Phân lập SUS1 Promoter từ cây ngô và thiết kế vector biểu hiện chứa SUS1 promoter và Gen Cryia (C)

Trong số các nghiên cứu về độc tố cry, cryIAc là một trong những protein được nghiên cứu kỹ, nổi bật với độc tính kháng sâu mạnh, chống lại côn trùng bộ cánh vẩy.. Một trong những hạn c

NGUYỄN THỊ TÌNH

PHÂN LẬP SUS1 PROMOTER

TỪ CÂY NGÔ VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN

CHỨA SUS1 PROMOTER VÀ GEN CRYIA(C)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2011

NGUYỄN THỊ TÌNH

PHÂN LẬP SUS1 PROMOTER

TỪ CÂY NGÔ VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN

CHỨA SUS1 PROMOTER VÀ GEN CRYIA(C)

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS NÔNG VĂN HẢI

THÁI NGUYÊN - 2011

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chƣa hề đƣợc sử dụng để bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã đƣợc cảm ơn và các thông tin trích dẫn đã đƣợc chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả

Nguyễn Thị Tình

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới thầy PGS TS Nông Văn

Hải – Phó viện trưởng Viện công nghệ sinh học, Giám đốc phòng thí nghiệm trọng điểm – Trưởng phòng Công nghệ ADN ứng dụng đã tận tình chỉ dẫn, giúp

đỡ tôi trong quá trình học tập thực hiện luận văn tại Viện công nghệ sinh học Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ThS - NCS Huỳnh Thị Thu Huệ, TS Lê Thị Thu Hiền, CN Dương Thị Thu Hà, cùng toàn bộ cán bộ, đồng nghiệp trong phòng Công nghệ ADN ứng dụng Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình công tác và nghiên cứu khoa học tại Phòng Thí nghiệm trong thời gian thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn Chương trình trọng điểm phát triển và ứng dụng

Công nghệ sinh học trong lĩnh vực nông nghiệp và phát triển nông thôn đến năm

2020 của Bộ Nông Nghiệp và phát triển Nông thôn đã tạo điều kiện cho thực hiện

luận văn này trong khuôn khổ đề tài mã số CNSH ĐT 03/06 -2010

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô khoa Sinh trường Đại học Sư

Phạm Thái Nguyên đã tận tình dạy dỗ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập

tại khoa Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Sư

Phạm, Đại học Thái Nguyên, Các thầy cô Khoa Sau đại học - Trường Đại học Sư

phạm Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã nhiệt tình động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu khoa học và trong cuộc sống Sự tin tưởng và khích lệ từ gia đình đã giúp tôi vững vàng, toàn tâm, toàn ý cho công việc

Từ trái tim mình, tôi muốn gửi lời cảm ơn đến tất cả mọi người !

Thái Nguyên, ngày 22 tháng 9 năm 2011

Tác giả

Nguyễn Thị Tình

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng các gen kháng sâu Bt trong tạo cây trồng chuyển gen có khả năng kháng sâu tự nhiên 3

1.2 Những nghiên cứu về Bacillus thuringiensis và gen cry 4

1.2.1 Những nghiên cứu chung về Bacillus thuringiensis 4

1.2.2 Một số nghiên cứu về gen Cry 5

1.2.3 Một số nghiên cứu về gen cryIA(c) 8

1.3 Promoter và vai trò điều khiển biểu hiện gen 9

1.3.1 Cấu trúc của gen 9

1.3.2 Cấu trúc promoter 10

1.3.3 Vai trò điều khiển biểu hiện gen của promoter 12

1.3.4 Những nghiên cứu Sus1 promoter 15

1.4 Agrobacterium tumefaciens và cơ chế chuyển gen vào thực vật 17

1.4.1 Giới thiệu chung về Agrobacterium tumefaciens 17

1.4.2 Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid 18

1.4.3 Cấu trúc và chức năng của các đoạn T- DNA 19

1.4.4 Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens 19

1.4.5 Tương tác giữa T - DNA và genome tế bào thực vật 21

1.4.6 Một số phương pháp biến nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 22

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Nguyên liệu 24

2.2 PHƯƠNG PHÁP 27

2.2.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số mầm ngô 27

2.2.2 Phương pháp điện di DNA trên gel agarose 28

2.2.3 PCR (Polymerase chain reaction) 30

2.2.4 Xử lý DNA bằng enzyme hạn chế 31

2.2.5 Phản ứng nối ghép gen 32

2.2.6 Biến nạp plasmid 32

2.2.7 Tách chiết DNA plasmid 34

2.2.8 Tinh sạch ADN từ gel agarose bằng cột 35

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

3.1 Phân lập Sus1 promoter từ mầm ngô 36

3.1.1 Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ mầm ngô 36

3.1.2 Tách dòng đoạn Sus1 promoter trong pJET 1.2/blunt 39

3.1.3 Trình tự đoạn Sus1 promoter 42

3.2 Thiết kế vector biểu hiện gen thực vật pCB301 chứa Sus1 promoter và gen cryIA(c) 45

3.2.1 Chuyển promoter Sus1 vào vector trung gian pRTRA7/3 46

3.2.2 Chuyển kết cấu biểu hiện chứa Sus1 promoter và gen cryIA(c) vào pCB301 49

3.3 Chuyển kết cấu Sus1 promoter và cryIA(c) trong pCB301 vào A tumefaciens 50

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ

Bp Cặp base (base pair)

