Nghiên cứu môi trường nhân giống In vitro Lan hoàng thảo (Dendrobium Sonia) và giá thể đưa cây ra ngoài tự nhiên

Ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin tới sự phát sinh chồi và tạo protocorm lan Hoàng Thảo Dendrobium Sonia ..... Ảnh hưởng của chất kích thích sinh t

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

- -

TRẦN THANH HUYỀN

NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG NHÂN GIỐNG

IN VITRO LAN HOÀNG THẢO (DENDROBIUM SONIA)

VÀ GIÁ THỂ ĐƯA CÂY RA NGOÀI TỰ NHIÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN, NĂM 2012

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

- -

TRẦN THANH HUYỀN

NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG NHÂN GIỐNG

IN VITRO LAN HOÀNG THẢO (DENDROBIUM SONIA)

VÀ GIÁ THỂ ĐƯA CÂY RA NGOÀI TỰ NHIÊN

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60.42.30

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS TS NGUYỄN THỊ TÂM

THÁI NGUYÊN, NĂM 2012

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện luận văn, tôi đã nhận được sự quan tâm, giúp đỡ của nhiều cá nhân và cơ quan đơn vị Nay luận văn đã hoàn thành, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành, sâu sắc tới:

PGS TS Nguyễn Thị Tâm, người đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện, giúp đỡ tôi nghiên cứu và thực hiện đề tài

Các thầy giáo, cô giáo thuộc Khoa Sinh - KTNN, Khoa Sau đại học, trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã nhiệt tình giảng dạy và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học

Các cán bộ, kỹ thuật viên phòng Công nghệ tế bào thực vật –Trường Đại học

Sư phạm – Đại học Thái Nguyên đã nhiệt tình hướng dẫn , giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi thực hiện luận văn Phòng Công nghệ tế bào thực vật - Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam đã cung cấp mẫu vật nghiên cứu

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn vè đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian học tập

Thái Nguyên, tháng 8 năm 2012

Học viên

Trần Thanh Huyền

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Vài nét về phân loại và đặc điểm của phong lan 3

1.1.1 Đặc điểm thực vật học của họ lan 3

1.1.2 Đặc điểm thực vật học của chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium) 4

1.1.3 Đặc diểm thực vật học của lan Dendrobium Sonia 4

1.2 Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật trong công tác nhân giống cây trồng 5

1.2.1 Các hướng nghiên cứu ứng dụng 5

1.2.2 Ưu thế của nhân giống in vitro 6

1.2.3 Các phương thức nhân giống in vitro 6

1.2.4 Quy trình nhân giống in vitro 8

1.3 Một số nghiên cứu nhân giống lan bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro 9

1.3.1 Các nghiên cứu trong nước 9

1.3.2 Các nghiên cứu của nước ngoài 11

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 Vật liệu 13

2.2 Phương pháp nghiên cứu 14

2.2.1 Phương pháp pha môi trường và nuôi cấy 15

2.2.2 Nghiên cứu môi trường nuôi cấy 16

2.2.3 Phương pháp ra cây 17

2.2.4 Phương pháp tính toán kết quả 18

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19

3.1 So sánh ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy MS và Phytamax tới sự phát sinh chồi và tạo protocorm lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) 19

3.2 Ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin tới sự phát sinh chồi và tạo protocorm lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) 20

3.2.1 Ảnh hưởng của BAP tới sự phát sinh chồi và tạo protocorm lan

Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) 20

3.2.2 Ảnh hưởng của kinetin lên sự phát sinh chồi và tạo protocorm ở lan

Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) 23

3.3 Ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin tới

sự phát sinh rễ lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) 26

3.3.1 Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng α-NAA đến sự phát

sinh rễ của lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) 26

3.3.2 Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng IAA đến sự phát sinh rễ

của lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) 28

3.3.3 Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng IBA đến sự hình thành

rễ của lan Hoàng thảo (Dendrobium Sonia) 29

3.4 Ảnh hưởng của tổ hợp các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm

cytokinin và auxin đến sự sinh trưởng của lan Hoàng Thảo (Dendrobium

Sonia) 33

3.4.1 Ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng BAP và α-NAA

đến sự sinh trưởng của lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) 33

3.4.2 Ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng BAP và IAA đến

sự sinh trưởng của lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) 34

3.4.3 Ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng BAP và IBA đến

sự sinh trưởng của lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) 36

3.4.4 Ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng kinetin và

α-NAA đến sự sinh trưởng của lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) 38

.3.4.5 Ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng kinetin và IAA

đến sự sinh trưởng của lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) 40

3.4.6 Ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng kinetin và IBA

đến sự sinh trưởng của lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) 41

3.5 Ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của lan Hoàng Thảo

(Dendrobium Sonia) 44

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần cơ bản của môi trường MS 13

Bảng 2.2 Thành phần cơ bản của môi trường Phytamax 14

Bảng 3.1 So sánh ảnh hưởng của môi trường MS và Phytamax tới sự phát sinh chồi và tạo protocorm ở lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) 19

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của BAP tới sự phát sinh chồi và tạo protocorm ở lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) 22

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của kinetin tới sự phát sinh chồi và tạo protocorm ở lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) 25

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của α-NAA tới sự phát sinh rễ ở lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) 27

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của IAA tới sự phát sinh rễ ở lan Hoàng Thảo

(Dendrobium Sonia) 29

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của IBA tới sự phát sinh rễ ở lan Hoàng Thảo

(Dendrobium Sonia) 31

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng BAP và α-NAA tới sự sinh trưởng của lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) 33

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng BAP và IAA tới sự sinh trưởng của lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) 34

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng BAP và IBA tới sự sinh trưởng của lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) 37

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng kinetin và α-NAA tới sự sinh trưởng của lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) 39

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng kinetin và IAA 40

Bảng 3.12 Ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng kinetin và IBA tới sự sinh trưởng của lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) 42

Bảng 3.13 Sự phát triển của lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) trên một số giá thể ngoài môi trường nuôi cấy 44

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) 5 Hình 3.1 So sánh ảnh hưởng của môi trường MS và Phytamax tới sự phát sinh chồi

và tạo protocorm ở lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) 20

Hình 3.2 Ảnh hưởng của BAP tới sự phát sinh chồi và tạo protocorm ở lan Hoàng

Thảo (Dendrobium Sonia) 23

Hình 3.3 Ảnh hưởng của kinetin tới sự phát sinh chồi và tạo protocorm ở lan

Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) 26

Hình 3.4 Ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin tới sự

phát sinh rễ của lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) 32

Hình 3.5 Ảnh hưởng của tổ hợp các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin

và cytokinin tới sự sinh trưởng của lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) 43

Hình 3.6 Hình ảnh về sự sinh trưởng của lan Hoàng Thảo trên một số giá thể 45

Benzylamino purine

Indol axetic axit

Indol butyric axit

MỞ ĐẦU

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Công nghệ nuôi cấy mô - tế bào thực vật đã trải qua hơn một trăm năm hình thành và phát triển, đem lại giá trị to lớn cho loài người Hiện nay, hầu hết các cơ sở nghiên cứu giống cây trồng trên thế giới đều áp dụng công nghệ này với các mục đích khác nhau

