần lớn thân rệp có màu xanh lá cây, đen, nâu, hồng hoặc không màu Rệp là nhóm côn trùng chích hút phổ biến nhất hiện nay, phân bố tập trung nhất ở các vùng ôn đới [72], một số sống ở cả cận nhiệt đới và nhiệt đới với số lượng khoảng 3700 loài rệp đã được biết trên thế giới [48]

Hình 1.1 Cấu tạo ngoài của rệp

(University of Birmingham, England) [105]

Rệp có thể sinh sản theo cả hình thức đơn tính và hữu tính Vào mùa thu, khi có

sự thay đổi về cường độ chiếu sáng, nhiệt độ, sự giảm sút về nguồn thức ăn hoặc chất lượng thức ăn, rệp cái sinh ra cả rệp đực và rệp cái con Đặc điểm di truyền của rệp đực giống hệt rệp mẹ ngoại trừ việc ít hơn một nhiễm sắc thể giới tính Rệp con hữu tính có thể thiếu cánh, thậm trí thiếu vòi chích hút [72] Khi trưởng thành, rệp cái giao

Trang 6

phối với rệp đực rồi đẻ trứng Trứng sống sót qua mùa đông khắc nghiệt rồi nở ra rệp cái có cánh hoặc không cánh (Hình 1.2) Các rệp cái sẽ sinh sản vô tính ra rệp cái không cánh hoặc rệp cái có cánh (khi khan hiếm thức ăn) để bay đến cây kí chủ khác Tuy nhiên, trong môi trường ấm áp như ở vùng nhiệt đới hoặc trong nhà kính, rệp có thể sinh sản vô tính trong nhiều năm Trong vòng đời, một rệp cái có thể sinh ra 31 đến

93 rệp con theo hình thức sinh sản này [12], [111], [115] Đặc biệt, một số loài có khả năng sinh sản lồng, khi rệp cái mẹ sinh ra rệp cái con thì rệp cái con cũng chuẩn bị sinh ra thế hệ tiếp theo đã có sẵn trong cơ thể nó Cách sinh sản này có thể ảnh hưởng đến kích thước của rệp và tốc độ sinh sản tăng lên [54], [81]

Hình 1.2 Vòng đời của rệp

(BMC Developmental Biology) [99]

Trong điều kiện thuận lợi, vòng đời trung bình của một cá thể rệp khoảng 30 ngày Rệp con sinh ra sẽ phát triển trong khoảng 4 đến 10 ngày để trưởng thành và bắt đầu sinh sản ra các thế hệ mới [68]

Phần lớn rệp có thân mềm nên chúng dễ dàng bị giết bởi nhiều kẻ thù tự nhiên như bọ rùa, ong bắp cày kí sinh, ấu trùng muỗi kí sinh, nhện cua, vi khuẩn, virus, các

loài nấm kí sinh côn trùng như Neozygites fresenii, Entomophthorales, Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Lecanicillium lecanii,…

Trang 7

Rệp (Aphididae) có khoảng 4700 loài, chúng có thể kí sinh trên nhiều loại cây

trồng và cỏ dại khác nhau như các cây ngô, lúa mì, khoai tây, bông, ớt, hoa hồng, cam, quýt,… thuộc các họ lúa, họ dưa, họ cà, họ có múi,… gây thiệt hại hàng tỷ đô la Mỹ

mỗi năm cho ngành nông nghiệp trồng trọt [48] Các loài rệp phá hoại cây trồng mạnh như rệp đào Myzus persicae Sulzer, rệp bông Aphis gossypii Glover, rệp ngô Aphis maydis, rệp đậu đũa Aphis craccivora Koch,… chúng thường ẩn ở phần mặt dưới của

lá, thân non và chích hút nhựa tại đó [106], vừa làm cạn nguồn dinh dưỡng của cây vừa tiết ra chất đường mật không chỉ làm đóng khí khổng của lá mà còn góp phần tăng

sự phát triển của mốc đen, làm ngăn cản ánh sáng đến các mô quang hợp, ảnh hưởng nghiêm trọng tới trao đổi chất và năng suất cây trồng Ngoài ra, việc chích hút nhựa cây của các loài rệp làm lây lan virus gây bệnh từ những cây bệnh sang các cây khỏe mạnh [72]

Loài rệp ngô Aphis maydis là một loại sâu hại phổ biến trên toàn thế giới, chúng

kí sinh trên nhiều loại cây trồng như lúa miến (Sorghum), ngô và lúa mì,… với mật độ

cá thể cao sẽ làm giảm sản lượng hạt và lây truyền virus gây bệnh Rệp có thể chích hút nhựa, làm tổn thương ở tất cả các bộ phận khác nhau của cây ngô nhưng chúng phá hoại mạnh nhất ở bộ phận bắp non và râu ngô gây ra các mức độ khô cháy khác nhau, ảnh hưởng tới quá trình thụ phấn, thụ tinh và hình thành hạt, dẫn tới giảm năng suất, chất lượng hạt ngô [28]

1.1.2 Tình hình rệp hại cây trồng trên thế giới và Việt Nam

Tình hình rệp hại trên thế giới:

Rệp là một trong những loài côn trùng có tác hại nguy hiểm nhất trên thế giới Chúng không chỉ gây hại trực tiếp, hút cạn nguồn dinh dưỡng mà còn là vật trung gian truyền nhiều loại virus gây bệnh cho thực vật, đồng thời rất khó kiểm soát chúng bằng một loại thuốc bảo vệ hóa học thực vật thông thường bởi khả năng kháng thuốc rất mạnh của rệp nên số lượng cá thể tăng nhanh [34]

Đậu tương là loại hạt dầu được trồng nhiều nhất trên thế giới nhưng năng suất

bị đe dọa nghiêm trọng bởi rệp đậu tương (A glycines) Sản lượng hạt bị thiệt hại ước

tính khoảng 34%, theo tính toán của Catangui và cộng sự (2009), con số thiệt hại thậm

Trang 8

chí lên đến 48 – 72% Nguyên nhân do rệp chích hút có thể làm giảm 50% tốc độ quang hợp của lá cây [29]

Đậu đũa (Vigna unguiculata) là loại cây được trồng nhiều ở châu Phi, ước tính

sản lượng hàng năm ở khu vực này khoảng 3,36 triệu tấn Không giống như ở cây

bông vải bị phá hoại chủ yếu bởi A gossypii, đậu đũa bị phá hoại bởi nhiều loài rệp như A craccivora, A leguminosae, A labburni, A fabae, Myzus persica và cả A gossypii Ở những khu vực không có biện pháp bảo vệ, sản lượng thiệt hại có thể lên

đến 20 – 100% [83]

Rệp đào (Myzus persicae Sulzer) là một trong những loài rệp nguy hiểm nhất

với cây trồng Chúng đươc biết đến từ năm 1776, cơ thể có hình quả lê dài 2 mm với nhiều mầu sắc khác nhau Rệp đào kí sinh trên hàng trăm loài cây thuộc 40 họ khác nhau Các cây này phân bố rộng khắp thế giới, nhiều cây phân bố ở những vùng khá lạnh như Atiso, bắp cải, cà rốt, súp lơ, ngô, su hào, cải dầu, củ cải đường, cà chua,…[75] chúng hút nhựa làm cho chồi non cong queo, lá xoăn, làm rụng hoa quả non gây ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây Kennedy và cộng

sự (1962) đã liệt kê hơn 100 loại virus lây truyền qua loài rệp này Một số bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng như virus khoai tây, cà chua, củ cải, súp lơ, dưa hấu, dưa chuột,…[27] Rệp đào truyền virus gây bệnh khảm có thể làm thiệt hại 60% năng suất dưa chuột [101] Chúng cũng gây bệnh trầm trọng ở cải bắp ngay từ giai đoạn 3 – 4 lá, chúng chích hút dịch cây, lá, bẹ lá, dẫn đến lá cây héo, thân ủ rũ rồi chết [114]

Rệp cải bắp (còn gọi là rệp cải hay rệp muội) (Brevicoryne brassicae) là một

trong những loài rệp gây thiệt hại lớn cho người trồng rau cải và sản xuất dầu hạt cải Tùy theo từng vùng địa lý và mùa vụ mà thời điểm rệp xuất hiện cũng như gia tăng mật độ cá thể cao nhất có sự khác nhau Rệp thường chích hút nhựa trên lá, cụm hoa

và thân cây đồng thời gián tiếp truyền virus gây bệnh cho cây cải Thiệt hại do rệp cải bắp gây ra từ 35 – 75% năng suất rau cải và 6% hàm lượng dầu hạt cải [20]

Rệp ngô (Aphis maydis): Rệp ngô phân bố rộng rãi ở các vùng nhiệt đới và cận

nhiệt đới, kí sinh trên nhiều loài cây khác nhau thuộc họ lúa như đại mạch, lúa mì, lúa

miến (cao lương – sorghum), ngô, các loại cỏ làm thức ăn gia súc,… đồng thời là vật

Trang 9

trung gian truyền virus gây bệnh khảm lá mía, đốm lá ngô, Trong điều kiện thuận lợi, rệp ngô có vòng đời khoảng 15 ngày và có nhiều thế hệ liên tiếp trong một năm Rệp non và trưởng thành hút nhựa ở nõn ngô, bẹ lá, phiến lá, bông cờ, lá bi, làm cho cây ngô mất hết dinh dưỡng, lá quăn giảm khả năng quang hợp, cây ngô trở nên gầy yếu, bắp bé đi hoặc không hạt, chất lượng hạt rất kém Thường phát dịch ở những ruộng khô hạn hoặc cằn cỗi vào thời kì ngô sắp trổ cờ, kết bắp [28], [110]