Bt Bacillus thuringiensis

ddNTP Dideoxy Nucleoside triphosphate

DNA Deoxyribo Nucleoic acid

dNTP Deoxy ribo Nucleoside triphosphate

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

DANH MỤC HÌNH

Hình Trang Hình 1 1: Cấu trúc một gen 10

Hình 1 4 Quá trình chuyển T - ADN vào tế bào thực vật 20 Hình 3.1 : DNA Tổng số tách từ mầm ngô 38

Hình 3.2 : Điện di đồ sản phẩm PCR đoạn Sus1 promoter bằng cặp mồi F8 39

Hình 3.3 Điện di sản phẩm tách plasmid chọn dòng trong vector pJET

Hình 3.4 : Sản phẩm PCR đoạn Sus1 promoter từ vector pJET 1.2/blunt 42

Hình 3 5: Kiểm tra các plasmid trong vector chọn dòng pJET1.2/blunt 42

Hình 3.6: So sánh trình tự đoạn Sus1 promoter từ ngô Q411

Hình 3.7: Sơ đồ thiết kế vector pCB301 mang gen Cry1A(c) và Sus1

Hình 3.8: Ảnh điện di đồ các plasmid tái tổ hợp trong vector pRTRA7/3 48

Hình 3.9: PCR kiểm tra đoạn Sus1 promoter bằng cặp mồi Zsuc-PstIF và

Bảng 2.4 Tương quan giữa nộng độ gel agarose và kích thước đoạn DNA

MỞ ĐẦU

Trong nghiên cứu thiết kế vector chuyển gen thực vật, ngoài việc tìm kiếm phân lập các gen quy định cho các tính trạng có giá trị thì việc tìm kiếm phân lập các promoter cũng rất cần thiết để tăng cường mức độ biểu hiện đặc hiệu của gen Trước đây, các gen quan tâm thường được điều khiển bởi các promoter cơ định như: CaMV 35S - promoter, actin promoter, NOS promoter, Ubiquitin promoter dẫn đến sản phẩm gen được biểu hiện hầu hết ở các mô và cơ quan Xu hướng hiện nay là sử dụng các promoter đặc hiệu để điều khiển gen ở những mô mong muốn hoặc trong các giai đoạn phát triển nhất định của cây Promoter của gen mã hóa sucrose synthase1 (Sus1) của ngô đã được chứng minh trên cây thuốc lá chuyển gen

là một promoter đặc hiệu ở tế bào phloem Vì vậy, Sus1 promoter của ngô có thể được sử dụng trong các nghiên cứu chuyển gen nhằm biểu hiện các tính trạng ở phloem [74] Ở Việt Nam, promoter của gen mã hóa sucrose synthase1 đã được phân lập ở hai giống lúa Tám xoan và Dự thơm nhằm mục đích làm nguyên liệu cho các nghiên cứu chuyển gen cho lúa [4]

Các gen cry được phân lập từ các chủng Bacillus thuringensis (Bt) Có

khoảng 150 gen mã hóa cho các protein tinh thể độc có tác dụng với một số loại

sâu Trong số các nghiên cứu về độc tố cry, cryIA(c) là một trong những protein

được nghiên cứu kỹ, nổi bật với độc tính kháng sâu mạnh, chống lại côn trùng bộ cánh vẩy Trên thế giới, việc thiết kế vector chuyển gen thực vật mã hóa protein gây

độc cho côn trùng có nguồn gốc từ Bt được bắt đầu từ những năm đầu của thập kỷ

20 Đến năm 2002, cây trồng chuyển gen có khả năng sinh ra các độc tố kháng sâu

có nguồn gốc Bt đã được trồng trên 62 triệu hecta trên toàn thế giới [66] Gen cry

đã chuyển vào nhiều cây trồng như: cryIA(b) vào cây thuốc lá, gen cryIA(c) vào cà

chua, đậu tương, lúa, bông [38, [59], [70] Ở Việt Nam, việc nghiên cứu thiết kế

vector chứa gen kháng sâu được tiến hành khá nhiều Gen cryIA(c) đã được chuyển

vào vector chuyển gen thế hệ mới dưới sự điều khiển của Ubiquitin promoter phục

vụ nghiên cứu chuyển gen vào lúa [3] và được thiết kế trong vector pCB301 dưới sự

điều khiển của 35S promoter để kiểm tra biểu hiện trên cây thuốc lá Nicotiana

benthaminana nhằm phục vụ nghiên cứu chuyển gen cho cây lâm nghiệp [7] Tuy

nhiên với từng loại cây trồng thì việc thiết kế vector chuyển gen vẫn cần được thực hiện để tối ưu cho phù hợp với đặc điểm của mỗi loài Đồng thời, khả năng kháng sâu ở cây chuyển gen cũng cần phải có tính đặc hiệu cho phù hợp với tình trạng sâu bệnh ở mỗi loại cây trồng [18]

Vì vậy, trong nghiên cứu này, với mục đích phân lập một promoter đặc hiệu phloem phục vụ cho nghiên cứu chuyển gen kháng sâu cho cây ngô, chúng tôi đã

tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân lập Sus1 promoter từ cây ngô và thiết kế

vector biểu hiện chứa Sus1 promoter và gen cryIA(c)”

