Tiểu luận môn Phân tích sắc ký. Đề tài Tìm hiểu về các loại detector trong sắc ký lỏng

Tiểu luận môn Phân tích sắc ký. Đề tài Tìm hiểu về các loại detector trong sắc ký lỏng Tiểu luận môn Phân tích sắc ký. Đề tài Tìm hiểu về các loại detector trong sắc ký lỏng Tiểu luận môn Phân tích sắc ký. Đề tài Tìm hiểu về các loại detector trong sắc ký lỏng Tiểu luận môn Phân tích sắc ký. Đề tài Tìm hiểu về các loại detector trong sắc ký lỏng Tiểu luận môn Phân tích sắc ký. Đề tài Tìm hiểu về các loại detector trong sắc ký lỏng Tiểu luận môn Phân tích sắc ký. Đề tài Tìm hiểu về các loại detector trong sắc ký lỏng Tiểu luận môn Phân tích sắc ký. Đề tài Tìm hiểu về các loại detector trong sắc ký lỏng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP.HỒ CHÍ MINH

TIỂU LUẬN MÔN

Đỗ Duy Tân – 10231391 Nguyễn Chí Thanh – 10230641

Detector được trang bị với flow-cell là một bước đột phá lớn

trong sự phát triển của sắc ký lỏng hiện đại

Phát hiện này lần đầu tiên được áp dụng bởi nhóm Tiselius, tại

Thụy Điển vào năm 1940, bằng cách liên tục đo chỉ số khúc xạ

của cột nước thải

Hiện tại, Detector LC có phạm vi hoạt động rộng cho phép

phân tích và quy mô chuẩn bị chạy trên cùng một công

cụ Chúng có độ nhạy cao, thường cho phép phát hiện lượng

vết của các chất

Hình 1.1:

Arne Wilhelm Kaurin Tiselius

(1902-1971)

Trong thập kỷ qua, có một tiến bộ đáng kể trong sự phát triển của detector trong HPLC trong đó HPLC ghép đầu dò MS được cho là có độ nhạy và độ chọn lọc cao nhất

1 Giới Thiệu về Detector trong sắc ký lỏng

1.1 Tổng quan

Nhiệm vụ của đầu dò (detector) là nhận biết các thành phần mẫu khi chúng giải hấp ra khỏi cột sắc ký Đầu dò có khả năng phân tích cả định tính và định lượng Để đầu dò phù hợp với mục đích sử dụng, cần thỏa mãn các yêu cầu về

độ nhạy, tính chọn lọc, độ ổn định, dải tuyến tính, thể tích đầu dò và thời gian đáp ứng

Hình 1.1 Sơ đồ hệ thống LC

Trong sắc ký lỏng người ta thường dùng các quang phổ kế đo quang có độ nhạy cao, nhờ đó có thể nhận dạng các hợp chất đến nồng độ cực nhỏ 10-10 M trong miền ánh sáng nhìn thấy.

Để dò tìm các chất không màu người ta thường dùng các máy đo

chiết suất vi sai

Khi phân tích các chất có khả năng oxy hóa – khử người ta dùng các bộ dò tìm điện hóa (đo điện thế, cực phổ) Người ta cũng dùng các bộ dò tìm huỳnh quang, đo độ dẫn điện

* Tính chất chung của detector :

 Tính chọn lọc cao

 Độ nhạy cao

 Trơ với mẫu và điều kiện môi trường, ổn định khi phân

tích mẫu, thể tích nhỏ gọn, dễ sử dụng và dễ vận hành…

1.2 Các thông số quan trọng của detector

* Độ nhạy ( S > 2N)

* Thời gian đáp ứng (response)

* Khoảng tuyến tính

* Độ chính xác, độ đúng

Thời gian đáp ứng: là thời gian cần thiết để cho tín hiệu điện tương ứng

với nồng độ nhất định trong pha khí được thiết lập

Khoảng tuyến tính: đây là thông số quan

trọng nhất để đánh giá chất lượng của bất

kì một loại detector nào

Nó bao gồm phạm vi kể từ nồng độ lớn cho

tới nồng độ nhỏ nhất vẫn còn phân biệt rõ

ràng so với can nhiễu của đường nền

Hình 1.2 Khoảng tuyến tính của đồ thị

Khoảng tuyến tính của một detector được coi là lớn,

nếu như:

- Can nhiễu đường nền nhỏ và do vậy khả năng phát

hiện của detector này lớn

- Các lượng chất nhỏ nhất cũng như các lượng chất lớn

nhất được phát hiện với khả năng đáp ứng như nhau

Can nhiễu đường nền

Nguyên nhân:

- Mất cân bằng trong detector do nguồn điện cung cấp cho detector dẫn đến đầu ra thay đổi chậm

- Thay đổi nhiệt độ xung quanh

Short Term noise

Long Term noise

Drift

Total noise

Nguyên nhân: Detector, máy ghi Khắc phục: sử dụng bộ lọc nhiễu

Nguyên nhân: sự không ổn định

detector làm thay đổi môi trường xung quanh

(VD: RID detector độ nhạy phụ thuộc nhiệt độ và áp suất)

1.3 Phân loại Detector

- Detector điện hóa:(electrochemical detector )

đo dòng, cực phổ, độ dẫn

- Detector chỉ số khúc xạ (chiết suất vi sai)

(reflective index,RI)

- Detector tán xạ bay hơi (evaporative light

scattering detector ,ELSD)

- Detector UV-VIS đơn bước sóng (UV detector )

để phát hiện các chất hấp thụ quang

Đây là lọai đầu dò thông dụng nhất

- Detector huỳnh quang (fluorescence detector )

để phát hiện các chất hữu cơ chứa huỳnh quang tự nhiên

và các dẫn suất có huỳnh quang

I Detector phát hiện sự thay đổi các đặc tính của dung dịch rửa giải

Hình 1.4: một số UV Detector

II.Các detector quang phổ

- Detector dãy diod quang (photodiode array , PDA )

có khả năng quét chồng phổ để định tính các chất theo

độ hấp thụ cực đại của các chất

- Detector khối phổ (MS)

• Đầu dò khối phổ bẫy ion (Ion Trap, IT)

• Đầu dò khối phổ cộng hưởng cyclotron sử dụng phép

biến đổi Fourier (Fourier Transform Ion Cyclotron

Resonance Mass Spectrometry, FTICR hay FT-MS)

• Đầu dò khối phổ thời gian bay (Time-of-Flight, TOF)

• Đầu dò khối phổ tứ cực (Quadrupole) Hình 1.5 Detector

bẫy ion

Bảng 1.1: Bảng so sánh độ nhạy của một số detector trong LC

Bảng 1.2 Các thông số cơ bản của một số detector.

2 Nguyên lý hoạt động của một số detector trong sắc ký lỏng

2.1 Detector điện hóa

Detector điện hóa thực chất là một máy phân tích điện hóa được dùng như một detector có độ nhạy cao và dựa vào sự thay đổi cường độ dòng điện, điện thế hay sự thay đổi độ dẫn, điện lượng,

Nguyên tắc: Tín hiệu đo theo tính chất điện hóa tuân theo

mối quan hệ sau:

A = k.C

A : tín hiệu đo

K : hằng số thực nghiệm của phép đo ( phụ thuộc vào điều kiện thực nghiệm chọn trước & cấu tạo flowcell của detector

I.Cấu tạo detector điện hóa

Gồm 2 bộ phận:

- Buồng đo (flowcell) và điện cực

- Hệ đo để nhận, khuếch đại tín hiệu

nhận được,ghi nhận cũng như điều

khiển quá trình đo

Phản điện cực Vòng đệm

RE-3V điện cực tham chiếu

Điện cực hoạt động

Cấu tạo flowcell

Hình 2.1 Sơ đồ cấu tạo chi tiết của flow-cell trong detector điện hóa

II Hệ điện cực

Hệ điện cực của detector điện hóa thường gồm 3 loại điện cực

Một vài loại điện cực thường dùng

Hình 2.2 Một số điện

cực thường dùng

III.Một số detector điện hóa dùng trong HPLC

Detector điện hóa có nhiều loại khác nhau

Dựa vào nguyên tắc và cấu tạo người ta phân ra thành các loại sau :

- Detector đo điện dung

- Detector đo điện lượng

IV Ứng dụng của detector điện hóa

Trong kĩ thuật phân tích HPLC thì các detector điện hóa là một công cụ quan trọng để phát hiện và định lượng các chất vô cơ cũng như hữu cơ có tính chất điện hóa học Dù bằng phương pháp trực tiếp hay gián tiếp