Ở Việt Nam, kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã được bắt đầu nghiên cứu và ứng dụng từ giữa những năm 70 của thế kỷ XX Những kết quả bước đầu trong nghiên cứu và ứng dụng đã đạt kết quả khả quan đối với một số đối tượng cây trồng như chuối, khoai tây, mía, lúa…, đặc biệt là phong lan

Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm mưa nhiều, là điều kiện lý tưởng cho sự sinh trưởng và phát triển của hoa lan Trong thế giới các loài hoa, hoa lan được ưa chuộng hơn cả Hoa lan có đặc điểm là cấu hình lạ, màu sắc đẹp, độ bền hoa cao Ngoài giá trị tinh thần thẩm mỹ, hoa lan còn có ý nghĩa lớn trong nền kinh tế quốc dân Loài hoa này từ lâu đã được con người thuần hoá, sưu tầm, nhập nội, thuần dưỡng các giống ngoại và lai tạo để tạo ra hàng nghìn giống có màu sắc và hương thơm như ý muốn phục vụ nhu cầu của con người

Việt Nam có hàng trăm loài lan được trồng rộng rãi trên khắp đất nước Hoa lan như một loại cây quan trọng trong chuyển dịch cơ cấu cây trồng trong nông nghiệp đô thị và ven đô Một số loại lan nhập nội đã nhanh chóng khẳng định ưu thế của nó và được phát triển với quy mô đáng kể, trong số đó phải kể đến lan Hoàng

Thảo lai (Dendrobium hybrids) Lan Hoàng Thảo lai hấp dẫn người tiêu dùng bởi

màu sắc và độ bền hoa, dễ trồng và đặc biệt có giá trị kinh tế cao, cho thu nhập lớn với ngành trồng hoa trong nước

Song song với việc sưu tập, nhập nội các giống lan Hoàng Thảo lai

(Dendrobium hybrids) thì việc nghiên cứu, hoàn thiện các biện pháp kỹ thuật để tạo

điều kiện nâng cao năng suất, chất lượng là thực sự cần thiết Đồng thời cần nhân rộng

các mô hình trồng lan Hoàng Thảo lai (Dendrobium hybrids) tại miền Bắc Việt

Nam nhằm phục vụ nhu cầu ngày càng lớn của thị trường Trong nhóm lan

Dendrobium thì Dendrobium Sonia (Dendrobium Gracia Lewis × Dendrobium

Lady Constance) là loài chủ lực để trồng nhằm mục đích cắt cành Chính vì vậy, đề

tài chọn Dendrobium Sonia là vật liệu nghiên cứu

Xuất phát từ yêu cầu thực tế khách quan đó và để góp phần phát triển ngành nuôi trồng lan Hoàng Thảo có hiệu quả, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

Sonia) và giá thể đưa cây ra ngoài tự nhiên”

2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

- Xác định được môi trường tối ưu trong nhân giống in vitro lan Hoàng Thảo

Dendrobium Sonia

- Xác định được giá thể thích hợp để đưa cây lan Hoàng Thảo Dendrobium Sonia từ trong ống nghiệm ra môi trường tự nhiên

3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường cơ bản MS và Phytamax đến sự sinh

trưởng của lan Hoàng Thảo

- Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin đến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng của lan Hoàng Thảo

- Nghiên cứu sự ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin đến phát sinh rễ và tạo cây hoàn chỉnh

- Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp các chất kích thích sinh trưởn g thuộc nhóm auxin và nhóm cytokinin lên sự sinh trưởng của lan Hoàng Thảo

- Nghiên cứu tìm ra loại giá thể thích hợp nhất cho ra cây lan Hoàng Thảo (xơ dừa, tảo, than củi …)

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 VÀI NÉT VỀ PHÂN LOẠI VÀ ĐẶC ĐIỂM CỦA PHONG LAN

1.1.1 Đặc điểm thực vật học của họ lan

Họ lan (Orchidadeae) là họ phong phú, đa dạng và phức tạp, mọc ở nhiều môi

trường khác nhau và được chia làm 4 loại như sau:

Epiphytes: Phong lan bám vào cành hay thân cây

Teretrials: Địa lan mọc dưới đất

Lithophytes: Thạch lan mọc ở kẽ đá

Saprophytes: Hoại lan mọc trên lớp rêu hoặc gỗ mục

Căn cứ vào cấu trúc, Pfitzer sắp xếp đa số lan tập trung vào hai nhóm: nhóm

đa thân (Sympodial) và nhóm đơn thân (Monopodial) Ngoài ra còn có một số giống

rất ít thuộc nhóm trung gian [6]

1.1.1.1 Rễ lan

Ở nhóm lan đa thân, rễ thường được hình thành từ căn hành, nhóm đơn thân thì rễ mọc thẳng từ thân và thường xen kẽ với lá Rễ trên không của các loài lan phụ sinh có một trục chính bao quanh bởi mô không chặt, mô xốp bao quanh gọi là mạc (Velamen), các tế bào khi khô chỉ chứa không khí

Khi sống ở đất, chúng thường có củ giả, rễ to mập tương đối ít phân nhánh, nó thuộc tổ chức có chất thịt Cấu tạo của rễ lan chia làm 3 tầng: tầng ngoài, tầng giữa

và tầng trong Tầng ngoài là lớp vỏ rễ, tác dụng chủ yếu là hút và giữ nước Tầng giữa là thịt rễ, phần lớn là tổ chức tế bào sống, chứa rất nhiều nấm rễ cộng sinh Tầng trong là gân rễ có sự liên kết tương đối dẻo dai [9]

1.1.1.2 Thân lan

Chiều cao thân của lan cũng thường biến động rất lớn từ 10 - 20cm, như với

các loài Ascocentrum miniatum, Aecides multiflora và có thể cao 3 - 4m như các loài

Papilionantheteres, Archinis hoặc khổng lồ như A campe, A vanilla Thân thường

mang rễ và lá Ở nhóm đơn thân, rễ và lá thường mọc theo hai chiều thẳng góc với nhau Cành hoa cũng xuất hiện trên thân từ các nách lá, cành hoa thường mọc song song với lá và thẳng góc với rễ [9]

1.1.1.3 Lá lan

Lá của lan là lá đơn nguyên, dầy cứng hay cũng có dạng mềm có gân ở giữa nổi rõ, có loài lá biến đổi thành vẩy hoặc tiêu biến hoàn toàn Lá mọc đơn độc hoặc xếp dày đặc ở gốc, hay xếp cách đều đặn trên thân, củ giả Hình dạng lá thay đổi rất nhiều, từ loại lá mọng nước, nạc, dài hình kim, hình trụ dài, tiết diện dài hay có rãnh đến loại lá hình phiến mỏng, dài màu xanh bóng đậm hay nhạt tuỳ theo vị trí sống của cây Đặc biệt rất hiếm loại lá hình tròn thuôn dài thành bẹ ôm lấy thân Phiến lá trải rộng hay gấp lại theo các gân vòng cung [9]