1.1 Mục tiêu của đề tài

Tạo ra một vector biểu hiện thực vật mang đồng thời Sus1 promoter phân lập từ

ngô và gen cryIA(c) kháng côn trùng

1.2 Yêu cầu của đề tài

- Nắm được cấu trúc Sus1 promoter, đặc điểm, cấu trúc của gen cryIA(c)

- Nắm được các nguyên lý, kỹ thuật và các phương pháp thực hiện trong quá trình tách dòng gen, gắn gen vào vector biểu hiện

- Tạo được chủng Agrobacterium tumefaciens chứa Sus1 promoter và gen

cryIA(c)

1.3 Nội dung của đề tài

- Phân lập Sus1 promoter từ ngô

- Thiết kế vector biểu hiện thực vật pCB301 chứa Sus1 promoter và gen

cryIA(c) kháng côn trùng

- Tạo chủng A.tumefaciens mang Sus1 promoter và gen cryIA(c) kháng côn trùng

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Kết quả của đề tài cung cấp nguyên liệu phục vụ các nghiên cứu chuyển gen vào cây ngô và một số cây trồng nông nghiệp có giá trị khác Nhằm tạo cây chuyển gen kháng côn trùng có tính đặc hiệu phloem.

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng các gen kháng sâu Bt trong tạo cây

trồng chuyển gen có khả năng kháng sâu tự nhiên

Trong nông nghiệp, ngành trồng trọt chịu ảnh hưởng của yếu tố thời tiết,

dịch bệnh Yếu tố này là nguyên nhân dẫn tới giảm năng suất và chất lượng cây trồng Nghiêm trọng hơn, việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học bừa bãi dẫn đến tình trạng sâu kháng lại thuốc trừ sâu hóa học Vấn đề này đã khiến các nhà quản lý và người nông dân gặp khó khăn hơn trong hạn chế các tổn thất về năng suất cũng như các lựa chọn đối tượng cây trồng và loại thuốc bảo vệ thực vật phù hợp Sau khi các loại protein thế hệ thứ nhất bao gồm các δ- endotoxin có khả năng kháng sâu của vi

khuẩn Bt như (Cry, Cyt) được phát hiện và nghiên cứu rộng rãi, nhiều loài cây trồng

biến đổi gen chứa các gen kháng sâu này đã mở ra triển vọng mới, thiết lập một nền nông nghiệp sạch, an toàn Ngay từ năm 2002, cây trồng chuyển gen có khả năng

sinh ra các độc tố kháng sâu có nguồn gốc Bt được trồng trên 62 triệu hecta trên

toàn thế giới [66] Ưu điểm nổi bật của cây trồng chuyển gen là khá bền vững trong điều kiện tự nhiên và giúp cây trồng kháng được tương đối nhiều sâu bệnh Do đó,

nhiều loại cây trồng chuyển gen chứa một hoặc nhiều gen của Bt (ví dụ gen cry, cyt,

vip) đã được nghiên cứu, thương mại hóa rộng rãi và đang là các loại cây trồng đóng

vai trò rất quan trọng trên thị trường thế giới [59] Tuy nhiên qua nhiều năm được trồng đại trà ở Mỹ và một số nước khác trên thế giới như Ấn Độ, Trung Quốc, Nhật Bản Các cây trồng chuyển gen thuộc thế hệ này đã bộc lộ nguy cơ bị giảm khả năng kháng do nhiều loài sâu bệnh đã tiến hoá và có khả năng kháng với độc tố được tiết ra trong cây [41], [54] Ngoài ra, việc biểu hiện các tính trạng kháng sâu không đặc hiệu hoặc không

ổn định do việc sử dụng promoter không đặc hiệu và biểu hiện không mạnh Vì vậy, việc nghiên cứu phát triển các loại protein diệt sâu đồng thời biểu hiện đặc hiệu ở những bộ phận của cây trồng được quan tâm nghiên cứu ngày càng sâu, rộng Năm

2001, ba gen kháng sâu là cryIA(c), cryIIA và gna (mã hoá lectin ở cây bạch đàn) cũng được chuyển vào lúa (Oryza sativa) giống M7 và Basmati 370 [47] Các protein

cryIA(c), cryIIA và gna đã được biểu hiện hoặc riêng lẻ hoặc cùng nhau

trong cây chuyển gen với các mức độ khác nhau, lần lượt chiếm 0,03 – 1%, 0,01 – 0,5% và 0,01 – 2,5% tổng số protein hòa tan thu được [27] Các gen chuyển đều thể hiện sự bền vững qua nhiều thế hệ cây và đã giúp các cây chuyển gen kháng hiệu Ở Việt Nam, hướng nghiên cứu chuyển gen vào cây trồng đang được tiếp cận, đầu tư

và triển khai nghiên cứu, ứng dụng với sự chú trọng đặc biệt Các đề tài chuyển gen thực vật chủ yếu tập trung hoàn thiện phương pháp chuyển gen vào cây trồng thông

qua vi khuẩn Agrobacterium, thu thập và phân lập một số gen và promoter có giá trị phục vụ cho nông nghiệp, đặc biệt phải kể đến nhóm gen kháng sâu cry Nhiều cấu trúc Ti – plasmid chứa gen cryIA(c), cryIA(b) đã được thiết kế [3,45] và biểu hiện ở nhiều cây trồng khác nhau như đậu xanh (Vigna radiate) [11], cải bắp (Brassica

oleracea var capitata) [9], thuốc lá (N tabacum và N benthamina) [1], [7]

quả sự tấn công của ba loại sâu hại lúa quan trọng nhất là sâu cắn lá

(Cnaphalocrocis medinalis), sâu đục thân (Scirpophaga incertalas) và bọ nhảy (Nilaparvata lugens) Năm 2008 gen cryIA(b) đã được chuyển vào bông [12]