Theo thống kế trong những năm 1965 – 1970 về năng suất của ngô cho thấy mức độ phá hoại của rệp ngô phụ thuộc rất nhiều vào các điều kiện nhiệt độ và độ ẩm của môi trường Ngô bị nhiễm rệp ở mức độ nhẹ (mật độ khoảng 400 cá thể rệp trên chùm râu bắp ngô) sẽ khiến cho năng suất bình quân giảm tới 8,3% khi cây đang bị thiếu nước, nếu cây đủ nước thì mức độ thiệt hại do rệp gây ra không đáng kể Nếu mức độ nhiễm rệp ở mức trung bình thì mức độ thiệt hại lên đến 34,8% trong điều kiện cây trồng thiếu nước và 11,8% trong điều kiện cây đủ nước Nếu mức độ nhiễm rệp nặng (mật độ rệp lên đến hàng trăm cá thể trên hầu hết các chùm râu bắp ngô) sẽ làm năng suất suy giảm nghiêm trọng, trung bình dao động từ 43,2 – 91,8% khi cây ngô đang bị thiếu nước và 58,9% khi cây ngô đủ nước [39]

Lipaphis erysimi (rệp cải dầu) kí sinh trên một số loài cây nhưng chủ yếu là các

loại cải và cải dầu, ngoài ra nó còn kí sinh trên cà rốt, cà chua và bí xanh Ở phía đông

miền Trung Ấn Độ, L erysimi cùng với M persicae và Brevicoryne brassicae là ba loại rệp nguy hiểm đối với cây cải dầu (Brassica juncea) Trong đó L erysimi phá hoại

nhiều nhất, riêng nó gây thiệt hại 35,4 – 91,3% sản lượng [24] Theo nghiên cứu của

Patel và cộng sự (2004), nếu không có biện pháp bảo vệ, L erysimi có thể gây thiệt hại

80,6 – 97,6% [87] Trong một nghiên cứu khác, Razaq và cộng sự (2011) cũng chỉ ra

rằng, M persicae và Brevicoryne brassicae cũng gây thiệt hại 75,1 – 81,9% sản lượng

cải dầu ở Multan, Punjab, Pakistan [94]

Aphis craccivora (rệp đậu lăng) cũng là một loài rệp kí sinh trên nhiều loại cây

trồng khác nhau như đậu đũa, bông vải, táo, cà rốt, lúa mì, đậu lăng Theo nghiên cứu

của Hossain và cộng sự (2006), A craccivora gây thiệt hại tới 9% cho sản xuất đậu

lăng Tuy nhiên, sản lượng đậu lăng đã tăng 0,91 – 9,89% khi áp dụng các biện pháp

Trang 10

diệt rệp hoặc gieo trồng tránh rệp [50] A craccivora truyền virus gây bệnh rụng lá ở

đậu lăng, đậu răng ngựa, đậu gà [56], [80]

Diuraphis noxia (rệp lúa mì Nga) chuyên phá hoại lúa mì, lúa mạch đen, lúa

mạch trắng, yến mạch Theo nghiên cứu của Akhtar và cộng sự (2010), năng suất lúa

mì có thể bị giảm 7,9 – 34,2% do D noxia phá hoại [15]

Tình hình rệp hại cây trồng ở Việt Nam

Tại Việt Nam, theo nghiên cứu và thống kê của các nhà khoa học, nước ta chịu

sự phá hoại của hơn 250 loài rệp khác nhau Tại đồng bằng sông Cửu Long, cây sầu riêng bị rệp sáp phá hoại Một số cây ăn quả ở thành phố Hồ Chí Minh và vùng phụ cận cũng bị ảnh hưởng bởi nhiều loài rệp làm giảm năng suất và thiệt hại về kinh tế Cây cà phê tại một số vùng ở Tây Nguyên cũng đang gặp phải vấn nạn rệp sáp và rệp bông Tại tỉnh Đắc Lắc, rệp sáp kí sinh trên chùm hoa và quả non gây thiệt hại từ 8 – 25% Tại tỉnh Đắc Nông, rệp đã tấn công gây hư hại trên 500 ha, trong đó gây thiệt hại nặng cho hơn 200 ha [10]

Trong những năm gần đây, thống kê các loài gây hại cho cây trồng tại nước ta, rệp đào đang là mối đe dọa cho ngành nông nghiệp với sự gia tăng nhanh chóng về diện tích và số lượng cây trồng bị hại Chúng có thể gây hại trên 300 loại cây trồng khác nhau, trong đó thường thấy trên các cây như: các loại rau họ cải như cải trắng, cải

củ, cải xanh, cải bắp; một số cây ăn quả như đào, hồng, lê, mận Trong điều kiện nước

ta, rệp đào có thể xuất hiện và gây hại quanh năm, trong đó tập trung nhiều khi thời tiết dịu mát, độ ẩm cao vào tháng 4 – 5 (vụ đông xuân) và tháng 9 – 10 (vụ thu đông) Rệp ngô ở Việt Nam cũng rất phổ biến, chúng có ở khắp các vùng trồng ngô từ đồng bằng đến miền núi, rệp thường phát triển nhiều trong mùa xuân và mùa thu, lúc độ ẩm trong không khí cao Rệp thường phá hại ở cây ngô từ giai đoạn 8 –10 lá cho tới khi ngô chín hoàn toàn Chỉ tính riêng ở 3 huyện Trà Ôn, Tam Bình và Vũng Liêm (Vĩnh Phúc), diện tích ngô bị nhiễm rệp từ 2 – 7%, như vậy nếu tính trên cả nước thì thiệt hại gây bởi rệp ngô là rất lớn [110], [116]

Trang 11

1.2 Thuốc diệt côn trùng

1.2.1 Tình hình sản xuất và sử dụng thuốc trừ sâu

* Thuốc trừ sâu hóa học

Thuốc trừ sâu hóa học, trừ bệnh và trừ cỏ dại là 3 loại thuốc bảo vệ thực vật Thuốc trừ sâu là một loại chất được sử dụng để chống côn trùng, chúng bao gồm các thuốc diệt trứng và thuốc diệt ấu trùng của côn trùng Các loại thuốc trừ sâu được sử dụng trong nhiều lĩnh vực nhưng chủ yếu được dùng trong nông nghiệp Việc sử dụng thuốc trừ sâu được cho là một trong các yếu tố chính dẫn tới sự gia tăng sản lượng nông nghiệp trong thế kỷ XX [103] Gần như tất cả các loại thuốc trừ sâu đều có nguy

cơ làm thay đổi lớn các hệ sinh thái, nhiều loại thuốc trừ sâu độc hại với con người và các sinh vật khi chúng tích tụ lại trong chuỗi thức ăn

Từ 2000 năm trước công nguyên, con người đã biết sử dụng thuốc trừ sâu có nguồn gốc tự nhiên để bảo vệ cây trồng [74] nhưng chỉ đến khi các hóa chất được tổng hợp nhân tạo dễ dàng trong các nhà máy hóa chất, đặc biệt là sau khi Paul Hermann Müller phát hiện ra khả năng diệt côn trùng mạnh mẽ của DDT vào năm 1939 thì nhiều loại thuốc bảo vệ thực vật phòng trừ sâu, bệnh và cỏ dại được nghiên cứu và đưa vào sử dụng Từ năm 1945 đến năm 1975, lượng thuốc bảo vệ thực vật được sản xuất tại Mỹ đã tăng 40 lần, từ 15,9 nghìn tấn/năm lên 636,3 nghìn tấn/năm Từ năm 1975 đến nay, mặc dù con người đã ý thức được mức độ nguy hại của thuốc bảo vệ thực vật

có nguồn gốc hóa học nhưng trước sự phá hoại mạnh mẽ của côn trùng và các dịch hại khác trong khi chưa có biện pháp thay thế thực sự hiệu quả thì việc sản xuất và sử dụng thuốc bảo vệ thực vật nguồn gốc hóa học đã tăng rất nhanh cả về khối lượng và giá trị thương mại [21], [42], [57], [96]

Ở Việt Nam, thuốc bảo vệ thực vật được sản xuất và sử dụng lần đầu tiên ở miền Bắc vào năm 1956 để tiêu diệt bọ gai và sâu cuốn lá hại lúa tại tỉnh Hưng Yên Tại miền Nam, thuốc bảo vệ thực vật được sử dụng bắt đầu từ năm 1962 Từ đó đến nay, lượng thuốc bảo vệ thực vật được tiêu thụ đều tăng mạnh qua các năm Theo Lê

Kế Sơn (1993), lượng thuốc bảo vệ thực vật nhập khẩu vào nước ta trong những năm

1980 chỉ khoảng 20 – 24 nghìn tấn/năm nhưng đến những năm 1990 con số đó tăng

Trang 12

lên khoảng trên 35 nghìn tấn/năm [2] Theo báo cáo của Cục bảo vệ thực vật (Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn) năm 2012, mỗi năm lượng thuốc bảo vệ thực vật được nhập vào nước ta khoảng 70 nghìn tấn, đạt giá trị thương mại từ 210 – 500 triệu USD [4]

* Thuốc trừ sâu sinh học

Thuốc trừ sâu sinh học (còn được gọi là thuốc diệt côn trùng có nguồn gốc sinh học hay chế phẩm sinh học trừ sâu) là một sản phẩm đang được nhiều nước trên thế giới nghiên cứu và ứng dụng trong bảo vệ thực vật Mechnikoff (1879) và Karassilnikor (1888) đã đặt nền móng cho xu hướng kiểm soát côn trùng bằng vi sinh

vật, nghiên cứu về khả năng sử dụng nấm kí sinh côn trùng Metarrhizium anisopliae

để diệt côn trùng gây hại ngũ cốc và củ cải đường Năm 1914, lần đầu tiên d’ Herelle thử nghiệm kiểm soát côn trùng bằng vi khuẩn Cho đến năm 2013 đã có khoảng 400 yếu tố diệt hại sinh học (bao gồm thuốc diệt côn trùng) đã được đăng kí với hơn 1250 sản phẩm khác nhau [102]

Nhiều chế phẩm sinh học diệt côn trùng từ nấm kí sinh côn trùng đã được thương mại hóa Theo thống kê của De Faria và cộng sự (2007), có ít nhất 12 loài (hoặc dưới loài) nấm được ứng dụng để sản xuất chế phẩm diệt côn trùng như

