Nghiên cứu bệnh thối nhũn cây hành (allium fistulosum l ) tại kinh môn hải dương và đề xuất một số biện pháp phòng trừ

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦ 2 bởi một số loài bệnh hại như bệnh sương mai Phytophthora destructor, bệnh héo vàng Fusarium oxysporum, bệ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-

ðINH XUÂN HOÀN

NGHIÊN CỨU BỆNH THỐI NHŨN

CÂY HÀNH (ALLIUM FISTULOSUM L.)

TẠI KINH MÔN – HẢI DƯƠNG VÀ ðỀ XUẤT

MỘT SỐ BIỆN PHÁP PHÒNG TRỪ

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

HÀ NỘI - 2012

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-

ðINH XUÂN HOÀN

NGHIÊN CỨU BỆNH THỐI NHŨN

CÂY HÀNH (ALLIUM FISTULOSUM L.)

TẠI KINH MÔN – HẢI DƯƠNG VÀ ðỀ XUẤT

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… i

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu

sử dụng trong luận văn là hoàn toàn trung thực, các tài liệu tham khảo ñã ñược trích dẫn chính xác và mọi sự giúp ñỡ ñều ñã ñược cảm ơn ñầy ñủ

Hà Nội, ngày 15 tháng 10 năm 2012

Tác giả

ðinh Xuân Hoàn

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦ ii

ựề tài này

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành ựến toàn thể các thầy cô giáo, các cán bộ Viện đào tạo sau ựại học Ờ Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội, các thầy cô giáo trong khoa Nông học nói chung và Bộ môn Bệnh cây Ờ Nông dược nói riêng ựã luôn nhiệt tình trong công tác giảng dạy, truyền ựạt kiến thức và luôn tạo ựiều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện luận văn tốt nghiệp Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành ựến toàn bộ các cán bộ Bộ môn Miễn dịch thực vật Ờ Viện Bảo vệ thực vật ựã tạo mọi ựiều kiện và luôn tận tình giúp ựỡ, ựộng viên tôi cả về vật chất và tinh thần trong quá trình thực hiện ựề tài

Tôi xin gửi lời cảm ơn ựến gia ựình, các bạn bè và ựồng nghiệp ựã ựộng viên, khắch lệ và giúp ựỡ tôi trong quá trình thực hiện ựề tài

Một lần nữa xin trân trọng cảm ơn

Hà Nội, ngày 15 tháng 10 năm 2012

Tác giả

đinh Xuân Hoàn

Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ……… iii

MỤC LỤC LỜI CAM ðOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC HÌNH vii

BẢNG CHÚ GIẢI CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT viii

PHẦN I: MỞ ðẦU 1

1.1 ðặt vấn đề 1

1.2 Mục đích và yêu cầu 2

1.2.1 Mục đích 2

1.2.2 Yêu cầu 3

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 4

2.1.1 Nghiên cứu về cây hành 4

2.1.2 Tình hình nghiên cứu về các loại bệnh hại hành 4

2.1.2.1 Bệnh thối nhũn do vi khuẩn Erwinia carotovora 4

2.1.2.2 Bệnh héo do nấm Fusarium oxysporum 5

2.1.2.3 Bệnh khơ đầu lá do nấm Stemphyllium botryosum W. 6

2.1.3 Các phương pháp chẩn đốn bệnh do vi khuẩn gây ra 6

2.2 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 9

2.2.1 Thiệt hại do vi khuẩn Erwinia carotovora gây ra 9

2.2.2 Triệu chứng bệnh thối nhũn do vi khuẩn Erwinia carotovora gây ra 11

2.2.3 Hệ thống phân loại vi khuẩn Erwinia carotovora 12

2.2.4 ðặc điểm sinh học, sinh thái của vi khuẩn Erwinia carotovora 13

2.2.5 Sự lan truyền vi khuẩn Erwinia carotovora 16

2.2.6 Phân lập và giám định vi khuẩn Erwinia carotovora 17

2.2.7 Tình hình nghiên cứu về bệnh hại hành trong bảo quản 21

2.2.8 Tình hình nghiên cứu bệnh hại hành ngồi đồng ruộng 23

2.2.9 Những nghiên cứu về vi khuẩn đối kháng với Erwinia carotovora 25

2.2.10 Tình hình nghiên cứu biện pháp phịng chống bệnh thối nhũn hành 29

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦ iv

PHẦN III:VẬT LIỆU, đỊA đIỂM, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU31 3.1 Vật liệu nghiên cứu 31

3.2 Thời gian và ựịa ựiểm nghiên cứu 31

3.3 Nội dung nghiên cứu 31

3.4 Phương pháp nghiên cứu 32

3.4.1 Phương pháp ựiều tra thành phần bệnh hại hành 32

3.4.2 điều tra diễn biến bệnh thối nhũn hành trong sản xuất và bảo quản 32

3.4.3 Phân lập các tác nhân gây bệnh thối trên hành 32

3.4.4 Phương pháp lây nhiễm nhân tạo 34

3.4.5 Thử khả năng ựối kháng của một số vi sinh vật với Erwinia carotovora 35

3.4.6 Phương pháp nghiên cứu ngoài ựồng ruộng 35

3.4.7 Nghiên cứu một số biện pháp phòng trừ bệnh thối nhũn hành 37

3.4.8 Phương pháp xử lý số liệu 38

PHẦN IV: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 39

4.1 Thành phần bệnh hại hành trong bảo quản và ngoài sản xuất tại Kinh Môn, Hải Dương vụ đông Xuân 2011 Ờ 2012 39

4.1.1 Thành phần bệnh hại hành trong bảo quản năm 2011 39

4.1.2 Thành phần bệnh hại hành ngoài ựộng ruộng vụ đông Xuân 2011 - 2012 40

4.2 Các nguyên nhân làm giảm khối lượng hành và diễn biến một số bệnh hại chắnh trong bảo quản hành tại Kinh Môn, Hải Dương năm 2011 42

4.2.1 Các nguyên nhân làm giảm khối lượng hành trong bảo quản 42

4.2.2 Diễn biến một số bệnh hại hành trong bảo quản vụ Xuân năm 2011 45

4.3 Ảnh hưởng của các phương pháp bảo quản ựến tỷ lệ bệnh hại hành 46

4.4 Giám ựịnh bệnh thối nhũn hại hành 49

4.4.1 Kết quả lây nhiễm vi khuẩn gây bệnh thối nhũn hành theo chu trình Koch 49

4.4.2 đặc ựiểm khuẩn lạc của vi khuẩn gây thối nhũn hành trên môi trường PDA 49

4.4.3 Sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh thối nhũn hành trên môi trường TZC 50

4.4.4 Khả năng gây bệnh của vi khuẩn thối nhũn hành trên quả cà chua 51

4.4.5 Khả năng làm mủn mô thực vật của vi khuẩn gây bệnh thối nhũn hành 51

4.5 Ảnh hưởng của một số yếu tố vô sinh ựến sự phát triển của vi khuẩn Erwinia carotovora trên môi trường PDA 52

4.5.1 Ảnh hưởng của yếu tố nhiệt ựộ ựến sự phát triển của vi khuẩn Erwinia carotovora trên môi trường PDA 52

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦ v

4.5.2 Ảnh hưởng của pH môi trường ựến sự phát triển của vi khuẩn Erwinia carotovora trên môi trường PDA 55

4.6 Khả năng tồn tại của vi khuẩn Erwinia carotovora trong các môi trường ựất và nước 57

4.7 Khả năng gây bệnh của vi khuẩn Erwinia carotovora ở một số nồng ựộ 58

4.8 Kết quả nghiên cứu trong ựiều kiện lây nhiễm nhân tạo 59

4.8.1 Khả năng gây bệnh thối nhũn của vi khuẩn Erwinia carotovora trên các giống hành khác nhau trong ựiều kiện lây bệnh nhân tạo 59

4.8.2 Khả năng gây bệnh của vi khuẩn Erwinia carotovora sau thời gian tồn tại trong nước cất 62

4.9 Kết quả nghiên cứu bệnh thối nhũn hại hành ngoài ựồng ruộng 66

4.9.1 Ảnh hưởng của các chân ựất ựến bệnh thối nhũn hại hành vụ đông Xuân năm 2011 - 2012 66

4.9.2 Ảnh hưởng của lượng ựạm bón ựến bệnh thối nhũn hại hành vụ đông Xuân năm 2011 - 2012 68

4.9.3 Ảnh hưởng của giống hành ựến bệnh thối nhũn hại hành tại huyện Kinh Môn, Hải Dương vụ đông Xuân năm 2011 Ờ 2012 70

4.10 Nghiên cứu các giải pháp phòng trừ bệnh thối nhũn hại hành tại Kinh Môn, Hải Dương vụ đông Xuân năm 2011 Ờ 2012 73

4.10.1 Khả năng ức chế vi khuẩn Erwinia carotovora của một số loại thuốc hóa học trong ựiều kiện phòng thắ nghiệm 73

4.10.2 đánh giá hiệu lực của một số loại thuốc hóa học trong phòng trừ bệnh thối nhũn hành ngoài ựồng ruộng 75

4.10.3 Khả năng ựối kháng của vi khuẩn Bacillus thuringiensis với vi khuẩn Erwinia carotovora trong ựiều kiện phòng thắ nghiệm. 77

PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ đỀ NGHỊ 80

5.1 Kết luận 80

5.2 đề nghị 81

TÀI LIỆU THAM KHẢO 83

PHỤ LỤC 84

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦ vi

ở một số nồng ựộ khác nhau 59 Bảng 4.10 Tỷ lệ bệnh thối nhũn trên giống hành trắng và hành tắm trong ựiều kiện lây nhiễm nhân tạo 61 Bảng 4.11 Khả năng gây bệnh của vi khuẩn Erwinia carotovora sau thời gian tồn tại của vi khuẩn trong nước cất trên hành có vết thương 63 Bảng 4.12 Khả năng gây bệnh của vi khuẩn Erwinia carotovora sau thời gian tồn tại của vi khuẩn trong nước cất trên hành không có vết thương 64 Bảng 4.13 Diễn biến bệnh thối nhũn hại hành trên các chân ựất khác nhau vụ đông Xuân 2011 Ờ 2012 67 Bảng 4.14 Diễn biến bệnh thối nhũn hại hành trên các chế ựộ bón ựạm khác nhau

vụ đông Xuân 2011 Ờ 201 269 Bảng 4.15 Diễn biến bệnh thối nhũn hành trên các giống hành khác nhau vụ đông Xuân năm 2011 Ờ 2012 71 Bảng 4.16 đường kắnh khuẩn lạc Erwinia carotovora trên môi trường PDA có pha một số loại thuốc hóa học (cm) 74 Bảng 4.17 Hiệu lực của một số loại thuốc hóa học trong phòng trừ bệnh thối nhũn hại hành ngoài ựồng ruộng vụ đông Xuân 2011 Ờ 2012 76 Bảng 4.18 Diện tắch vết lõm trên lát cắt khoai tây gây ra bởi các nồng ựộ khác nhau của vi khuẩn Erwinia carotovora 78

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦ vii

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 4.1 Biểu ựồ biểu diễn tỷ lệ thiệt hại do các tác nhân gây bệnh ựối với hành củ sau bảo quản 43 Hình 4.2 đồ thị biểu diễn diễn biến một số bệnh hại hành trong bảo quản năm 2011 46 Hình 4.3 Biểu ựồ biểu diễn tỷ lệ các loại bệnh hại ở các phương pháp bảo quản năm 2011 48 Hình 4.4 Kết quả lây nhiễm vi khuẩn gây bệnh thối nhũn lên củ hành khỏe sau 3 ngày lây nhiễm 49 Hình 4.5 Khuẩn lạc của vi khuẩn gây bệnh thối nhũn hành trên môi trường PDA 50 Hình 4.6 Khuẩn lạc vi khuẩn gây thối nhũn hành trên môi trường TZC 50 Hình 4.7 Kết quả lây nhiễm vi khuẩn gây bệnh thối nhũn hành lên quả cà chua sau