1.2 Những nghiên cứu về Bacillus thuringiensis và gen cry

1.2.1 Những nghiên cứu chung về Bacillus thuringiensis

Vi khuẩn Bt có thể tìm thấy ở nhiều nơi như đất rừng, bụi cát, phân dơi, nước biển, xác chết côn trùng Bt là vi khuẩn hiếu khí, hình que, gram dương, có khả

năng hình thành bảo tử trong điều kiện môi trường bất lợi và sản sinh protein tinh thể độc ở dạng ngoại bào (a, b,  exotoxin) và nội bào (-endotoxin) Trong đó, -endotoxin là một họ protein tinh thể độc chính Mặc dù được coi là thuốc trừ sâu vi sinh hiệu quả, một số hạn chế nhất định về phương diện sinh học như thời gian ảnh hưởng ngắn, không tiếp xúc được với côn trùng ẩn sâu dưới lá, đất, đã phần nào

giảm mức độ sử dụng chế phẩm Bt Những điểm bất lợi này hoàn toàn bị loại trừ khi chuyển và biểu hiện gen cry vào cây trồng [10]

Trong chuyển gen, những protein độc có khả năng diệt sâu của Bt đã được sử

dụng để tạo nên các sản phẩm kháng côn trùng như ngô, bông, khoai tây, lúa Điểm

đặc biệt của Bt là protein tinh thể được hình thành trong quá trình hình thành bào tử

[11] Những phân tử protein này được biết đến là có tính độc đối với các ấu trùng và những dạng côn trùng gây hại khác (như bộ cánh cứng (Coleoptera), bộ hai cánh

(Diptera), bộ cánh vẩy (Lepidoptera) với hiệu lực khác nhau Độc tố của Bt có tính đặc

hiệu rất cao, không gây độc cho động vật có vú và những côn trùng có ích khác [46]

1.2.2 Một số nghiên cứu về gen Cry

Hệ thống gen cry hầu hết được phân lập từ chủng Bt Có khoảng 150 gen cry

mã hóa cho các protein tinh thể độc có tác dụng với một số loại sâu Các gen cry tự

nhiên thường nằm trên plasmid cỡ lớn có kích thước 3 kb, trong đó chỉ có đoạn 2 kb

mã hóa protein tinh thể độc Các plasmid này có mặt trong hầu hết các chủng Bt với

số lượng bản sao từ 2 đến 12 bản sao Ngoài ra, các gen cry cũng nằm trên nhiễm sắc thể ở một số chủng Bt như kurstaki HD - 1, entomocidus, aizawai 7.29…[21]

Ở Việt Nam, đã có nhiều công trình khoa học nghiên cứu phân lập các chủng

để sản xuất chế phẩm Bt Một trong những hạn chế của thuốc trừ sâu sinh học là

tính tác động chọn lọc và quy trình sản xuất cần có công nghệ hiện đại, để khắc

phục điều này việc thiết kế các vector mang gen cry chuyển vào cây trồng là việc

làm cần thiết Các nhà khoa học của Việt Nam đã tiến hành phân lập hơn 3500

chủng Qua so sánh với các chủng Bt trên thế giới, các chủng Bt của Việt Nam rất

đa dạng về cấu trúc tinh thể độc tố, hình tháp chiếm 63,1%, hình cầu 11,2%, hình khối lập phương 4,8% và đặc biệt đa dạng về gen mã hóa protein diệt côn trùng

cánh vẩy (Lepidoptera), cánh cứng (Coleoptera), hai cánh (Diptera), diệt tuyến trùng hại cây nông, lâm, công, nghiệp Trong đó, gen cryI (cryIAa, cryIAb, cryIAc,

cryIB, cryIC, cryIE, cryIF) chiếm 57 %, cryII chiếm 5%, cry4 (cryIVA, cryIVB)

chiếm 43%, cryVIII chiếm 8% Ngoài ra, các gen cyt, gen vip, gen parasporin cũng

được phát hiện chiếm khoảng 1 - 5% [11]

Cho tới nay, có hàng trăm gen cry đã được công bố Tuy nhiên, hầu hết mối quan tâm đều tập trung vào nhóm gen cryI, cryIII, cryIV Các chủng mang gen cryI có kích thước 490 – 980 bp Các chủng mang gen cryIV có kích thước