Beauveria bassiana (33,9%), M anisopliae (33,9%), Lecanicillium spp (9,4%), Isaria fumosorsea (5,8%) và B brongniartii (4,1%) là phổ biến nhất trong số 171 sản phẩm

được thống kê Trong đó, 75% sản phẩm đã được thương mại hóa, 15% hiện không còn được sử dụng và 10% hiện chưa biết thông tin [32]

Bacillus thuringiensis là một trong những vi khuẩn được sử dụng để kiểm soát

côn trùng sớm nhất Năm 1901, Ishiwatari phát hiện ra một loại vi khuẩn gây bệnh

chết đột ngột ở tằm và đặt tên là Bacillus sotto Năm 1911, Berliner phát hiện ra vi khuẩn này giết chết mọt bột mì và đặt tên lại là Bacillus thuringiensis Chế phẩm từ B thuringiensis (thường được gọi là Bt) bắt đầu được sử dụng để diệt côn trùng từ năm

1920 Bt được đăng kí để sử dụng làm thuốc diệt côn trùng đầu tiên ở Mỹ từ năm 1961

và được đăng kí lại vào năm 1998 Năm 2007, Ahmad và cộng sự (2007) đã so sánh

Trang 13

khả năng diệt rệp của Bt với một số hóa chất tổng hợp Kết quả cho thấy, Bt làm giảm 70% số lượng rệp, xấp xỉ với hiệu quả của các hóa chất này [14]

Hiện nay, các nghiên cứu về các chủng nấm Lecanicillium spp được sử dụng

để kiểm soát côn trùng gây hại cây trồng cũng đã và đang được nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu bởi khả năng diệt côn trùng của chúng rất cao Việc sử dụng

bào tử nấm Lecanicillium spp đã rất được quan tâm để kiểm soát côn trùng và sâu

bệnh hại cây trồng Bên cạnh đó, giun tròn nang gây hại đậu tương, nấm mốc gây hại dưa chuột và các loại nấm gỉ gây hại cây hoa cúc cũng có thể được kiểm soát bởi loại

nấm này [73], [104], [109] Hơn nữa, Lecanicillium spp đã được chứng minh có độc tính rất mạnh đối với một số loài rệp như rệp đào (Myzus persicae), rệp bông (Aphis gossypii) và Macrosiphum euphorbiae [19] Do đó, tại Anh, Mỹ và một số nước khác

đã nghiên cứu và có chế phẩm thương mại như Vertalec ® từ bào tử nấm L longisporum diệt nhiều loại rệp chích hút nhựa cây Ngoài ra, Lecanicillium spp đã

được chứng minh có các hoạt động chống nấm mốc gây bệnh phấn trắng trên nhiều loại cây trồng, diệt sâu, bọ chích hút nhựa cây [41], [59], [67]

Trong nghiên cứu của Park và cộng sự (2010), chủng Lecanicillium sp 4078 diệt được trứng, ấu trùng và con trưởng thành của Bemisia tabaci với các tỉ lệ lần lượt

là 77,68 ± 12,01%; 77,55 ± 6,68% và 99,33 ± 11,55% [86] Guclu và cộng sự (2010),

Lecanicillium muscurium có thể diệt 60 – 75% bướm Ricania simulans sau 7 ngày phun [43] Lecanicillium muscarium trong nghiên cứu của Cuthbertson và cộng sự (2010) đã được làm tăng hiệu quả diệt bướm khoai lang (Bemisia tabaci) nhờ phụ gia

Trang 14

Tại Việt Nam việc nghiên cứu và ứng dụng thuốc trừ sâu sinh học trong phòng trừ sâu hại chủ yếu vẫn ở quy mô nhỏ lẻ nên giá thành sản phẩm còn khá cao Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc trừ sâu sinh học để kiểm soát sâu bệnh gây hại cây trồng ngày càng được ưa chuộng hơn

Nhóm thuốc trừ sâu sinh học ứng dụng cho phòng trừ sâu bệnh là nhóm sản phẩm được ứng dụng khá rộng rãi và sớm nhất Theo Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, trong danh mục các loại thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc sinh học, từ năm 2000 chỉ có 2 sản phẩm trừ sâu sinh học được công nhận cho đăng ký đến năm

2005 đã có 57 sản phẩm các loại, đến 6 tháng đầu năm 2007 có 193 sản phẩm được cấp giấy phép đăng ký, nâng tổng số sản phẩm sinh học được phép lưu hành lên 479 sản phẩm, trong đó có 300 loại thuốc trừ sâu và 98 sản phẩm thuốc trừ bệnh Các sản phẩm này đã góp phần không nhỏ vào công tác phòng trừ dịch hại, góp phần thay thế

và hạn chế dần nguy cơ độc hại do sử dụng thuốc bảo vệ thực vật nguồn gốc hóa học

ảnh hưởng đến sức khỏe con người và gây ô nhiễm môi trường [5]

Hoạt chất Abamectin được tổng hợp bởi xạ khuẩn Streptomyces avermitilis diệt

trừ được các loại sâu như sâu vẽ bùa, nhện, sâu tơ, sâu xanh, bọ trĩ, bọ phấn Ngoài ra, sản phẩm Vivadamy, Vanicide, Vali có hoạt chất là Validamycin A, được tổng hợp bởi

xạ khuẩn Streptomyces hygroscopius var jingangiesis Đây là nhóm thuốc trừ bệnh có

nguồn gốc kháng sinh đặc trị các bệnh đốm vằn trên lúa, bệnh nấm hồng trên cao su, bệnh chết rạp cây con ở cà chua, khoai tây, thuốc lá, bông vải… Các chế phẩm từ nấm

đối kháng Trichoderma sp vừa có tác dụng đề kháng một số nấm bệnh gây hại trên bộ

rễ cây trồng như: bệnh vàng lá chết nhanh do nấm Phytophthora palmirova gây ra, bệnh vàng héo rũ hay còn gọi là bệnh héo chậm do một số nấm bệnh như Furasium solari, Pythium sp., Sclerotium rolfosii gây ra Hai chế phẩm nấm diệt côn trùng M anisopliae và B bassiana là sản phẩm của đề tài do Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long thực hiện [112]

Tại Việt Nam, quy trình sử dụng vi nấm M anisopliae và B brassiana đã được

nghiên cứu khá thành công và được sản xuất thành một số chế phẩm Theo Nguyễn Thị Lộc (Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long), việc triển khai sinh bào tử nấm đến hộ nông dân và sử dụng nấm để kiểm soát rầy nâu đã góp phần làm giảm chi phí và tăng

Trang 15

thu nhập cho người trồng lúa Nguyễn Dương Khuê đã sử dụng nấm M anisopliae để

kiểm soát mối nhà Chế phẩm từ hai loại nấm này giúp bảo vệ môi trường và tạo thêm một số mô hình kinh tế mới như trồng lúa kết hợp nuôi tôm Sử dụng biện pháp sinh học này giúp việc kiểm soát rầy nâu giảm bớt chi phí so với dùng thuốc trừ sâu hóa học [6]

Vi nấm M anisopliae cũng có hiệu lực cao đối với rệp sáp giả Dysmicoccus sp

hại na Phun nấm với nồng độ 9×108 bào tử/ml đã kiểm soát được 82% rệp sáp giả sau

5 ngày xử lý Tuy nhiên, hiệu quả trừ rệp sáp giả của nấm M anisopliae trên cây na ở

điều kiện đồng ruộng ở ngoại ô TP Hồ Chí Minh thấp hơn so với ở phòng thí nghiệm nhưng cũng đạt 56 – 78% [8] Chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học 2B có nguồn gốc từ

nấm B bassiana đã được thử nghiệm kiểm soát rầy nâu hại lúa [7] Các chủng B thuringiensis được chọn lọc từ tự nhiên ở Việt Nam và nước ngoài cũng đã được

nghiên cứu tạo chế phẩm, chế phẩm Bt do Viện Công nghệ sau thu hoạch sản xuất có hoạt tính diệt sâu cao đối với côn trùng bộ cánh vảy hại rau hoa quả, nông sản bảo quản [1]

Có thể thấy, xu hướng sử dụng thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc là sinh học trên thế giới và Việt Nam ngày càng nhiều và càng được quan tâm, trong đó có xu

hướng sử dụng nấm kí sinh côn trùng

1.2.2 Ưu và nhược điểm của thuốc trừ sâu hóa học và thuốc trừ sâu sinh học

* Ưu nhược điểm của thuốc trừ sâu hóa học

Trang 16

khí và tích tụ trong các sản phẩm nông nghiệp gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người

Thuốc bảo vệ thực vật được sử dụng tràn lan, nồng độ ngày một tăng làm cho các loài gây hại biến đổi nhanh chóng và kháng thuốc, dẫn đến hiệu quả sử dụng thuốc ngày càng giảm và chi phí tăng cao Ước tính có khoảng 520 loài côn trùng, 150 loài

vi sinh vật gây bệnh cho thực vật và 273 loài cỏ dại đã kháng lại thuốc bảo vệ thực vật [89] Hàng năm, riêng nước Mỹ chi khoảng từ 10% đến 25% trong tổng số 400 triệu đôla Mỹ cho công tác bảo vệ thực vật để chống lại sự gia tăng của sâu bọ kháng thuốc [90] Một số thuốc diệt cỏ có thời gian phân hủy lâu, sau khi được phun cho cây trồng

sẽ thẩm thấu một phần vào đất, mạch nước ngầm và tồn tại ở đó rất lâu vì trong đất có rất ít vi sinh vật có khả năng phân hủy chúng [49], vì thế nên nguy cơ bị ngộ độc thuốc diệt côn trùng là rất cao

Một loại thuốc diệt côn trùng sau khi được sử dụng trên đồng ruộng sẽ theo các kênh thoát nước đi vào các thủy vực gây nhiễm độc hoặc giết chết các sinh vật thủy sinh, làm giảm giá trị của nguồn lợi thủy sản và ảnh hưởng tới sức khỏe của con người nếu ăn phải hải sản bị nhiễm độc