1.1.1.4 Hoa lan

Hoa lan thuộc hoa lưỡng tính rất hiếm gặp loài đơn tính, bao hoa có dạng cánh xếp thành hai vòng Hoa lan có 3 cánh đài, thường có cùng màu sắc và kích thước Tuy nhiên các loài lan khác nhau thì cánh đài có hình dạng biến đổi rất khác nhau Dạng

hình tròn như các giống Vanda, Ascocentrum, nhọn như Cattleya, xoắn như các loài thuộc giống Laelia Có khi hai lá đài thấp nằm ở hai bên dính lại thành một như chi

Oncidium [1],[3]

1.1.2 Đặc điểm thực vật học của chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium)

Hoàng Thảo là những loài lan sống bám trên cây hay đá, mọc thành bụi nhiều hành giả Các giả hành có thể phân thành các đốt như cây tre Nhiều loài có rãnh dọc theo giả hành Rễ thuộc loại rễ chùm, có màu trắng và nhỏ hơn rễ của một số loài lan khác, rễ có khả năng tái sinh mạnh, khả năng hút nước và dinh dưỡng tốt

Rễ lan Hoàng Thảo nhỏ, tập trung ở gốc do đó cần giữ ẩm cho rễ

Hoàng Thảo có thân dài, được tạo bởi các đốt, trên các đốt có bẹ lá bao bọc, mỗi đốt có 1 mầm ngủ, mầm ngủ này có khả năng tái sinh tạo thành một cá thể mới Hoa của lan Hoàng Thảo cũng mang đặc trưng chung của các loài lan Thuộc hoa mẫu 3, có 6 cánh hoa, trong đó có 3 cánh đài, ở giữa là cánh môi Màu sắc của hoa rất phong phú và độ bền dài Cuống hoa mọc ở đỉnh sinh trưởng của cây Một thân

có thể có từ 1 - 4 cành hoa, mỗi cành hoa mang từ 5-16 hoa tùy theo giống, độ tuổi của cây và điều kiện chăm sóc Hoa có khả năng đậu quả rất cao [6]

1.1.3 Đặc diểm thực vật học của lan Dendrobium Sonia

Dendrobium Sonia là kết quả của phép lai giữa Dendrobium Gracia Lewis và Dendrobium Lady Constance Dendrobium Sonia có các đặc điểm như sau:

Rễ Dendrobium Sonia thuộc hệ rễ chùm , màu trắng , có một lớp mô hút ẩm

dày bao quanh gồm những lớp tế bào chết chứa đầy không khí nên rễ ánh lên màu

xám bạc Rễ lan Dendrobium Sonia không chịu được lạnh nên rễ tập trung ở gốc

Hình 1.1 Lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia)

Dendrobium Sonia thuộc nhóm đa thân dạng cộng trụ , thân dài, tạo bởi các

đốt Lá Dendrobium Sonia to, dày, nạc dài, màu xanh đậm, mọc đối xứng nhau, ôm

lấy thân Hoa màu trắng tím , tổ chức theo kiểu tam phân (mẫu 3): 3 lá đài, 3 cánh hoa, 3 tâm bì Trụ hoa là bộ phận sinh dục của hoa , có đồ ng thời cả cơ quan sinh dục đực và cái nên được gọi là trục - hợp - nhụy Hoa mọc thành chùm, cành hoa dạng thẳng đứng Quả thuộc loại quả nang Khi hạt chín, các nang bung ra Quả có nhiều hạt Một quả chứa từ 10000 đến 100000 hạt, đôi khi đến 3 triệu hạt nên kích thước rất nhỏ, phôi hạt chưa phân hóa

1.2 ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT TRONG CÔNG TÁC NHÂN GIỐNG CÂY TRỒNG

1.2.1 Các hướng nghiên cứu ứng dụng

Nhân giống in vitro là một trong những ứng dụng c hính của công nghệ tế bào

thực vật, sử dụng sự phát triển nhân tạo và nhân các điểm sinh trưởng hoặc các mô phân sinh của cây Theo các công trình thí nghiệm của Amato (1977), chỉ có đỉnh sinh trưởng của chồi mới đảm bảo sự ổn định về di truyền , tiếp đến là mô phân sinh với kích thước nhỏ, kết hợp với xử lý nhiệt để làm sạch bệnh là nguyên liệu tốt cho nhân giống

Kỹ thuật nhân nhanh được ứng dụng nhằm phục vụ cho các mục đích chính như: duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm , làm vật liệu cho công tác chọn

giống; duy trì và nhân nhanh các cá thể đầu dòng để cung cấp hạt giống cho các loại cây trồng khác nhau như cây lương thực có củ , cây rau, cây cảnh ; nhân nhanh ở điều kiện vô trùng cách ly tái nhiễm kết hợp với việc làm sạch bệnh virut , rút ngắn thời gian đưa các cây lai và các cây tự nhiên có đặc điểm tốt ; bảo quản tốt tập đoàn giống vô tính về các loài cây giao phấn trong ngân hàng gen [2], [16]

1.2.2 Ưu thế của nhân giống in vitro

Hệ số nhân cao , rút ngắn thời gian đưa giống vào sản xuất Từ một cây trong vòng 1-2 năm có thể tạo thành hàng triệu cây Nhân được số lượng cây lớn trong một diện tích nhỏ, trong 1m2

có thể để 18000 cây [16], [18]

Làm sạch bệnh cây trồng và cách ly chúng với nguồn bệnh , vì vậ y đảm bảo giống sạch bệnh ; thuận tiện trong vận chuyển và bảo quản (cây giống giữ ở 40C trong hàng tháng vẫn cho tỷ lệ sống 95%) Đồng thời, có thể sản xuất quanh năm

mà không phụ thuộc vào mùa vụ, có tiềm năng công nghiệp hoá cao [18]

1.2.3 Các phương thức nhân giống in vitro

1.2.3.1 Nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng

Theo Lê Trần Bình (1997), mô phân sinh nuôi cấy là mẫu vật nuôi cấy được tách từ đỉnh sinh trưởng có kích thước trong vòng 0,1mm tính từ chóp của chóp đỉnh sinh trưởng Tuy nhiên trong thực tế việc nuôi cấy mẫu vật như vậy rất kh ó thành công, người ta chỉ tiến hành nuôi cấy khi mục đích là làm sạch virut cho cây trồng Nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng được tiến hành phổ biến nhất ở các đối tượng phong lan , dứa, mía đỉnh sinh trưởng đượ c tách với kích thước 5-10mm [2]