690 - 1290 bp Còn các chủng mang gen cryIII có kích thước 649 – 1060 bp Thành phần protein tinh thể của Bt không những quyết định hoạt lực diệt côn

trùng mà còn liên quan đến sự tồn tại các lớp gen cry Các protein 130 kDa, diệt côn trùng cánh vảy do gen cryI mã hoá Gen cryIII mã hóa protein có khối lượng

phân tử thấp hơn (66 -73 kDa), diệt côn trùng cánh cứng Protein tinh thể diệt côn trùng hai cánh đa dạng nhất bao gồm các protein 130 kDa, 128 kDa, 67 kDa,

28 kDa do gen cryIV, cryX, cryXI mã hóa Thành phần protein của các chủng

cũng rất đa dạng Trên gel polyacrylamide đã phát hiện protein 130 kDa của các

chủng Bt mang gen cryI, còn protein 130 kDa, 67 kDa và 28 kDa của Bt mang gen cryIV và cryIII có protein 70 kDa [11], [12]

1.2.2.1 Phân loại gen cry

Cricmorore và đồng tác giả (1982) [26] là nhóm nghiên cứu đầu tiên sử dụng

chữ viết tắt “cry” (crystal) để chỉ các gen tạo tinh thể độc tố của Bt [3], [12], [12,

[26] Dựa trên tính tác động chuyên biệt vào sâu mục tiêu và sự tương đồng về trình

tự, gen mã hóa protein độc tố có thể được phân thành 6 nhóm chính:

(a) Các gen mã hóa tiền độc tố 130 - 140 kDa gây hại sâu cánh phấn được

xếp vào nhóm cryI - được phân loại sâu hơn (subclass) từ cryIA đến cryIG Dựa trên

sự tương đồng về trình tự amino acid (>80%), gen cryIA có thể được phân loại sâu

hơn nữa thành IA(a), IA(b), IA(c)

(b) Gen cryII mã hóa tiền độc tố 66 kDa gây hại sâu cánh phấn (cryIIB) hoặc gây hại cả sâu cánh phấn và sâu hai cánh (cryIIA)

(c) Gen cryIII mã hóa protein 73 kDa gây hại sâu cánh cứng

(d) Gen cryIV- phân lập từ chủng Bt (israelensis) mã hóa protein các loại

135, 128, 74 và 72 kDa có tác dụng gây hại sâu hai cánh

(e) Gen cryV mã protein 80 kDa có tác dụng gây hại sâu cánh phấn và sâu

cánh cứng

(f) Gen cryVI có hoạt tính gây hại tuyến trùng[29], [31], [48]

1.2.3.2 Cấu trúc và chức năng của protein tinh thể độc

Cho đến nay, hơn 150 loại độc tố cry khác nhau đã được phân lập và kiểm

tra tính độc trên nhiều loại côn trùng [10] Trong khi đó danh sách những gen hay protein mới liên tục được kéo dài, những danh pháp mới cũng được đặt thêm, theo

đó mỗi gen/ protein có tên dài gồm 4 chữ cái, dựa vào trình tự amino acid được xác định [26] Protein tinh thể độc có cấu trúc đặc thù Các nghiên cứu về cấu trúc của chúng thường bắt đầu bằng những nghiên cứu về chức năng của những vùng cấu trúc này Đặc điểm điển hình trong cấu trúc của protein tinh thể độc là có các vùng bảo thủ nằm xen kẽ những vùng biến đổi Các vùng bảo thủ này đóng vai trò quan

trọng về mặt cấu trúc và chức năng Bt và δ - endotoxins của nó được nghiên cứu ở

mức độ phân tử để có thể hiểu rõ mối quan hệ giữa cấu trúc và chức năng, hoạt động của độc tố

1.2.3.3 Cơ chế và hoạt động của protein tinh thể độc tố

Cơ chế tác dụng của tiền độc tố lên côn trùng đích đã được nghiên cứu khá sâu Đầu tiên tinh thể xâm nhập vào cơ thể côn trùng theo thức ăn qua đường miệng Sau đó dưới tác động của môi trường có độ pH > 10 ở ruột giữa của sâu cùng với sự hoạt động của protease ruột sâu, tương tự trypsin, các tiền độc tố được

hoạt hóa Tiền độc tố cryI và cryIV với kích thước 130 - 140 kDa khi đã được hoạt

hóa đã hình thành độc tố, kích thước 65 - 75 kDa có hoạt tính bền vững Trong khi

tiền độc tố cryII và III (70 - 75 kDa) sau quá trình biến đổi đã tạo ra độc tố kích

thước 60 - 65 kDa Sau khi được hoạt hóa, protein tinh thể độc đã liên kết ái lực mạnh với các chất nhận glycoprotein tại những vị trí đặc hiệu nằm trên các vi nhung mao của các tế bào biểu mô ruột giữa của ấu trùng Chính mối liên kết của các độc

tố với các chất nhận ở vi nhung mao này đã quyết định tính đặc hiệu của các độc tố

Ở những côn trùng không mẫn cảm, mối liên kết này rất lỏng lẻo Hiện nay, người

ta xác định được ba nhóm vị trí gắn Một số vị trí có thể liên kết với một loại độc tố, một số vị trí khác có thể liên kết với hai hay nhiều loại Như vậy, một độc tố đặc thù

có thể liên kết với nhiều vị trí nhận trong ruột côn trùng Sau khi gắn kết, protein tinh thể độc tố đính trên bề mặt tế bào biểu mô ruột giữa, gây tổn thương và phá hủy

tế bào, tiêu diệt côn trùng mẫn cảm Độc tố Bt gắn vào glycoprotein niêm mạc ruột,

