Nghiên cứu xác định các con lai soma khoai tây và các đặc tính nông sinh học của các dòng con lai đó

Một trong những hướng tạo vật liệu khởi ựầu cho chọn tạo giống khoai tây ựang ựược quan tâm là việc tổ hợp ựược các ựặc tắnh kháng bệnh của khoai tây dại vào khoai tây trồng qua dung hợp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

= = = =


= = = =

NGUYỄN THỊ THỦY

NGHIÊN CỨU XÁC ðỊNH CÁC CON LAI SOMA KHOAI TÂY VÀ CÁC ðẶC TÍNH NÔNG SINH HỌC

CỦA CÁC DÒNG CON LAI ðÓ

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyªn ngµnh : Công nghệ sinh học

Ng−êi h−íng dÉn khoa häc: GS.TS NGUYÔN QUANG TH¹CH

HÀ NỘI – 2012

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan rằng, những số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam ñoan rằng, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này

ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội ngày 20 tháng 09 năm 2012

Tác giả

Nguyễn Thị Thủy

LỜI CẢM ƠN!

ðể hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, tôi ñã nhận ñược sự quan tâm, giúp ñỡ và tạo mọi ñiều kiện thuận lợi của Thầy Cô, Gia ñình, bạn bè, ñồng nghiệp trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Thầy giáo NGND.GS.TS Nguyễn Quang Thạch, người ñã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo ñóng góp những ý kiến quý báu cho tôi trong suốt quá trình thực hiện ñề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh ñạo Viện Sinh học Nông nghiệp – Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã tạo mọi ñiều kiện thuận lợi cho tôi

về thời gian, cơ sở vật chất thiết bị trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia ñình, bạn bè, ñồng nghiệp ñã giúp ñỡ, ñộng viên tôi trong suốt quá trình học tập, ñóng góp những ý kiến quý báu cho tôi hoàn thành ñược nghiên cứu này

Hà Nội ngày 20 tháng 09 năm 2012

Tác giả

Nguyễn Thị Thủy

MỤC LỤC

LỜI CAM ðOAN i

LỜI CẢM ƠN! ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC HÌNH viii

DANH MỤC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT x

1 MỞ ðẦU 1

1.1 ðặt vấn ñề 1

1.2 Mục ñích và yêu cầu 2

1.2.1 Mục ñích 2

1.2.2 Yêu cầu 2

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 2

1.3.1 Ý nghĩa khoa học 2

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Giới thiệu chung về cây khoai tây 4

2.1.1 Nguồn gốc 4

2.1.2 Phân loại 4

2.1.3 Yêu cầu ñiều kiện ngoại cảnh của cây khoai tây 6

2.2 Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới và trong nước 7

2.2.1 Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới 7

2.2.2 Tình hình sản xuất khoai tây ở Việt Nam 9

2.3 Tình hình bệnh virus hại khoai tây 10

2.3.1 Tìm hiểu về virus hại khoai tây 11

2.3.2 Tác hại của bệnh virus 13

2.4 Giải pháp khắc phục 15

2.4.1 Các giải pháp về canh tác 15

2.4.2 Giải pháp công nghệ sinh học 15

2.5 Các nghiên cứu về tạo giống khoai tây bằng dung hợp tế bào trần 19

2.5.1 Nghiên cứu về tạo giống khoai tây bằng dung hợp tế bào trần trên thế giới 19 2.5.2 Một số nghiên cứu về dung hợp tế bào trần trên ựối tượng cây khoai tây ở Việt Nam 24

3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

3.1 đối tượng, vật liệu, ựịa ựiểm và thời gian nghiên cứu 25

3.2 Nội dung nghiên cứu 26

3.3 Phương pháp nghiên cứu 27

3.3.1 Các phương pháp nghiên cứu trong phòng 27

3.3.2 Các phương pháp ngoài ựồng 32

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

4.1 Chọn lọc các con lai soma (heterozygous) qua phân tắch ựộ bội, isozym và chỉ thị phân tử 33

4.1.1 Xác ựịnh ựộ bội của các dòng lai soma tái sinh ựược sau dung hợp (phương pháp flow cytometry) 33

4.1.2 Xác ựịnh con lai soma bằng phương pháp Isozyme 34

4.1.3 Xác ựịnh con lai soma bằng chỉ thị SSR trên máy Beckman Coutler 37

4.2 đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển và hình thành củ trong ựiều kiện in vitro của các con lai soma heterozygous (dị nhân) xác ựịnh ựược. 43

4.2.1 đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển của con lai soma heterozygous (dị nhân) trong ựiều kiện in vitro 44

4.2.2 đánh giá khả năng tạo củ của các dòng Ộbố mẹỢ và con lai của chúng 45

4.3 đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển và các yếu tố hình thành năng suất của các dòng Ộbố mẹỢ và con lai soma trong ựiều kiện chậu vại 47

4.3.1 đánh giá sinh trưởng và phát triển của các con lai soma dị nhân và các

dòng nhị bội gốc 47

4.3.2 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của các con lai soma dị nhân và dòng Ộbố mẹỢ gốc 47

4.3.3 Các chỉ tiêu hình thái củ và chất lượng chế biến của củ 49

4.4 Một số chỉ tiêu phẩm chất chế biến, ăn tươi của các dòng lai soma và Ộbố mẹỢ của chúng 51

4.5 đánh giá tắnh kháng bệnh PVX, PVY của các con lai và dòng Ộbố mẹỢ gốc 52

4.5.1 đánh giá tắnh kháng bệnh virus PVX, PVY của các con lai và dòng Ộbố mẹỢ nhị bội thông qua kiểm tra gen kháng 52

4.5.2 đánh giá khả năng kháng virus PVX, PVY thông qua lây nhiễm nhân tạo 54

5 KẾT LUẬN VÀ đỀ NGHỊ 58

5.1 Kết luận 58

5.2 đề nghị 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO 60

PHỤ LỤC 67

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Diện tắch, năng suất và sản lượng khoai tây các khu vực trên thế

giới năm 2011 (FAOSTAT) 8

Bảng 2.2 Sản lượng khoai tây trên thế giới giai ựoạn 1991 Ờ 2007 9

Bảng 2.3 Nhóm virus chắnh hại khoai tây (Beemster và DeBokx 1987; Burton 1989; Brunt và cs 1996) [15] 12

Bảng 3.1 Các dòng lai soma tái sinh ựược từ 4 tổ hợp dung hợp 25

nghiên cứu 25

Bảng 4.1 Kết quả xác ựịnh ựộ bội các dòng lai soma tái sinh sau dung hợp 34

Bảng 4.2 Trình tự và nhiệt ựộ gắn mồi sử dụng trong phân tắch PCR 37

Bảng 4.3 Kết quả ựánh giá ựa hình các dòng Ộbố mẹỢ nhị bội 38

Bảng 4.4 Kết quả xác ựịnh con lai soma bằng chỉ thị phân tử SSR 43

Bảng 4.5 đánh giá ựộng thái tăng trưởng chiều cao, số lá của các con lai và Ộbố mẹỢ của chúng sau 4 tuần theo dõi trong ựiều kiện in vitro trên tổ hợp B208+B186 44

Bảng 4.6 Kết quả ựánh giả khả năng tạo củ các con lai soma dị nhân xác ựịnh ựược trong ựiều kiện in vitro của tổ hợp B208 + B186 45

Bảng 4.7 động thái tăng trưởng chiều cao, số lá các con lai của tổ hợp lai B208+B186 47

Bảng 4.8 Năng suất, các yếu tố cấu thành năng suất các con lai soma dị nhân và các dòng nhị bội gốc của tổ hợp B208+B186 48

Bảng 4.9 Một số kết quả ựánh giá ựặc ựiểm thực vật học củ các con lai soma dị nhân của tổ hợp B208+B186 49

Bảng 4.10 Một số chỉ tiêu hóa sinh của các dòng lai soma dị nhân và Ộbố mẹỢ của chúng 51

Bảng 4.11 Trình tự các mẫu khoai tây kiểm tra sau lây nhiễm 15 ngày ñược

Hình 4.1 Kết quả phân tích ñộ bội của dòng khoai tây “bố mẹ” và con lai tái

Hình 4.2 Hình ảnh xác ñịnh con lai soma bằng isozym với hai hệ enzym khác nhau 36