Trong nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưở ng cần chú ý tới tương quan giữa độ lớn chồi , tỷ lệ sống và mức độ ổn định về mặt di truyền của chồi, vì thông thường nếu độ lớn của chồi t ăng thì tỷ lệ sống và mức độ ổn định di truyền tăng nhưng hiệu quả kinh tế giảm và ngược lại Do vậy phải kết hợp giữa các yếu tố để tìm ra phương pháp lấy mẫu tối ưu Một đỉnh sinh trưởng nuôi cấy ở điều kiện thích hợp sẽ phát triển thành một hay nhiều chồi và các chồi sẽ phát triển thành cây hoàn chỉnh có rễ đầy đủ Nếu xét về nguồn gốc các cây tái sinh từ nuôi cấy nguyên liệu

ban đầu là mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng thì có ba khả năng: cây phát triển từ chồi đỉnh (chồi ngọn ); cây phát t riển từ chồi nách phá ngủ ; cây phát triển từ chồi mới phát sinh Tuy nhiên trong thực tế rất khó phân biệt được chồi phá ngủ và chồi mới phát sinh [12]

Có 2 phương thức hình thành cây tái sinh từ nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng Cây tái sinh trực tiếp từ chồi đỉnh hoặc chồi nách phá ngủ Phương thức này chủ yếu ở các đối tượng 2 lá mầm như : khoai tây, thuốc lá, cam, chanh, hoa cúc, nhưng có cả cây 1 lá mầm như dứa sợi , mía cây tái sinh qua giai đoạn hình thành dẻ hành (protocorm), chủ yếu gặp ở các đối tượng một lá mầm như : phong lan , dứa, hoa huệ Gần đây phương thức này cũng bắt đầu được bắt đầu được áp dụng có kết quả ở các cây ăn quả và cây lâm nghiệp , trong đó có cây quý như cà phê, táo, lê, cây thông, bồ đề Tổng số có trên 30 chi khác n hau được nuôi cấy thành công [2]

1.2.3.2 Tái sinh cây hoàn chỉnh từ các bộ phận khác của cây

Vì tế bào thực vật có tính toàn năng nên ngoài mô phân sinh và đỉnh sinh

trưởng là bộ phận dễ nuôi cấy thành công , các bộ phận còn lại của cơ thể thực vật

đều có thể thực hiện cho việc nhân giống in vitro được Các bộ phận đó là : đoạn

thân ở các đối tượng như ở thuốc lá, cam, chanh, ; mảnh lá ở thuốc lá, cà chua, bắp

cải ; cuống lá ở Nacissus; các bộ phận của hoa như súp lơ , lúa mì và nhánh củ ở

hành tỏi [2]

1.2.3.3 Nhân giống qua giai đoạn mô sẹo

Trong khuôn khổ của mục đích nhân giống vô tính , nếu tái sinh được cây hoàn chỉnh trực tiếp từ mẫu vật ban đầu thì không những nhanh chóng thu được cây mà cũng khá đồng đều về mặt di truyền Tuy nhiên , trong nhiều trường hợp mô nuôi cấy không tái sinh ngay mà phát triển thành khối mô sẹo Tế bào mô sẹo khi cấy chuyển nhiều lần sẽ không ổn định về mặt di truyền Do đó, nhất thiết phải sử dụng

mô sẹo v ừa phát sinh (mô sẹo sơ cấp ) thì mới thu được cây tái sinh đồng nhất Vì vậy, người ta chỉ tiến hành nhân giống qua giai đoạn mô sẹo đối với những đối tượng khó tái sinh cây trực tiếp Thông qua giai đoạn mô sẹo có thể thu được những cây sạch virus [2]

1.2.4 Quy trình nhân giống in vitro

1.2.4.1 Chuẩn bị cây làm vật liệu gốc

Vì trong nuôi cấy in vitro cây con sẽ mang những đặc tính và tính trạng của

cây mẹ ban đầu nên trong giai đ oạn này cần chọn lọc cây mẹ cẩn thận , cây mẹ thường là cây có nhiều đặc tính ưu việt , khoẻ, có giá trị kinh tế cao Sau đó, chọn cơ quan để lấy mẫu thường là mô non , đoạn thân có chồi ngủ , lá non hoặc hoa non

Mô chọn để nuôi cấy thường là mô có khả năng tái sinh cao trong môi trường nuôi cấy sạch bệnh , giữ được các đặc tính sinh học quý của cây mẹ , ít nguy cơ biến dị Tuỳ theo điều kiện, giai đoạn này có thể kéo dài 3-6 tháng [16]

1.2.4.2 Thiết lập hệ thống cấy vô trùng

Là giai đoạn chuyển mẫu vật từ ngoài vào môi trường nuôi cấy để tạo nguyên liệu sạch bệnh cho nhân giống, giai đoạn này được tiến hành theo các bước:

Khử trùng bề mặt mẫu vật và chuẩn bị các môi trường nuôi cấy

Cấy mẫu vật vào ống nghiệm hoặc bình nuôi cấy có sẵn môi trường nhân tạo

(giai đoạn này là giai đoạn cấy mẫu in vitro)

Các mẫu nuôi cấy nếu không bị nhiễm khuẩn , nấm, virus sẽ được nuôi trong phòng nuôi cấy với điều kiện nhiệt độ ánh sáng phù hợp Sau một thời gian nhất định, từ mẫu nuôi cấy đã bắt đầu xuất hiện các cụm tế bào hoặc các cơ quan hoặc các phôi vô tính Giai đoạn này phụ thuộc vào từng đối tượ ng đem nhân giống , thông thường kéo dài từ 2-12 tháng hoặc ít nhất 4 lần cấy chuyển [16]

1.2.4.3 Nhân nhanh chồi

Đây là giai đoạn sản xuất cây nhân giống quyết định hiệu quả của quá trình nuôi cấy mô , cây được nhân nhanh theo n hu cầu của người nuôi cấy Khi mẫu cấy sạch đã được tạo ra , từ đó nhận được các cụm chồi và các phôi vô tính sinh trưởng tốt trong quá trình nuôi cấy sẽ bước vào giai đoạn sản xuất Người ta cần tạo ra tốc độ nhân nhanh cao nhất trong điều kiện nuôi cấy Thành phần và điều kiện môi trường cần tối ưu hoá để tạo được mục tiêu nhân nhanh Đối với môi trường nhân chồi, người ta sử dụng các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin (BAP, kinetin) với nồng độ khác nhau tuỳ từng đối tượng cây Quy trình cấy chuyển để

nhân nhanh chồi thường trong khoảng 1-2 tháng tuỳ loài cây Tỷ lệ nhân nhanh khoảng 2-8 lần sau một lần cấy chuyển Nhìn chung giai đoạn này thường kéo dài 10-36 tháng Giai đoạn nhân nhanh chồi từ một vài chồi ban đầu không nên kéo dài quá lâu để tránh sự hình thành biến dị sôma [16]

1.2.4.4 Tạo rễ (tạo cây hoàn chỉnh)

Các chồi hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát triển rễ tự sinh, nhưng thông thường các chồi này phải cấy chuyển sang một môi trường khác để kích thích tạo rễ Đối với môi trường tạo rễ , người ta thường sử dụng chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin như α-NAA, IAA, IBA Thông thường giai đoạn này kéo dài 2-8 tuần tuỳ đối tượng Khi cây có đủ các bộ phận thân , lá, rễ với kích thích nhất định đảm bảo cho sinh trưởng , phát triển bình thường ngoài tự nhiên , người ta mới tiến hành giai đoạn tiếp theo là đưa cây ra ngoài môi trường tự nhiên [16]