Do tính độc mạnh và phổ tác dụng rộng nên tính tác dụng chọn lọc của thuốc trừ sâu hóa học rất kém Chúng không chỉ giết chết những côn trùng có hạ ết chết cả côn trùng có lợi cho con người và cây trồng như ong mật, ong mắt đỏ, kiến vống, sinh vật đất,… hoặc gây ức chế sinh trưởng, phát triển của cây trồng Ngoài ra, thuốc phát tán theo gió bám lên các loại rau, quả ở các khu vực lân cận đang trong thời

kì thu hoạch khiến dư lượng bảo vệ thực vật trong nông sản tăng lên ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm [64], [88], [91], [92]

Việc lạm dụng thuốc diệt côn trùng làm cho thực phẩm bị nhiễm độc gây ngộ độc cấp tính hoặc mãn tính cho người sử dụng Theo WHO (1990) thì mỗi năm trên thế giới có khoảng 3 triệu trường hợp ngộ độc thuốc trừ sâu, trong đó 220 nghìn ca tử vong do ngộ độc cấp tính [62] Eddleston và cộng sự (2008), tại các vùng nông thôn ở các nước đang phát triển khu vực châu Á có khoảng 300 nghìn ca tử vong mỗi năm [95]

Trang 17

Ở Việt Nam hiện nay có khoảng từ 15 – 20 triệu người thường xuyên tiếp xúc với thuốc bảo vệ thực vật, có khoảng 70% trong số đó đã có biểu hiện của sự nhiễm độc [4] Theo Cục Y tế dự phòng và Môi trường (Bộ Y tế) năm 2009, các bệnh viện đã tiếp nhận 4515 trường hợp nhiễm độc thuốc bảo vệ thực vật và 138 trường hợp đã tử vong [9] Trên thực tế số lượng trường hợp nhiễm độc thuốc bảo vệ thực vật còn lớn hơn nhiều

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, những người nhiễm độc thuốc bảo vệ thực vật sẽ làm tăng nguy cơ mắc các bệnh như rối loạn cảm giác, rối loạn trí nhớ, viêm họng mãn tính, viêm phế quản mãn tính, rối loạn chức năng tinh hoàn và vô sinh, đột biến gen, máu trắng, ung thư Thời gian tiếp xúc càng kéo dài thì nguy cơ mắc các bệnh này càng tăng lên

Từ những thông tin vừa trình bày, ngày nay thế giới có xu hướng giảm dần và tiến đến không sử dung thuốc trừ sâu hóa học mà thay vào đó là các biện pháp phòng trừ bằng thuốc trừ sâu sinh học an toàn và hiệu quả hơn

* Ưu nhược điểm của thuốc trừ sâu sinh học

Ưu điểm:

Các chế phẩm sinh học có nhiều ưu điểm vượt trội so với hóa chất tổng hợp về

độ thân thiện với môi trường, hệ sinh thái và sức khỏe con người Chúng không gây độc hại cho người và gia súc, không gây ô nhiễm môi trường, không ảnh hưởng đến chất lượng nông sản

Các chế phẩm sinh học có tác dụng chọn lọc, mỗi chế phẩm chỉ tác dụng lên một hay một số loài côn trùng nhất định, không hoặc chỉ gây ảnh hưởng đến một số ít loài ăn sâu bọ và các sinh vật có ích khác Do vậy, các hệ sinh thái được phun các chế phẩm này không bị xáo trộn, đảm bảo sự ổn định bền vững của đất trồng trọt Chế phẩm khi phát tán sang các khu vực lân cận cũng không gây ảnh hưởng tiêu cực đến cây trồng ở đó

Hiệu quả của nấm kí sinh côn trùng thường kéo dài vì chúng không chỉ tiêu diệt trực tiếp lứa sâu đang phá hoại mà chúng còn có thể lan truyền cho thế hệ tiếp theo nên rất tiết kiệm chi phí Hơn nữa, các chế phẩm sinh học không ảnh hưởng tiêu cực đến

Trang 18

tài nguyên vi sinh vật đất, các loài thiên địch hữu ích Nếu sử dụng hợp lý, đúng kỹ thuật sẽ mang lại hiệu quả kinh tế cao

Do có tác dụng chọn lọc đến côn trùng gây hại, các chế phẩm sinh học từ nấm

kí sinh, nếu sử dụng ở liều lượng cao, thường xuyên cũng không tạo ra nguy cơ kháng thuốc của côn trùng, mỗi loại chế phẩm được sử dụng trong thời gian lâu hơn làm giảm chi phí nghiên cứu sản xuất các chế phẩm mới thay thế

Nhược điểm:

Tác động của thuốc trừ sâu vi sinh thường chậm nên hiệu quả chậm bởi vì thuốc trừ sâu vi sinh thường có quá trình gây bệnh và nhiễm bệnh khi vào cơ thể sâu thì thời gian ủ bệnh phải mất 1 – 3 ngày Hiệu quả của thuốc ban đầu không cao, phổ tác dụng của thuốc còn hẹp Một vài loại thuốc trừ sâu vi sinh bị ảnh hưởng bởi điều kiện thời tiết như độ ẩm không khí, gió, ánh nắng mặt trời Nếu như phun thuốc trừ sâu sinh học không đúng kỹ thuật, phun trong điều kiện không thích hợp sẽ khó đạt hiệu quả cao Khả năng bảo quản các thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc sinh học không cao nên dẫn tới khó khăn trong việc bảo quản, lưu thông, phân phối và sử dụng Giá thuốc còn cao

1.3 Nấm kí sinh côn trùng Lecanicillium lecanii và ứng dụng

Lecanicillium là chi nấm kí sinh côn trùng thuộc ngành nấm túi Ascomycota, lớp Sordariomyces, bộ Hypocreales, họ Clavicipitacae Lecanicillium lecanii là một

trong số những chủng nấm gây bệnh côn trùng (entomopathogens) mà trước đó đã

được biết đến rộng rãi như Verticillium lecanii Hầu hết, các nấm gây bệnh côn trùng

chỉ kí sinh trên cơ thể côn trùng Tuy nhiên, một số nấm kí sinh côn trùng như

Lecanicillium lecanii có thể tồn tại trên cây trồng Vì vậy, Lecanicillium lecanii có thể

có hai vật chủ là côn trùng và thực vật Nấm Lecanicillium có thể sợi màu trắng, tốc độ

tăng trưởng 29 – 33 mm sau 10 ngày, tồn tại trong không khí và trong môi trường nuôi cấy Bào tử đính có hình elip được bố trí theo hình trụ ở đỉnh, trong suốt, 2,5 – 3,5 x 1 – 1,5 µm [51] (Hình 1.3)

Lecanicillium có khả năng kí sinh tự nhiên và diệt nhiều loài côn trùng như rệp, ruồi trắng, bọ trĩ, Cơ chế diệt côn trùng của Lecanicillium dựa trên sự tiếp xúc trực

Trang 19

tiếp của bào tử với côn trùng Sau khi bám trên vỏ côn trùng (chitin), các bào tử nảy mầm rồi tiết ra enzyme (chitinase, proteinase) phân hủy lớp biểu bì, kết hợp với áp lực nảy mầm của bào tử nấm giúp sợi nấm đâm sâu vào các khoang trong cơ thể Tại đây sợi nấm tiết các enzyme (proteinase, lipase, chitinase) thủy phân các mô, tiết các độc

tố nấm gây độc thần kinh cho côn trùng Kết quả là côn trùng bị tổn thương, bị đa

nhiễm bởi Lecanicillium và các vi sinh vật gây bệnh khác Sau khi côn trùng chết nấm

tiếp tục phát triển và sinh bào tử bên ngoài cơ thể côn trùng và có thể lây truyền bệnh cho côn trùng khác [76] Do đó việc sử dụng bào tử nấm để sản xuất chế phẩm diệt côn trùng hại cây trồng là rất hiệu quả

mại Vertalec™ được phát triển với thành phần chủ yếu là bào tử của nấm

Lecanicillium ssp Gần đây Lecanicillium spp đã được chứng minh rằng, nó có các

hoạt động chống nấm mốc gây bệnh phấn trắng (powdery mildew) và diệt các kí sinh trùng khác hại cây trồng [19], [59], [67]

Trang 20

Vi nấm Lecanicillium spp (Zimmerman) Viegas cũng ký sinh trên nhiều loại

côn trùng bao gồm bộ cánh đều, bộ cánh cứng, cánh thẳng và bướm [45], [65] Việc sử

dụng bào tử nấm Lecanicillium spp rất được quan tâm để kiểm soát côn trùng và sâu

bệnh hại cây trồng Bên cạnh đó, giun tròn nang gây hại đậu tương, nấm mốc gây hại dưa chuột và các loại nấm gỉ gây hại cây hoa cúc cũng có thể được kiểm soát bởi loại

nấm này [73], [104], [109] Ngoài ra, nấm Lecanicillium spp có thể được sử dụng với

hỗn hợp của một số thuốc trừ sâu hay thuốc diệt nấm trong các chương trình điều khiển dịch hại cây trồng tích hợp để có được một hiệu ứng hiệp đồng [44], [45]

Vi nấm Lecanicillium spp được phân lập từ rệp M persicae có khả năng diệt 100% rệp Aphis gossypii hại dưa cà, bông sau 3 – 5 ngày trong điều kiện phòng thí

nghiệm và trên 78% trong điều kiện nhà kính sau 14 ngày Bào tử của vi nấm

Lecanicillium spp cũng có khả năng diệt 100% rệp đào Myzus persicae hại rau cải, rau

diếp, ớt sau 4 – 5 ngày phun trong điều kiện phòng thí nghiệm, ngoài ra bào tử của nấm này có khả năng diệt được một số côn trùng và rệp cây khác [107]

Chủng nấm kí sinh côn trùng Lecanicillium muscarium (Petch) trong phòng thí nghiệm gây chết đối với dạng trưởng thành bọ dừa Thrips palmi khá cao khoảng 70%

sau 4 ngày Do vậy có thể dùng chủng vi nấm này để kiểm soát bọ dừa hiệu quả [82]