Hình 4.3 Kết quả phân tích con lai của tổ hợp lai B208+B186 sử dụng mồi

Hình 4.7 Hình ảnh cây “bố mẹ” và các dòng con lai sau 30 ngày theo dõi

Hình 4.8 Khả năng tạo củ của các con lai sau dung hợp trong ñiều kiện in

Hình 4.10 Kết quả ñiện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi ñặc hiệu GM339

Hình 4.11 Kết quả ñiện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi ñặc hiệu STM

Hình 4.12 Kết quả test Elisa kiểm tra ñộ sạch bệnh của các dòng con lai và

bố mẹ trước và sau lây nhiễm nhân tạo với chủng virus PVX; A1, A2, A3: Trước khi lây nhiễm với lần lượt các chủng virus PVX, PVY-O, PVY-N; B1, B2, B3: Sau khi lây nhiễm 15 ngày với lần lượt các chủng PVX, PVY-O,

DANH MỤC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT

8 bp Base pair

14 PVYNTN Potato virus Y strain (variant) NTN

16 DAS-ELISA Double Antibody Sanwich- Enzyme linked

1 MỞ đẦU

1.1 đặt vấn ựề

Khoai tây là cây trồng lý tưởng cho vụ đông ở đồng bằng Sông Hồng, tuy nhiên diện tắch khoai tây của Việt Nam không vượt quá 50.000 ha Có nhiều nguyên nhân hạn chế sự phát triển khoai tây của Việt Nam nhưng nguyên nhân chắnh là do công tác giống khoai tây Công tác giống khoai tây

có vai trò quyết ựịnh sự phát triển ngành sản xuất khoai tây của Việt Nam Có

2 vấn ựề bức xúc của công tác giống khoai tây là:

(1) Chưa xây dựng ựược hệ thống sản xuất giống khoai tây sạch bệnh tại chỗ nhằm chủ ựộng cung cấp củ giống sạch bệnh thay cho các giống cũ ựã thoái hóa do bị bệnh virus Các giống khoai tây sử dụng trong sản xuất chủ yếu vẫn phải nhập nội

(2) Còn có rất nhiều khó khăn và hạn chế trong công tác chọn tạo giống khoai tây phù hợp với ựiều kiện sinh thái Việt Nam có năng suất cao, phẩm chất tốt (ăn tươi hoặc chế biến) và ựặc biệt có ựặc tắnh kháng bệnh nhất là bệnh virus PVX, PVY gây thoái hóa giống khoai tây

Ở Việt Nam các nghiên cứu về chọn tạo giống khoai tây chủ yếu vẫn sử dụng các phương pháp chọn tạo giống truyền thống điều này gặp rất nhiều khó khăn và hầu như chưa ựược tiến hành, chưa sử dụng các phương pháp CNSH hiện ựại; chưa có bộ vật liệu phong phú mang các tắnh trạng quý Một trong những hướng tạo vật liệu khởi ựầu cho chọn tạo giống khoai tây ựang ựược quan tâm là việc tổ hợp ựược các ựặc tắnh kháng bệnh của khoai tây dại vào khoai tây trồng qua dung hợp tế bào (không qua lai hữu tắnh) Trong khuôn khổ ựề tài và hợp tác giữa Viện SHNN và Viện chọn tạo giống cây trồng JKI-CHLB đức ựã tạo ựược rất nhiều các thể tái sinh sau

dung hợp tế bào trần Việc xác ựịnh ựược các con lai soma và ựánh giá chúng

là hết sức cần thiết Trên cơ sở ựó chúng tôi tiến hành ựề tài:

ỘNghiên cứu xác ựịnh các con lai soma khoai tây và các ựặc tắnh nông sinh học của các dòng con lai ựóỢ

1.2 Mục ựắch và yêu cầu

1.2.1 Mục ựắch

Xác ựịnh ựược con lai soma heterozygous (dị nhân) sau dung hợp, ựánh giá các ựặc tắnh có lợi (ựánh giá một số ựặc ựiểm nông sinh học và khả năng kháng virus PVX, PVY của các con lai xác ựịnh ựược) nhằm chọn lọc các dòng triển vọng ựể phát triển thành giống kháng virus phục vụ sản xuất

1.2.2 Yêu cầu

Nghiên cứu xác ựịnh con lai soma

- đánh giá ựược ựộ bội của con lai sau dung hợp

- Xác ựịnh con lai soma bằng kỹ thuật Isozyme, bằng chỉ thị phân tử

đánh giá con lai

- đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển, tạo củ in vitro

- đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển hình thành năng suất trong ựiều kiện chậu vại

- đánh giá các phẩm chất chế biến và ăn tươi

- đánh giá khả năng kháng virus PVX, PVY thông qua việc kiểm tra gen kháng và phương pháp lây nhiễm nhân tạo

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

1.3.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả của ựề tài sẽ cung cấp những dẫn liệu khoa học mới và có giá trị về khả năng sinh trưởng phát triển, hình thành củ và kháng virus của các con lai soma từ dung hợp protoplast của các giống khoai tây nhị bội mang gen kháng virus

Kết quả là tài liệu tham khảo cho việc nghiên cứu về tạo giống khoai tây kháng bệnh virus thông qua dung hợp tế bào trần

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Tạo ñược các dòng khoai tây tứ bội có khả năng kháng virus PVX, PVY làm vật liệu khởi ñầu cho các nghiên cứu chọn tạo giống tiếp theo

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu chung về cây khoai tây

2.1.1 Nguồn gốc

Cây khoai tây (Solanum tuberosum L.) là một cây trồng cổ ựại Các

bằng chứng về khảo cổ học, lịch sử và ngôn ngữ học cũng như thực vật học ựều chứng minh rằng khoai tây có nguồn gốc từ Nam Mỹ Nhiều loài khoai tây hoang dại còn tồn tại tới ngày nay, ựặc biệt ở dãy Andes thuộc Peru, Bolivia (Nguyễn Quang Thạch, 1993).[9]

Chúng ựược ựem tới Tây Ban Nha và Châu Âu trong thế kỷ thứ 16, loài cây này nhanh chóng thắch nghi và sớm trở thành loại thực phẩm chắnh tại thời ựiểm mà dân số thế giới tăng nhanh Khoai Tây vào Pháp năm 1600 do hai nhà thực vật học người Thụy sỹ C.Bauhin và J.Bauhin mang tới, ựược trồng rộng rãi vào năm 1773 Từ Châu Âu khoai tây sang tới Ấn độ năm

1610, vào Trung Quốc năm 1700 và năm 1766 vào Nhật Bản Khoai tây ựến với Áo, Italia, đức và các vùng lãnh thổ Châu Âu vào cuối thế kỷ XVII Khoai tây ựược trồng trên quy mô lớn vào những năm 1800 và tới khoảng thế

kỷ XIX mới thực sự phổ biến trên các châu lục

Ở Việt Nam, khoai tây ựược người Pháp ựưa vào trồng năm 1890 ở một số vùng: Tú Sơn Ờ Hải Phòng, Trà Lĩnh Ờ Cao Bằng (1907), Thường Tắn Ờ Hà Tây (Hồ Hữu An, 2005) Hiện nay, khoai tây ựược trồng tập trung chủ yếu ở đồng Bằng Sông Hồng, Sapa, đà Lạt những vùng có khắ hậu mát mẻ,

ôn hòaẦ (đỗ Kim Chung, 2003).[1], [2]

2.1.2 Phân loại

Khoai tây (Solanum tuberosum L.) thuộc loài S tuberosum, chi

Solanum, họ cà Solanaceae, bộ Solanales, phân lớp Asteridae, lớp

Magnoliopsida, ngành Magnoliophyta Trong chi này có khoảng trên 200 loài

ñược phân bố khắp thế giới Sự ña dạng về loài, giống tập trung chủ yếu ở

vùng Trung – Nam Mỹ và Australia cùng với loài S tuberosum có khoảng 7

loài trồng trọt khác

Có nhiều cách ñể phân loại khoai tây; dựa vào ñặc ñiểm hình thái thân,

lá, hoa…hay số lượng nhiễm sắc thể…Theo J.G Hawkerkks (1991), khoai tây ñược phân thành 18 nhóm, trong ñó có 68 loài dại, chỉ có 8 loài trồng trọt, ñược chia thành 4 nhóm chủ yếu dựa vào số lượng NST (Tạ Thu Cúc, 2007).[3]