1.2.4.5 Chuyển cây ra đất trồng

Đây là giai đoạn đầu cây được chuyển từ điều kiện vô trùng trong ống nghiệm

ra ngoài môi trường tự nhiên Giai đoạn này quyế t định khả năng ứng dụng của quy

trình nhân giống in vitro Đa số các loài cây trồng chỉ sau khi chồi đã ra rễ tạo thành

cây hoàn chỉnh với kích thước nhất định mới được huấn luyện và chuyển ra ngoài

vườn ươm Cây nuôi cấy in vitro được sinh trưởng và phát triển trong những điều

kiện tối ưu về nhiệt độ , độ ẩm , pH, dinh dưỡng Vì vậy, trước khi đưa ra trồng , người ta cần huấn luyện cây để thích nghi với điều kiện tự nhiên Quá trình thích nghi với điều kiện bên ngoài của cây ở giai đoạn đầu yêu cầu cần được chăm sóc đặc biệt Vì vậy , cây được chuyển từ môi trường từ bão hoà hơi nước sang vườn ươm với những điều kiện khó khăn hơn , nên vườn ươm cần phải đáp ứn g các yêu cầu: che cây non bằng nilon và có hệ thống phun sương cung cấp độ ẩm và làm mát cây; giá thể trồng cây có thể là đất mùn , hoặc các hỗn hợp nhân tạo không chứa đất , mùn cưa và bọt biển Giai đoạn này đòi hỏi 4-16 tuần [16]

1.3 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG LAN BẰNG KỸ THUẬT NUÔI

CẤY IN VITRO

1.3.1 Các nghiên cứu trong nước

Ngày nay phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật không chỉ được sử dụng trong nghiên cứu mà còn được áp dụng rộng rãi vào thực tiễn chọn giống, không chỉ

ở cây ngũ cốc mà còn ở cây rau , cây ăn quả, và đặc biệt là hoa cây cảnh

Nuôi cấy mô và tế bào thực vật phục vụ nhân giống cây trồng đã triển khai trên 20 năm ở nước ta Nhân giống thương mại quy mô lớn đã đạt được ở một số cây trồng như nhân nhanh chuối, nhân nhanh khoai tây sạch bệnh, nhân nhanh các giống mía nhập nội… Quy trình công nghệ nhân nhanh giống chuối và giống mía đã được Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn công nhận và áp dụng để chuyển gen kháng sâu đục thân [2]

Hoàng Thị Giang và cộng sự (2010) nghiên cứu nhân giống in vitro và nuôi trồng giống lan Hài P hangianum perner Gurss (Hài Hằng) Kết quả nghiên cứu

cho thấy, môi trường nhân nhanh protocorm và tạo chồi là môi trường RE có bổ sung nước dừa 150ml/l và chuối chín 100g/l cho hệ số nhân cao nhất (4,3 lần) Bổ sung α-NAA 0,4mg/l - 0,6mg/l vào môi trường cho khả năng ra rễ tốt nhất Các kết quả thí nghiệm ngoài vườn ươm cho thấy, cây đạt tiêu chuẩn ra vườn ươm cao

3 - 4cm, có từ 3 - 4 lá, 4 - 5 rễ [4]

Phùng Văn Phê và cộng sự (2010) nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh chồi in

vitro lan Kim tuyến Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl Tác giả kết luận, môi

trường KC là phù hợp nhất để nhân nhanh chồi lan Kim tuyến in vitro Thể chồi 8

tuần tuổi từ phôi hạt chín và chồi từ thể chồi cao từ 2-3cm là phù hợp nhất để nhân nhanh trong môi trường thích hợp KC, bổ sung BAP 0,5mg/l + Kinetin 0,3mg/l + NAA 0,3mg/l + nước dừa 100ml/l + dịch chiết khoai tây 100g/l + saccharose 20g/l + agar 7,0g/l + than hoạt tính 0,5g/l [11]

Nguyễn Thái Hà và cộng sự (2003) nghiên cứu sự phát sinh củ in vitro các giống hoa Lilium spp Trên đối tượng giống hoa Lily nhập từ Mỹ được cấy trên môi

trường MS cơ bản có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng đã đưa ra được quy

trình nhân giống củ in vitro các giống hoa Lilium spp [5]

Nghiên cứu nhân nhanh in vitro giống lan Kim điệp (Dendrobium

chrysotoxum), Nguyễn Văn Song (2011) đã tìm ra được môi trường thích hợp cho

nảy mầm và phát sinh protocorm của hạt là MS cơ bản, bổ sung saccharose 20g/l, agar 8g/l, nước dừa 15% và BAP 2,0mg/l Môi trường nhân nhanh protocorm tốt

nhất là MS cơ bản, bổ sung saccharose 20g/l, agar 8,0g/l, nước dừa 15% và BAP 2,0mg/l Môi trường MS cơ bản, bổ sung saccharose 30g/l, agar 8,0g/l, than hoạt tính 1,0g/l, nước dừa 15%, BAP 2,0mg/l và NAA 1,0mg/l thích hợp nhất cho tái

sinh chồi từ protocorm và sinh trưởng của chồi in vitro Môi trường MS cơ bản, bổ

sung saccharose 20g/l, agar 8,0g/l, nước dừa 15% và NAA 1,0mg/l là thích hợp cho

tạo rễ của chồi in vitro [13]

Nghiên cứu môi trường nhân giống in vitro giống lan Dendrobium

fimbriatum Hook (Lan Hoàng Thảo Long nhãn), Nguyễn Thị Sơn (2011) đã khẳng

định môi trường thích hợp cho nảy mầm và phát sinh protocorm của hạt là môi trường MS, bổ sung nước dừa 100ml/l, saccharose 10g/l, agar 6,0g/l; Môi trường nhân nhanh protocorm tốt nhất là môi trường Knud, bổ sung nước dừa 100ml/l, saccharose 10g/l, khoai tây 60g/l, agar 6,0g/l; Môi trường MS, bổ sung nước dừa 100ml/l, saccharose 20g/l, chuối chín 60g/l, agar 6,0g/l là thích hợp nhất cho nhân

nhanh chồi in vitro; Môi trường tạo cây hoàn chỉnh là môi trường RE, bổ sung saccharose 10g/l, than hoạt tính 1,0g/l, agar 6,0g/l [14]

Nguyễn Quang Thạch và cộng sự (2003) đã tiến hành nghiên cứu xây dựng

quy trình nhân giống và nuôi trồng phong lan Phalaenopsis (lan Hồ Điệp) Giống

lan Hồ Điệp được khử trùng bằng HgCl2, sau đó được cấy lên môi trường nhân nhanh Kết quả đã đưa ra được quy trình nhân giống và nuôi trồng lan Hồ Điệp [15]