Kim và cộng sự (2008) đã sử dụng L attenuatum CNU-23 để kiểm soát M Persicare Trong phòng thí nghiệm, L attenuatum CNU-23 diệt được 50% rệp sau 3

ngày phun và 80% sau 7 ngày phun Thử nghiệm trên cây ớt được trồng trong nhà

kính, chủng nấm này diệt được 72 – 92% rệp sau 12 ngày phun [58] Chủng L indicum (Petch) Gams và L lecanii (Zimmermann) Viegas thể hiện độc tính rất mạnh đối với mối Cryptotermes brevis Walke (Isoptera: Rhinotermitidae) và Odontotermes brunneus Hagen (Isoptera: Termitidae), khả năng gây chết mối bởi hai chủng nấm này cao hơn so với M anisopliae (Metsch) Sorok [66], [79] Năm 2009, Diaz và cộng sự (2009) đã khảo sát độc lực của L lecanii đối với một số loài rệp Kết quả là chủng này diệt được 95% M persicae, trong khi sản phẩm thương mại Vertalec® chỉ diệt được

91,6% [35]

Trang 21

Có nhiều sản phẩm diệt côn trùng có nguồn gốc từ Lecanicillium đã được

thương mại hóa Một số sản phẩm tiêu biểu như Vertalec, Verelac, Mycotal, Envert,… đóng gói 500 g có mật độ bào tử từ 108

– 1010 bào tử/g, pha với nước (có thể bổ sung thêm chất phụ gia) phun trên bề mặt lá bằng các thiết bị tương tự như khi phun thuốc trừ sâu hóa học Các chế phẩm này, không chỉ có tác dụng lên rệp mà còn tác dụng lên nhiều loại côn trùng khác như ruồi trắng, bọ trĩ, ve bét [113]

Mặc dù tiềm năng kiểm soát các côn trùng gây hại cây trồng của nấm

Lecanicillium rất lớn nhưng việc nghiên cứu ứng dụng Lecanicillium để bảo vệ cây

trồng cũng như kết quả đạt được còn hạn chế, nhất là ở Việt Nam Hiệu quả diệt côn

trùng của chế phẩm Lecanicillium cũng như các chế phẩm sinh học khác còn kém,

khối lượng chế phẩm diệt côn trùng sinh học được sử dụng mới chỉ chiếm tỉ trọng thấp trong tổng khối lượng các loại thuốc diệt côn trùng Do vậy, việc tăng cường nghiên

cứu phát triển chế phẩm diệt côn trùng từ nấm Lecanicillium là cần thiết

1.4 Sản xuất và tạo chế phẩm bào tử nấm kí sinh trùng

Bào tử nấm kí sinh côn trùng đã được nghiên cứu sản xuất theo cả hai hệ thống lên men lỏng và lên men rắn Lên men trên môi trường lỏng các loài nấm có năng suất sinh bào tử rất cao (bào tử chồi), tuy nhiên sức sống của bào tử chồi yếu nếu phối trộn với dầu và bảo quản lâu dài [61], [79] Lên men trên môi trường rắn, nấm phát triển chậm hơn nhưng bào tử sinh ra (bào tử đính) có sức sống khỏe hơn, có thể bảo quản được trong thời gian dài Vì vậy, lên men trên môi trường rắn được sử dụng để sản xuất số lượng lớn bào tử nấm kí sinh côn trùng nhằm tạo chế phẩm sinh học tan trong dầu khi sử dụng và bảo quản [55] Ngoài ra, lên men rắn cũng có nhiều ưu điểm như nguồn nguyên liệu đơn giản, sẵn có với giá rẻ, không cần phải kiểm tra các thông số lên men, không cần chi phí lớn để mua thiết bị, ít tiêu tốn năng lượng, kiểm soát ô nhiễm dễ dàng,…[22], [85]

Để đảm bảo hiệu quả cao khi sản xuất bào tử nấm với số lượng lớn, quá trình sản xuất chia thành 2 giai đoạn Giai đoạn hoạt hóa trên môi trường thạch khoảng 7 ngày, nhân giống được lên men trên môi trường lỏng trong khoảng 3 ngày và giai đoạn sản xuất bào tử được lên men trên môi trường rắn từ 10 đến 15 ngày Bào tử được sấy

Trang 22

khô ở điều kiện phù hợp vừa làm giảm lượng nước còn khoảng 10% vừa đảm bảo duy trì khả năng sống của bào tử Sau đó bào tử được thu bằng máy hoặc bằng tay, sàng qua 3 lớp sàng khác nhau, cơ chất được loại bỏ, bào tử có độ tinh khiết cao được gom lại, tạo điều kiện thuận lợi cho việc điều chỉnh nồng độ bào tử theo tiêu chuẩn kỹ thuật khi phối trộn chất phụ gia trong bảo quản và sử dụng chế phẩm sau này Bào tử tinh khiết tiếp tục làm khô bằng bình hút ẩm bởi silica gel khô trong 5 ngày để giảm độ ẩm còn 5%, mang bảo quản cùng với dầu và các chất phụ gia khác ở điều kiện 4oC và

26oC để đánh giá khả năng sống sót theo định kỳ sau thời gian bảo quản (Hình 1.4) [26], [38], [53], [69] , [71], [78], [84], [93]

Hình 1.4 Sơ đồ quá trình sản xuất bảo tử nấm kí sinh côn trùng

1.4.1 Lên men lỏng (chuẩn bị giống cấp 1, cấp 2)

Các môi trường lỏng sử dụng cho giai đoạn đầu của quá trình lên men sản xuất bào tử cần có nguồn carbohydrate để cung cấp năng lượng và nitơ dưới dạng của axit amin hoặc nitơ vô cơ như KNO3 để tổng hợp protein cần thiết cho sự tăng trưởng [69] Khi lên men bất kì chủng vi sinh vật nào thì môi trường cũng phải cung cấp đủ 2 thành phần này Một môi trường lỏng rẻ tiền và hiệu quả để sản xuất nấm với số lượng lớn

có thể được chuẩn bị rỉ đường (sản phẩm phụ của công nghiệp đường mía) như là

Trang 23

nguồn cung cấp cacbon và chất thải lên men bia được dùng làm nguồn cung cấp nitơ Ngoài ra, glucose cũng được sử dụng làm nguồn cung cấp cacbon, các đường khác như fructose, maltose hoặc cao malt ít được sử dụng hơn Nguồn nitơ có thể là vô cơ

và hữu cơ như cao nấm men, peptone, cao thịt, KNO3, NH4NO3,… Một số nguồn nitơ

vô cơ có thể ức chế tăng trưởng của nấm [69]

1.4.2 Ảnh hưởng của môi trường lên men rắn đến khả năng sinh bào tử của nấm

Nguồn cacbon:

Cacbon là một yếu tố không thể thiếu đối với mọi loại nấm cũng như vi sinh vật Tuy nhiên, nồng độ cacbon trong môi trường quá cao cũng gây ức chế sự sinh trưởng của vi sinh vật Gao và cộng sự (2009) đã nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ cacbon trong môi trường lên men sinh bào tử của một số chủng nấm Kết quả cho thấy

nồng độ tốt nhất cho sự sinh bào tử của chủng nấm L lecanii CA.1.G và M anisopliae

RS 4 1 là 4 g/l, Paecilomyces lilacinus IPC P là 1 g/l, P lilacinus M.14 là 2 g/l, M anisopliae SQZ 1 21 là 16 g/l, Tricoderma viride TV.1 là 2 g/l [40]

Nguồn cacbon được sử dụng như: glucose, lactose, bột ngô, bột gạo, bột mì,… ngoài khả năng cung cấp cacbon, chúng còn cung cấp nitơ, muối khoáng và giá thể Feng và cộng sự (2000) đã sử dụng gạo, trấu, cám gạo để tối ưu nguồn cơ chất lên men

rắn sản xuất bào tử chủng Verticillium lecanii, gạo luộc và cám gạo cho năng suất bào

tử tương đối bằng nhau, với cám gạo đạt 1,4 x 109 bào tử/g cơ chất và gạo luộc đạt 1,5

x 109 bào tử/g cơ chất [36] Vu và cộng sự (2008) sử dụng gạo luộc để lên men rắn L lecanii 41185 sản xuất bào tử với năng suất đạt từ 5,7 x 109 đến 1,82 x 1010 bào tử/g cơ chất [108]

Nguồn nitơ :

Nitơ được cung cấp từ nhiều nguồn khác nhau như muối nitơ, muối nitrate, peptone, cao nấm men, bột đậu tương, bột cá hay chitin Nguồn nitơ nào phù hợp nhất cho sự sinh bào tử tùy thuộc vào từng chủng nấm Nồng độ nitơ tối ưu cho sự sinh bào

tử của nấm còn phụ thuộc vào tỉ lệ C/N

Nghiên cứu về ảnh hưởng của tỉ lệ C/N lên sự sinh bào tử của một số chủng

Trang 24

1.G, P lilacinus IPC – P và M anisopliae RS.4.1 là 5:1, P lilacinus M.14 và T viride TV.1 là 10:1, M anisopliae SQZ 1.21 là 80:1 [40] Tuy nhiên, trong môi trường tự

nhiên như bột ngũ cốc, pepton, cao nấm men,… thì rất khó kiểm soát được hàm lượng nitơ cũng như tỉ lệ C/N

Shi và cộng sự (2009) đã sử dụng peptone, cao nấm men, bột đậu tương làm

nguồn cacbon để lên men V lecanii CBS 102071, bào tử sản xuất nhiều nhất với

nguồn nitơ là cao nấm men [98] Vu và cộng sự (2008) đã chọn được nguồn nitơ là KNO3 với nồng độ 0,6% bào tử sản xuất bởi nấm L lecanii 41185 đạt cao nhất [108]

Nhiệt độ lên men :

Dựa vào khoảng nhiệt độ thích nghi, có thể phân loại vi sinh vật thành 3 nhóm Nhóm ưa lạnh sinh trưởng tốt ở nhiệt độ dưới 15oC, nhóm ưa ấm sinh trưởng tốt ở 20 – 37oC, nhóm ưa nhiệt sinh trưởng và phát triển tốt ở nhiệt độ trên 50o