2 ngày lây nhiễm 51 Hình 4.8 Khả năng làm mủn lát cắt khoai tây của vi khuẩn gây bệnh thối nhũn hành (trái) và ựối chứng (phải) 52 Hình 4.9 đồ thị tuyến tắnh biểu diễn ảnh hưởng của yếu tố nhiệt ựộ ựến sự phát triển của vi khuẩn Erwinia carotovora trên môi trường PDA 54 Hình 4.10 đồ thị tuyến tắnh biểu diễn mối tương quan giữa pH môi trường và sự phát triển của vi khuẩn Erwinia carotovora trên môi trường PDA 56 Hình 4.11 Diễn biến bệnh thối nhũn trên hành có vết thương ựược lây bằng vi khuẩn Erwinia carotovora sau thời gian tồn tại trong nước cất 63 Hình 4.12 Diễn biến bệnh thối nhũn trên hành trắng không có vết thương ở các thời ựiểm sau lây bệnh 65 Hình 4.13 đồ thị biểu diễn diễn biến bệnh thối nhũn hành vụ đông Xuân năm 2011 Ờ 2012 67 Hình 4.14 đồ thị biểu diễn diễn biến bệnh thối nhũn hại hành ở các chế ựộ bón ựạm khác nhau 70 Hình 4.15 đồ thị biểu diễn diến biến bệnh thối nhũn trên các giống hành khác nhau vụ đông Xuân 2011 Ờ 2012 tại Kinh Môn Ờ Hải Dương 72 Hình 4.16 đồ thị tuyến tắnh biểu diễn ảnh hưởng của các loại thuốc hóa học ựến sự phát triển của vi khuẩn Erwinia carotovora trên môi trường PDA 74 Hình 4.17 đường kắnh khuẩn lạc Erwinia carotovora trên môi trường PDA có pha một số loại thuốc hóa học ở thời ựiểm 72 giờ sau cấy 75 Hình 4.18 Biểu ựồ biểu diễn hiệu lực của các loại thuốc hóa học ựối với bệnh thối nhũn vi khuẩn vụ đông Xuân 2011 Ờ 2012 76 Hình 4.19 Ờ 4.22 đồ thị biểu diễn diện tắch vết lõm trên lát cắt khoai tây gây ra bởi

vi khuẩn Erwinia carotovora ở các nồng ựộ khác nhau 78

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… viii

BẢNG CHÚ GIẢI CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

Ký hiệu

BT Dung dịch vi khuẩn Bacillus thurigiensis

Tr1CVT Giống hành trắng có vết thương ñược nhiễm bằng vi khuẩn Erwinia

carotovora tồn tại 01 ngày trong nước

Tr10CVT Giống hành trắng có vết thương ñược lây nhiễm bằng vi khuẩn

Erwinia carotovora tồn tại 10 ngày trong nước cất

Tr40CVT Giống hành trắng có vết thương ñược lây nhiễm bằng vi khuẩn

Erwinia carotovora tồn tại 40 ngày trong nước cất

Tr1KVT Giống hành trắng không có vết thương ñược lây nhiễm bằng vi khuẩn

Erwinia carotovora tồn tại 01 ngày trong nước cất

Tr10KVT Giống hành trắng không có vết thương ñược lây nhiễm bằng vi khuẩn

Erwinia carotovora tồn tại 10 ngày trong nước cất

Tr40KVT Giống hành trắng không có vết thương ñược lây nhiễm bằng vi khuẩn

Erwinia carotovora tồn tại 40 ngày trong nước cất

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 1

PHẦN I

MỞ ðẦU 1.1 ðặt vấn ñề

Cây hành (Allium fistulosum L.) là một trong những loại cây gia vị quan

trọng ở nước ta cũng như nhiều quốc gia khác trên thế giới Bên cạnh việc ñược dùng làm gia vị, cây hành còn ñược dùng làm thành phần quan trọng trong nhiều bài thuốc ñể chữa một số loại bệnh cho người như giảm ñau ñầu, giảm ho

và ñau họng, chữa bệnh thiếu máu hay ngăn chặn sự phát triển của các tế bào ung thư, v.v… Trong những năm gần ñây, sản phẩm hành củ của nước ta không những ñáp ứng ñủ nhu cầu trong nước mà còn ñược xuất khẩu ñến nhiều nước trên thế giới và ñược thị trường ưa chuộng nhờ chất lượng tốt

Trên thế giới, cây hành bị hại nặng cả trên ñồng ruộng và ở giai ñoạn bảo quản trong kho mà tác nhân gây hại chủ yếu là các loại bệnh hại Các nghiên cứu ñã xác ñịnh các loại dịch hại trên hành bao gồm: 4 loại côn trùng, 2 loài tuyến trùng gây hại, 7 loại bệnh hại do nấm và 5 loại bệnh hại do vi khuẩn gây ra (Theo CABI, 2006) Các loại bệnh hại chủ yếu trên ñồng ruộng bao gồm bệnh khô ñầu lá, bệnh sương mai, bệnh thối nhũn vi khuẩn, … và trong bảo

quản là các bệnh mốc ñen do nấm Aspergillus niger, bệnh mốc vàng do nấm

Aspergillus flavus và bệnh thối nhũn do vi khuẩn Erwinia carotovora Về sâu

hại, mối quan tâm lớn nhất trên cây hành củ ngoài sản xuất là sâu xanh da láng

(Spodoptera exigua)

Trong thực tế sản xuất hành ở nước ta hiện nay, một số loài sâu hại như

sâu xanh da láng (Spodoptera exigua), sâu khoang (Spodoptera litura) có xuất

hiện nhưng không phải là ñối tượng quan trọng, sự gây hại của chúng là không ñáng kể và không cần thiết phải áp dụng các biện pháp phòng trừ Tuy nhiên, cây hành lại chịu sự tác ñộng rất lớn bởi các yếu tố bệnh hại từ khi trồng ngoài sản xuất ñến bảo quản sau thu hoạch Trên ñồng ruộng, cây hành bị tấn công

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦ 2

bởi một số loài bệnh hại như bệnh sương mai (Phytophthora destructor), bệnh héo vàng (Fusarium oxysporum), bệnh khô ựầu lá (Stemphylium botryosum),

.v.vẦ Trong bảo quản, hành bị gây hại nghiêm trọng bởi bệnh thối củ do nhiều tác nhân tác ựộng tổng hợp gây ra trong ựó tác nhân chủ yếu và quan trọng nhất

là vi khuẩn Erwinia carotovora

Diện tắch cây vụ đông trên ựịa bàn huyện Kinh Môn hàng năm ựều ựạt trên 3.400 ha trong ựó diện tắch trồng hành luôn chiếm tỷ lệ lớn Trong những năm gần ựây, tỷ lệ về diện tắch trồng hành trên ựịa bàn huyện chiếm từ 65% ựến gần 80% tổng diện tắch canh tác cây vụ đông điều này khẳng ựịnh tầm quan trọng của cây hành như là một loại cây trồng chủ lực trong cơ cấu cây trồng của huyện Chỉ tắnh riêng xã Hiệp Hòa của huyện Kinh Môn, diện tắch trồng hành hàng năm ựạt từ 370 Ờ 390 ha (chiếm từ 90 Ờ 95% diện tắch cây vụ đông của xã) Tuy nhiên, sản lượng hành củ thương phẩm bị giảm mạnh trong quá trình bảo quản do tác ựộng của bệnh thối nhũn gây thiệt hại lớn về kinh tế

Theo số liệu của Sở NN&PTNT tỉnh Hải Dương, trong quá trình trồng

và bảo quản, hành bị bệnh thối nhũn gây ra ựã làm thất thu năng suất 30- 40% sản lượng, có hộ gia ựình mất trắng sau 5 tháng bảo quản các cơ quan chức năng của ựịa phương ựã chỉ ựạo phòng chống bệnh nhưng hiệu quả chưa cao,

sử dụng các loại thuốc BVTV trong bảo quản quá nhiều, sản phẩm sau bảo quản chưa an toàn với con người Xuất phát từ vấn ựề trên, chúng tôi tiến hành

nghiên cứu ựề tài: ỘNghiên cứu bệnh thối nhũn cây hành (Allium fistulosum

L.) tại Kinh Môn - Hải Dương và ựề xuất một số biện pháp phòng trừỢ

1.2 Mục ựắch và yêu cầu

1.2.1 Mục ựắch

Nhằm xác ựịnh ựược thành phần bệnh hại hành trong sản xuất, trong

bảo quản và nghiên cứu một số ựặc ựiểm sinh lý của vi khuẩn Erwinia

carotovora ựể từ ựó ựề xuất một số biện pháp phòng trừ

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 3

1.2.2 Yêu cầu

- Có ñược bảng thành phần bệnh hại hành ngoài sản xuất và trong bảo quản

- Giám ñịnh ñược các tác nhân gây bệnh thối nhũn hại hành và xác ñịnh ñược nguyên nhân gây hại chính

- Xác ñịnh ñược các ñặc ñiểm sinh lý của vi khuẩn gây bệnh thối nhũn

hại hành, các yếu tố vô sinh ảnh hưởng ñến sự phát sinh phát triển của loại vi

khuẩn này như nhiệt ñộ, ñộ pH

- ðề xuất biện pháp phòng trừ trên cơ sở kết quả ñạt ñược của ñề tài

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 4

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

2.1.1 Nghiên cứu về cây hành

Tên tiếng Việt: hành ta

Tên tiếng Anh: Welsh onion

Tên latinh: Allium fistulosum L

Hành là cây thân thảo, sống lâu năm, có mùi ñặc biệt Có 5-6 lá, lá hình trụ rỗng, dài 30-50 cm, phía gốc lá phình to, trên ñầu thuôn nhọn Hoa tự mọc trên ống hình trụ rỗng Hoa tự dạng hình xim, có ngấn thành hình tán giả trông tựa hình cầu Quả nang, tròn Hành ñược trồng khắp nơi, chủ yếu là làm gia vị Thời vụ trồng: hành có thể ñược trồng quanh năm, tuy nhiên năng suất mùa nắng cao hơn năng suất trong mùa mưa

2.1.2 Tình hình nghiên cứu về các loại bệnh hại hành

2.1.2.1 Bệnh thối nhũn do vi khuẩn Erwinia carotovora

Ở Việt Nam bệnh thối củ hành tây chính thức ñược ghi nhận ở vùng Mê Linh – Vĩnh Phúc Hàng năm bệnh gây tổn thất từ 5- 25% sản lượng, ñặc biệt bệnh hại nghiêm trọng trong thời gian bảo quản ở trong kho và ngoài sản xuất [8]

Vi khuẩn Erwinia carotovora cũng gây bệnh thối nhũn trên nhiều loài

cây trồng khác Trên khoai tây, bệnh thối ướt làm cho vỏ củ thường bị chuyển thành màu nâu, nâu xẫm, củ mềm Trên bề mặt củ bệnh, ở phần mô bệnh ñôi khi thấy có bọt nước màu vàng, mùi thối khó ngửi Nếu cắt củ bệnh

sẽ thấy thịt củ bị thối nát, có màu vàng nâu Trong ñiều kiện bảo quản không ñúng kỹ thuật như quá ẩm, thiếu ánh sáng, nhiệt ñộ tương ñối cao thì bệnh thối ướt sẽ phát sinh phát triển mạnh ðồng thời, trong ñiều kiện ngoại cảnh