• Nhóm 1: Diploid: 2n = 2x = 24

S arjanhuiri juz.et Buk

S gomiocalyx juz.et Buck

S stenotomum Juz.et Buk

S phueja Juz.et Buk

Trong các loài trên, loài S phueja Juz.et Buk có ý nghĩa lớn nhất với trồng trọt

2.1.3 Yêu cầu ñiều kiện ngoại cảnh của cây khoai tây

* Nhiệt ñộ:

Nhiệt ñộ trong vụ trồng khoai tây là yếu tố quan trọng ảnh hưởng ñến

sự phát triển của cây và năng suất củ Nhiệt ñộ trong vụ trồng bình quân là

16oC – 18oC là thích hợp và cho năng suất cao nhất Các thời kỳ sinh trưởng khác nhau sẽ yêu cầu ñiều kiện nhiệt ñộ khác nhau

Hạt nảy mầm ở nhiệt ñộ tối thiểu 12oC –15oC và nhiệt ñộ thích hợp nhất

là 18oC – 22oC Nhiệt ñộ lớn hơn 25oC làm mầm phát triển chậm và dễ thối

Thời kỳ sinh trưởng thân lá nhiệt ñộ thích hợp là 20oC – 22oC

Thời kỳ hình thành và phát triển củ: Quá trình tích lũy tinh bột vào củ hình thành khó khăn hơn, tia củ vươn dài và thời gian hình thành củ kéo dài hơn dẫn ñến giảm năng suất, củ khoa tây bị dị hình

ðộ dài ngày ảnh hưởng rất lớn tới sự sinh trưởng và phát triển của cây khoai tây Khoai tây là cây ưa ánh sáng ngày dài Cường ñộ ánh sáng thích hợp từ 40000 – 60000 Lux sẽ cho năng suất cao Cường ñộ ánh sáng mạnh có lợi cho quang hợp, sẽ thuận lợi cho sự hình thành và tích luỹ chất khô Các thời kỳ sinh trưởng khác nhau yêu cầu thời gian chiếu sáng khác nhau

Từ khi khoai tây mọc khỏi mặt ñất cho ñến thời kỳ xuất hiện nụ hoa yêu cầu thời gian chiếu sáng dài ñể cây quang hợp và tích lũy vật chất

Thời kỳ phát triển tia củ yêu cầu thời gian chiếu sáng ngắn ñể thúc ñẩy hình thành thân và củ (Mai Thạch Hoành, 2003).[4]

* ðộ ẩm:

Khoai tây là cây có bộ rễ ăn nông, tiềm năng năng suất cao nên ñể cây khoai tây sinh trưởng, phát triển tốt cần phải cung cấp nước thường xuyên Các thời kỳ sinh trưởng khác nhau yêu cầu về nước cũng khác nhau:

Thời kỳ trồng ñến xuất hiện tia củ ñảm bảo ñộ ẩm tối thiểu 60 – 80%

Thời kỳ phát triển củ cần thường xuyên giữ ẩm ñộ ẩm ñất là 80% Thiếu nước hoặc thừa nước ñều ảnh hưởng xấu ñến sinh trưởng của cây

2.2 Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới và trong nước

2.2.1 Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới

Vào thế kỷ XIX, khoai tây thực sự ñược trồng phổ biến ở các châu lục với khoảng 150 nước Ngày nay, khoai tây ñược trồng chủ yếu ở khu vực Châu Á, Châu Âu cho năng suất và sản lượng lớn

Qua bảng 2.1 cho thấy, diện tích trồng khoai tây ở Trung Quốc lớn nhất khoảng 5 077 504 (ha), thứ hai là Nga với diện tích 2 109 100 (ha) và khoai tây ñược trồng ít nhất ở Hà lan vào khoảng 156 969 (ha) Nhưng năng suất khoai tây lớn nhất là ở Mỹ ñạt 44,3 (tấn/ha), sau ñó là Hà Lan ñạt 43,6 (tấn/ha), ñứng thứ 3 là ðức 40,00 (tấn/ha)

Do ñó, khoai tây chính là cây trồng giàu tiềm năng phát triển trong tương lai, với diện tích trồng ngày càng ñược mở rộng và năng suất, chất lượng khoai tây ngày càng tăng, nhất là ở các nước ñang phát triển

Bảng 2.1 Diện tích, năng suất và sản lượng khoai tây các khu vực trên

thế giới năm 2011 (FAOSTAT)

Nước

Diện tích (ha)

Sản lượng (tấn)

Năng suất (tấn/ha)

Khoai tây có nguồn gốc từ Nam Mỹ sau ñó mở rộng sang các nước phát triển Vậy tại sao hiện nay khoai tây ñược trồng chủ yếu ở những nước ñang phát triển? Theo các chuyên gia nhận ñịnh: Khoai tây chính là cây lương thực của tương lai dành cho những nước nghèo và nước ñang phát triển “Khi giá lúa gạo và lúa mỳ tăng lên, lúc này khoai tây ñược phát hiện là nguồn cây trồng giàu dinh dưỡng cho những nước ñó với giá rất rẻ” (FAO, 2006) [65] Mặt khác “Khoai tây là cây trồng tạo ra khối lượng sinh học và năng lượng nhiều hơn bất kỳ một loại cây trồng lương thực nào (trừ lúa gạo, ngô, lúa mỳ) trong thời gian ngắn trên cùng một ñơn vị diện tích” (FAO, 2005) [65]

Bảng 2.2 Sản lượng khoai tây trên thế giới giai ñoạn 1991 – 2007

(triệu tấn) (FAOSTAT) Năm

Ở các nước ñang phát triển có diện tích trồng lớn nhưng năng suất kém một phần là do nguồn giống không ñảm bảo chất lượng, củ giống không rõ nguồn gốc, dễ bị nhiễm bệnh nhất là bệnh virus sau vài năm trồng, dẫn ñến sự thoái hóa củ giống nghiêm trọng ảnh hưởng ñến năng suất và chất lượng củ

Do vậy, các nhà nghiên cứu ñang xây dựng chiến lược sản xuất củ giống sạch bệnh và có phẩm chất tốt phục vụ sản xuất khoai tây thương mại

2.2.2 Tình hình sản xuất khoai tây ở Việt Nam

Vấn ñề khó khăn nhất hiện nay ñối với ngành sản xuất khoai tây ñó là giống Hiện giống khoai tây ở trong nước mới chỉ ñáp ứng từ 20 – 25% nhu cầu, số còn lại phải nhập khẩu từ Trung Quốc, Hà Lan…

Hiện nay, giống khoai tây mà người dân sử dụng hầu hết do nông dân tự

duy trì từ vụ này sang vụ khác hoặc giống do người dân tự mua không rõ nguồn gốc, do vậy mà giống không những bị thoái hóa mà còn có tỷ lệ nhiễm virus cao từ 54 – 65% cộng với hao hụt trong bảo quản từ 45 – 60% Khoai tây trồng chủ yếu bằng con ñường nhân giống vô tính nên tỷ lệ tái nhiễm virus cao Hơn nữa trong ñiều kiện sản xuất ở Việt Nam, củ giống bảo quản trong thời gian dài khoảng 9 tháng (từ tháng 2 – tháng 10), ñiều kiện nóng ẩm của mùa hè

củ giống bị già sinh lý nhanh chóng, khi trồng khả năng sinh trưởng kém, hậu quả là năng suất và chất lượng củ thấp

Mặt khác việc sản xuất và cung ứng giống khoai tây ở Việt Nam còn nhỏ

lẻ, chưa mang tính hệ thống Trước tình hình ñó cần xây dựng các chương trình nhân tạo giống khoai tây sạch bệnh, có chất lượng và phẩm chất tốt phục vụ bà con nông dân

Từ năm 2003 ñến 2004 diện tích trồng khoai tây ở nước ta là 47340 ha với năng suất ñạt 148 tạ/ ha Vùng Trung du miền núi phía Bắc có 9266 ha ñạt năng suất 109 tạ/ ha Vùng Duyên hải Bắc Trung Bộ có 1686 ha với năng suất ñạt 200 tạ/ ha Vùng ðồng bằng sông Hồng có 38267 ha ñạt năng suất 164 tạ/

ha Vùng Tây Nguyên có 1126 ha với năng suất ñạt 178 tạ/ ha

Trong giai ñoạn hiện nay, cây khoai tây rất ñược chú trọng trong công tác nhập nội, chọn lọc và lai tạo dòng ñặc biệt là việc sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào và dung hợp tế bào trần Vì vậy, trong những năm gần ñây diện tích trồng khoai tây ñược mở rộng nhanh chóng và khoai tây trở thành cây trồng chính trong vụ ñông, là cây quan trọng ở nước ta