C Phần lớn nấm

là sinh vật ưa ấm và phát triển tốt nhất ở 25 – 30oC [3] Theo Kope và cộng sự (2008),

nấm Lecanicillium spp sinh trưởng tốt nhất ở 25oC [63]

Độ ẩm môi trường và độ ẩm cơ chất :

Nước là yếu tố không thể thiếu đối với sự sống của sinh vật Nước vừa tham gia cấu tạo nên cơ thể vừa tham gia điều hòa các hoạt động sinh lý, sinh hóa của cơ thể Nhìn chung, nấm có thể sinh trưởng trong giới hạn độ ẩm khá rộng, nấm sinh trưởng trên cơ chất gạo luộc có độ ẩm 20% hay môi trường dinh dưỡng lỏng Tuy nhiên, mỗi loài nấm đòi hỏi một độ ẩm tối ưu khác nhau, trên mỗi loại cơ chất thì độ ẩm tối ưu

cho nấm phát triển cũng khác nhau Theo Vu và cộng sự (2008), chủng nấm L lecanii

41185 sinh bào tử cao nhất khi độ ẩm không khí là 75% và độ ẩm cơ chất là 28,5%

[108] Trong nghiên cứu của Shi và cộng sự (2009), V lecanii thích hợp nhất ở độ ẩm

không khí 97%, bổ sung 7 ml cơ chất lên men (35,79 g bột ngô ; 8,69 g cao nấm men; 1,63 g KH2PO4 ; 0,325 g K2HPO4 ; 0,325 g MgSO4 trong 1 lít môi trường/ 2 g bã mía [98]

Một số yếu tố khác :

Trong môi trường lên men rắn, nguồn cơ chất tự nhiên như bột gạo, bột ngô, bột đậu tương, lõi ngô, cám gạo,… ngoài khả năng cung cấp các chất dinh dưỡng

Trang 25

(cacbon, nitơ, muối khoáng), chúng còn ảnh hưởng đến khả năng sinh bào tử của nấm

L lecanii vì mỗi nguồn cơ chất sẽ tạo ra độ thoáng khí, khả năng trao đổi nhiệt cho

môi trường lên men khác nhau

Bào tử đính được sản xuất trên môi trường rắn (dạng bào tử thích hợp nhất để bảo quản và phối trộn với dầu khi sử dụng), cơ chất rắn từ các loại ngũ cốc như gạo,

kê, ngô, cám lúa mì, là các sản phẩm tự nhiên nên thành phần dinh dưỡng của chúng rất đa dạng, các loại nấm sẽ sử dụng một phần dinh dưỡng của cơ chất để tăng trưởng

và sinh bào tử Trong một số trường hợp, cấu trúc bề mặt của cơ chất quan trọng hơn các chất dinh dưỡng cung cấp [69]

Một cơ chất lý tưởng sẽ tạo ra một diện tích bề mặt lớn và có không gian để thông khí tốt nhất trong cơ chất tạo điều kiện cho hình thành bào tử Do đó, gạo, gạo tấm thường được sử dụng làm cơ chất để lên men rắn sản xuất bào tử Với các hạt nhỏ tạo ra một diện tích bề mặt lớn và nếu được xử lí cẩn thận, các hạt gạo vẫn tách riêng

biệt sau khi hấp khử trùng và cấy giống [69] Shi và cộng sự (2009), V lecanii sinh

bào tử trên cơ chất bã mía tốt hơn trên cơ chất cám lúa mì [98] Vu và cộng sự (2008)

đã chọn được gạo là nguồn cơ chất tốt nhất để lên men rắn sản xuất bào tử từ chủng

nấm L lecanii 41185, sau khi đánh giá nhiều nguồn cơ chất như cám mì, gạo, trấu,

than bùn, gạo trộn cám gạo, gạo trộn bột mì, gạo trộn gạo tấm [108] Chất khoáng có trong các cơ chất tự nhiên nhưng hàm lượng các chất khoáng có sự khác nhau Vu và

cộng sự (2008) đã chứng minh L lecanii 41185 sinh bào tử cao nhất khi bổ sung 0,6%

KNO3 và 0,02% MgSO4 [108]

1.4.3 Tạo chế phẩm bào tử và sử dụng

Theo Soper và Ward (1981) chế phẩm sinh học thương mại phải được xây dựng theo hai tiêu chí: (1) dễ dàng sử dụng trên đồng ruộng; (2) thời hạn sử dụng và hiệu lực diệt côn trùng lâu dài là những tiêu chuẩn để đánh giá cho một chế phẩm nấm kí sinh trùng Một chế phẩm sinh học tốt phải được phối trộn chính xác các thành phần phụ gia và loại phụ gia phù hợp Việc tạo ra một chế phẩm bào tử nấm diệt côn trùng phù hợp đòi hỏi sự hiểu biết về chu kỳ sống và các đặc điểm sinh học của cả nấm và côn trùng mục tiêu có liên quan [38] Chất phụ gia như: chất phân tán, chất hoạt động

Trang 26

bề mặt, các chất làm ẩm, chất bảo vệ bào tử do tác động của tia cực tím từ mặt trời,…

để phối trộn khi tạo chế phẩm; những chất này không ảnh hưởng đến sức sống, quá trình lây nhiễm của nấm, duy trì và năng nâng cao khả năng sống sót, độc tính của nấm trên đồng ruộng Tránh lựa chọn các chất phụ gia không tương thích, bất lợi đối với bào tử và cây trồng Mặt khác, để kiểm soát các loại sâu bọ ở những môi trường sinh thái khác nhau đòi hỏi phải tạo ra chế phẩm phù hợp Các chế phẩm sinh học phải phù hợp với các phương tiện và kỹ thuật hiện đang sử dụng phổ biến cho các thuốc trừ sâu thông thường [38]

Bào tử sản xuất theo phương pháp lên men lỏng thường được làm khô bằng cách sấy phun ở nhiệt độ và áp suất phù hợp để loại bỏ nước Sau lên men, sợi nấm được loại bỏ, ly tâm thu bào tử Bào tử được trộn với skim milk, glucose, lactose, vv… trước khi sấy phun [38]

Bào tử sản xuất từ lên men rắn, sau lên men cơ chất - bào tử được sấy khô bằng

hệ thống máy sấy có quạt thông gió ở nhiệt độ 35oC trong 24 giờ để loại bỏ nước để độ

ẩm còn lại từ 9 – 12%, bào tử được tách ra khỏi cơ chất bởi hệ thống sàng liên hợp với

ít nhất một sàng có kích thước lỗ nhỏ nhất là 74 µm ở đầu thu bào tử Bào tử tiếp tục làm khô bằng sấy khô chân không hoặc đặt trong bình hút ẩm chứa silica gel để độ ẩm còn dưới 5% Bào tử được phối trộn với chất phụ gia tự nhiên như bột đất sét, bột diatomite, bột kaoline, than bùn, sữa khô, dầu khoáng,… để tạo chế phẩm ở 2 dạng (lỏng và dạng bột tan), bảo quản ở 4oC [37], [38], [47], [69]

Hàm lượng nước trong chế phẩm bào tử là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng sống sót của bào tử Chen và cộng sự (1983) cho thấy bột bào tử tinh khiết sau khi thu bằng máy có thể được lưu trữ trong hộp kín, không có chất phụ gia, bảo quản ở 4oC bào tử vẫn sống sót 71% sau 21 tháng nếu độ ẩm trong chế phẩm < 10% Bào tử trộn với một phụ gia (attaclay X - 250) bảo quản ở 26°C, sau 12 tháng độc tính của bào tử vẫn được duy trì ở mức cao

Khi phun, bột bào tử được pha với nước có bổ sung chất nhũ hóa hoặc dầu

khoáng Theo Cuthbertson và cộng sự (2010) hiệu quả diệt bướm khoai lang (Bemisia tabaci) bởi bào tử nấm Lecanicillium muscarium khi trộn với chất phụ gia Dung dịch

Trang 27

bào tử nấm chỉ diệt được xấp xỉ 60% nhưng sau khi trộn thêm dầu và phụ gia, khả

năng diệt Bemisia tabaci tăng 95% [30]

Pan và cộng sự (1988) đã phát triển chất nhũ hóa gồm 38,9% resin, 22,2% dầu diesel, 5,6% Na2CO3 và 33,3% nước để pha với bột bào tử B bassiana dùng phun

bằng máy bay diệt trừ sâu bướm thông Hỗn hợp được xử lý như sau: (1) Hỗn hợp resin và dầu diesel đun nóng chảy ở 130°C ; (2) Bổ sung dần dần hỗn hợp đó vào một dung dịch Na2CO3 khuấy nhẹ nhàng và sau đó tiếp tục đun sôi cho 'xà phòng hóa' cho đến khi bọt biến mất; (3) Bổ sung một lượng nước tương đương với 50% tổng khối lượng hỗn hợp đã được nhũ hóa và tiếp tục đun sôi (1,5 – 2,0 giờ) cho đến khi nước dư thừa bay hơi và đạt khối lượng mong muốn Các kết quả thu được chất lỏng nhũ hóa mong muốn có giá trị pH 8,65 và khối lượng riêng bằng 1, chất dịch này có màu nâu nhưng sẽ trở thành màu trắng đục khi pha với nước Chất nhũ hóa này không làm ảnh hưởng đến sức sống của bào tử mà còn làm tăng đáng kể tính độc hại của chế phẩm đối với sâu hại thông Cũng trong báo cáo này của Pan và cộng sự thì việc phối trộn với 12,5% chất nhũ hóa (v/v) là nồng độ lý tưởng khi phun chế phẩm lên tán rừng Chế phẩm (800 lít) được làm nhũ hóa, dùng máy bay để phun khoảng 533 ha (125 g bột bào tử khô/ha, > 1,2 x 1010 bào tử/g) Một loại dầu khoáng gọi là Erxianýou (Trung