ñó, bệnh thối khô do nấm Fusarium cũng xâm nhập và gây bệnh [5]

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 5

Một loài vi khuẩn ñất gây hại từ ngoài ñồng ruộng ñến trong kho bảo

quản, trở thành mối nguy hiểm cho năng suất rau quả ñó là vi khuẩn E

carotovora Vi khuẩn là loại ña thực phá hoại trên nhiều loại cây trồng khác

nhau: hành tây, tỏi tây, cà rốt, cải bắp, súp lơ, cải canh Theo Nguyễn Thị Nghiêm, Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề (1999) chúng có khả năng tấn công nhiều loại cây rau màu như gừng, dưa leo, cải bắp, cần tàu, ớt, cà chua, cà rốt, khoai tây Vết bệnh nhũn nước xuất hiện trên mô cây bệnh rồi phát triển nhanh chóng Mô bệnh trở nên mềm nhũn, nhày nhụa, thường sậm màu, bốc

mùi hôi thối Vi khuẩn E carotovora có hình gậy, màu trắng kem, có 2 – 8 lông roi dạng tiêm mao, chúng có khả năng phân giải tinh bột và gelatin [7] E

carotovora mất tính gây bệnh sau 10 ngày ở ñất không có khử trùng, và 10

tháng ñối với ñất có khử trùng [7] Bệnh gây hại trong những ngày mưa dầm,

ñất thoát nước kém, lên luống thấp [6] E carotovora xâm nhập qua vết thương

cơ giới, gió mưa, côn trùng, gia súc, con người Sau khi xâm nhập chúng bắt ñầu phát triển trong gian bào, xâm nhiễm vào trong nhu mô [7] Phạm vi biến ñộng ñộ ẩm lớn 20-100%, mầm bệnh lưu tồn trong xác cây và chất hữư cơ trong ñất Theo Nguyễn Thanh Trà và cộng sự (2008) có nghiên cứu về biện pháp phòng trừ bệnh thối nhũn bằng hợp chất ñược chiết ra từ cây Bạch hoa xà

- Plumbagin - một hợp chất tự nhiên Plumbagin và dẫn xuất 4 có hoạt tính

kháng chủng vi khuẩn Erwinia carotovora gây bệnh thối nhũn cây ðịa lan, ñặc

biệt là dẫn xuất 4 có hoạt tính mạnh nhất Tuy mới bước ñầu nghiên cứu nhưng

ñã mở ra một hướng mới phòng trừ thối nhũn bằng dịch chiết từ cây cỏ [9]

2.1.2.2 Bệnh héo do nấm Fusarium oxysporum

Ở nước ta, bệnh héo rũ cây trồng do nấm Fusarium là bệnh phổ biến trên

nhiều loại cây trồng như lạc, ớt, bầu bí, khoai lang, gừng loa kèn, ñinh lăng [3]

Theo ðỗ Tấn Dũng (2001), triệu chứng ñiển hình do nấm gây ra là héo

bó mạch dẫn, cây héo và chết Sợi nấm phát triển mạnh, ña bào, tản nấm phát triển có màu trắng hồng ñến màu tím violet hoặc tím ñậm [2]

Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 6

Nấm Fusarium oxysporum gây héo cây trồng cạn cĩ 3 loại bào tử:

Bào tử lớn thường hình thành nhiều, kích thước bào tử ngắn, trung bình hoặc dài, phần lớn cĩ 3 – 5 vách ngăn ngang, một đầu hơi nhọn hoặc thon nhỏ một đầu hình bàn chân Bào tử lớn nhìn chung được tìm thấy ở bề mặt cây bệnh cũng như trong nhĩm cuống bào tử đính

Bào tử nhỏ hình thành nhiều hình dạng bào tử thay đổi cĩ hình oval, elip hoặc quả thận, đơn bào Bào tử nhỏ gồm từ 1 đến 2 tế bào và là dạng bào

tử cĩ khối lượng lớn nhất, sản sinh thường xuyên trong tất cả mọi điều kiện, xuất hiện nhiều nhất trong mơ mạch của cây chủ

Bào tử hậu vỏ dày do các sợi nấm tạo thành, hình trịn, gồm từ 1 đến 2

tế bào được sản sinh ở cuối hoặc giữa hệ sợi giả hoặc trong bào tử lớn

Dựa vào đặc điểm hình thái bào tử lớn, bào tử lớn, bào tử nhỏ và bào tử

hậu người ta cĩ thể chuẩn đốn, giám định các chủng nấm Fusarium

oxysporum gây bệnh héo trên nhiều loại cây trồng khác nhau

Sự lan truyền của nấm trên đồng ruộng nhờ giĩ, mưa, nước tưới vật liệu giống nhiễm bệnh… Nguồn bệnh tồn tại dưới dạng sợi nấm và các loại bào tử trong đất, trong tàn dư, trong hạt giống, cây giống và các ký chủ phụ, cỏ dại [2]

2.1.2.3 Bệnh khơ đầu lá do nấm Stemphyllium botryosum W

Bệnh khơ đầu lá là một trong những bệnh hại nghiêm trọng, phổ biến ở nước ta Bệnh được ghi nhận từ năm 1978, gây hại trên hành tây, hành ta, tỏi ở vùng Bắc Ninh, Mê Linh (Vĩnh Phúc); Tứ Kỳ, Gia Lộc (Hải Dương)

và các vùng trồng hành khác Hàng năm bệnh gây hại nghiêm trọng, đặc biệt giai đoạn hình thành củ (cuối tháng 11đến tháng 2) đến khi thu hoạch, bệnh

cĩ thể làm giảm năng suất trung bình từ 15 – 20% [5]

2.1.3 Các phương pháp chẩn đốn bệnh do vi khuẩn gây ra

Chẩn đốn theo triệu chứng: một lồi vi khuẩn hoặc một nhĩm vi

khuẩn hại cây cĩ thể gây ra những loại triệu chứng bệnh đặc trưng Tuy nhiên, dựa vào triệu chứng bệnh chỉ cĩ thể xác định chẩn đốn đúng trong rất ít trường hợp.Trên một lồi cây, nhiều lồi vi khuẩn khác nhau và nhiều loại vi

Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 7

sinh vật khác nhau cĩ thể tạo ra các triệu chứng bệnh tương tự giống nhau rất khĩ phân biệt như các loại bệnh héo rũ, bệnh thối hỏng [7]

Chẩn đốn bằng phương pháp vi sinh: để xác định bệnh do vi

khuẩn gây ra, cần thiết phải khẳng định sự cĩ mặt của vi khuẩn trong mơ bệnh, phân lập từ mơ bệnh để nuơi cấy vi khuẩn thuần khiết, sau đĩ lây bệnh nhân tạo để xác định tính gây bệnh của chúng trên cây kí chủ theo quy tắc Koch Tiếp tục nghiên cứu xác định rõ đặc tính hình thái, sinh trưởng (khuẩn lạc) và phản ứng sinh hĩa để cĩ cơ sở phân loại, giám định loại (giống) và lồi vi khuẩn cần chẩn đốn [7]

Chẩn đốn bằng phương pháp sinh hĩa: một số chỉ tiêu cần thiết để

giám định lồi vi khuẩn cần chẩn đốn phải được khảo sát nghiên cứu bằng phương pháp thử các phản ứng sinh hĩa riêng biệt Các loại (giống) vi khuẩn khác nhau phân biệt về nhu cầu, khả năng sử dụng các chất dinh dưỡng và về kiểu trao đổi chất [7]

Chẩn đốn bằng phương pháp huyết thanh: là một phương pháp

chẩn đốn nhanh bệnh vi khuẩn được ứng dụng trong bệnh cây nhất là trong việc kiểm tra, chọn lọc giống, vật liệu làm giống sạch bệnh và trong kiểm dịch thực vật Phương pháp huyết thanh chẩn đốn vi khuẩn dựa trên cơ sở phản ứng cĩ tính đặc hiệu cao giữa kháng nguyên và kháng thể tương ứng

Tế bào vi khuẩn là những kháng nguyên, trong đĩ kháng nguyên O (ở tế bào) và kháng nguyên H (lơng roi) cĩ ý nghĩa lớn trong việc ứng dụng phương pháp huyết thanh để chẩn đốn, xác định lồi vi khuẩn gây bệnh một cách nhanh chĩng và khá chính xác Người ta tiêm kháng nguyên vi khuẩn vào trong cơ thể động vật rồi lấy kháng huyết thanh để thực hiện việc chẩn đốn ðể tăng độ nhạy phản ứng của kháng huyết thanh nhất là trong trường hợp số lượng tế bào vi khuẩn trong mơ bệnh quá thấp, cần áp dụng các phương pháp thử phản ứng theo phương pháp miễn dịch khuếch tán trên gel hoặc phương pháp miễn dịch liên kết men (ELISA) [7]

Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 8

Chẩn đốn bằng phương pháp sinh học phân tử: Phương pháp chẩn

đốn bệnh vi khuẩn theo phương pháp truyền thống là nuơi cấy trên một vài mơi trường chọn lọc Phương pháp này tốn nhiều thời gian và khơng đủ nhạy [37] Do đĩ, yêu cầu cĩ một kỹ thuật chẩn đốn, phát hiện bệnh một cách nhanh chĩng, chính xác và hiệu quả Các phương pháp sinh học phân tử đã phát triển mạnh mẽ và mang lại nhiều thành tựu to lớn cho việc chẩn đốn, phát hiện vi khuẩn gây bệnh cây trồng như DNA probe, PCR, RFLP, RAPD,…Phương pháp PCR là một trong những cơng cụ hữu hiệu trong việc xác định tác nhân gây bệnh cây trồng Theo Kang và ctv ( 2003), kỹ thuật PCR cho phép phát hiện nhanh, nhạy, dễ dàng khi so sánh với lai probe (probe hybridization) và nĩ khuếch đại đặc hiệu một trình tự gen mục tiêu chỉ hiện diện trong genome của một loại vi khuẩn Kỹ thuật PCR cĩ thể được sử dụng

để phát hiện tác nhân gây bệnh hiện diện với mật độ thấp trên mơ cây bị nhiễm bệnh Trên vi khuẩn người ta thường nghiên cứu vùng 16S ribosomal DNA (rDNA), 16S – 23S rDNA intergenic spacer regions (ISRs) Theo Subandiyah

và ctv (2000), 16S rDNA là một cơng cụ hữu dụng để nghiên cứu mối quan hệ phát sinh lồi và sự tiến hĩa giữa vi khuẩn và các sinh vật prokaryote khác, trình tự 16S rRNA và vùng hoạt động (intergenic region) giữa 16S rRNA và 23S rRNA được xem như cĩ thể biến đổi giữa các dịng trong một lồi Theo Christopher và David (1999), khi xem xét mối quan hệ thân cận trong lồi, 23S rDNA thường cho phép phân tích tốt hơn 16S rDNA bởi vì nĩ lớn hơn (khoảng 2,5 kb trong khi 16S rDNA khoảng 1,5 kb) và nĩ chứa trình tự biến đổi ở mức

độ cao hơn Ngồi ra, nhiều gen mục tiêu khác cũng được sử dụng trong nghiên cứu xác định mối quan hệ phát sinh lồi và phân loại tác nhân lây nhiễm như

gen mã hĩa protein heat-shock 65 (hsp65) trên lồi Mycobacterial, trình tự 23S rDNA, gen mã hĩa protein bề mặt A (ospA) và gen flagellin (fla) trên lồi