2.3 Tình hình bệnh virus hại khoai tây

Như chúng ta ñã biết, khoai tây là loại cây trồng rất dễ bị tấn công bởi

một số tác nhân gây bệnh: Virus (PVX, PVY, PLRV, LR, S, M, A, PSTVD),

vi khuẩn (Ralstonia solanacearum), nấm (Phytophthora infestans), nhóm

ngành giun tròn (nematodes – bệnh do tuyến trùng), và một số loại bệnh khác

2.3.1 Tìm hiểu về virus hại khoai tây

Bệnh virus là bệnh rất nguy hiểm, khi xâm nhập vào cây, virus sẽ tấn công vào các tế bào, các cơ quan làm thay ựổi các quá trình trao ựổi chất của cây, qua ựó sẽ làm ảnh hưởng lớn ựến năng suất Khi cây bị nhiễm virus không thể chữa, chỉ có thể nhổ cây bị hại vứt xa nguồn nước và nơi trồng Bởi

vì virus tồn tại ở các mô sống nên virus rất nguy hiểm ựối với những cây trồng nhân giống vô tắnh bằng củ tiếp tục nhân lên ở các thế hệ sau Ngoài ra bệnh virus còn ựược lan truyền do côn trùng hoặc tiếp xúc cơ giới

Theo (Vũ Triệu Mân, 1978) [6] và một số tác giả khác cho rằng: virus

ựã làm ảnh hưởng rất lớn ựến năng suất và phẩm chất khoai tây, ựặc biệt là virus PVY làm giảm năng suất từ 50% - 90% Chắnh vì vậy, ựến nay dù có nhiều tác nhân gây bệnh hại khoai tây nhưng virus vẫn là nguyên nhân chủ yếu làm giảm năng suất kinh tế một cách trầm trọng

Theo nghiên cứu của Nguyễn Thơ, Nguyễn Phương đại, Hà Minh Trung,

Vũ Triệu Mân (1978 Ờ 1986) [6,7] về virus khoai tây ở Miền Bắc Việt Nam cho

thấy: Bệnh virus khoai tây ở Việt Nam do 7 loài virus gây hại chắnh đó là:

Virus Y khoai tây (PVY)

Virus X khoai tây (PVX)

VirusA khoai tây (PVA)

Virus S khoai tây (PVS)

Virus M khoai tây (PVM)

Virus cuốn lá khoai tây (PLRV)

Virus khảm Aucuba khoai tây (PAMV)

Năm 1991 Ủy Ban Quốc Tế về phân loại virus (ICTVỜInternational Committee on Taxonomy of Viruses) ựã xây dựng hệ thống dữ liệu về các nhóm virus gồm ựặc ựiểm của từng nhóm và hệ thống hóa số liệu ựo lường (số hóa) các loại virus ựó

Với loài S Tuberosum L phát hiện tác nhân virus gây bệnh chắnh như sau:

Bảng 2.3 Nhóm virus chính hại khoai tây (Beemster và DeBokx 1987;

từ 40-90% Ở Việt Nam khoai tây ít bị nhiễm virus này (Bode, 1969)

• PVY – Smith phát hiện năm 1931 tại Anh Nhóm này gồm 3 dòng chính: PVYO gây bệnh quan trọng ở khắp thế giới, PVYN gây ra các vết chết hoại trên gân lá thuốc lá, PVYC ít nguy hiểm, không phổ biến trên thế giới Bên cạnh ñó mới phát hiện ra PVYNTN, PVYNW, PVYZ.PVYNTN Virus Y kết hợp với virus PLRV sẽ gây hại rất nặng ở Châu Âu Khả năng gây giảm năng suất từ 50 – 90% Riêng virus Y ñặc biệt gây hại nặng ở các vùng trồng khoai tây có khí hậu nóng kèm một vụ lạnh như ở Việt Nam (Vũ Triệu Mân, 1986).[7]

• PVA – Nhóm virus này khá phổ biến trên thế giới, Murphy và Mckay phát hiện ở Eire năm 1932 Trong nhóm này phát hiện có 2 dòng chính: Dòng

A1 cảm ứng phản ứng siêu nhạy ở loài S tuberosum.cv King Edward, ngược

lại dòng A2 thì không (Valkonen và cs.1995a) Virus này gây hại giảm năng suất trên 50% (Bode 1969, Weideman 1970) [18]

• PVX – phát hiện ở Anh bởi Smith (1931) Theo Cockerham (1955) [23] PVX ñược chia thành 4 nhóm dựa trên phản ứng của gen trội tạo HR: PVX1, PVX2, PVX3, PVX4, ngoài ra mới phát hiện PVXHB gây giảm năng suất từ

10 – 25%

• PVV – Rozendaal phát hiện ở Nertherlvàs năm 1971, gây hại nhiều ở

Châu Âu và Nam Mỹ, không có sự phân chia thành các nhóm Qua phân tích

Cp (Coat protein) chỉ ra isolate ở Châu Âu có sự cảm ứng HR ở loài S

tuberosum cv Pentlvà Dell

• PVM – Schltz và Folson phát hiện năm 1923 tại Mỹ, khá phổ biến và gây ra vài triệu chứng lạ Theo Vũ Triệu Mân (1984) cho biết hai giống khoai tây ở Nga ñã bị nhiễm virus PVM làm giảm năng suất tới 60 – 70%

• PVS – ðược phát hiện ở Nertherland vào năm 1952, gây hại ít làm giảm năng suất từ 10 – 15% thường gây hại khi kết hợp với các virus khác

2.3.2 Tác hại của bệnh virus

Virus khoai tây ñược ñánh giá là một tác nhân gây bệnh nguy hiểm, làm giảm ñáng kể năng suất và chất lượng củ Bởi bệnh virus có những ñặc tính sau:

- Là bệnh không chữa ñược khi ñã bị nhiễm Do virus khi xâm nhiễm vào cây trồng chúng không có sự trao ñổi chất riêng và ñộc lập mà phải sử dụng vật chất của ký chủ ñể nhân lên, tấn công các tế bào khác từ vị trí xâm nhiễm Như vậy, tế bào ký chủ ñã làm nhiệm vụ nhân virus lên, nên nếu tác nhân nào ngăn chặn sự tái bản của phân tử virus ñồng thời cũng ức chế các quá trình sinh tổng hợp của ký chủ

- Bệnh virus khoai tây có ñặc tính di truyền Ở những cây nhân giống theo con ñường hữu tính, bệnh virus rất ít truyền qua hạt Ngược lại cây nhân giống vô tính, virus có mặt ở mọi tế bào ñang sống nên rất dễ lan truyền Khi virus xâm nhiễm vào cây chúng nhân lên và di chuyển theo dòng nhựa luyện tới các bộ phận trong cây, tới tận các củ con Khi ñó, một củ mẹ bị nhiễm bệnh sẽ tạo ra một cây bệnh, cây này lại tạo ra các thế hệ củ con bị nhiễm virus Do vậy, năm này qua năn khác bệnh càng mở rộng, tăng lên nhanh chóng Sự xâm nhiễm virus rất khó phát hiện, diễn ra trong suốt quá trình sống của cây

- Bệnh virus lan truyền qua các vector truyền bệnh và tiếp xúc cơ giới

Tùy từng kiểu truyền bệnh của côn trùng mà virus ñược truyền ngay hoặc có thời gian tiềm ẩn trong cơ thể côn trùng kể từ khi trích nạp virus cho tới lúc truyền sang cây mới

Từ những nguyên nhân trên dẫn tới khi khoai tây bị nhiễm virus sẽ gây nên hiện tượng thoái hóa giống Nghĩa là làm giảm dần năng suất gieo trồng của củ, biểu hiện củ nhỏ ñi về kích thước và trọng lượng, chất lượng củ xấu, hàm lượng dinh dưỡng giảm so với trước, thân lá bị biến dạng làm giảm khả năng quang hợp Nếu hiện tượng này diễn ra dài có thể dẫn ñến tiêu diệt hoàn toàn giống khoai tây nào ñó Ngoài ra, khi củ giống bị già sinh lý do bảo quản lâu trong ñiều kiện nóng ẩm cũng dẫn ñến hiện tượng thoái hóa củ Trong ñó virus là nguyên nhân chính dẫn tới hiện tượng thoái hóa

Ở Anh khoai tây bị nhiễm virus PLRV, PVY và PVX gây thiệt hại trung bình từ 30 – 50 triệu pound mỗi năm (Hull, 1984) [34]