Trong lĩnh vực phân tích hữu cơ, hầu hết các ứng dụng của detector điện hóa

là để phát hiện các hợp chất có trong các loại mẫu y học, sinh học, thực phẩm, môi trường

Bảng 2.2 Các nhóm chất được phát hiện bởi các detector khác nhau

2.2 UV detector

UV detector là đầu dò phổ biến rộng rãi nhất trong

phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Thiết bị này là đơn giản và dễ dàng phân tích được nhiều chất phân tích phù hợp cho HPLC hấp thụ tia UV

- Khoảng tuyến tính rộng

- Thể tích chết tương đối nhỏ nên UV detector kết hợp hiệu quả với HPLC

Nếu cần thiết, phạm vi bước sóng có thể dễ dàng

mở rộng sang vùng ánh sáng nhìn thấy (VIS) để phát hiện các chất phân tích có màu

Đây là lý do tại sao nó là rấtphổ biến và được sử dụng từ lâu kể từ những ngày khi các nhà hóa học xây dựng nên phương pháp phân tích sắc ký lỏng, nó được dùng phổ biến

từ năm 1958

I Giới thiệu

Mối liên hệ giữa cường độ ánh sáng

UV truyền qua cell đo

và nồng độ chất tan

I o: cường độ ánh sáng tới cell

I T : cường độ ánh sáng truyền qua

L: chiều dài của cell đo C: nồng độ chất tan.

k: hệ số dập tắt phân tử

(chất tan, bước sóng)

IT = Io.e-kLC

Ln.IT = Ln.Io.e-kLC

Nguyên tắc đo: dựa vào

định luật Lambert – Beer:

A=log(I0/I)= ε L.C

Cấu tạo flowcell trong

UV detector

II Nguyên tắc và Cấu tạo

Hình 2.3 cấu tạo flow-cell trong UV detector

Đầu dò này đo sự tập trung của mẫu dưới một dãy bước sóng trong giới hạn nhất định khi chúng rời khỏi cột và đi xuyên qua detector của dòng pin

Khi không có bước sóng đi xuyên qua detector tín hiệu là một giá trị không đổi Khi mẫu có bước sóng đi qua detector, detector sẽ phản ứng lại tín hiệu được hiển thị trên màn hình

Dưới hình thức đơn giản nhất đầu dò UV

bao gồm:

Nguồn sáng, dòng Pin, dòng cảm biến

Hình 2.4 sơ đồ

hệ thống đo trong HPLC

Khi không có mẫu qua detector ánh sáng đi

qua dòng pin và phát ra tín hiệu lớn nhất tại

dòng cảm biến nếu một mẫu có bước sóng đi

qua detector, mẫu này làm giảm lượng ánh

sáng ở dòng cảm biến và là nguyên nhân làm

thay đổi tín hiệu ở detector

Nguyên tắc hoạt động :

Tín hiệu này chuyển một dòng electron và xuất hiện sắc phổ trên giấy Tín hiệu hiển thị tăng lên tập trung tại mẫu của dòng pin

VIDEO NGUYÊN TẮC HOẠT ĐỘNG CỦA UV DETECTOR

Hình 2.5 quan hệ giữa độ nhạy và bước sóng

III.Detector UV_VIS đơn bước sóng

Đầu dò UV có bước sóng thay đổi sử dụng

ánh sáng đơn sắc ( cho ánh sáng đi qua khe

và tấm cách )

Để chọn 1 bước sóng ánh sáng đi qua mẫu

Hình 2.6 sơ đồ hoạt động của UV-VIS đơn bước sóng

Sơ đồ cấu tạo của UV-VIS detector – Đơn bước sóng

Hình 2.7 Sơ đồ cấu tạo của UV-VIS detector – Đơn bước sóng

- Kích thước Cell đo (L=1-10 mm, bk = 1mm)

- Đèn : Đèn hơi thủy ngân

Mô tả một UV detector đơn bước sóng

Hình 2.8 mô tả nguyên lý của UV-VIS detector

IV Đầu dò photodiode array (PAD)