đặc biệt là đoạn giữa ruột làm cho ruột bị thủng, rò rỉ dịch tiêu hóa vào đường dẫn máu gây nên hiện tượng bị loãng dịch tiêu hóa và nhiễm trùng máu [24]

1.2.3 Một số nghiên cứu về gen cryIA(c)

Trong số các nghiên cứu về độc tố cry, cryIA(c) là một trong những protein

cry được nghiên cứu kỹ, nổi bật với độc tính kháng sâu mạnh, chống lại côn trùng

bộ cánh vẩy, đặc biệt được sử dụng trong việc bảo vệ nông nghiệp

Tuy nhiên, mối quan hệ giữa cấu trúc và chức năng của protein cryIA(c)

vẫn chưa được hiểu rõ và cần những nghiên cứu sâu hơn Nghiên cứu về tinh thể

bào tử bao gồm mảnh DNA dị hợp 20 kb liên kết với tiền độc tố, nó có thể đóng vai trò chìa khóa trong việc đảm bảo cấu trúc ổn định của những hạt tinh thể cũng như sự hoạt hóa tinh thể độc tố trong ruột giữa của sâu đích Tuy nhiên,

mối tương tác tự nhiên của tiền độc tố Bt với DNA, trình tự và nguồn gốc của

DNA 20 kb còn lại được nghiên cứu kĩ Học thuyết hiện đại nghiên cấu cấu trức

không gian 3 chiều của cryIA(c) đã được dự đoán khi nghiên cứu cầu trúc của đồng đẳng của nó là cryIA(a), và sự khác biệt về cấu trúc giữa cryIA(a),

cryIIA(a), cryIIIA(a) và cryIVA(a) Cấu trúc của nó gồm 3 “domain” chính

Domain 1 bao gồm 7 chuỗi xoắn alpha, trong đó chuỗi thứ 5 được bao quanh bởi các chuỗi khác, tạo nên một bó xoắn Domain 2 bao gồm 3 tấm β tạo nên cấu trúc hình học Greek, được xếp trong 1 hình lăng trụ Domain 3 được tạo ra bởi 2

tấm β không song song thành dạng bánh β - sandwich trong một cấu trúc hình

trụ Đoạn gen cryIA(c) đầy đủ được phân lập và tách ra từ chủng Bt 4.0718, qua plasmid biểu hiện pHTAc35 được cài gen cryIA(c)

Tinh thể độc tố Bt được chuyển cùng với pHTAc35 và được biểu hiện thành dạng tiền độc tố cryIA(c5) 130 kDa, trong những nghiên cứu trước đây đã phát hiện

ra 20kb - DNA và cryIA(c) được tinh sạch, mối tương tác của chúng được phân tích

bằng cách sử dụng phép thử huỳnh quang Những vùng liên kết đều nằm trong 3 phần domain chính Trong đó nhận thấy so với cấu trúc DNA thông thường, DNA

20 kb có liên kết rất chặt chẽ Bên cạnh có cấu trúc chung giống với tất cả các phân

tử DNA khác, độc tố có thể là do các trình từ Nucleotide đặc hiệu tạo nên thể hiện

trong nhiều đoạn của phân tử DNA 20kb Phân tử được mô phỏng sử dụng cryIA(c)

và một đoạn của 20 - bp DNA chứa một vài vị trí liên kết với 3 domain của

cryIA(c) Vị trí liên kết Ser283 -Ala284 - Gln285, Ser440 - Ser441 - Ser442 DNA

Ser555 - Leu556 - Asn557 được tạo nên nhờ liên kết tương tác hidro Đó là tương tác hidro giữa phân tử phosphor trên đoạn DNA với 3 phân tử amino acid (Arg209,

Asn212 DNA Gly339) của cryIA(c) Phần thêm của phân tử 20 kb - DNA hoạt hóa

cryIA(c) trong điều kiện in vitro đã làm giảm độc tính của Bt dưới điều kiện có

trypsin và tia cực tím đã chỉ ra rằng sự tồn tại của 20 kb - DNA trong những phân tử độc tố đóng vai trò bảo vệ tính độc

Một trong những điều mà các nhà khoa học quan tâm là vấn đề sau khi các

gen cry mã hóa protein tinh thể độc chuyển vào thực vật thì mức độ nó biểu hiện là cao hay thấp Nhờ kỹ thuật di truyền thì hiện nay trình tự gen cry đã được cải thiện

rất nhiều để nó có thể biểu hiện ở mức độ cao nhất đảm bảo cho hoạt lực kháng sâu