Khoai tây khi nhiễm virus PLRV làm sản lượng củ bị giảm khoảng 20 triệu tấn/ha mỗi năm trên thế giới (Kojima và Lapierre, 1988) [36]

Theo Banttari và cs (1993) khi củ khoai tây bị nhiễm virus PVY và PLRV dẫn tới năng suất giảm 80% [13]

Hiện nay, người trồng khoai tây ñã sử dụng quá nhiều lượng thuốc trừ sâu, với mục ñích tạo ra củ sạch bệnh và kiểm soát côn trùng truyền bệnh (rệp muội, bọ phấn…) Tuy nhiên giải pháp sử dụng thuốc trừ sâu ñể kiểm soát sự nhân lên của virus là không hiệu quả Do ñó, việc sử dụng thuốc trừ sâu tràn lan không những không cho hiệu quả trừ bệnh mà còn làm tăng tính kháng thuốc của côn trùng truyền virus, xuất hiện nhiều loài mới trong quần thể, hơn nữa còn gây ảnh hưởng tiêu cực ñến hệ sinh thái nông nghiệp và môi trường sống xung quanh Quan trọng nhất là lượng thuốc còn tồn dư trong củ khoai tây sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe người tiêu dùng

Chính vì thế hướng ñi theo con ñường tạo giống khoai tây kháng virus, kháng vector truyền bệnh ñược xem là giải pháp tối ưu Hướng ñi này ñã và

ñang nhận ñược sự quan tâm, chú ý của nhiều nhà nghiên cứu nhằm bảo vệ cây khoai tây nói riêng và cây trồng nói chung

2.4 Giải pháp khắc phục

2.4.1 Các giải pháp về canh tác

Trước những tác hại của bệnh virus trên, các nhà nghiên cứu về cây khoai tây ñã ñề xuất một số giải pháp nhằm canh tác phòng trừ sự nhiễm bệnh virus khoai tây như sau:

• Loại bỏ nguồn cây, củ bị nhiễm virus

• Hạn chế tối ña sự nhân lên và lan rộng của phân tử virus

• Trồng xen canh, luân canh một sô loại cây trồng có tính kháng virus, xua ñuổi côn trùng truyền bệnh virus Ngoài ra, có thể áp dụng biện pháp dùng côn trùng ñể kiểm soát vector truyền virus, tuy nhiên phương pháp này rất ñắt (Valkonen và cs, 1994) [61]

• Hay sử dụng giải pháp phun xịt dầu khoáng ñể ngăn chặn vector truyền virus theo kiểu không bền vững (R.M.Solomon-blackburn và H.Barker, 2001) [49]

2.4.2 Giải pháp công nghệ sinh học

Tạo giống khoai tây chuyển gen kháng virus

2.4.2.2 Tính kháng bắt nguồn từ gen CP (CPMR-Coat Protein Mediated Resistance)

Việc chuyển gen sinh protein vỏ virus vào khoai tây ñể tạo giống kháng virus, ñây là hướng nghiên cứu ñầu tiên về tính kháng virus bắt nguồn từ tác nhân gây bệnh Trong ñó, Hemenway (1988) ñã chuyển nạp thành công gen

Cp của PVX vào khoai tây, thu ñược kết quả tạo khoai tây chống chịu virus PVX [33]

Cơ chế của tính kháng là chống lại sự tích lũy virus trong cây Kawchuk

và cs (1991) chứng minh nồng ñộ virus PLRV ở cây chuyển gen Cp rất thấp chỉ

khoảng 1% giống như cây ñối chứng trong giai ñoạn tiền xâm nhiễm [37]

2.4.2.3 Tính kháng bắt nguồn từ protein di chuyển

Virus mã hóa một số loại protein di chuyển hỗ trợ sự lây lan của virus trong cây Khi ñó các phân tử protein này chính là mục tiêu trong tạo giống kháng virus

Vào năm 1996, Tacke ñã chuyển trình tự gen ORF của virus PLRV sang cây khoai tây, gen này mã hóa cho protein pr17 giúp virus di chuyển trong mạch phloem Dòng khoai tây chuyển gen có biểu hiện ñột biến protein pr17 thì kháng ñược với virus PVX, PVY Ngược lại, dòng không có ñột biến trên thì chỉ kháng virus PLRV nhưng không kháng PVX và PVY Khi tiến hành kiểm tra về tính kháng với virus PLRV của các cây chuyển gen thấy ñược lượng kháng nguyên (virus) trong cây giảm rõ rệt Qua nghiên cứu này Tacke chứng minh tính kháng PLRV ñược kiểm soát ở mức RNA, trong khi

ñó tính kháng PVX và PVY là tính kháng bắt nguồn từ protein ñược mã hóa của tác nhân gây bệnh Do ñó, những cây tích lũy protein này sẽ kháng ñược

sự lây nhiễm của nhiều loại virus khác nhau, PVY và PVX Cơ chế kháng này không mang tính ñặc hiệu dòng virus

2.4.2.4 Tính kháng bắt nguồn từ gen tái bản (Replicase (polymerase) mediated resistance)

Năm 1990, nhà khoa học Golemboski ñã chuyển vùng gen polymerase

của virus TMV (Tobacco Mosaic tobamovirus) vào cây khoai tây, gen này tạo

ra tính kháng virus theo cơ chế “tính kháng bắt nguồn từ gen tái bản polymerase” Tiếp ñó, hàng loạt nghiên cứu về chuyển các kiểu gen polymerase của RNA virus và tương tự như cơ chế kháng trên ñối với nhiều loại virus khác nhau, virus PVX (Braun và Hemenway 1992 Nguyên lý của phản ứng kháng là sự ức chế quá trình tái bản của virus (Braun và Hemenway 1992; Mueller và cs, 1995) [41]

2.4.2.5 Tính kháng theo cơ chế làm câm gen sau phiên mã Postranscriptional Gene Silencing)

Trong một số trường hợp tính kháng chuyển gen bắt nguồn từ quá trình phiên mã RNA tỏ ra ưu thế hơn phương pháp gen mã hóa protein cũng như một vài phương pháp trên Dougherty năm 1994 cho biết các cây chuyển gen

Cp của virus TEV (Tobacco etch potyvirus) không ñược dịch mã thì có biểu

hiện tính kháng hoặc nhiễm với virus TEV sau vài tuần lây nhiễm Ông giải thích hiện tượng trên là do sự phân giải RNA chuyển gen sau phiên mã ñã xảy

ra trong cây, lượng RNA bị giảm mặc dù gen chuyển ñã ñược phiên mã Tiếp

ñó, tính kháng virus PVX bằng phương pháp chuyển gen RNA polymerase ñược nghiên cứu bởi Mueller (1995) Kết quả cho thấy những cây có tính kháng cao nhất với virus PVX thì lượng polymerase là thấp nhất và số bản sao của gen chuyển nhiều Tính kháng không ảnh hưởng ñến sự phiên mã của gen chuyển Cơ chế kháng ở ñây là sự làm câm gen sau phiên mã (PTGS) PTGS không những ñược cảm ứng bởi gen chuyển mà còn bởi virus (Baulcombe, 1996) và dường như là phản ứng phòng thủ chung của cây trồng

và ñược giải thích theo nhiều cơ chế bảo vệ cây trồng bắt nguồn từ tác nhân gây bệnh (pathoge – derived protection) [14]

Tạo giống khoai tây kháng virus bằng dung hợp tế bào trần

ðối với hướng tạo giống khoai tây kháng virus bằng dung hợp tế bào trần giữa hai hay nhiều dòng mang ñặc tính kháng tỏ ra có nhiều ưu ñiểm: Tổ hợp ñược bộ genome của cả hai “bố mẹ” tạo thành một cấu trúc genome dị hợp tử mới, không có sự biệt lập trong quá trình giảm phân, rút ngắn thời gian chọn tạo, khắc phục những rào cản về mặt di truyền trong lai hữu tính… Cho nên trở thành công cụ ñầy hứa hẹn phục vụ chương trình chọn tạo giống cây khoai tây kháng virus

Trong tự nhiên tồn tại khá nhiều nguồn gen kháng virus, có khoảng 206 loài khoai tây dại mang củ, 7 loài nguyên thủy và một loài khoai tây trồng