1.3.2 Các nghiên cứu của nước ngoài

Wang (1997) đã nghiên cứu sự nở hoa của giống lan Dendrobium candidum được tạo ra bằng phương pháp nuôi cấy in vitro Kết quả cho thấy, việc bổ sung

spermidine, BAP, hoặc sự kết hợp của NAA và BAP môi trường nuôi cấy có thể tăng khả năng tạo protocorm và chồi hoa trong vòng 3-6 tháng với tần số 31,6% - 45,8% Tần số nở hoa tăng lên 82,8% trước khi bổ sung ABA vào môi trường nuôi cấy, sau đó chuyển protocorm vào môi trường MS cơ bản có bổ sung BAP [37]

Xu, Liu và cộng sự (2001) nghiên cứu môi trường nuôi cấy in vitro giống lan

Dendrobium chrysotoxum và kết luận: phôi Dendrobium chrysotoxum có thể nảy

mầm được trong điều kiện có hoặc không có ánh sáng Dựa trên môi trường MS, bổ sung NAA 0,5mg/l, BAP 1mg/l cho hiệu quả nảy mầm cao [34]

Nghiên cứu về môi trường nuôi cấy in vitro giống lan Dendrobium

macrostachyum, Pyati (2002) sử dụng môi trường MS cơ bản, bổ sung

BAP (2,22µM, 4,44µM, 8,88µM), Kinetin (2,32µM, 4,65µM, 9,29µM), 2,69µM

NAA và nước dừa 5%, 10%, 15%) [19] Tác giả nhận định rằng, môi trường MS có

bổ sung nước dừa 15%, mật độ 6 chồi/bình cấy cho hiệu quả tối ưu [27]

Cũng sử dụng môi trường MS cơ bản, Martin và cộng sự (2005) bổ sung

kinetin 6,97µM hoặc BAP 13,3µM, nước dừa 15%, than hoạt tính 2,0g/l sẽ tạo điều

kiện cho sự nảy chồi của giống lan Dendrobium Sonia Tỷ lệ sống của cây con đạt

80% [24]

Nghiên cứu về sự cảm ứng ra hoa của giống lan Dendrobium Sonia trong

ống nghiệm, Tee (2008) đã kết luận: trong môi trường MS cơ bản, bổ sung BAP

20μM kích thích sự ra hoa và ức chế sự tạo rễ Môi trường nuôi cấy với hàm lượng

P cao và N thấp kích thích sự ra hoa, trong khi môi trường nuôi cấy với hàm lượng

P thấp và N cao lại thúc đẩy hình thành của chồi [33]

Năm 2009, Huang Yong nghiên cứu bảo tồn giống lan Dendrobium

officinale, Dendrobium nobile và Dendrobium fimbriatum bằng phương pháp nuôi

cấy hạt giống in vitro Kết quả nghiên cứu cho thấy, hạt giống nảy mầm và sinh

trưởng tốt trong môi trường MS có bổ sung BAP 0,5mg/l, NAA 0,1mg/l + khoai tây

50g/l + chuốichín 50g/l + than hoạt tính 5g/l + saccharose 25g/l [22]

Nghiên cứu về môi trường nuôi cấy in vitro giống lan Dendrobium nobile

var Emma white, Sana Asghar và cộng sự (2011) sử dụng BAP và kinetin có nồng

độ từ 0,5mg/l - 3,0mg/l, nước dừa 50ml/l - 300ml/l Nghiên cứu cho thấy, môi

trường có bổ sung BAP 2,0mg/l cho hiệu quả tạo chồi cao nhất (4,33 chồi); kinetin

1,5mg/l cho hiệu quả chiều cao chồi cao nhất (2,45cm); IBA 2,0mg/l cho số lượng

rễ và chiều dài gốc cao hơn so với NAA 1,5mg/l [30]

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU

2.1.1 Vật liệu thực vật

Giống lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) do phòng Công nghệ tế bào thực

vật - Viện Di truyền Nông nghiệp cung cấp

2.1.2 Hóa chất và thiết bị

* Hóa chất

Các chất kích thích sinh trưởng, đường saccharose, agar, than hoạt tính, nước

dừa, khoai tây

Nuôi cấy được tiến hành trên nền môi trường MS và môi trường Phytamax

Bảng 2.1 Thành phần cơ bản của môi trường MS

Bảng 2.2 Thành phần cơ bản của môi trường Phytamax

Bình tam giác, pipet, cốc thủy tinh định mức

Bông, giấy làm nút, giấy thấm

Bình tam giác 250ml

Bộ đồ cấy gồm: dao cấy, que cấy, đĩa cấy…

Buồng cấy vô trùng (Biological Safety Cabinets) của hãng Nuarie, Mỹ Nồi khử trùng (Auto Clace) của hãng ToMy, Nhật bản

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Quy trình nghiên cứu được tóm tắt theo sơ đồ sau:

Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm 2.2.1 Phương pháp pha môi trường và nuôi cấy

2.2.1.1 Pha môi trường nuôi cấy

Pha môi trường đặc với thành phần và nồng độ các chất phù hợp Môi trường

có đầy đủ muối khoáng, các chất hữu cơ, vitamin… Tất cả các hóa chất phải được tan đều, không kết tủa Môi trường có bổ sung chất độn là thạch làm giá đỡ không quá rắn hay quá mềm để khi cấy mẫu vật được dễ dàng Khử trùng môi trường theo phương pháp Pasteur

Sau khi xác định công thức môi trường cần pha, tính thể tích các hóa chất cần sử dụng trong môi trường nuôi cấy Ví dụ pha một lít môi trường nhân phong lan có công thức: MS, saccharose 30g/l, agar 8,0g/l, BAP 0,5mg/l, than hoạt tính 1,0g/l, nước dừa 100ml/l thì tiến hành theo các bước sau:

 Đong 100ml nước dừa

 Cân 50g khoai tây, nghiền nát

 Đong 0,75l hỗn hợp nước cất, nước dừa, khoai tây, sau đó đun sôi

 Dùng pipet hoặc ống đong để lấy các dung dịch MS cho vào một cốc thủy tinh sạch

 Bổ sung BAP vào cốc dung dịch trên

 Cân saccharose 30g, agar 8,0g, than hoạt tính 1,0g

Mẫu giống Tạo protocorm Tạo đa chồi

Tạo rễ Tạo đa chồi

Cây hoàn chỉnh

Đưa cây ra môi trường tự nhiên

 Khi nước gần sôi (50-700

C) thì đổ agar khuấy đều cho tan, sau đó cho đường và than hoạt tính vào khuấy tan hết

 Bổ sung dung dịch hóa chất đã chuẩn bị ở cốc thủy tinh khi nước sôi

 Định lượng hỗn hợp dung dịch trên bằng nước cất cho đủ 1 lít

 Chuẩn độ pH của hỗn hợp dung dịch trong khoảng 5,5 – 5,8

 Chia đều hỗn hợp dung dịch nuôi cấy cho các bình tam giác, mỗi bình 50ml môi trường Sau đó nút bông và làm nắp bằng giấy, đậy kín