Borrelia So Young Yoo và ctv (2002) đã đề xuất một hướng mới trong nghiên

cứu xác định vi khuẩn gây bệnh dựa trên trình tự vùng ITS và 23S rDNA

Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 9

Vùng ITS (Internal transcribed spacer) là một đoạn (stretch) DNA nằm giữa tiểu đơn vị ribosom nhỏ (16S) và tiểu đơn vị ribosom lớn (23S) Việc thiết kế probe dựa trên trình tự vùng ITS và 23S rDNA mà nĩ thích hợp với kỹ thuật microarray để chẩn đốn bệnh do vi khuẩn gây ra Kết quả là đã tạo ra chip DNA chứa những probe đặc hiệu cho việc phát hiện nhiều loại vi khuẩn và nấm gây bệnh với tên thương mại là Pathochip [39]

Chẩn đốn Erwinia carotovora bằng cách nuơi cấy trên mơi trường

đặc biệt: V A Friedman sử dụng mơi trường cĩ Tetrazonium để nuơi

Erwinia carotovora Những vi khuẩn gây bệnh mọc trong mơi trường này

dưới dạng những khuẩn lạc lớn, nhẵn và ở giữa cĩ màu đỏ, rìa mép ngồi màu trắng Những loại khơng gây bệnh cĩ dạng nhỏ, rắn, xung quanh khuẩn lạc rộng khơng màu [21]

Chất Triphenyl-Tetrazonium-Chlorit (TTC) là chất chỉ thị, tác dụng lên men dehydrogena, dưới tác dụng của men này, trong mơi trường tạo thành chất focmazan Chất này khơng hịa tan trong nước và làm cho khuẩn lạc cĩ màu đỏ Chất TTC là loại chất độc đối với vi khuẩn và nĩ kìm hãm sự sinh trưởng của

vi khuẩn gram dương ở nồng độ thấp hơn so với vi khuẩn gram âm [21]

2.2 Tình hình nghiên cứu ngồi nước

2.2.1 Thiệt hại do vi khuẩn Erwinia carotovora gây ra

Bệnh thối ướt là một bệnh rất nguy hiểm Vi khuẩn Erwinia carotovora

cĩ phạm vi ký chủ rất rộng, gây hại nhiều loại cây thuộc nhiều họ thực vật bao gồm khoai tây, nhiều loại hoa quả và rau khác Tầm quan trọng của thiệt hại kinh

tế do Erwinia carotovora gây ra cĩ thể là rất lớn, tùy thuộc vào giá trị kinh tế của

cây trồng và tỷ lệ bệnh trên đồng ruộng Mức độ thiệt hại ở các nước khác nhau

là khơng giống nhau, tùy thuộc vào ảnh hưởng của điều kiện khí hậu và điều kiện bảo quản, đặc biệt là ở điều kiện khí hậu nhiệt đới nĩng ẩm Nếu xử lý khơng tốt và điều kiện bảo quản khơng được đảm bảo, trong quá trình vận chuyển với khoảng cách xa, tổn thất do bệnh thối nhũn gây ra cĩ thể là 100%

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 10

Trên khoai tây: Tỷ lệ trung bình của 34 giống khoai tây ñem ñánh giá

tính kháng Erwinia carotovora dao ñộng từ 10 ñến 100% [32] Việc giảm

lượng củ trung bình dao ñộng từ 0,13 ñến 16,43% và hệ số tương quan thu

ñược giữa tỷ lệ bệnh thối nhũn với trọng lượng củ bị giảm là tương ñối chặt

Với các cây trồng khác: Với thuốc lá, khối lượng hao hụt do bị thối

trong kho bảo quản (do nấm Sclerotinia sclerotiorum) và do bệnh thối thân (do vi khuẩn Erwinia carotovora) tương ứng là 16,53 và 24,7 kg/ha ñã ñược

ghi nhận tại Nhật Bản năm 1980 Thiệt hại về năng suất có tương quan với các yếu tố khí tượng [21]

Năm 1995, tại Argentina, quả và cây cà chua (Lycopersicon esculentum

Mill hybrid Tommy) từ các nhà kính thương mại gần La Plata và gần

Chacabuco xuất hiện những triệu chứng bệnh gây ra bởi Erwinia carotovora subsp carotovora Tỉ lệ bị bệnh 2% là khá phổ biến và gần 10% cây ở chỗ ẩm

ướt trong nhà kính bị nhiễm bệnh

Năm 1994, tại Thổ Nhĩ Kỳ, bệnh thối thân cây cà chua gây ra bởi

Erwinia carotovora subsp carotovora và Erwinia chrysanthemi ñược phát hiện

lần ñầu tiên trong nhà kính ở vùng phía ñông ðịa Trung Hải Từ năm 1999, bệnh bùng phát nghiêm trọng trong nhiều nhà kính trồng cà chua ở vùng ðịa Trung Hải và Aegean của Thổ Nhĩ Kỳ Năm 2003, phạm vi tác ñộng của bệnh hơn 25% ở vùng ðịa Trung Hải và Aegean của Thổ Nhĩ Kỳ [12]

Vụ ñông và ñông xuân năm 2002, xuất hiện bệnh trong một vài nhà kính thương mại ở Mersin và Antakya, vùng phía ñông ðịa Trung Hải của Thổ Nhĩ Kỳ Phạm vi tác ñộng của bệnh này khoảng 20 – 25% và 80 – 90% trong nhà kính ở Mersin và Antakya Sau khi quan sát các triệu chứng, phân lập, mô tả về mặt hình thái học, sinh lý, sinh hóa, kiểm tra tính gây bệnh và phân tích FAME (fatty acid methyl ester) người ta ñã xác ñịnh ñược nguyên

nhân gây bệnh do vi khuẩn Pseudomonas viridiflava, Erwinia carotovora subsp carotovora và Erwinia chrysanthemi [12]

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 11

Tại Canada, thiệt hại do vi khuẩn Erwinia carotovora subsp

carotovora gây ra là 12% và 20% vào năm 1996 và 1997 tại các nhà kính

trồng tiêu tại St David's, Ontario Bệnh cũng ñược quan sát trên cánh ñồng trồng tiêu gần Harrow năm 1996 – 1997 ðây là báo cáo ñầu tiên về

vi khuẩn gây thối thân tại các nhà kính trồng tiêu ở Canada [14]

Ở New Zealand, một loại vi khuẩn ñược phân lập từ những củ cala

(Zantedeschia spp.) bị nhiễm bệnh ñược xác ñịnh là Erwinia carotovora subsp carotovora Báo cáo này cho thấy Erwinia carotovora subsp

carotovora là nguyên nhân gây ra bệnh thối mềm trên cây hoa quan trọng ở

New Zealand [43]

2.2.2 Triệu chứng bệnh thối nhũn do vi khuẩn Erwinia carotovora gây ra

Erwinia carotovora làm thối ướt cù khoai tây và các cơ quan dự trữ

dinh dưỡng (các loại củ, rễ củ, thân hành) của một loạt các loại cây trồng

Triệu chứng thối ướt trên rau và các bộ phân dự trữ gây ra bởi Erwinia

carotovora có biểu hiện là các vết tổn thương nhỏ, úng nước Các vết tổn

thương nhanh chóng lan rộng và vùng mô bị úng nước tăng lên nhanh chóng, cuối cùng cây bị ñổ ngã Với hầu hết các loại cây trồng không sinh sản sinh dưỡng, các vết tổn thương của bệnh thối nhũn lần ñầu tiên xuất hiện ở các bộ phận bên trên mặt ñất hoặc từ các bộ phận của cây tiếp xúc gần với bề mặt ñất Thông thường, tác nhân gây bệnh xâm nhập qua các vết thương, gây thối nhũn tất cả các bộ phận bị nhiễm bệnh

Biểu hiện thối nhũn trên cây thuốc lá, sắn và các cây dâu tằm ñược ñặc trưng bởi hiện tượng ñen vỏ cây, thối nhũn, héo hoặc rỗng thân cây Với cây bắp cải Trung Quốc, bệnh nhiễm vào vùng rễ từ ñất sau ñó lây lan lên lá thấp hơn, thông qua các các mạch dẫn mà lan ra toàn bộ cây Trên hướng dương và

củ cải ñường, các triệu chứng xuất hiện trên tất cả các cơ quan, ñặc biệt là các thân cây, cuống lá và ñầu hoa có các ñiểm chảy nước mà về sau sẽ trở thành

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 12

chất nhầy Thối nhũn lõi cà rốt ñược ñặc trưng bằng một số biểu hiện: lõi bị xốp, hỏng, ñổi màu và thường bắt ñầu thối từ ñầu củ

Biểu hiện bệnh trên cây hành ngoài sản xuất: ban ñầu, trên thân hành xuất hiện các vết úng nước, các vết úng này lan rộng dần và một thời gian sau thì có biểu hiện triệu chứng thối nhũn Phần thân bị bệnh thối ướt, các lá phía trên bộ phận bị thối không thẳng ñứng nữa mà bị ñổ gục xuống sát mặt ñất và bị phân hủy dưới tác ñộng của các yếu tố vô sinh cũng như các sinh vật phân hủy có trong ñất

Biểu hiện trên củ hành trong bảo quản, bệnh thối nhũn gây hại từ trong ra ngoài Nhìn bề ngoài, rất khó ñể phân biệt củ hành bị bệnh ở giai ñoạn ñầu với củ hành khỏe vì lớp vỏ hành vẫn ñược giữ nguyên cả màu sắc

cũng như hình dạng củ Sau khi bị nhiễm vi khuẩn Erwinia carotovora, củ

hành bị bệnh sẽ có biểu hiện thối nhũn, chảy nước và có mùi hôi khó chịu Sau ñó củ hành sẽ bị thối hoàn toàn, không giữ ñược hình dạng ban ñầu nữa

mà bị móp lại do không còn phần lõi bên trong, lúc này vỏ củ cũng chuyển sang màu nâu cánh gián, bên trong củ có thể có giòi