Các nghiên cứu của Perlak và đtg đã nghiên cứu cải biến gen cryIA(b) và cryIA(c)

bằng cách thay thế các trình tự Adenin/Timin bằng trình tự Guanin/Cytonin mà vẫn giữ nguyên trình tự acid amin của protein [2] Các gen cải biến này được đặt dưới

sự điều khiển của đoạn khởi động mạnh đã được chuyển vào giống bông Coker với mức độ biểu hiện protein tăng 100 lần [3] đã thiết kế vector thế hệ mới mang gen

kháng côn trùng cryIA(c) để chuyển vào cây thuốc lá

1.3 Promoter và vai trò điều khiển biểu hiện gen

1.3.1 Cấu trúc của gen

Cấu trúc của một gen mã hóa cho một protein (gen sẽ được phiên mã thành mRNA) thường bao gồm 3 vùng: (1) Vùng 5’ là vùng mang các trình tự điều khiển biểu hiện của gen và các trình tự tăng cường promoter; (2) Vùng được phiên mã (gen cấu trúc) bao gồm các trình tự intron và exon; Exon là trình tự có mặt trong mRNA ở trong tế bào chất, thường tương ứng với phần mã hóa của gen và sẽ được dịch mã thành protein; Intron là trình tự được phiên mã nhưng sẽ bị loại bỏ trong quá trình trưởng thành của mRNA Trình tự này không thấy ở sinh vật nhân sơ; (3) Vùng có chức năng polyadenyl hóa (terminator) [6, 30] Ở một số gen, vùng này mang các trình

tự điều hòa chuyên biệt Vùng 5’ và vùng 3’ không được phiên mã Hình 1.1 [61]

Hình 1 1: Cấu trúc chung của một gen 1.3.2 Cấu trúc promoter

Các gen cấu trúc có thể biểu hiện được thành protein cần sự có mặt của các trình tự điều khiển thích hợp ở những vị trí nhất định Trình tự tham gia tích cực vào quá trình điều khiển biểu hiện gen là đoạn điều khiển biểu hiện gen (promoter) Promoter, bao gồm trình tự nucleotide nằm ngược phía trên đầu 5’ so với vị trí khởi đầu phiên mã gen (transcription start site – TSS) Tùy thuộc vào khoảng cách từ TSS, các thuật ngữ “promoter gần” hay “promoter tối thiểu” (khoảng vài trăm nucleotide quanh vùng TSS) (proximal promoter hay minimal promoter) và

“promoter xa” (hàng nghìn nucleotide ở phía trên TSS) (distal promoter) có thể được sử dụng Cả hai loại promoter gần và xa đều chứa rất nhiều yếu tố tham gia vào quy trình phức tạp của các nhân tố điều hòa phiên mã đặc hiệu tế bào, mô, cơ quan, giai đoạn phát triển và môi trường Hình 1 2 [61]

Hình 1.2: Vị trí của promoter trong gen

Về mặt cấu trúc, promoter có tổ chức phức tạp và chứa rất nhiều yếu tố đặc trưng có chức năng bám, gắn với các nhân tố protein tham gia vào quá trình phiên

mã gen Các yếu tố điều hòa (regulatory elements) nằm trên promoter và cùng một sợi với vùng mang mã của gen được gọi là yếu tố cis (cis elements) [20] Mỗi yếu tố được đặt tên trên cơ sở trình tự nucleotide của chúng Yếu tố cis cơ bản nhất là hộp TATA, được tìm thấy ở hầu hết các gen của sinh vật nhân chuẩn, nằm ở vị trí được xác định là + 1) Ở sinh vật nhân sơ, hộp TATA thường nằm ở quanh vị trí – 10 Hộp này chịu trách nhiệm đảm bảo cho quá trình gắn RNA polymerase chính xác vào vị trí khởi đầu phiên mã Một gen vẫn có thể gắn RNA polymerase vào promoter với một TATA cải biến nhưng hiệu quả của quá trình khởi đầu phiên mã

có thể bị ảnh hưởng rất nhiều Hầu hết các gen cảm ứng (inducible genes) thường

có chứa hộp TATA và ít nhất là hai yếu tố cis khác Trong khi đó, các “gen giữ nhà” (housekeeping gene) có các yếu tố cis ít đa dạng hơn và thậm chí có thể chứa hộp TATA Hộp TATA thường nằm ngay cạnh một yếu tố cis cơ bản khác là hộp CCAAT cung cấp vị trí gắn cho RNA polymerase Một số trình tự thường gặp ở promoter của sinh vật nhân chuẩn được trình bày ở Bảng 1.1:

Bảng 1.1: Một số trình tự thường có ở promoter sinh vật nhân chuẩn Promoter Vị trí Nhân tố phiên mã Trình tự đặc trưng

Vị trí khởi đầu

PyPyA + 1N (T/A)PyPy

Ở thực vật, hộp TATA thường nằm ở vị trí từ - 35 đến – 25 bp trước vị trí khởi đầu Hộp CCAAT nằm ở vị trí giữa -70 và -100 bp trước vị trí khởi đầu Hộp

này có thể có trình tự khác nhau và được gọi là hộp AGGA [20] Promoter của nhiều gen thực vật cảm ứng bởi môi trường còn mang một số yếu tố cis là các trình

tự đặc trưng khác như hộp G (G – box) Hộp G được phát hiện đầu tiên như là một trình tự 11 bp (5’ C/AACACGTGGCA3’) nằm ở phía trước của rất nhiều gen mã hóa cho tiểu đơn vị nhỏ của ribulose biphosphate carboxylase Từ đó đến nay, các yếu tố cis chứa hộp G hoặc các tiết tấu (motif) trình tự liên quan với lõi hexanucleotide CACGTG đã được xác định trong các promoter của nhiều gen không liên quan, như gen được cảm ứng bởi ánh sáng, bởi abscisis acid (ABA), khi

bị tổn thương, trong điều kiện kị khí [28]