 Khử trùng trong nồi khử trùng ở nhiệt độ 1200C, áp suất 1-1,2atm, trong thời gian 20 phút Trong quá trình lấy môi trường ra khỏi nồi hấp thì lắc nhẹ bình tam giác chứa môi trường nuôi cấy để than hoạt tính tan đều trong môi trường Sau khi hấp khử trùng xong để môi trường 2-3 ngày thì bắt đầu sử dụng

2.2.1.2 Phương pháp nuôi cấy

Trước khi tiến hành nuôi cấy, cần khử trùng box cấy bằng đèn UV trong thời gian 30-60 phút, khử trùng bộ cấy bằng cách đốt trên ngọn lửa đèn cồn, sau đó để nguội,

Cụm chồi lan được lấy từ bình giống ra, tách thành từng cụm nhỏ đường kính 0,5-1cm, các cụm chồi này được cấy bằng que cấy vào môi trường nhân giống Bố trí thí nghiệm với các công thức môi trường tùy từng mục đích nghiên cứu Bình nuôi cấy được đặt trong nhà nuôi cấy với cường độ ánh sáng 2000lux, thời gian chiếu sáng 10/24 giờ, nhiệt độ 25-270

C

2.2.2 Nghiên cứu môi trường nuôi cấy

Để tìm ra môi trường nuôi cấy tối ưu cho nhân nhanh và tạo rễ lan

Dendrobium Sonia, chúng tôi bố trí các thí nghiệm thăm dò môi trường nuôi cấy

Đầu tiên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu sự ảnh hưởng của môi trường MS

cơ bản và môi trường Phytamax đến sự sinh trưởng và phát triển của lan

Dendrobium Sonia Các mô lan được cấy trên môi trường MS và Phytamax chỉ bổ

sung saccharose 30g/l + agar 8,0g/l + khoai tây 50g/l + than hoạt tính 1,0g/l + nước dừa 100ml/l Công thức thí nghiệm được tiến hành trên 30 mô, lặp lại 3 lần, kết quả đánh giá sau 4 tuần, 8 tuần, 12 tuần Sau 12 tuần, kết quả đánh giá sẽ được sử dụng vào các công thức thí nghiệm tiếp theo

2.2.2.1 Môi trường nhân giống

Thăm dò ảnh hưởng của nồng độ BAP và kinetin đến khả năng nhân chồi

của lan Dendrobium Sonia Các mô lan được cấy lên môi trường nhân chồi trên nền

môi trường MS cơ bản, bổ sung BAP với nồng độ 0,5mg/l; 1,0mg/l; 1,5mg/l; 2,0mg/l; 2,5mg/l hoặc kinetin với nồng độ từ 0,5mg/l; 1,0mg/l; 1,5mg/l; 2,0mg/l; 2,5mg/l Mỗi công thức thí nghiệm được tiến hành trên 30 mô, lặp lại 3 lần Kết quả được đánh giá sau 4 tuần, 8 tuần, 12 tuần nuôi cấy

2.2.2.2 Môi trường tạo cây hoàn chỉnh (môi trường tạo rễ)

Những chồi nhân được có kích thước từ 1,5 - 2,0cm được cấy chuyển sang môi trường tạo rễ trên nền môi trường MS cơ bản, bổ sung chất kích thích sinh trường α-NAA riêng rẽ, nồng độ từ 0,2mg/l; 0,4mg/l; 0,6mg/l; 0,8mg/l; 1,0mg/l; IAA riêng rẽ có nồng độ từ 0,2mg/l; 0,4mg/l; 0,6mg/l; 0,8mg/l; 1,0mg/l; IBA riêng

rẽ có nồng độ từ 0,2mg/l; 0,4mg/l; 0,6mg/l; 0,8mg/l; 1,0mg/l

Phối hợp BAP nồng độ 0,5mg/l với α-NAA, IBA, IAA nồng độ từ 0,2mg/l đến 0,8mg/l Phối hợp kinetin nồng độ 2,0mg/l với α-NAA, IBA, IAA nồng độ từ 0,2mg/l đến 0,8mg/l Mỗi công thức thí nghiệm được tiến hành trên 30 mô, lặp lại 3 lần Theo dõi sự sinh trưởng, phát triển của cây thông qua sự phát sinh rễ, lá, kích thước rễ, kích thước lá sau 4 tuần, 8 tuần, 12 tuần nuôi cấy

2.2.3 Phương pháp ra cây

Khi cây con có rễ dài trung bình từ 1,0cm đến 1,5cm, hoặc lá với chiều dài trung bình từ 1,5cm đến 2,0cm, bộ rễ khỏe, lá xanh tốt được tiến hành huấn luyện đưa cây trồng ngoài tự nhiên bằng cách để các bình cây ra nơi có ánh sáng khuếch tán 2-3 ngày trước khi đưa cây ra khỏi bình

Khả năng sống của cây khi chuyển từ trong ống nghiệm ra vườn ươm quyết

định hiệu quả kinh tế của phương pháp nhân giống in vitro Do đó, một quy trình ra

cây đạt hiểu quả cao có ý nghĩa rất lớn

2.2.3.1 Đưa cây ra ngoài môi trường

Các bình cây được mở nút, cho nước vào ngâm 10-15 phút, sau đó lắc nhẹ cho thạch rời ra khỏi cây, dùng panh nhẹ nhàng gắp cây ra khỏi bình, cố gắng để cây được nguyên vẹn không bị dập nát

Ngâm cây trong chậu nước sạch, sau đó rửa dưới vòi nước chảy cho hết thạch bám vào bộ rễ của cây

Chuẩn bị giá thể trồng cây Giá thể được đựng vào khay trồng với bề dày 10cm

Khay ra cây có thể là khay nhựa hoặc khay gỗ có kích thước vừa phải để có thể dễ dàng di chuyển vị trí hoặc che đậy, độ sâu khoảng 10-15cm khay nhựa phải

có lỗ dưới đáy để thoát nước dễ dàng, khay gỗ chỉ có tính chất là một khung, sau đó lót lưới nhựa cho có độ thông thoáng tốt

Than hoa, xơ dừa, tảo… để làm giá thể trồng cây

Bình phun để tưới cây

Panh, kéo, chậu nhựa, rổ nhựa…

Các dung dịch muối khoáng để pha loãng tưới cây

Zinep, kháng sinh để phòng chống nhiễm mốc, nhiễm khuẩn

Sau khi trồng, phun nước nhẹ nhàng cho chặt gốc cây

2.2.3.2 Chăm sóc cây con

Trong 2-3 ngày đầu tưới nước lã bằng cách phun sương 3 giờ/lần Trời rét, khô hanh phải che nilon tránh rét và tránh thoát nước nhanh Nilon che phải đục ra một số lỗ thủng cho thoáng khí Sau 3 ngày có thể bỏ nilon che, để khay cây ra nơi đủ ánh sáng, thoáng khí nhưng không gió, tránh nắng mưa trực tiếp Tưới nước bằng bình phun 2-3 lần/ngày Sau 3-4 tuần cây sống ra rễ mới, lá mới là có thể đưa

ra vườn ươm

2.2.4 Phương pháp tính toán kết quả

Sau khi tiến hành nuôi cấy và thu thập số liệu, số liệu thu được sẽ được tính toán trên phần mềm Excel theo hướng dẫn của Chu Văn Mẫn [10]