2.2.3 Hệ thống phân loại vi khuẩn Erwinia carotovora

Species: Erwinia carotovora

Theo cách phân loại vi khuẩn Bergey loài Erwinia gồm các loài vi

khuẩn không hình thành bào tử và có lông roi toàn thân ðây là một loài vi khuẩn không ñồng nhất Vì vậy, Uoondi (1945) ñã chia loại này thành hai

loại: Erwinia gồm các loại vi khuẩn gây bệnh có lông roi toàn thân, không có

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 13

enzyme pectinaza và protopectinaza Loại Pectobacterium cũng gồm các loại

vi khuẩn lông roi toàn thân, nhưng có loại enzyme nói trên

Có 5 phân loài của Erwinia carotovora bao gồm: Erwinia carotovora subsp carotovora Erwinia carotovora subsp atroseptica và gần ñây có 3 loài ñược mô tả thêm bao gồm Erwinia carotovora subsp betavasculorum gây thối nhũn củ cải ñường [40]; Erwinia carotovora subsp odorifera gây thối nhũn trên cây rau diếp xoăn [18]; và Erwinia carotovora subsp wasabiae

gây thối nhũn trên cây cải ngựa Nhật Bản [19] Xác ñịnh ở cấp loài và phân loài dựa trên các phản ứng của vi khuẩn với một lượng tương ñối nhỏ các xét nghiệm: không phát triển ở nhiệt ñộ 370C, sử dụng alpha-methylglucoside và

phân giải hợp chất từ sucrose ñể phân biệt Erwinia carotovora sups

atroseptica với Erwinia carotovora subsp carotovora; phản ứng phosphatase

và sinh indole là ñặc trưng của Erwinia chrysanthemi Ba phân loài còn lại có thể phân biệt ñược dựa trên một số phản ứng sinh hóa: Erwinia carotovora subsp betavasculorum không sử dụng cellobiose, citrate và sản sinh axit từ inulin; Erwinia carotovora subsp odorifera sử dụng sorbitol; Erwinia

carotovora subsp wasabiae không sử dụng alpha-methylglucoside và

raffinose và không phân giải sucrose

2.2.4 ðặc ñiểm sinh học, sinh thái của vi khuẩn Erwinia carotovora

Loại Erwinia phân hủy pectinaza gây ra hiện tượng thối nhũn trên các giống cây trồng khác nhau Loại vi khuẩn Erwinia carotovora subsp

carotovora và E chrysanthemi là hai loài quan trọng nhất Kiểu bệnh chết

hoại cũng ñược tìm thấy Vi khuẩn gây bệnh là loại ña thực, ký sinh trên nhiều loại cây trồng khác nhau Vi khuẩn hình gậy, hai ñầu hơi tròn có 2 – 6 lông roi bao quanh mình Nuôi cấy trên môi trường pepton saccarose, khoai tây – agar khuẩn lạc có màu trắng xám hình tròn hoặc hình bầu dục không ñều, bề mặt khuẩn lạc hơi ướt Vi khuẩn không có vỏ nhờn, nhuộm gram âm, háo khí, dịch hóa gelatin, tạo H2S, thủy phân tinh bột, không tạo NH3 Trên

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 14

môi trường TZC khuẩn lạc của vi khuẩn có màu ñỏ ở giữa, dìa có màu trắng

ñó là ñặc trưng ñể nhận biết loài Erwinia sp Vi khuẩn phát triển thuận lợi

trong phạm vi nhiệt ñộ khá rộng nhiệt ñộ thích hợp nhất là 27 – 320C, nhiệt ñộ tới hạn là 500C, phạm vi pH cũng khá rộng từ 5,3 - 9,2, thích hợp nhất là pH 7,2 Vi khuẩn có thể bị chết trong ñiều kiện khô và dưới ánh sáng

Nhiệt ñộ có vai trò quan trọng quyết ñịnh ñến tốc ñộ phát triển của bệnh

thối nhũn do vi khuẩn Erwinia carotovora trên khoai tây Ở mức nhiệt ñộ thấp

(15 – 200C), vi khuẩn Erwinia carotovora subsp atroseptica gây thối cả củ và gốc cây Với ñiều kiện nhiệt ñộ tăng, sự hoạt ñộng của Erwinia carotovora subps atroseptica có xu hướng giảm trong khi Erwinia carotovora subsp

carotovora và Erwinia chrysanthemi lại có xu hướng phát triển mạnh và lấn át

cả các vi sinh vật khác như Clostridium và Bacillus Ảnh hưởng của nhiệt ñộ

tới nhiễm bệnh nhân tạo ñược giải thích là do ảnh hưởng của nó ñến mức ñộ sản sinh ra enzime pectolaza

Trong bảo quản, bệnh thối ướt phát triển do các không có hệ thống thông gió hoặc hệ thống thông gió không ñảm bảo, nhiệt ñộ dao ñộng dẫn ñến ñộ ẩm tương ñối trong kho cao, ngưng tụ hơi nước Nếu củ ñược ñặt trong môi trường

ẩm ướt, màng nước trên vỏ củ tạo ra ñiều kiện yếm khí trong củ, do ñó làm suy yếu sức ñề kháng của chúng và cũng là ñiều kiện thuận lợi cho sự phát triển của vi khuẩn, ñặc biệt là trong ñiều kiện ấm áp Dịch vi khuẩn từ củ bị các bệnh

khác (bị nhiễm nấm Pythium và Phytophthora spp.) cũng tạo ñiều kiện thuận

lợi cho bệnh thối nhũn phát triển Các vết thương trên củ trong quá trình thu hoạch và xử lý sau thu hoạch, lớp biểu bì trên củ bị tổn thương do giun, côn

trùng hoặc nhiễm nấm (ñặc biệt là Fusarium spp.), rối loạn hoạt ñộng sinh lý

của củ hoặc ñiều kiện môi trường quá nóng cũng tạo ra các ñiều kiện thuận lợi

cho vi khuẩn Erwinia carotovora phát triển Nếu ñiều kiện kỵ khí chiếm ưu thế

trước khi các vết thương cơ giới ñược khắc phục, ñặc biệt là với sự có mặt của nước tự do trong không khí, bệnh thối nhũn sẽ phát sinh và phát triển rất nhanh

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 15

Nhiều yếu tố sinh lý cũng ñã ñược báo cáo là có ảnh hưởng ñến mức ñộ nghiêm trọng của bệnh thối nhũn như kiểu gen của cây, ñộ già của củ, ñiều kiện lúc thu hoạch, lượng nước tự do cao, hàm lượng canxi thấp, bón phân ñạm cao và sự tương tác với các tác nhân gây bệnh khác

Hầu hết các kho dự trữ có chứa hạt hay củ giống bị nhiễm bệnh thối

nhũn do Erwinia carotovora có thể là nguồn lây nhiễm bệnh Tuy nhiên, hầu

hết các loại ñất, ñặc biệt là trong các hệ thống luân canh cây trồng với chu kỳ

luân canh dài, ñất sẽ là yếu tố hạn chế sự tồn tại của vi khuẩn Erwinia

carotovora Do ñó, củ khoai tây giống bị bệnh là nguồn bệnh quan trọng trên

ñồng ruộng Sau khi có củ khoai tây bị thối ướt, các vi khuẩn lan truyền qua ñất nhờ sự di chuyển của nước ñể lây nhiễm lên các củ khác ở lân cận cũng như cho các củ non Các vi khuẩn chủ yếu tồn tại trong các mắt củ có xu hướng phát tán ra xung quanh khi ñộ ẩm ñất cao Các vết cắt củ khoai tây trước khi trồng cũng có thể là nguyên nhân làm tăng khả năng nhiễm bệnh

Các yếu tố ảnh hưởng ñến sự tổn tại của vi khuẩn Erwinia carotovora

trong ñất ñã ñược thảo luận bởi Stanghellini (1982) và Pérombelon và Hyman

(1989) Khả năng tồn tại của vi khuẩn Erwinia carotovora trong ñất bị hạn

chế, thời gian tồn tại trong ñiều kiện lạnh và ẩm ướt kéo dài hơn trong ñiều kiện nóng và khô Tương tự như vậy, vi khuẩn lây lan trong phạm vi hẹp hơn trong ñiều kiện khô và ấm áp Thời gian tồn tại của vi khuẩn trong ñất chịu tác ñộng rất lớn từ yếu tố nhiệt ñộ ðộ ẩm ñất và các quần thể thực vật trong ñất có thể có vai trò nhất ñịnh Vi khuẩn có thể không tồn tại tự do trong ñất trong khoảng thời gian dài ở nhiệt ñộ trên 250C nhưng nó có thể tồn tại rất lâu (trong vài tháng) trong ñiều kiện nhiệt ñộ dưới 100C Tuy nhiên, vi khuẩn

Erwinia carotovora có thể tồn tại trên các ký chủ dại, trên vùng rễ của một số

loài cỏ dại, trên tàn dư cây trồng và trên củ còn sót lại sau thu hoạch cho ñến khi các ký chủ này bị thối hỏng hoàn toàn [30, 38]

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 16

Việc lây bệnh trên củ cũng có thể diễn ra trong suốt thời gian trồng từ các nguồn lây nhiễm khác ngoài tác nhân từ ñất và bảo quản Nguồn bệnh phổ biến tồn tại trong các loài côn trùng bay trong không khí như ruồi, và lây lan trong phạm vi rộng ñã ñược chứng minh từ ñống tàn dư ñang phân hủy và từ các vết thối gốc [13, 24] Vi khuẩn cũng có thể qua ñông và truyền cho cây trồng vụ tiếp theo nhờ ấu trùng của nhiều loài côn trùng Khoảng cách phát

tán xa của vi khuẩn thối nhũn Erwinia carotovora cũng có thể xảy ra bởi tác

ñộng của nước mưa lên cây bị bệnh và do tưới phun từ trên cao [20] Máy móc sử dụng trong quá trình thu hoạch và tuyển lựa, cũng như quá trình rửa trước khi lưu trữ cũng ñóng một vai trò nhất ñịnh trong việc tồn tại và lây lan tác nhân gây bệnh Nước tưới cũng có thể là một nguồn bệnh quan trọng [29] Ngoài cây khoai tây, một số lượng lớn các loài cây trồng khác có thể bị

ảnh hưởng bởi Erwinia carotovora nhưng chưa ñược nghiên cứu ñầy ñủ Nhìn

chung, từ các kết quả nghiên cứu trên khoai tây, có thể ngoại suy trên các cây trồng khác về các bộ phận bị ảnh hưởng, các phương pháp trồng, nhân giống

E carotovora gây bệnh bằng cách tạo ra một tế bào osmotically dễ vỡ

Nó tạo enzym ngoại bào phá hủy sự toàn vẹn của các pectin ðến mức ñộ thấp hơn, nó tạo ra một enzym ngoại bào ñể làm suy thoái cellulose [15] Kết quả

là tạo ra những vết thối mềm, chảy nước, sau ñó là sủi bọt và có mùi hôi, khoai tây bị nhiễm bệnh có khoảng cách giữa vết bệnh và phần không bị bệnh

có màu ñen và có mùi hôi [23]

2.2.5 Sự lan truyền vi khuẩn Erwinia carotovora

Bệnh thối nhũn do vi khuẩn Erwinia carotovora thường không lây lan

bằng cách tồn tại tác nhân gây bệnh trên các hạt giống Ngược lại, các hình thức nhân giống bằng các bộ phận sinh dưỡng hay ghép có thể giúp lây lan

bệnh thối nhũn một cách nhanh chóng do sự hiện diện của vi khuẩn Erwinia

carotovora gây bệnh trên các vật liệu làm giống, hoặc sự nhiễm bệnh có thể

xảy ra trong quá trình canh tác với nguồn bệnh từ môi trường, hoặc trong và

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 17

sau khi thu hoạch Cũng giống như nhiều bệnh truyền qua hạt giống, tác nhân gây bệnh tồn tại trên vật liệu làm giống có thể tiềm ẩn hoặc không hoạt ñộng trong quá trình bảo quản và ñiều ñó sẽ giúp cho nguồn bệnh lây lan rộng rãi trên ñồng ruộng Trên củ khoai tây, các vi khuẩn này có thể tồn tại trên bề mặt

củ, trong mắt củ và trong những vết thương bị hóa bần trên lớp biểu bì Tuy nhiên, hiếm khi tìm thấy sự tồn tại của vi khuẩn gây bệnh trong các mạch dẫn

và chúng cũng không tồn tại trong các nhu mô của củ

2.2.6 Phân lập và giám ñịnh vi khuẩn Erwinia carotovora

Các xét nghiệm sinh hóa ñược mô tả bởi Lelliott và Stead (1987), Schaad (1988) và Toth và cộng sự (2002) Các xét nghiệm này ñược tiến hành trên môi trường vô trùng trong vòng 48 giờ trên các môi trường dinh dưỡng Sự phát triển trong các ñiều kiện nhiệt ñộ khác nhau trên môi trường CVP cũng có thể giúp

phân biệt các loài phụ của Erwinia carotovora Nếu như Erwinia carotovora subsp atroseptica phát triển mạnh ở nhiệt ñộ 270C thì Erwinia carotovora subsp carotovora và Erwinia chrysanthemi phát triển mạnh và tạo thành hố trên

bề mặt môi trường ở nhiệt ñộ tương ứng là 33,5 và 370C [25, 26, 33]