Quốc) cũng thích hợp với bào tử nấm B bassiana, từ 2 – 3 lít (5 – 10 x 109 bào tử/ml) phối trộn dầu có thể phun cho ít nhất 1 ha [38]

Theo Hayler (1993) việc bổ sung dầu hạt cải vào bào tử V lecanii trước khi phun đã làm tăng hiệu quả diệt rệp bông A gossypii và bọ trĩ Frankliniella occidentalis trên dưa chuột trong nhà kính lên tới 90% [100]

Trang 28

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu

Cây ngô và rệp ngô được trồng và nuôi tại nhà lưới của Viện bảo vệ thực vật,

Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, Xã Đông Ngạc huyện Từ Liêm, Hà Nội

Nước muối sinh lý 0,9% NaCl

Dung dịch glyxerol 30% 30% glyxerol

Dung dịch glyxerol 50% 50% glyxerol

Trang 29

Một số vật liệu cần thiết khác như: cám gạo, gạo lức, bột ngô, bột lõi ngô, bột sắn, bột đậu tương và khoai tây mua tại chợ ở Hà Nội

2.1.4 Môi trường nuôi cấy

Môi trường PDB (potato dextrose broth) (g/l): 200 g khoai tây bỏ vỏ, đun sôi

cách thủy 2 giờ thu dịch chiết; 20 g glucose; 5 g KNO3

Môi trường PDA (potato dextrose agar) (g/l): Môi trường PDB được bổ sung

thêm 20 g agar

2.1.5 Thiết bị

Các thiết bị được sử dụng trong thí nghiệm thuộc Phòng Các chất chức năng sinh học; Phòng Công nghệ enzyme và Phòng trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa hoc và Công nghệ Việt Nam

Nhà lưới của Viện Bảo vệ thực vật, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn

Bảng 2.2 Danh mục các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm

Máy đo pH HANA HI 2211 PH/ORP Meter Ý

AB applied Biosystems, Gene Amp PCR system 2700, Singapore

Trang 30

Nguồn điện di Life & Technology GIBCOBRL CH Pháp

Vortex

Tủ lên men rắn Biose, Ldt 1000 l

Trung Quốc Liên doanh

C

Lên men lỏng để nhân giống:

Cắt một miếng thạch có chứa nấm (10 x 10 mm2) đã được nuôi 7 ngày tuổi trên môi trường PDA cấy vào bình tam giác 250 ml có chứa 100 ml môi trường PDB đậy bằng nút bông và nắp giấy, được khử trùng ở 121oC trong 20 phút (Potato Dextrose

Trang 31

Broth: 1 lít dịch chiết từ 200 g khoai tây, 20 g glucose), pH = 6, ủ trong máy lắc tốc độ

200 vòng/phút, ở nhiệt độ 28oC

Lên men rắn:

Gạo lức ngâm trong nước 2 giờ, vớt để ráo nước Đun sôi nước, đổ gạo vào đun sủi đều, tắt bếp, ngâm khoảng 10 phút để hạt gạo đủ trương nước mà không bị hồ hóa, vớt ra để khô bề mặt hạt gạo Sau đó gạo luộc được đưa vào túi plastic (hoặc khay

có nắp đậy) và các bình tam giác 250 ml với khối lượng lần lượt là 700 g/túi (hoặc 500 g/khay) và 10 g/bình, khử trùng ở 121oC, 1 atm, trong 30 phút Sau khi để nguội, cơ chất được tiếp 15% giống 5 ngày tuổi, 10% khoáng Czapek, pH = 6, lên men 12 ngày

ở 28o

C Sau 12 ngày lên men, số lượng bào tử được xác định bằng buồng đếm hồng cầu Neubauer [38], [107]

Làm khô cơ chất – bào tử sau lên men rắn:

Hỗn hợp cơ chất – bào tử sau lên men được làm khô ở các điều kiện như hong khô trong phòng thí nghiệm, trong tủ hút có quạt thông gió, trong bình hút ẩm có chứa

vôi sống để làm giảm độ ẩm của hỗn hợp cơ chất – bào tử xuống còn khoảng 10% ], [

Tách và thu bào tử:

Lấy 1 kg hỗn hợp cơ chất – bào tử đã khô có mật độ bào tử đạt 3,93 x 1011CFU/g cơ chất để tách bào tử Sau đó hỗn hợp được sàng qua 3 lớp khác nhau có kích thước lần lượt 710 µm, 180 µm và 75 µm để thu bào tử [37]

Bảo quản bào tử:

Bào tử làm khô còn 5% độ ẩm được kiểm tra sức sống bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên môi trường rắn Sau đó, bào tử được phối trộn với các chất phụ gia để bảo quản

Dạng lỏng: 10% bào tử nấm đã khô trộn với các dung dịch bảo quản gồm: hỗn

hợp (10% sữa gầy, 5% glucose), dầu Do, parafin, dầu Mo80, dầu Mo – chất phụ gia (72% dầu Mo80, 8% AT50, 10% EFW) đựng trong ống falcon có nắp kín, bảo quản ở

4oC và 26oC

Trang 32

Dạng bột khô: Bảo quản trong hộp kín có đựng các gói silicagel hút ẩm: 20%

hạt silica gel khô (w/w) gói riêng trong túi vải màn, bột bào tử và silica gel được đặt trong 2 lớp túi nilon và túi thiếc hút chân không, ở 4oC và 26oC

Dạng bột tan: 20% bột bào tử trộn với các chất phụ gia dạng bột tan theo tỉ lệ 20% bột bào tử trộn với hỗn hợp phụ gia (5% DW95 – Chất phân tán, 10% DA203W – chất phân tán, 50% Diatom300 – chất độn, 15% Kao – chất độn) đựng trong 2 lớp túi nilon và túi thiếc hút chân không, bảo quản ở 4oC và 26oC Khả năng sống sót của bào

tử được đánh giá định kỳ sau 1, 3, 6, 9 tháng bảo quản bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên môi trường rắn [37], [38], [69]

W: Trọng lượng cốc nung và mẫu tươi D: Trọng lượng cốc nung và mẫu khô B: Trọng lượng của cốc nung

Tính độ ẩm trong trong chế phẩm:

M (%) =M1 - M2 Trong đó:

M là% độ ẩm còn lại trong mẫu

M 1 là% độ ẩm tuyệt đối trong hỗn hợp bào tử cơ chất sau lên men rắn

M 2 là% độ ẩm đã bay hơi trong quá trình làm khô

Trang 33

2.2.3 Tối ưu điều kiện lên men rắn

Cơ chất đựng trong bình tam giác 250 ml, khử trùng ở 121oC trong 25 phút, để nguội Lấy 1 ml giống được lên men ở dạng lỏng 5 ngày tuổi thêm vào môi trường lên men và trộn đều bằng thìa cán dài vô trùng Bình được nút bông và nắp giấy để tránh

bị nhiễm và đủ lượng ôxi cho nấm phát triển thể sợi và tạo bào tử Các bình tam giác sau đó được ủ tĩnh ở các điều kiện khác nhau: nhiệt độ, pH và độ ẩm tương đối trong khoảng thời gian khác nhau, tùy thuộc vào mục đích thí nghiệm Trong 3 ngày đầu tiên, sau 12 giờ các bình tam giác được lắc nhẹ một lần để đảm bảo bên trong môi trường luôn thoáng khí

Các yếu tố tối ưu bao gồm:

Cơ chất: bột ngô, lõi ngô, gạo lức, cám gạo, bột sắn, bột ngô – lõi ngô (1:1, w/w), cám gạo – lõi ngô (1:1, w/w), bột ngô – cám gạo (1:1, w/w), bột ngô – bột sắn (1:1, w/w), bột sắn – lõi ngô (1:1, w/w), bột sắn – cám gạo (1:1, w/w)

Tỷ lệ cơ chất sau chọn lọc gồm có 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2 (w/w)

Độ dày cơ chất từ 8 – 26 g trong bình tam giác có thể tích 250 ml

Độ ẩm 40 – 120% v/w (trong đó v và w lần lượt là thể tích nước và khối lượng

cơ chất) tương đương với độ ẩm từ 23 – 58% của môi trường cơ chất

pH của môi trường lên men rắn từ 3 – 10 (sử dụng dải pH của các loại đệm citrat, đệm photphate, đệm glycine – NaOH)

Nhiệt độ ủ lên men từ 26 ~ 37oC

Nguồn nitơ bổ sung vào cơ chất đạt nồng độ cuối cùng 0,5% (w/w) gồm nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ như bột đậu tương, cao nấm men, ure, peptone, cao thịt, NaNO3,

Trang 34

Các thí nghiệm được tiến hành kế tiếp nhau dựa vào các kết quả chọn lọc từ thí nghiệm trước đó, số lượng bào tử nấm sinh ra sau lên men được xác định bằng buồng đếm hồng cầu

2.2.4 Phương pháp xác định số lượng và khả năng sống sót của bào tử sau bảo quản

Xác định số lượng bào tử:

Pha loãng: Cần 1g hỗn hợp cơ chất – bào tử sau lên men rắn 12 ngày (hoặc 1g

chế phẩm dạng bột hoặc 1 ml chế phẩm dạng lỏng) cho vào trong ống falcon, bổ sung

9 ml Tween 80 0,05% ngâm trong 30 phút, thu được dung dịch bào tử có độ pha loãng

10-1 và tiếp tục pha loãng đến 10-2 Tiếp tục làm như vậy đến khi thu được dung dịch bào tử có độ pha loãng cần thiết (10- n) (Hình 2.1)

Hình 2.1 Phương pháp pha loãng bào tử

Đếm bào tử: Bào tử được đếm trong buồng đếm hồng cầu (Neubauer improved,

Superior Marienfeld, Germany) soi dưới kính hiển vi với độ phóng đại 400 lần Đếm tổng số 5 ô vuông lớn lần lượt ở 4 góc và ở chính giữa trong tổng số 25 ô vuông lớn trên buồng đếm hồng cầu neubauer (mỗi ô vuông lớn có 16 ô vuông nhỏ) (Hình 2.2)