Solanum spp, cũng như một số loài dại không mang củ có ñặc tính kháng

virus tốt (Spooner và Hijmans, 2001) Trong số ñó dòng S etuberosum có ñặc

tính kháng cao với bệnh virus PVY, PVA…(Valkonen và cs, 1992b; Thieme

và cs, 2000 ), S tarnii tính kháng cao với dòng virus PVY (Thieme và cs, 2003), loài khoai tây S cardiophyllum Lindl và S etuberosum Lindl thuộc chi Pinnatisecta và Etuberosa thể hiện tính kháng cao với nấm Phytophthora

infestans Chúng ñược thu thập và thăm dò về tính kháng virus và tác nhân gây

bệnh khác kể cả sâu hại Một số nghiên cứu về khoai tây ở Châu Âu khẳng ñịnh 90% loài khoai tây dại trong quỹ gen thu thập là nguồn gen kháng mới có ý nghĩa ðây là nguồn gen kháng quan trọng phục vụ chương trình chọn tạo giống khoai tây kháng virus bằng dung hợp tế bào trần Nếu lai tạo giống theo phương pháp truyền thống giữa những dòng dại có tính kháng virus và dòng trồng thường gặp rào cản về mặt di truyền, thời gian chọn tạo lâu [60], [55], [56] Rất khó khăn ñể có thể tập hợp nguồn gen dại vào dòng khoai tây trồng Châu Âu bằng lai hữu tính, do ñó dung hợp tế bào trần là phương pháp hữu

hiệu ñể ñưa nguồn gen ñó vào quỹ gen của loài S Tuberosum L., vượt qua

ñược tính không tương hợp trong lai hữu tính và sự phân tách gen trong chương trình chọn tạo giống Sự dung hợp giữa tế bào trần của loài khoai tây

dại không có củ S Brevidens với loài khoai tây trồng S Tuberosum tạo con

lai soma biểu hiện tính kháng cao với một số nhóm virus và kháng vector truyền bệnh (Austin và cs, 1985b; Fish và cs, 1987; Vankonen và cs, 1994b) [12], [29], [61]

Tùy thuộc vào thành phần gen của con lai soma mà biểu hiện một số các biến ñổi về tính trạng hình thái và phản ứng lại sự xâm nhiễm virus PVX bởi vector (Thieme và cs, 2000) Một số con lai soma ñược lai lại thành công với dòng khoai tây trồng mà vẫn biểu hiện tính kháng Hàng loạt con lai soma của

S etuberosum và S tuberosum và dòng BC1 thể hiện kháng tốt với PVY và

tính rất kháng với PVX (Gavlirenco và cs, 2003) Nghiên cứu của Polgar và cs

(2002) ñã tạo ñược 150 dòng lai soma giữa khoai tây Hungari và S brevidens

cùng một vài thế hệ BC Kết quả cho thấy tất cả con lai và hầu hết dòng BC biểu hiện mức kháng cao với virus PVY và PLRV [55], [30]

Nghiên cứu gần ñây của Thieme và cs (2008) cho biết loài khoai tây dại

S tarnii là nguồn gen kháng quan trọng với cả sâu hại và bệnh hại, biểu hiện

tính kháng cao với virus PVY, tính kháng cao với nấm Phytopthera infestans Khi ñó tiến hành lai soma với một số dòng khoai tây trồng thuộc loài S

tuberosum ñể tạo thể lai mới kế thừa tính kháng từ dòng khoai tây dại S tarnii

Trong số các phương pháp tạo giống khoai tây kháng virus thì phương pháp lai soma có nhiều ưu ñiểm và hiệu quả hơn cả Phương pháp lai hữu tính gặp nhiều khó khăn về mặt di truyền, tốn thời gian chọn tạo ðối với phương pháp chuyển gen, gen kháng virus có thể không biểu hiện tính kháng (Cockerham, 1970; Ross, 1986; Jones 1990) mà còn xuất hiện các sản phẩm phụ (protein) từ gen chuyển gây rối loạn hoạt ñộng của cây chủ Nhược ñiểm của phương pháp chuyển gen là mang tính kháng ñặc hiệu dòng virus, dễ bị phá vỡ tính kháng khi lây nhiễm virus với nồng ñộ cao, chỉ có ý nghĩa với nhóm virus lây nhiễm cơ giới mà không có hiệu quả với nhóm virus truyền qua tuyến nước bọt của côn trùng [24], [35]

ðể có thể giải quyết vấn ñề bệnh virus của cây khoai tây, cần áp dụng nhiều biện pháp khác nhau, trong ñó ưu tiên giải pháp tạo giống kháng vector truyền bệnh virus và kháng trực tiếp dòng virus

2.5 Các nghiên cứu về tạo giống khoai tây bằng dung hợp tế bào trần

2.5.1 Nghiên cứu về tạo giống khoai tây bằng dung hợp tế bào trần trên thế giới

Phương pháp chọn tạo khoai tây truyền thống nhờ kỹ thuật lai tạo, lai hồi giao (back cross), ñột biến và chọn lọc (Kuckuck et al, 1985) vấp

phải những khó khăn về mặt ựặc tắnh di truyền của kỹ thuật trồng trọt (Solanum tubersosum) đó là bộ genom của khoai tây trồng trọt ở thể tứ bội tetraploid (2n=4x = 48 nhiễm sắc thể), gây ra sự phân ly sau lai tạo với một quần thể rất lớn, rất phức tạp, ựòi hỏi quá trình chọn lọc rất nhiều công sức Quá trình này ựòi hỏi tối thiểu 10 năm ựể có ựược một giống lai

ra ựời Ngoài ra, nhiều ựặc tắnh chống chịu do nhiều gen quy ựịnh sẽ có thể mất dần trong quá trình chọn lọc ở các thế hệ tiếp sau [37]

Phương pháp chuyển gen ựược coi là chiến lược mới ựể cải tiến các giống cây trồng Tuy nhiên, nhiều tắnh trạng nông sinh học quan trọng không thể chuyển vào cây trồng bằng công nghệ gen do chúng ựược kiểm soát bởi ựa gen; hoặc các gen kiểm soát các tắnh trạng mong muốn vẫn chưa ựược biết ựến; hoặc các gen của chúng chưa thể tách ra ựược và nhân dòng thành công Do ựó, phương pháp lai tạo giữa các loài có quan

hệ gần gũi bằng dung hợp tế bào trần là một phương pháp thú vị ựể khắc phục những nhược ựiểm trên Phương pháp dung hợp tế bào trần ựã giải thắch cơ sở di truyền của tắnh kháng với các stress vô sinh và hữu sinh ở cây trồng (McGrath và cộng sự, 2002) [40]

Sơ ựồ tạo giống khoai tây nổi tiếng của Wenzel (1979) bằng dung hợp tế bào trần bao gồm các khâu: chọn lọc các ựặc tắnh mong muốn ở bố

mẹ (haploid, 1x) sau ựó tạo cây dihaploid (2x), lai tạo các cây dihaploid (có các ựặc tắnh khác nhau) ựể tạo con lai 2x tổ hợp ựược các ựặc tắnh mong muốn của bố mẹ Sử dụng kỹ thuật dung hợp tế bào ựể tổ hợp các ựặc tắnh mong muốn ở các dạng 2x Kết quả thu ựược con lai soma 4x (tetraploid) Các dòng lai soma này ựược chọn lọc ựể phát triển thành giống có ựặc tắnh mong muốn

Các dòng tứ bội khởi ựầu (4x )

kỹ thuật giảm ñộ bội của khoai tây tứ bội xuống nhị bội khi lai khoai tứ bội

với dòng dại Solanum phureja (Nitzche và Wenzel, 1977); các công trình

nghiên cứu về hoàn thiện kỹ thuật tách protoplast và dung hợp protoplast khoai tây theo các phương pháp hoá học, ñiện học (Thomas 1981, Bokelmann, Roest 1983 Eduard Chani và cộng sự (2000) ñã áp dụng công nghệ dung hợp protoplast và nuôi cấy bao phấn ñể tạo các cây ñơn bội Các

con lai soma ñược tạo ra từ tổ hợp lai giữa Solanum phureja Juz.&Buk và S

chacoense Bitt Nuôi cấy hạt phấn của các con lai này ñể tạo 1 họ cây ñơn

bội Có nhiều yếu tố ảnh hưởng ñến nuôi cấy bao phấn như ñiều kiện trồng cây cho bao phấn; phương pháp chuẩn bị môi trường nuôi cấy; ñiều kiện nuôi