Việc phân lập vi khuẩn thối nhũn Erwinia carotovora từ các mô bị

bệnh, nước và ñất có thể tiến hành bằng cách sử dụng các môi trường chọn lọc Một số một trường ñã ñược miêu tả nhưng hiệu quả và ñơn giản nhất là môi trường với các tinh thể tím (Hyman và cộng sự, 2001) Trên môi trường này, sau 48 giờ ủ ở nhiệt ñộ 270C, loài vi khuẩn thối nhũn Erwinia carotovora

hình thành khuẩn lạc óng ánh, xuất hiện các ñiểm lõm sâu

Việc hòa loãng dịch ñể phân lập trên CVP ñược chuẩn bị sau khi loại bỏ

một mảnh mô tiếp giáp giữa mô bệnh và mô khỏe Việc phân lập Erwinia

carotovora gặp khó khăn vì trên vết bệnh thường có các loại vi sinh vật hoại

sinh Nếu phân lập từ thân cây bị bệnh, lớp biểu bì sẽ ñược tước bỏ tại ñường giao nhau giữa mô bệnh và mô khỏe, lấy phần mô bị thối nhũn và dầm nát

Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 18

trong nước cất vơ trùng Khuẩn lạc của vi khuẩn Erwinia carotovora khơng tạo huỳnh quang trên mơi trường King B trong khi hầu hết các lồi Pseudomonas

cĩ tạo huỳnh quang ðể xác định một lồi là Erwinia carotovora cần phải cĩ

các dấu hiệu sau đây: phản ứng catalase dương tính, âm tính với phản ứng oxy hĩa, lên men chuyển hĩa và làm thối lát cắt củ khoai tây

Việc chẩn đốn nhanh vi khuẩn Erwinia carotovora bằng kỹ thuật hiện

đại khơng thể thực hiện được nếu khơng cĩ kháng thể và mồi PCR đặc hiệu

Tuy nhiên, cĩ thể phân biệt được sự khác biệt giữa Erwinia carotovora subsp

atroseptica và Erwinia chrysanthemi bằng cách tiến hành đồng thời hai phản

ứng PCR cĩ sử dụng một tập hợp các đoạn mồi cho phép phát hiện hầu hết

các phân lồi Erwinia carotovora bao gồm cả Erwinia carotovora subsp

carotovora và Erwinia carotovora subsp atroseptica nhưng khơng phát hiện

được Erwinia chrysathemi [11] mà cụ thể trên khoai tây là lồi Erwinia

carotovora subsp Atroseptica [41]

Trên thế giới cĩ rất nhiều cơng trình nghiên cứu về vi khuẩn Erwinia

carotovora subsp carotovora bằng nhiều phương pháp khác nhau.Với sự phát

triển vượt bậc của cơng nghệ sinh học, các kỹ thuật phân tử ra đời như PCR (Polymerase Chain Reaction), RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA),… đã tạo nên một sự chuyển biến mới trong cơng tác bảo vệ thực vật

Một nhĩm các nhà nghiên cứu Thái Lan sử dụng phương pháp PCR để

phát hiện và phân loại vi khuẩn gây bệnh thối nhũn Erwinia trên thực vật

Bằng cách sử dụng cặp primer Y1 và Y2 để khuếch đại đoạn 434 bp trong

khung đọc mở (open reading frame) của pectate lyase (Pel) gen của Erwinia

carotovora, cặp primer ADE1và ADE2 để khuếch đại đoạn 420 bp trong

khung đọc mở của pectate lyase gen của Erwinia chrysanthemi Kết quả chỉ

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 19

có cặp primer Y1 và Y2 khuếch ñại ñược ñoạn gen mong muốn của tất cả các dòng vi khuẩn phân lập ñược [31]

Darrasse và ctv, (1994) sử dụng phương pháp PCR – RFLP trên gen pel

(mã hóa pectate lyases) ñể xác ñịnh mối quan hệ giữa Erwinia carotovora với

bệnh trên cây khoai tây Bằng cách sử dụng cặp primer Y1 và Y2 cho phép

khuếch ñại một ñoạn 434 bp của những dòng Erwinia carotovora Trong 89 dòng Erwinia carotovora ñược kiểm tra, chỉ những dòng Erwinia carotovora subsp betavasculorum là không phát hiện thấy RFLP ñược thực hiện trên ñoạn ñược khuếch ñại với 7 enzyme endonuclease: TaqI, HaeIII, HhaI, AluI,

HaeII, Sau3AI, HpaII thì thấy có sự ña hình giữa các dòng [11]

Seo và ctv (2001) ñã sử dụng phương pháp PCR – RFLP nghiên cứu về

kiểu hình và ña dạng di truyền trên 87 dòng vi khuẩn Erwinia carotovora ssp

carotovora (Ecc) phân lập từ các cây kí chủ khác nhau ở Nhật Bản, Hàn Quốc

và Thái Lan Thí nghiệm tiến hành phân tích PCR – RFLP của gen 16S ribosomol DNA (rDNA) với cặp primer fD1 và rP2, 16S – 23S rDNA

intergenic spacer regions (ISRs) với cặp primer R16 - 1, R23 – 2R, gen pel

mã hóa pectate lyase với cặp primer Y1và Y2 Bằng phân tích RFLP trên sản

phẩm khuếch ñại với các enzyme cắt giới hạn HinfI, MboI, Sau3AI, kết quả

cho thấy sự ña hình giữa các dòng nghiên cứu Năm 2003, nhóm các nhà nghiên cứu này cũng ñã sử dụng phương pháp PCR – RFLP và RAPD ñể

nghiên cứu về mặt kiểu hình và ñặc tính di truyền của vi khuẩn Erwinia

carotovora trên cây dâu tằm (mulberry) (Morus spp.) Thí nghiệm ñược tiến

hành trên 9 dòng vi khuẩn ñược phân lập từ cây dâu tằm [34]

Bằng phương pháp thử các phản ứng sinh hóa, những dòng vi khuẩn này ñược chia thành 2 loại: type 1 và type 2 Hai dòng thuộc type 1 giống với Ecc trong khi 7 dòng thuộc type 2 thì khác biệt với Ecc Bằng nghiên cứu qua nhiều giai ñoạn bao gồm thử nghiệm huyết thanh học (serological assay),

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 20

PCR chuyên biệt cho Erwinia carotovora subsp atroseptica (Eca), PCR –

RFLP với pectate lyase (Pel) gen và PCR – RAPD cho thấy những dòng vi

khuẩn thuộc type 2 thuộc về những nhóm phụ Erwinia carotovora khác hơn

là Ecc và Eca Fiori và Schiaffino (2003) cũng sử dụng phương pháp PCR –

RFLP ñể nghiên cứu vi khuẩn gây bệnh thối mềm thân cây hồ tiêu (Capsicum

annuum L.): Erwinia carotovora subsp carotovora tại các nhà kính ở

Sardinia, Italia Phản ứng PCR với cặp mồi Y1 và Y2 cho phép khuếch ñại một trình tự có kích thước 434bp Phân tích RFLP trên sản phẩm PCR ñược

tiến hành với 4 enzyme endonuclase giới hạn AluI, HaeII, HpaII, Sau3AI thì

thấy có sự ña hình giữa các dòng

Các nhà khoa học trường ñại học Cambridge ñã có một khám phá then chốt về gen của vi khuẩn gây ra bệnh thối cây, một loại bệnh ở khoai tây gây thiệt hại về kinh tế và khám phá này có thể ñưa ñến các phương pháp mới ñể chống lại căn bệnh này Họ phát hiện ra rằng, nếu làm cho một gen cụ thể

không hoạt ñộng trong vi khuẩn Erwinia carotovora thì khả năng làm hư cây

và gây bệnh ở cây của vi khuẩn này sẽ bị cản trở rất nhiều

Vi khuẩn Erwinia carotovora ñược biết ñến nhiều nhất ở các vùng ôn

ñới vì gây ra bệnh chết khô và bệnh thối ướt ở khoai tây Sự gây bệnh ñược thực hiện do vi khuẩn có thể sản xuất ra các enzyme làm phá vỡ các thành tế bào của cây chủ Thành tế bào bị phá vỡ cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn này và vì thế hỗ trợ sự tồn tại và phát triển của nó

Các nhà khoa học Cambridge phát hiện ra rằng, nếu làm cho một gen không hoạt ñộng gọi là gen re1A, gen giúp vi khuẩn nhận ra khi nào chất dinh dưỡng ñang ít ñi, thì khả năng sản xuất ra enzyme của nó ñể phá thành tế bào của cây chủ cũng sẽ ñược phá huỷ ñi

Chủ nhiệm nghiên cứu - tiến sĩ Martin Welch giải thích: “Bệnh thối cây

là một vấn ñề kinh tế quan trọng, về cơ bản làm giảm sản lượng thu hoạch Chúng tôi ñã chứng minh ñược rằng, việc tạo ra các enzyme phá hủy thành tế

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 21

bào có liên quan về mặt di truyền chẳng những với khả năng phát tín hiệu mà còn ở trạng thái dinh dưỡng của vi khuẩn ðiều này có ý nghĩa quan trọng cho các nhà khoa học trong việc tìm ra các phương pháp mới ñề phòng và chống căn bệnh này Bằng cách cải thiện hiểu biết của chúng ta về cách mà vi khuẩn Erwinia carotovora làm thối cây, chúng ta có thể khám phá thêm các phương pháp mới lạ ñể phát triển các tác nhân chống thối cây”

2.2.7 Tình hình nghiên cứu về bệnh hại hành trong bảo quản

2.2.7.1 Tổng quan về bảo quản hành

Hành bảo quản ñúng cách sẽ giữ ñược trong thời gian từ 8 - 10 tháng, trong suốt quá trình trồng và sau khi thu hoạch và bảo vệ tránh cho hành nảy mầm ðiều kiện gieo trồng thường xuyên cũng ảnh hưởng tới chất lượng của hành trong quá trình bảo quản Thực tế cho thấy hành ñược trồng trong ñiều kiện khí hậu lạnh chu kỳ bảo quản ñược dài hơn hành trồng dưới sự tưới nước trong ñiều kiện khí hậu nóng Kéo dài ñiều kiện ẩm ướt trong khoảng từ 4- 6 tuần trước khi thu hoạch sẽ làm nhanh quá trình thối khi bảo quản bởi nấm

Aspergillus và Penicillium spp, ñặc biệt là ở các vùng nóng (Theo State of

Victoria, Deparment of Primary Industries)

Các nhân tố khác làm phát triển bệnh trong quá trình bảo quản

- Mật ñộ gieo trồng cao

- ðiều kiện ẩm ướt kéo dài trong suốt thời gian chín trên ñồng

- Thiêt hại của bệnh và dịch hại sau khi thu hoạch

- Thiếu sự xử lý (Trên ñồng ruộng hay bảo quản) quyết ñịnh 80%

- Thời gian thu hoạch trên ñồng ruộng quá dài

- Công cụ thu hoạch và phân loại làm bằng tay thô sơ

- Nhiệt ñộ cao và ẩm trong suốt quá trình bảo quản

Tác nhân gây thối trong quá trình bảo quản ñược xác ñịnh bởi nấm, vi khuẩn, sống trong tổng thể hợp chất hữu cơ và trên hành ở trong ñất Có các ổ bệnh tồn tại ở trong ñất và sẽ tấn công vài loại cây trồng