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 So sánh ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy MS và Phytamax tới sự phát

sinh chồi và tạo protocorm lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia)

Môi trường MS là một trong những loại môi trường được sử dụng rộng rãi nhất trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật Môi trường MS thích hợp cho cả thực vật một lá mầm và hai lá mầm Ngoài ra, dựa trên cơ sở các công thức môi trường VW, Knudson, Lindemann, hãng Sigma đã đưa ra một số công thức môi trường nuôi cấy

phong lan như môi trường VW cho nuôi cấy các loài lan Cymbidium hoặc môi

trường Phytamax cho loài phong lan nói chung [2] Để tìm được môi trường cơ bản

tốt nhất cho việc nhân giống lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia), chúng tôi tiến

hành so sánh môi trường nuôi cấy MS và môi trường Phytamax, bổ sung saccharose 30g/l + agar 8,0g/l + khoai tây 50g/l + than hoạt tính 1,0g/l + nước dừa 100ml/l, kết quả thể hiện qua bảng 3.1

Bảng 3.1 So sánh ảnh hưởng của môi trường MS và Phytamax tới sự phát sinh chồi

và tạo protocorm ở lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia)

Sau 4 tuần

Sau 8 tuần

Sau 12 tuần

Kết quả bảng số liệu 3.1 cho thấy, sự phát sinh chồi và tạo protocorm của lan Hoàng Thảo trên nền môi trường MS là cao hơn môi trường Phytamax Cụ thể, ở môi trường MS, tỷ lệ mô sống, tỷ lệ mô tạo chồi và tỷ lệ mô tạo protocorm sau 4 tuần lần lượt đạt 70,37%; 28,15%; 20,74%; sau 12 tuần lần lượt đạt 69,63%; 34,44%; 28,89% Các chỉ tiêu so sánh trên ở môi trường Phytamax thấp hơn so với mẫu nuôi cấy trên môi trường MS sau 4 tuần và 12 tuần (sau 4 tuần, tỷ lệ mô sống ,

tỷ lệ mô tạo chồi và tỷ lệ mô tạo protocorm đạt 65,19%; 26,67%; 18,52%; sau 12 tuần lần lượt đạt 61,48%; 31,85%; 24,04%) Do vậy, qua nghiên cứu và quan sát kết quả, chúng tôi sử dụng môi trường MS , bổ sung saccharose 30g/l + agar 8,0g/l + khoai tây 50g/l + than hoạt tính 1,0g/l + nước dừa 100ml/l cho các nghiên cứu tiếp theo

Kết quả trên cũng trùng lặp với nhận xét của Nguyễn Thị Liễu và cộng sự (2011) khi cho rằng: mặc dù có rất nhiều công thức môi trường nuôi cấy khác nhau dùng để nuôi cấy các loài thực vật khác nhau nhưng công thức pha môi trường MS được sử dụng nhiều nhất, thường chỉ thay đổi các thành phần khoáng đa lượng [8]

A

B

Hình 3.1 So sánh ảnh hưởng của môi trường MS và Phytamax tới sự phát sinh chồi

và tạo protocorm ở lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia)

A Mô lan sau 12 tuần (MS) B Mô lan sau 12 tuần (Phytamax)

3.2 Ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin tới

sự phát sinh chồi và tạo protocorm lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia)

3.2.1 Ảnh hưởng của BAP tới sự phát sinh chồi và tạo protocorm lan Hoàng

Thảo (Dendrobium Sonia)

BAP là một chất điều tiết sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm cytokinin, là nhóm được sử dụng rộng rãi nhất trong kỹ thuật nuôi cấy mô hiện nay Tác dụng chủ yếu của BAP là kích thích sự phân chia tế bào, thúc đẩy sự hoạt động của chồi bên Nồng độ sử dụng khác nhau tuỳ đối tượng thực vật nuôi cấy, chẳng hạn ở nồng

độ 22µM thích hợp với sự phát triển chồi ở Cymbidium aloifolium, nhưng đối với

Dendrobium aphyllum và Dendrobium moschatum, nồng độ thích hợp nhất cho sự

phát triến của chồi là 44µM [25]

Theo nhiều nghiên cứu cho thấy, BAP thường được sử dụng với nồng độ thay đổi từ 1 - 3mg/l là thích hợp cho nhiều loại mô cấy Ở các nồng độ cao hơn hoặc thấp hơn đều biểu hiện hiệu quả kích thích kém, dẫn đến sự tạo chồi và sinh trưởng của chồi giảm Với nồng độ BAP cao sẽ hoạt hóa sự hình thành chồi bất định [21], [36] Dựa trên nghiên cứu của một số tác giả trên đối tượng lan khác nhau

như: nuôi cấy mô phân sinh giống Cattleya [29], nuôi cấy mô phân sinh giống

Dendrobium [35], chúng tôi tiến hành nghiên cứu thăm dò để tìm ra môi trường tối

ưu cho sự phát sinh chồi và protocorm của lan Hoàng Thảo bằng cách sử dụng môi trường đối chứng không có các chất kích thích sinh trưởng (môi trường MS + saccharose 30g/l + nước dừa 100ml/l + khoai tây 50g/l + than hoạt tính 1,0g/l + agar 8g/l) và môi trường có bổ sung các chất kích thích sinh trưởng ở các nồng độ khác nhau (bổ sung BAP ở các nồng độ từ 0,5mg/l đến 2,5mg/l) Theo dõi sau 4, 8, 12 tuần nuôi cấy, quan sát và ghi nhận được kết quả qua bảng số liệu 3.2

Khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy ở các nồng độ BAP khác nhau thì khả năng phát sinh chồi và protocorm có sự khác nhau Ở môi trường đối chứng, sau 4 tuần, 8 tuần và 12 tuần, tỷ lệ mô sống đạt 73,33%; 70,37%; 69,63%, tỷ lệ mô tạo chồi đạt 30,00%; 31,11%; 31,85% và tỷ lệ mô tạo protocorm đạt 22,59%; 25,93%; 26,67%

Qua bảng số liệu 3.2, môi trường nuôi cấy bổ sung BAP nồng độ 0,5mg/l cho hiệu quả cao nhất Sau 12 tuần nuôi cấy, tỷ lệ mô sống đạt 91,11%, tỷ lệ mô tạo chồi đạt 58,89% và tỷ lệ mô tạo protocorm đạt 60,37% Như vậy, sau 4 tuần nuôi cấy tỷ lệ mô tạo chồi ở môi trường bổ sung BAP 0,5mg/l cao gấp 1,64 lần so với khả năng tạo chồi của mô ở môi trường đối chứng, còn tỷ lệ tạo protocorm cao gấp