Tạo dòng ñơn bội bằng nuôi cấy hạt phấn – nhị bội hóa tạo 2x

Chọn lọc (2x) x x

a*1a*2 (+) a*3a*4

a*1 *2a*3a*4

cấy; kiểu gen; thời gian lấy bao phấn ða số các cây tái sinh ñều là cây nhị bội, ñiều này chứng tỏ rằng có một số alen ñã bị ñào thải trong thể dị hợp ở cây cho hạt phấn Trong các cây tái sinh, các thể ñồng hợp cũng ñược xác

ñịnh thành công bằng chỉ thị phân tử SSR với 8 cặp mồi

Trong giai ñoạn những năm 80 ñến 90, các nghiên cứu nhằm phát triển các phương pháp tách, dung hợp, nuôi cấy và tái sinh các thể lai soma ñược tiến hành rất mạnh mẽ (haberlach và cs,1985; Austin và cs, 1985a; Fish và cs, 1988; Perl và cs , 1988; Schilde, Rentschler và cs, 1988; Deimling và cs,1998; Masson và cs, 1988; Hunt và Helgeson, 1989; Chaput và cs, 1990; Wenzel, 1992; Thach et al., 1993) Các công trình nghiên cứu tạo các con lai soma tổ hợp ñược các ñặc tính kháng bệnh virus từ bố mẹ ñã chọn lọc (2x) cũng ñược rất nhiều tác giả nghiên cứu thành công Các tác giả này thừa nhận có thể tổ hợp ñược các ñặc tính kháng bệnh (virus PVY, PVX, mốc sương, rệp) của bố

mẹ vào con lai soma và các ñặc tính này có thể quan sát rõ trên ñồng ruộng Tuy nhiên những dòng con lai soma có nhiều biến dị trên ñồng ruộng cần phải

chọn lọc [31], [12], [29], [27], [25], [54]

Thạch và cộng sự (1993) ñã chọn lọc thành công 14 dòng khoai tây nhị

bội S tuberosum mang gen kháng Rx hoặc Ry hoặc cả hai, biểu hiện tính

kháng rất cao với virus PVX, PVY, ñiều này rất ý nghĩa ñể tiến hành nghiên cứu dung hợp tế bào trần giữa chúng nhằm tạo thể lai soma mang ñặc tính kháng bệnh virus Các tổ hợp chọn cho dung hợp hầu hết tạo thể lai tứ bội (tetraploid), một số kết quả khác gần 50% là thể lục bội (hexaploid) và thể bội không hoàn chỉnh (aneuploid) ðặc biệt một tổ hợp lai thu ñược có tới 94% dòng lai soma, trong khi ñó những tổ hợp khác chỉ có 2% là dòng lai soma

ða số các con lai soma thu ñược có biểu hiện tính kháng virus của cả hai ñối tượng khoai tây dung hợp, con lai ñược xác ñịnh bằng kỹ thuật RFLP và phân tích isozyme với 2 loại enzym esterase và peroxidase

Lu Wenhe và cộng sự (2004) cho rằng dung hợp tế bào trần không chỉ vượt qua rào cản lai tạo thông thường mà còn thu ñược các thể lai soma, do

vậy con lai soma sẽ thể hiện ưu thế lai rất rõ Kỹ thuật dung hợp tế bào ñã ñược nghiên cứu và ứng dụng thành công trong việc phát triển các giống cây trồng mới Có thể kể tên một số giống ñã thương mại hoá thành công như : cam "Oretachi" (cam + cam ba lá), "Shuvel" (quít Satsuma + cam), "Gravel" (cam lai bưởi chùm), "Murrel" (murcott +cam) và "Yuvel" (Yuzu + cam), Giống thuốc lá bất dục ñực Ms-F 224 Ngoài ra nhiều dòng bất dục ñực dùng

ñể sản xuất hạt F1 ở lúa, cà rốt, cải bắp và cà cũng ñược phát triển bằng kỹ thuật dung hợp tế bào

Với sự phát triển không ngừng của các công nghệ hiện ñại kết hợp với các kỹ thuật truyền thống, các gen kháng hai loại virus PVY và PVX ñã ñược xác ñịnh thông qua các nghiên cứu di truyền và chỉ thị phân tử (Blackburn & Barker, 2001) Các trình tự liên quan ñến khả năng kháng virus ở khoai tây ñã ñược xác ñịnh Bên cạnh ñó, hơn 5881 SSRs ở khoai tây ñã ñược tìm thấy ðây chính là những cơ sở dữ liệu quan trọng ñể ứng dụng các kỹ thuật của công nghệ sinh học hiện ñại (tin sinh học, chỉ thị phân tử) nhằm nhanh chóng tạo các giống khoai tây theo ñịnh hướng mong muốn D.Milbourne và cộng

sự (1998) ñã thành công trong việc phân lập, ñánh giá và lập bản ñồ SSR cho khoai tây Các nhà nghiên cứu ñã thiết kế và tổng hợp thành công 120 cặp mồi với vị trí chính xác trên ADN của khoai tây ñược thiết kế và tổng hợp ðây là những giữ liệu rất quan trọng cho nghiên cứu di truyền ở khoai tây trong tương lai Kế thừa những kết quả này, Ye –So Song và cộng sự (2005)

ñã xây dựng thành công bản ñồ gen Rysto (gen kháng cực kỳ cao với virus PVY), gen này nằm trên nhiễm sắc thể số XII của khoai tây 12 marker của

gen Rysto ñã ñược sử dụng ñể phân tích ña hình của 106 giống khoai tây của

ðức, Ba lan, Thụy sỹ Locus của gen Rysto ñã ñược xác ñịnh nằm trên nhiễm sắc thể số XII bằng mồi STM0003 Sử dụng các dòng khoai tây nhị bội tạo ra

từ nuôi cấy hạt phấn sơ cấp ñể phát triển các chỉ thị phân tử ñã ñược chứng minh ðây là nguồn marker tiềm năng cho chương trình chọn tạo giống khoai

tây có các ñặc tính mong muốn [49], [64]

Gần ựây, có nhiều hướng nghiên cứu mới là sử dụng nguồn gen khoai

tây dại có ựặc tắnh kháng bệnh và dịch hại (virus, Phytophtora infestan, rệp

truyền bệnh ) rất ựiển hình làm nguyên liệu dung hợp trực tiếp với các dòng khoai tây trồng ựể tạo các con lai soma mang ựặc tắnh chống chịu virus mốc sương và rệp truyền bệnh Các dòng lai này sẽ ựược sử dụng làm vật liệu lai lại (BC) với chắnh bố mẹ của chúng Kết quả tạo ra các dòng khoai tây trồng trọt mang ựặc tắnh kháng bệnh virus rõ rệt cùng với các ựặc tắnh nông sinh học tốt của bố mẹ đã có nhiều công trình công bố về việc sử dụng nguồn gen khoai tây dại ựể chuyển vào các giống khoai tây trồng bằng dung hợp tế bào

trần và lai hữu tắnh: S chacoense (Butenko và cs, 1982); S.niggrum (Binding

và cs, 1982; 1988); S.brevidens (Austin và cs, 1985; helgeson, 1993);

S.circaeifolium (Mattheij và cs, 1992); S.berthaultii (Serraf và cs,1991); S.commersonii (Cardi và cs, 1993); S khasianum, S.aculeatissimum

(Stattmann và cs, 1994); S.pinnatisectum (Schilde-Rentschler và cs, 1993; Thieme và cs, 1995); S.bulbocastanum (Austin và cs, 1993; Brown và cs,

3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ðối tượng, vật liệu, ñịa ñiểm và thời gian nghiên cứu

Bảng 3.1 Các dòng lai soma tái sinh ñược từ 4 tổ hợp dung hợp

nghiên cứu Các tổ hợp

dung hợp A16+B208 A15 + A56 B208 + B186 A15 + B208

- Các dòng lai soma khoai tây tái sinh ở dạng cây in vitro nuôi cấy trên

môi trường MS cơ bản, với quang chu kỳ chiếu sáng 16h/ngày, nhiệt ñộ phòng nuôi 18 – 22oC Các dòng “bố mẹ” cũng ñược nuôi cấy trong ñiều kiện

tương tự ñể làm vật liệu ñối chứng

- Các hóa chất và thiết bị sử dụng cho nghiên cứu:

+ Hóa chất nuôi cấy mô (Phụ lục 1)

+ Hóa chất dùng ựể tách chiết DNA (Phụ lục 2)

+ Hóa chất dùng ựể tách chiết protein (Phụ lục 3)