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 22

2.2.7.2 Các loại bệnh hại hành trong quá trình bảo quản

Hành ñược bảo quản trong thời gian từ 8 ñến 10 tháng với ñiều kiện là chúng phải ñược xử lý một cách chính xác, trong và sau khi thu hoạch, và ñể ngăn cản việc nảy chồi ðiều kiện ngoại cảnh cũng có ảnh hưởng ñến chất lượng hành trong bảo quản Nhìn chung, hành phát triển rất chậm trong ñiều kiện khí hậu ôn ñới mát mẻ sẽ bảo quản ñược trong thời gian dài hơn so với hành phát triển dưới ñiều kiện tưới ẩm ở những vùng khí hậu nóng Kéo dài ñiều kiện ẩm ướt trong giai ñoạn từ 4 ñến 6 tuần trước khi thu hoạch sẽ thúc ñẩy sự phát triển

của các loại bệnh gây thối rễ gây ra bởi các loại nấm như Aspergillus spp và

Penicillium spp., ñặc biệt là ở các vùng có khí hậu nóng ẩm

Các yếu tố khác sẽ làm tăng thiệt hại do bệnh trong quá trình bảo quản bao gồm:

* Mật ñộ cây trồng quá dày trên ñồng ruộng

* Kéo dài ñiều kiện ẩm ướt trong quá trình phát triển củ hành

* Những tác hại của các loại bệnh hại nói riêng và dịch hại nói chung trước khi thu hoạch

* ðể các cây hành ñã phát triển ñầy ñủ quá lâu trên ñồng ruộng

* Thao tác mạnh tay trong quá trình thu hoạch và xử lý sau thu hoạch

* Nhiệt ñộ và ñộ ẩm cao trong quá trình bảo quản

ðất có chứa các bào tử từ nấm hoặc vi khuẩn tồn tại trên cổ hoặc thân củ hành trong quá trình phát triển của cây hành và gây ra các loại bệnh hại khi ñiều kiện thuận lợi trong quá trình bảo quản Các loại vi sinh vật có thể gây ra một số loại bệnh hại sau ñây trong quá trình bảo quản:

Mốc xanh Một lớp bụi bào tử màu xanh chạy dọc theo các ñường gân,

phủ trên bề mặt của củ hành khi ñiều kiện thời tiết ẩm ướt trước khi thu hoạch Trong bảo quản, bệnh phát triển rất nhanh, ñặc biệt là trong ñiều kiện

ẩm ướt có một lớp bột màu xanh thưa thớt, triệu chứng cũng xuất hiện tương

tự trên cổ củ hành và cả hai mặt của lớp vỏ ngoài cùng

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 23

Mốc ñen Bệnh này xảy ra giống như trường hợp bệnh mốc xanh và hai

loài nấm này thường xuất hiện cùng nhau Khối bào tử muội ñen thường phát triển bên dưới bề mặt của lớp vỏ và có xu hướng biểu hiện mạnh hơn so với nấm mốc xanh

Thời tiết nóng trên ñồng ruộng và trong suốt quá trình bảo quản sẽ ñẩy nhanh quá trình phát triển và lây lan của bệnh Nhiệt ñộ trên 300C, với ñộ ẩm tương ñối của không khí cao, là ñiều kiện lý tưởng cho nấm mốc ñen phát triển

Thối cổ củ hành Nấm gây bệnh tồn tại trên củ giống Nó vẫn không

hoạt ñộng trong suốt thời kỳ phát triển của cây trồng và nhìn chung là chúng không biểu hiện triệu chứng thối cổ củ cho ñến khi chúng ñược bảo quản trong thời gian từ 8 ñến 10 tuần Một lớp bào tử màu xám phát triển trên củ hành bị nhiễm bệnh, cổ củ hành bị mềm ra và ñôi khi có xuất hiện một cấu trúc màu ñen ñược gọi là hạch nấm, ñường kính có thể lên tới 1,5 cm, ñôi khi

nằm dưới lớp vỏ Bệnh thối nâu mềm phát triển và lan xuống củ hành

Thối fusarium Nói chung bệnh này gây thiệt hại nhỏ, nhưng những củ

hành bị thối nhũn trong túi ñựng có thể là nguyên nhân làm thối hỏng các củ hành khác Trong ñiều kiện khí hậu ấm áp từ 28 ñến 320C, bệnh thối nhũn thường bắt ñầu từ thân của hành và tiến tới xâm nhập vào củ và gây hiện tượng làm mềm mô

và thối ướt Bệnh này thường kết hợp với sự phân hủy của vi khuẩn

Thối do vi khuẩn Ở ñiều kiện nhiệt ñộ ngoài ñồng ruộng cao trên

300C là ñiều kiện thuận lợi cho sự phát triển của vi khuẩn – ñiều này có nghĩa

là bệnh thối nhũn do vi khuẩn gây ra là một vấn ñề quan trọng trong sản xuất hành ở các vùng có khí hậu ấm áp Các củ hành có thể khi quan sát vẫn thấy

là hành khỏe nhưng khi cắt ra, lớp vỏ chính ñã hóa nâu và sũng nước Khi nén các củ hành này, các lõi bên trong củ hành có thể bị ñẩy ra Các củ hành bị nhiễm bệnh thường có mùi hăng và bị thối rất nhanh

2.2.8 Tình hình nghiên cứu bệnh hại hành ngoài ñồng ruộng

Ngoài ñồng ruộng, cây hành chịu tác ñộng của rất nhiều các yếu tố khác nhau trong ñó có cả các yếu tố hữu sinh và các yếu tố vô sinh Các yếu

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 24

tố hữu sinh phải kể ñến là các loài vi sinh vật gây bệnh cho cây hành, ñặc biệt

là các loại vi sinh vật gây bệnh có nguồn gốc trong ñất

* Sự tồn tại của tác nhân gây bệnh

ðất trồng có chứa các tác nhân gây bệnh như nấm và tuyến trùng, các vi sinh vật này có thể tồn tại trong nhiều năm trên các diện tích ñất trước ñây bị nhiễm bệnh hoặc các tàn dư của cây hành còn sót lại sau thu hoạch bằng cách hình thành các dạng qua ñông ñặc biệt hoặc vào giai ñoạn ngủ ñông Những cấu trúc ñặc biệt này có thể là các loại bào tử vách dày (bào tử trứng của nấm

Pythium hay bào tử hậu của nấm Fusarium) và sợi nấm (nấm Rhizoctonia và

Fusarium) hoặc cấu trúc hạch như của nấm Rhizoctonia và quả cành (Nấm mốc hồng rễ) Ấu trùng tuyến trùng tiền trưởng thành có thể tạm ngừng hoạt ñộng trong những ñiều kiện cơ bản của việc bảo quản củ khô hoặc hạt giống Một số tác nhân gây bệnh cũng có thể tồn tại trên hoặc trong hạt giống Các tác nhân gây bệnh này cũng có thể tồn tại trong một thời gian ngắn chủ yếu là trên rễ và các cây ký chủ phụ bị nhiễm khác

Tác nhân gây bệnh sau quá trình qua ñông có thể sẽ ñược kích thích nảy mầm bởi các yếu tố khác nhau bao gồm: dịch tiết từ cây ký chủ từ các

bộ phận mô nhạy cảm như rễ hành tây Tác nhân gây bệnh ñang tạm ngừng hoạt ñộng cũng có thể ñược kích thích phát triển bởi gốc rễ của các cây ký chủ phụ ñể duy trì và sinh sản cho ñến khi xuất hiện mô và các bộ phận khác của cây ký chủ chính

* Sự phát triển bệnh

Tỷ lệ cây bị bệnh và mức ñộ nghiêm trọng của các loại bệnh hại do các loài vi sinh vật tồn tại trong ñất gây ra chịu ảnh hưởng rất lớn bởi các yếu tố như cây ký chủ, môi trường và các yếu tố nuôi cấy, thâm canh

* Các triệu chứng bệnh

Lở cổ rễ (do các loài nấm Pythium, Fusarium và Rhizoctonia) có thể

xuất hiện ở các khu vực có ruộng bị nhiễm bệnh hoặc chúng cũng có thể xuất

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 25

hiện trên những cây riêng rẽ giữa những cây khỏe Các cây con có thể bị nhiễm bệnh và chết trước khi hình thành cây Cây bị bệnh thường bị teo thắt ở phần thân gần sát mặt ñất, trong khi các bộ phận bên trên mặt ñất bị héo và ñổ gục Hệ thống rễ của cây con và cây ghép có thể bị hỏng, mục nát do tác ñộng của các loại nấm hoặc cũng có thể bị tuyến trùng gây hại Do ñó, rễ cây có thể

bị chết hoặc suy yếu và từ ñó dẫn ñến dễ bị các bệnh hại khác

2.2.9 Những nghiên cứu về vi khuẩn ñối kháng với Erwinia carotovora

2.2.9.1 Một số nghiên cứu về vi khuẩn Bacillus subtilis

Tên ban ñầu của vi khuẩn này là Vibrio subtilis năm 1835, Vi sinh vật ñã ñược ñặt lại tên thành Bacillus subtilis vào năm 1872 Những tên khác cho vi khuẩn này bao gồm Bacillus uniflagellatus, Bacillus globigii và Bacillus natto Vi khuẩn Bacillus subtilis là một trong những vi khuẩn ñầu tiên ñược nghiên cứu

Những vi khuẩn này là mô hình tốt cho sự phát triển tế bào và sự khác biệt (Entrez Genome Project)

Bacillus subtilis là vi khuẩn hình que, vi khuẩn gram dương có thể ñược

tìm thấy tự nhiên trong ñất và thảm thực vật Bacillus subtilis phát triển trong

khoảng nhiệt ñộ tối ưu như các vi sinh vật khác là từ 20 ñến 400C, trong ñó nhiệt

ñộ tối thích là từ 25 ñến 350C (Entrez Genome Project) Áp suất lớn và sự nghèo dinh dưỡng là tình trạng phổ biến trong ñiều kiện môi trường này, do ñó,

Bacillus subtilis ñã hình thành nên một loạt các chiến lược ñể có thể cho phép nó

tồn tại trong ñiều kiện khắc nghiệt này Một chiến lược, ví dụ như, hình thành nên các nội bào tử chống lại áp lực

Một chiến lước khác là sự hấp thu của DNA bên ngoài, nó cho phép vi khuẩn thích nghi bằng cách tái tổ hợp Mặc dù vậy, những chiến lược này ñòi

hỏi nhiều thời gian Bacillus subtilis cũng có thể ñược bảo vệ một cách nhanh

hơn chống lại nhiều yếu tố gây áp lực như axit, kiềm, sự thẩm thấu, ñiều kiện oxy hóa, và nhiệt ñộ hoặc cồn

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 26

Vi khuẩn Bacillus subtilis dòng SO113 tiết ra enzyme pectate liase

nhiều nhất trong pha sinh sản theo cấp số nhân trong chu kỳ sinh trưởng của chúng, ngay trước khi hình thành bào tử mới Enzyme pectate lyase ngoại bào này, sản sinh ra các sản phẩm không bão hòa từ Polygalacturonate ñã ñược

làm sạch 35 lần so với bề mặt nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis nhờ máy sắc

ký Sephadex CM ðiểm ñẳng ñiện của dịch vi khuẩn này vào khoảng 9,6 Khả năng hoạt ñộng tối ưu của vi khuẩn diễn ra ở pH = 8,4 và nhiệt ñộ là