- Đầu có khả năng quét chồng

phổ để định tính các chất theo

độ hấp thụ cực đại của các chất

Hình 2.9 Sơ đồ của quang phổ dãy điốt quang

Sơ đồ cấu tạo của PAD – Đa bước sóng

Hình 2.10 Sơ đồ cấu tạo của PAD – Đa bước sóng

Ghi lại thời gian của một peak đặc trưng,

phổ đồ của chất tan Phổ ghi nhận

Phổ đồ của PAD

V Ảnh hưởng của nhiệt đến Cell đo

Nói chung, hình dạng phổ đồ bị ảnh hưởng

bởi nhiệt độ môi trường

Sự khác biệt giữa độ hấp thu

do chênh lệch nhiệt độ

absorbance ở nhiệt độ cao absorbance ở nhiệt

độ thấp

VI Không khí hòa tan trong pha động ảnh hưởng

peak trong UV detector

Detection: UV-210nm

Pha động được

khử không khí Pha động chưa được khử không khí

2.3 Detector tán xạ bay hơi

(evaporating light scattering detector ,ELSD)

Evaporating Light Scattering Detector (ELSD),

hay còn gọi là Detector tán xạ bay hơi, thích

hợp cho việc phát hiện các thành phần mẫu

không bay hơi trong một dung môi dễ bay hơi

Các dòng dung môi đi qua một nebuliser vào

một buồng bốc hơi, dung môi được bốc hơi để

lại một màn sương của các hạt mẫu nhỏ

Những phân tán chùm tia sáng, và mức độ

của sự tán xạ ánh sáng là tỷ lệ thuận với số

lượng hiện tại mẫu

Nguyên tắc hoạt động

Hình 2.12 sơ đồ cấu tạo của ELSD

Quá trình thực hiện: Gồm 3 giai đoạn

Ống phun Bay hơi

ELSD đòi hỏi cung cấp một nguồn khí sạch (tốt

nhất là khí trơ) khô

Không khí nén đôi khi được sử dụng, nhưng cần

loại bỏ các dấu vết của dầu hoặc nước, vì chúng sẽ

cho ra một đường nền rất nhiễu

1 Ống phun

Cột mẫu đi vào thông qua một lổ nhỏ như lỗ

kim và pha trộn với khí nitơ để hình thành một

2 Bay hơi

Các hạt nhỏ đi qua nguồn nhiệt

“drift tube” nơi mà pha động bốc hơi,

để lại một màn sương của mẫu khô

là các hạt theo hơi dung môi

Phổ đồ của ELSD trong phân tích lipit

2.4.Detector chỉ số khúc xạ RI (Refractive Index)

Nguyên tắc phát hiện liên quan đến việc đo lường sự thay đổi trong chỉ

số khúc xạ của các dung dịch tách được từ cột sắc kí lỏng

Hình 2.13 Hiện tượng thay đổi góc khúc xạ

Sự khác biệt lớn về chỉ số chiết suất

giữa mẫu và pha động càng lớn thì

càng tạo ra một sự mất cân bằng lớn

Nên tính nhạy của đầu dò sẽ cao

hơn nếu có sự cách biệt về chỉ số

chiết suất giữa pha động và pha tĩnh

) /

( )

I Cấu tạo detector RI

Mirrow

Đầu dò chiết suất RI là một dụng cụ đòi hỏi có độ chính xác cao, bất cứ sự thay đổi nào trong thành phần của các cấu

tử cần tách cũng đòi hỏi sự tái lặp cân bằng của đầu dò

Biểu đồ thể hiện cách hoạt động

của detector chiết suất RI được

thể hiện theo hình sau: Nguồn sáng

Bộ phận tiếp nhận ánh sáng Phía

bên mẫu

Phía bên Tham chiếu

Nguyên lý hoạt động

Hình 2.14 cấu tạo RID

2.5.Detector huỳnh quang (fluorescence detector)

Detector huỳnh quang là detector nhạy cảm nhất

trong số các detector hiện đại hiện có HPLC

Có thể để phát hiện sự hiện diện của một phân

tử chất phân tích duy nhất trong flow-cell

Thông thường, độ nhạy huỳnh quang cao hơn

10 -1000 lần so với detector UV- VIS Detector

huỳnh quang chính xác và có tính chọn lọc hơn

trong số các detector quang học khác

Khoảng 15% các hợp chất có huỳnh quang trong tự nhiên Sự hiện diện của liên hợp pi-electron, đặc biệt là trong các thành phần thơm cho cường độ huỳnh quang cao nhất Ngoài ra, hợp chất béo và alicyclic với các nhóm cacbonyl và các hợp chất có liên kết đôi liên hợp đều phát huỳnh quang