3.2 Nội dung nghiên cứu

Nội dung nghiên cứu ựược thể hiện theo sơ ựồ sau:

Cây lai soma khoai tây tái sinh sau dung hợp

Chọn lọc các con lai tứ bội (phương pháp flow cytometry)

PP Isozyme Xác ựịnh con lai heterozygous

(Con lai soma dị nhân)

PP chỉ thị ADN đánh giá con lai soma dị nhân

Trong ựiều kiện in vitro

- Khả năng sinh trưởng phát triển

- Khả năng tạo củ

- Kiểm tra sự có mặt của gen kháng

virus PVX, PVY

Trong ựiều kiện chậu vại

- Khả năng sinh trưởng phát triển

- Khả năng tạo củ

- Kiểm tra tắnh kháng virus PVX, PVY bằng lây nhiễm nhân tạo

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Các phương pháp nghiên cứu trong phòng

3.3.1.1 Phương pháp nuôi cấy mô hiện hành:

Các dòng khoai tây nhị bội (diploid) ñược nuôi cấy in vitro trong môi trường MS Cây in vitro ñược ñặt trong phòng nuôi theo chế ñộ nhiệt ñộ là

210C, cường ñộ chiếu sáng 3000 – 4000 lux, quang chu kỳ 16h chiếu sáng/ngày

3.3.1.2 Phương pháp xác ñịnh con lai bằng ñếm ñộ bội flow cytometry

Nguyên lý: ðây là một công nghệ dùng ñể ñếm và xác ñịnh những hạt siêu nhỏ như tế bào và nhiễm sắc thể Bằng cách làm nổi chúng trong một dòng chảy và dẫn qua bộ từ trường ðây là một phép ño các thông số quang học (huỳnh quang) của các dạng hạt siêu nhỏ trong dịch huyền phù (tế bào, nucleicacid), vận chuyển trên một dòng chảy ñơn qua các ñiểm ño lường Mỗi hạt huyền phù có kích thước từ 0,2 – 150 µm chạy qua một tia sáng, khi ñó các chất huỳnh quang sẽ tìm thấy các hạt này hoặc lực hút các thể này sẽ ñược tính toán Khi các hạt này chạy qua nguồn sáng UV, chất màu ñược nhuộm huỳnh quang sẽ tương ứng với hàm lượng ADN Dấu hiệu của chất nhuộm huỳnh quang ñược biến ñổi tùy thuộc vào tín hiệu electron Các giá trị ño ñược sẽ ñược tính toán và tóm tắt trên một biểu ñồ Số lượng nhân tất nhiên sẽ tương ứng với hàm lượng ADN

Quy trình ñánh giá mức ña bội của tế bào thực vật (phụ lục 4)

3.3.1.3 Phương pháp xác ñịnh con lai bằng chỉ thị ISOZYME (theo Thach và

cs, 1993)

Từ kết quả ñánh giá ñộ bội thông qua máy Flow cytometry chúng ta sẽ lọc ñược những dòng tứ bội Tuy nhiên không phải tất cả các dòng tứ bội ñó ñều là con lai dị nhân (heterozygous) do vậy ñể tìm ra ñâu là con lai dị nhân cần tiến hành theo nhiều phương pháp khác nhau Nghiên cứu ñã sử dụng 2 loại isozym là esteraza và peroxidaza cho xác ñịnh con lai soma Phương pháp và hóa chất ñược thể hiện trong phụ lục 3

3.3.1.4 Phương pháp xác ñịnh con lai soma bằng chỉ thị phân tử SSR: dựa

trên chỉ thị phân tử SSR kết hợp sử dụng hệ thống phân tích di truyền ña năng

GenomeLab GeXP 8800 (Beckman GenomeLab Coulters)

Phương pháp chiết tách ADN

Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp tách chiết và tinh sạch ADN tổng số của GS Hans – Joerg Jacobsen trường ðại học Hannover (Phụ lục 5)

Sau khi tách chiết DNA xong tiến hành kiểm tra ñộ nguyên vẹn của DNA tổng số bằng ñiện di trên gel agarose 1% Nếu ñạt yêu cầu thì thực hiện thí nghiệm chạy phản ứng PCR với cặp mồi ñặc hiệu

Phương pháp sử dụng mồi SSR:

- Các mồi SSR sử dụng ñược trình bày ở bảng như trong phần vật liệu

- Các mồi ñánh dấu và không ñánh dấu do Biomers net GmbH (ðức) cung cấp Phản ứng ñánh dấu các ñoạn ADN với chất nhuộm huỳnh quang sử dụng ba mồi: một mồi xuôi với ñuôi M13 ở ñầu 5’, một mồi ngược và một mồi M13 chung (Schuelke, 2000)

- Sử dụng máy MJ Research Thermocycler (PTC-200) ñể tăng cường nồng ñộ của các ñoạn chỉ thị

- Thể tích của dung dịch phản ứng PCR là 20 ul, bao gồm 25 ng DNA, 1x dung dịch ñệm PCR, 2.5 mM MgCl2, 200 uM cho mỗi dNTP, 0.1 uM mồi xuôi có ñánh dấu ñuôi, 0.17 uM mồi ngược, 0.07 uM mồi ñánh dấu M13 và 0.5 ñơn vị enzyme Taq DNA polymerase

- Chu kỳ PCR bao gồm: bước ñầu tiên 5 phút; 30 chu kỳ với mỗi chu kỳ kéo dài 30 giây ở 94oC, 45 giây ở 60oC, 45 giây ở 72oC; 8 chu kỳ với 30 giây ở 94oC, 45 giây ở 56oC, 45 giây ở 72oC; và bước kéo dài cuối cùng ở 72oC trong 10 phút

- Sản phẩm PCR ñược cho vào ống mao quản và phân tích theo thiết bị GenomeLab GeXP 8800 (Beckman Coulter) Kích thước của các ñoạn ADN ñược xác ñịnh tự ñộng bởi phần mềm phân tích chuyên dụng ñi kèm với máy

3.3.1.5 Phương pháp ñánh giá khả năng kháng virus bằng phương pháp DAS – ELISA (Double Antibody Sandwich Enzyme – linked imunosorbent assay) Bước 1: Cố ñịnh kháng thể IgG ñặc hiệu của virus vào bản ELISA

IgG hòa trong dung dịch ñệm carbonat, cho vào mỗi giếng 200µl ðặt bản ELISA trong hộp ẩm có nắp ñậy, ñể vào tủ ấm ở nhiệt ñộ 370C trong 2 giờ Sau khi ủ, các giếng ñược rửa bằng dung dịch ñệm rửa (PBS-T) 4 lần

Bước 2: Cố ñịnh dịch cây vào bản ELISA

Nghiền mỗi mẫu 1g trong ñệm chiết với ñộ pha loãng 1/10 Dịch cây ñược nhỏ vào bản ELISA với lượng 200µl/1giếng ðồng thời cho 200µl dung dịch ñối chứng âm và 200µl dung dịch ñối chứng dương vào các giếng ñánh dấu riêng Ủ bản Elisa ở 370C trong 2 giờ Sau khi ủ các giếng ñược rửa bằng dung dịch ñệm rửa (PBS-T) 4 lần, mỗi lần trong 5 phút

Bước 3: Cố ñịnh IgG liên kết Enzyme

Hòa IgG liên kết enzyme (IgG – E) trong dung dịch ñệm liên kết Cho vào mỗi giếng 200µl Bản ELISA ñược ủ trong 2 giờ và rửa như bước 2

Bước 4: Cố ñịnh chất nền vào bản ELISA

Hòa chất nền NPP (nitrophenol phosphate) vào dung dịch ñệm subtra theo tỷ lệ ñã cho Sau ñó nhỏ vào mỗi giếng 200µl Bản ELISA ñể trong hộp

ẩm ñược ñặt ở nhiệt ñộ phòng Quan sát sự phản ứng màu ở các giếng Sau 1 giờ các giếng có màu vàng là các giếng có phản ứng dương tính, giếng không

có màu là không có phản ứng Kết quả ñược ñọc chính xác hơn trên máy ñọc ELISA ở bước sóng 405nm

3.3.1.6 Phương pháp phân tích các chỉ tiêu chất lượng

* ðịnh lượng ñường khử (phương pháp iod-Ixekutz)

Nguyên liệu: Dịch chiết ñược chuẩn bị theo phương pháp Bertrand (phụ lục 7)

Tiến hành: lấy 2 bình tam giác:bình 1 (ñối chứng), bình 2 (thí nghiệm)