420C Canxi có tác dụng kích thích và ñẩy mạnh sự hoạt ñộng của enzyme trong khi EDTA dẫn ñến bất hoạt enzyme Pectate lyase có hoạt ñộng ñặc trưng ở ñộ 131 ml/lít của các nhóm andehit trong 1 phút với mỗi mg protein Bằng cách sử dụng kháng thể ñơn dòng ñể phản ứng lại với enzyme pectate

lyase của vi khuẩn Erwinia chrysanthemi 3937, nó ñã chỉ ra rằng Pectate

lyases loại b và c của dòng này có tính miễn dịch liên quan chặt chẽ với

enzyme pectate lyase của vi khuẩn Bacillus subtilis [27]

Các chất kháng khuẩn ñược sản xuất bởi vi khuẩn Bacillus subtilis BS

107 trong môi trường xác ñịnh và phân lập từ dịch lọc trên ñĩa nuôi cấy bằng nước chảy ở pH = 2,5 Phần nhỏ hoạt ñộng ñược trích xuất trong ethyl acetate, acetone và ethanol 80% và tinh chế bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) trên gel silica ñược pha với hỗn hợp ethanol nước với tỷ lệ 2:1 về thể tích Trong mỗi trường hợp, một băng có Rf là o,75 hình thành một vùng ức chế khi các tấm sắc ký mỏng (TLC) ñược ñặt tiếp xúc với môi trường thạch có chứa môi trường nuôi cấy Erwinia spp Kháng sinh ñược tạo thành ở môi trường nuôi cấy trong giai

ñoạn ñầu của sự phát triển của vi khuẩn Bacillus subtilis BS 107 nhưng một

lượng lớn hơn ñã ñược tạo thành trong môi trường nuôi cấy cũ Các khác sinh này có khả năng chống lại tác ñộng của các enzyme như nucleases, protease và lipase Các enzyme này ổn ñịnh ngay cả khi hấp 2 lần trong thời gian 35 phút ở

áp suất 2 atmosphere trong các môi trường axit, trung tính và kiềm

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 27

Loại kháng sinh này vẫn hoạt ñộng trong phạm vi pH rộng từ 1 ñến 14 trong 1 tháng quan sát và ñược chứng minh là không bị giảm khả năng hoạt ñộng khi bảo quản ở nhiệt ñộ 40C trong hơn 1 năm Bacillus subtilis BS 107

cho thấy khả năng hoạt ñộng trong ñiều kiện in vitro và in vivo chống lại vi

khuẩn Erwinia carotovora subsp atroseptica và Erwinia carotovora subsp

carotovora – các tác nhân gây có liên quan chặt chẽ và gây bệnh thối ướt trên khoai tây và một số loại cây trồng khác Khả năng ñối kháng này thể hiện ở tác dụng làm giảm triệu chứng bệnh trên củ khoai tây [36]

Bệnh thối nhũn trên cây hoa Amorphophallus do vi khuẩn Erwinia

carotovora gây ra Các tác giả của một công trình nghiên cứu về loại bệnh

này ñã xác ñịnh và mô tả một loại protein APn5 ñược phân lập từ chủng vi

khuẩn Bacillus subtilis BSn5 có khả năng kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn

Erwinia carotovora Loại protein APn5 ñược chiết xuất từ bề mặt môi trường

nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis bằng cách kết tủa với ammonium sulfate

với ñộ bão hòa tương ñối 30% và siêu lọc Kết quả thử nghiệm loại protein APn5 chỉ ra rằng nó có khả năng ức chế với phổ vi sinh vật tương ñối hẹp, chủ yếu là ñối với các vi khuẩn gây bệnh thực vật Loại protein này nhạy cảm với nhiệt ñộ cao và ñộ pH kiềm, tương ñối nhạy cảm với các enzyme tripsine,

proteinase K và pronase E Khả năng ñối kháng của vi khuẩn Bacillus subtilis

trong pha tăng trưởng là không ổn ñịnh, khả năng ñối kháng giảm dần trong pha tĩnh và cuối cùng sẽ biến mất [17]

Vi khuẩn Bacillus subtilis ñược phân lập từ ñất bằng kỹ thuật lắc, có

nhiệm vụ sản xuất kháng sinh Hoạt tính kháng sinh mạnh nhất ñã ñược nhận

biết là chủng Bacillus subtilis MH-4 Kháng sinh hoạt ñộng tối ưu nhất ở nhiệt

ñộ 370C và pH cơ bản là 8 Glycerol là nguồn các bon tối ưu và axit L-glutamic

là nguồn nitơ tối ưu nhất cho Bacillus subtilis Kháng sinh Bacitracin ñược xác

ñịnh là có hiệu quả với các vi khuẩn gram dương [10] Các loại kháng sinh

khác mà Bacillus subtilis tạo ra là Polymyxin, difficidin, subtilin và

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 28

mycobacillin Polymyxin có tác dụng chống lại vi khuẩn gram âm trong khi difficidin có phổ tác ñộng rộng hơn [42]

2.2.9.2 Một số loài vi khuẩn khác có khả năng ñối kháng Erwinia carotovora

Vi khuẩn Bacillus thuringiensis thường ñược coi là vi khuẩn có thể sản

xuất kháng sinh ñể can thiệp vào các chức năng sinh học bình thường của vi sinh vật ñối kháng ñể ñạt lợi thế cạnh tranh Kết quả nghiên cứu ñã chỉ ra rằng vi

khuẩn Bacillus thuringiensis ức chế sự tồn tại và phát triển của khuẩn lạc vi khuẩn phụ thuộc vào ñộc tính của tác nhân gây bệnh cây Erwinia carotovora thông qua một hình thức ñối kháng mới, ñó là tín hiệu cảm ứng Erwinia

carotovora sản xuất ra các phân tử tín hiệu acyl-homoserine lactone (AHL) ñề

ñiều chỉnh việc sản xuất ra kháng sinh và biểu hiện của gen ñộc, trong khi ñó các

chủng Bacillus thuringiensis có AHL - lactonase, ñó là một enzyme có hoạt tính mạnh giúp phân giải và làm giảm lượng AHL do Erwinia carotovora sản sinh

ra Bacillus thuringiensis dường như không can thiệp vào sự phát triển bình thường của vi khuẩn Erwinia carotovora, ñúng hơn, nó xóa bỏ sự tích tụ của các

phân tử tín hiệu AHL khi chúng tồn tại trong cùng một môi trường nuôi cấy Vi

khuẩn Bacillus thuringiensis làm giảm ñáng kể tỷ lệ nhiễm Erwinia carotovora

cũng như làm giảm triệu chứng thối ướt khoai tây do các tác nhân khác nhau gây

ra Hiệu quả kiểm soát sinh học tương quan với khả năng sản xuất

AHL-lactonase của các chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis Trong khi tất cả 7 chủng Bacillus thuringiensis ñều sản sinh ra AHL - lactonase ñể chống lại sự xâm nhiễm và gây bệnh của Erwinia carotovora thì các loài vi khuẩn Bacillus

fusiformis và các chủng Escherichia coli sản sinh rất hạn chế hoặc không sản

sinh ra enzyme AHL-lactonase ñể làm giảm sự tích tụ của các phân tử tín hiệu AHL nên chúng có tác ñộng kiểm soát sinh học rất nhỏ ðột biến của gen aiiA –

gen mã hóa sản sinh enzyme AHL – lactonase trong vi khuẩn Bacillus

thuringiensis dẫn ñến giảm ñáng kể về hiệu quả kiểm soát sinh học của nó Kết

quả này cho thấy rằng cơ chế can thiệp vào tín hiệu cảm ứng hiện nay trong các

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 29

hệ sinh thái tự nhiên có thể ñược khám phá như một ñường hướng mới của sự ñối kháng ñể phòng ngừa các bệnh hại thực vật do vi khuẩn gây ra [16]

2.2.10 Tình hình nghiên cứu biện pháp phòng chống bệnh thối nhũn hành

Việc kiểm soát vi khuẩn gây bệnh thối nhũn gặp rất nhiều khó khăn vì tác nhân gây bệnh thường tồn tại và ñược bảo vệ trong những mắt củ, lỗ vỏ cây hóa bần, do ñó chúng không bị tác ñộng bởi các dung dịch khử trùng Hơn nữa,

vi khuẩn Erwinia carotovora dễ dàng lan rộng ra môi trường xung quanh

Theo Reene Miller (2011), những ñiều sau ñây cần ñược chú ý ñể làm giảm thiệt hại cho củ hành trong bảo quản Cụ thể, cần chú ý những ñiều sau:

- Áp dụng các loại thuốc trừ sâu dạng hạt trong quá trình trồng ñể kiểm soát các loài côn trùng như giòi hành mà chúng có thể vừa gây ra vết thương vừa truyền vi khuẩn và gây ra hậu quả là làm thối nhũn củ hành

- Hạn chế các vết dập và vết thương cơ giới trên cây hành trong suốt quá trình thu hoạch và xử lý Những cây bị thương là những cây có khả năng bị bệnh thối nhũn cao nhất

- Cắt ñứt rễ hành khi nhổ hành lên khỏi mặt ñất ñể ñẩy nhanh việc làm khô lá và cổ củ hành

- Luân canh trong vòng 3 năm với các loại cây trồng kháng bệnh thối nhũn như các loại ngủ cốc ñể hạn chế các tác nhân gây bệnh này từ ñất

- Phun các loại thuốc trừ vi khuẩn có gốc ñồng hai tuần trước giai ñoạn vào củ ñể kiểm soát sự phát triển của vi khuẩn gây thối rễ Các cơn bão có thể là nguyên nhân gây ra các vết thương trên lá và trên củ hành Nếu các thuốc trừ vi khuẩn có gốc ñồng ñược phun lên các lá và củ ñã bị các vết thương cơ giới trong nhiều giờ, sự phát triển của vi khuẩn có thể bị giảm mạnh Vẫn có các triệu chứng của bệnh thối nhũn xảy ra, tuy nhiên, sự ảnh hưởng của nó là không lớn

- Tiếp tục phun thuốc ñịnh kỳ 1 tuần ñến 10 ngày Chú ý tuân thủ các hướng dẫn ghi trên nhãn mác, và trong ñiều kiện khô, bổ sung nước cho ñủ ñể bảo ñảm hiệu quả diệt khuẩn của các loại thuốc trừ vi khuẩn

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 30

- Tránh tưới roa khi hành bắt ñầu vào củ, nó có thể làm cho hành phát triển thành hai vòng ñường kính cổ của củ hành Nước có thể làm lây lan vi khuẩn tới các củ hành không bị nhiễm bệnh và lây lan qua ñất

- Cắt củ hành khoảng 1,3 cm bên trên cổ củ hành khi thu hoạch ñể ngăn chặn khả năng bị dập và tránh các vết thương cho củ hành

- Thu hoạch hành chỉ khi các củ ñã phát triển ñầy ñủ ñể bảo ñảm cổ củ hành ñã khô, nó sẽ giúp tạo ra một rào cản ñể chống lại sự xâm nhập của vi khuẩn sau thu hoạch

- ðể hành ở nơi thoáng khí cho ñến khi cổ của củ hành ñược làm khô trước khi chúng ñược ñưa vào bảo quản

- Loại bỏ bất kỳ củ hành nào có những biểu hiện của việc bị dập hoặc những vết thương khác trước khi bảo quản ñể chống lại bệnh thối nhũn vi khuẩn có thể tồn tại trên những củ này rồi từ ñó lây lan sang các củ khỏe

- Bảo quản củ hành sau khi thu hoặc ở ñiều kiện từ 0 ñến 20C và ñiều kiện ñộ ẩm duy trì thấp hơn 70%