I Giới thiệu

Là ứng dụng của quang phổ huỳnh quang

Nó liên quan đến việc sử dụng một chùm sáng

Lưới nhiễu xạ

được kích thích bởi bước sóng có năng lượng

thấp, bức xạ cao được gọi là Huỳnh Quang

Thông thừơng sự phát xạ này đều đặn ở một

góc 90o khi có sự kích thích Hình 2.15 Phương pháp

quang phổ huỳnh quang

II Cấu tạo

Nguồn sáng

sự kích thích

thay đổi sự kích thích và bước sóng phát xạ

Sự phát xạ

Bộ phận nhận quang

Flow cell

- Ánh sáng huỳnh quang phát

ra theo mọi hướng

Một số ánh sáng huỳnh quang

này đi qua một

bộ lọc đơn sắc thứ hai và đi đến

một detector, thường được đặt

ở góc 90 ° so với chùm tia ánh

sáng tới để giảm thiểu nguy cơ

của ánh sáng truyền tới hoặc

phản chiếu đến các detector

Hình 2.16 Nguyên tắc hoạt động của Fluorescence Detector

3 Detector khối phổ trong LC (LC/MS)

3.2 Nguyên lý chung

Phương pháp khối phổ (Mass Spectrometry-MS) là phương pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lượng phân

tử của chất đó dựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong một điện trường hoặc từ trường nhất định Nếu biết được

điện tích của ion thì ta dễ dàng xác định được khối lượng của ion đó.

LC/MS là phương pháp được dùng trong

phân tích vết (ppb, ppm) các hợp chất cần

nhận danh chính xác Trong những điều kiện

vận hành nhất định ngoài thời gian lưu đặc

trưng, các chất còn được nhận danh bằng

khối phổ của nó

3.1 Giới thiệu

Có ba kiểu hình thành ion ứng dụng cho nguồn API trong LC/MS:

• Ion hóa tia điện (electrospray ionization – ESI).

• Ion hóa hóa học tại áp suất khí quyển

(atmospheric pressure chemical ionization – APCI)

• Ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển

(Atmospheric Pressure Photoionization – APPI)

Trong đó, hai kỹ thuật APCI và ESI, đặc biệt là ESI được sử dụng nhiều hơn cả

Phân loại nguồn ion hóa

Như vậy, trong nghiên cứu khối phổ của bất kỳ chất nào, trước tiên nó phải

được chuyển sang trạng thái bay hơi, sau đó được ion hoá bằng các phương

pháp thích hợp

Tùy theo loại điện tích của ion nghiên cứu mà người ta chọn kiểu quét ion

dương (+) hoặc âm (-)

Kiểu quét ion dương thường cho nhiều thông tin hơn về ion nghiên cứu nên

được dùng phổ biến hơn

3.3.Nguồn ion hóa trong đầu dò khối phổ

I Ion hóa tia điện (ESI)

ESI là một kỹ thuật ion hóa được ứng dụng cho những hợp chất không bền nhiệt, phân cực, có khối lượng phân tử lớn

Thích hợp cho phân tích các hợp chất sinh học như protein, peptide, nucleotide… hoặc các polyme công nghiệp như polyethylen glycol

Trong ESI, các ion được hình thành như sau:

Khí phun vào Ion dương

II Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI)

- APCI là kỹ thuật ion hóa thường được sử dụng để phân tích những hợp chất có độ phân cực trung bình, có phân tử lượng nhỏ, dễ bay hơi

- Trong APCI, ion đươc hình

thành như sau: mẫu hợp chất

cần phân tích  hòa tan trong pha

động  sau khi ra khỏi cột sắc ký

 được cho đi ngang qua ống

mao quản đốt nóng

- Hợp chất đi theo luồng khí nóng ra khỏi ống để đến một vùng có áp suất khí quyển, nơi đây sẽ xảy ra sự ion hóa hóa học nhờ vào que phóng điện corona, tại đây có sự trao đổi proton để biến thành ion dương (M + H)+ và trao đổi electron hoặc proton để biến thành ion âm (M – H)- Sau đó, các ion sẽ được đưa vào bộ phân tích khối