Số lượng bào tử được xác định bằng công thức: A = a.k.5.104

Trong đó: A – là số lượng bào tử có trong 1 gam cơ chất hoặc 1 ml dịch nuôi; a – là số lượng bào tử đếm được trong 5/25 ô vuông lớn của buồng đếm neubauer; k – là

hệ số pha loãng; 5 – là tỉ lệ chênh lệch giữa số lượng ô vuông lớn được đếm so với

Trang 35

Atổng số ô vuông lớn của buồng đếm neubauer; 104 là hằng số để tính đủ thể tích 1 ml (tổng thể tích của 25 ô vuông lớn trên buồng đếm neubauer là ml)

Hình 2.2 Phương pháp đếm bào tử trên buồng đếm hồng cầu

Phương pháp xác định số lượng bào tử sống sót bằng số khuẩn lạc (CFU/g hoặc CFU/ml):

Lấy 1 g hỗn hợp bào tử bảo quản dạng khô (hoặc 1 ml chế phẩm dạng dầu) pha loãng đến 10- 11

Hút 0,1 ml ở mỗi nồng độ đã pha loãng cấy trải trên đĩa thạch PDA, ủ

ở 28oC, trong 4 ngày, đếm khuẩn lạc để xác định số lượng bào tử

Số khuẩn lạc được đếm và xác định theo công thức trong bài giảng của Lê Minh Tâm [11] Số liệu được xử lý bằng phần mềm Excel

2.2.5 Nghiên cứu khả năng diệt rệp hại ngô A maydis của chế phẩm bào tử nấm L lecanii L439

Chuẩn bị chế phẩm:

Công thức phun chế phẩm có sự tham khảo chế phẩm Mycotal (Hà Lan) Dung dịch chế phẩm bao gồm: chất phụ gia (0,05% DW95 – chất giữ ẩm và bám dính; 0,05% DA203W – chất giữ ẩm và phân tán; 0,05% EFW – chất giữ ẩm và phân tán; 0,1% dầu Mo – chất lan tỏa, bám dính; 0,05% tween80 – chất bám dính), bào tử nấm

và nước để dung dịch phun có nồng độ 107

, 108 và 5 x 108 bào tử/ml

Trang 36

Trong phòng thí nghiệm:

Nuôi rệp ngô: Rệp ngô bắt từ đồng ruộng được nuôi trên các mảnh lá ngô kích

thước khoảng 10 x 10cm đựng trong các hộp có nắp đậy, dưới đáy có dải 3 – 4 lớp giấy thấm nước (để độ ẩm tương đối khoảng 85%) giúp cho lá ngô luôn tươi và rệp sống bình thường, nuôi ở nhiệt độ 28 – 30oC Hằng ngày kiểm tra khả năng sống của rệp, thay lá ngô mới và bổ sung độ ẩm (nếu cần) Sau 4 – 5 ngày, khi chúng bắt đầu đẻ con non thì tách những con rệp non ra nuôi riêng ở các hộp khác nhau, mỗi hộp nuôi

25 con để phục vụ cho các thí nghiệm sau này khi chúng đạt kích thước mong muốn

Phun chế phẩm: Mỗi công thức thí nghiệm lặp lại 3 lần, phun sương bằng bình

xịt, khoảng cách 25 – 30cm

Các công thức phun: CT1 (dung dịch có nồng độ 107 bào tử/ ml, có chất phụ gia); CT2 (dung dịch có nồng độ 108 bào tử/ ml, có chất phụ gia); CT3 (dung dịch có nồng độ 5 x 108 bào tử/ ml, có chất phụ gia); CT4 (dung dịch chất phụ gia, không có bào tử) và CT4 (đối chứng không phun Sau khi phun bào tử lên rệp ngô và đối chứng không phun) Hàng ngày, kiểm tra số lượng rệp còn sống sót, rệp mới sinh để tính tỷ lệ rệp chết

Trong nhà lưới và ngoài đồng ruộng:

- Xác định nồng độ phun: nồng độ phun 107, 108, 5 x 108 bào tử/ml

- Xác định số lần phun chế phẩm: 1 lần phun, 2 lần phun và 3 lần phun (các lần

phun cách nhau 7 ngày)

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi công thức 5 m2 nhắc lại 3 lần Gieo ngô trong chậu vại để làm thức ăn nuôi rệp Khi số lượng rệp vừa

đủ lớn, tiến hành thả rệp Khi mật độ rệp từ 10 – 20 con/cây tiến hành phun chế phẩm vời nồng độ và thời điểm phun khác nhau Điều tra mật độ rệp (con/cây) ở 3,7, 10 ngày sau phun, phương pháp điều tra: theo dõi 5 điểm cố định, mỗi điểm 2 cây

Phương pháp xử lý số liệu:

Hiệu lực của chế phẩm trên rệp ở trong nhà lưới và phòng thí nghiêm được xác định theo công thức Abbott, ở ngoài đồng ruộng theo công thức Henderson – Tilton

Trang 37

Công thức Abbott [13]:

E(%) = E (%) : Hiệu lực của thuốc

C: Số sâu sống ở công thức đối chứng

T: Số sâu sống ở công thức thí nghiệm

Công thức Henderson- Tilton [46]:

T a : Số sâu sống ở công thức thí nghiệm sau khi phun

T b : Số sâu sống ở công thức thí nghiệm trước khi phun

C a : Số sâu sống ở công thức đối chứng sau khi phun

C b : Số sâu sống ở công thức đối chứng trước khi phun

Các giá trị trung bình của các công thức thí nghiệm đƣợc so sánh bằng trắc nghiệm F, t ở mức xác suất p ≤ 95% Số liệu đƣợc xử lý thống kê bằng các phần mềm EXCEL

100

C T C

Trang 38

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Tối ưu điều kiện lên men rắn sản xuất bào tử nấm kí sinh côn trùng L lecanii

L439

3.1.1 Ảnh hưởng của nguồn cơ chất

Trong các nguồn cơ chất được thử nghiệm, nấm L lecanii L439 lên men rắn

hỗn hợp cám gạo – bột ngô (1:1, w/w) cho năng suất bào tử cao nhất đạt (3,87 ± 0,204)

x 108 bào tử/g cơ chất Với các nguồn cơ chất khác như: gạo, cám gạo – lõi ngô (1:1, w/w), cám gạo, bột ngô – lõi ngô (1:1, w/w) cho năng xuất thấp hơn, từ (2,69 ± 0,4) x

Trang 39

Kết quả này có sự khác biệt với các nghiên cứu trước đây Feng và cộng sự

(2000) lên men rắn sản xuất bào tử V lecanii trên môi trường gạo và cám gạo cho

năng suất bào tử đạt lần lượt là 1,5 x 109

và 1,4 x 109 bào tử/g cơ chất Vu và cộng sự

(2008) sản xuất bào tử chủng L lecanii 41185 trên môi trường gạo, năng suất đạt từ

5,7 x 109 đến 1,82 x 1010/g cơ chất [36], [108] Shi và cộng sự (2009) đã lên men sản

xuất bào tử nấm Verticillium lecanii CBS 102071 trên cơ chất bã mía với nguồn cung

cấp cacbon là bột ngô cho số lượng bào tử 1,1 x 1010 bào tử/ Ơg chất khô [98]

Lên men trên các nguồn cơ chất còn lại L lecanii L439 sản xuất bào tử không

cao, do vậy nguồn cơ chất cám gạo – bột ngô (1:1, w/w) được chọn để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo

3.1.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ các thành phần cơ chất

Hình 3.2 Ảnh hưởng tỉ lệ của bột ngô, cám gạo trong cơ chất lên men đến khả năng

sản xuất bào tử nấm L lecanii L439

BN (Bột Ngô); CG (Cám gạo)

Tỉ lệ thành phần cơ chất làm môi trường lên men rắn có ảnh hưởng lớn đến khả

năng sản xuất bào tử của chủng nấm L lecanii L439 (Hình 3.2) Cơ chất cám gạo – bột

ngô tỉ lệ (6:4, w/w) có số lượng bào tử (1,08 ± 0,08) x 1010/g cơ chất, tỉ lệ 2:8 và tỉ lệ 3:7 cho bào tử thấp nhất ở mức (6,44 ± 1,3) x 109 và (7,11 ± 1,4) x 109 /g cơ chất Các

10.83

02468101214

2 CG: 8 BN

3 CG: 7 BN

4 CG: 6 BN

5 CG: 5 BN

6 CG: 4 BN

7 CG: 3 BN

Trang 40

tỉ lệ còn lại cho số lượng bào tử từ (8,5 ± 0,44) x 109 đến (1,01 ± 0,15) x 1010 /g cơ

chất (P < 0,01)

Nghiên cứu của Lin và cộng sự (1988), nấm B brongniartii lên men trên hỗn

hợp cơ chất gồm bột vỏ hạt bông, cám lúa mì, bột ngô với tỷ lệ (70: 25:5, w/w/w) cho năng suất đạt 2,9 x 109

bào tử/g cơ chất khô [108] Tao và cộng sự (1988) lên men sản

xuất bảo tử nấm B bassiana trên hỗn hợp cơ chất gồm 70% cám lúa mì, 25% bột ngô

đạt lượng bào tử 2,9 x 1010/g cơ chất khô [38] Tỉ lệ 6:4 được sử dụng để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo

3.1.3 Ảnh hưởng của độ dày cơ chất

Ở độ dày cơ chất tương đương với 14 g cơ chất/bình tam giác 250 ml thích hợp

nhất cho sự sản xuất bào tử của L lecanii L439 với số lượng đạt được (1,04 ± 0,06) x

1010 bào tử/g cơ chất, sấp sỉ số lượng bào tử đạt được khi lên men ở độ dầy tương đương 12 g và 16 g lần lượt đạt mức (1,03 ± 0,04) x 1010

bề mặt gây cản trở sự khuếch tán của ôxy tới những vị trí này, làm ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của sợi nấm [52] Độ dầy cơ chất tương đương với 14 g được

chọn để tiến hành thí nghiệm tiếp theo

Định dạng
Số trang	99
Dung lượng	1,55 MB