Ngoài các trình tự đặc trưng như TATA và CCAAT, một số trình tự DNA ngược dòng về phía trên vùng 5’ của hầu như tất cả các promoter của sinh vật nhân chuẩn được nghiên cứu cho đến nay có chứa các yếu tố điều hòa khác [38] Những trình tự điều hòa ngược dòng này được biết rộng rãi như là các vùng tăng cường (enhancers) hay các trình tự hoạt hóa ngược dòng (ups tream activating sequences) Những trình tự này rất đa dạng về chiều dài, có thể dao động từ khoảng – 100 bp đến 100 bp hoặc ngược khá xa về phía đầu 5’ của vị trí khởi đầu phiên mã với những cấu trúc là các trình tự lặp lại Các vùng tăng cường cũng có thể được tìm thấy ở vùng 3’ không được dịch mã và thậm chí ở cả các intron [20] Mỗi vùng tăng cường có thể có chức năng độc lập như là một yếu tố cis và nằm trên cùng một sợi với các gen được tác động Vùng tăng cường thường đặc thù cho từng gen hoặc từng nhóm gen, có thể có vai trò điều hòa đặc hiệu, điều khiển gen biểu hiện ở những mô hoặc cơ quan cụ thể Vai trò này thường được duy trì khi vùng tăng cường được cắt và đưa vào một gen khác để điều khiển biểu hiện một gen mới trong một cơ thể chủ

1.3.3 Vai trò điều khiển biểu hiện gen của promoter

Các gen cấu trúc muốn biểu hiện được thành protein, trước tiên gen đó cần thực hiện quá trình phiên mã Quá trình này chịu sự điều khiển của nhiều yếu tố như các protein tham gia quá trình phiên mã, đoạn promoter, các trình tự tăng cường, đoạn kết thúc gen [71] Trong đó, đoạn promoter, có vai trò chính trong quá trình

biểu hiện gen Về cơ bản, promoter đóng vai trò như một công tắc bật gen Tất cả các gen cần một promoter để hoạt động hoặc bắt đầu biểu hiện Nhưng promoter không chỉ đơn giản như một công tắc điện, ví dụ chỉ có hai chiều, bật hoàn toàn hoặc tắt hoàn toàn Thay vào đó, promoter có rất nhiều module khác nhau hoạt động như các cảm biến (sensor) và cho phép chúng có thể phản ứng theo những cách mà hiện nay chúng ta chưa hiểu được hoàn toàn, đối với những tín hiệu khác nhau từ những gen khác hoặc từ môi trường, định rõ khi nào thì khởi động và khởi động ở đâu, với cường độ và thời gian như thế nào Trong điều kiện nhất định, promoter có thể không hoạt động và khi đó thì gen hoàn toàn không được khởi động Nói chung, vai trò của promoter của một gen bình thường trong một sinh vật là cho phép gen hoạt động đúng trong các chu trình điều hòa hết sức phức tạp của sinh vật Promoter liên quan đến các gen thuộc từng sinh vật được thích ứng với gen đó trong khi toàn

bộ các gen của sinh vật được thích ứng để tồn tại và hoạt động cùng nhau qua hàng triệu hay hàng trăm triệu năm [70]

1.3.3.1 Phân loại promoter

- Promoter cơ định: Là loại promoter tham gia điều khiển biểu hiện gen ở tất cả hoặc hầu hết như tất cả các loại mô khác nhau trong tất cả hay hầu như mọi giai đoạn phát triển của sinh vật

- Promoter đặc hiệu: Sự biểu hiện đặc hiệu là sự biểu hiện các sản phẩm của gen giới hạn ở một hoặc một vài mô (hạn chế về không gian – spatial limitation) và hoặc

ở một hoặc vài giai đoạn phát triển (đặc hiệu thời gian – temporal limitation)

+ Promoter cảm ứng: Trong điều kiện stress (hạn, nhiệt độ cực đoan, oxy hóa cao…), các gen chống chịu thường biểu hiện với tốc độ nhanh Vì vậy vấn đề khởi động sự phiên mã cũng như cấu trúc promoter của chúng và các promoter tham gia vào việc điều khiển biểu hiện gen được đặc biệt quan tâm

+ promoter đặc hiệu ở mô

Promoter chỉ điều khiển biểu hiện gen ở những mô đặc hiệu, ví dụ promoter đặc hiệu bó mạch ở thực vật điều khiển biểu hiện gen ở bó mạch Promoter này

chứa các trình tự đặc trưng của một promoter như hộp TATA, hộp CCAAT và các trình tự đặc hiệu, quyết định sự biểu hiện gen đặc hiệu ở bó mạch như hộp ASL, hộp GATA [74] Thuộc nhóm promoter này có promoter điều khiển biểu hiện gen

mã hóa sucrose synthase đặc hiệu ở bó mạch Sucrose synthase là một trong những enzyme quan trọng tham gia vào mọi hoạt động sống của tế bào Chúng xúc tác cho phản ứng thuận nghịch: Sucrose + UDP = Fructose + UDP – glucose Nhờ quá trình chuyển hóa này, cơ chất UDP – glucose được cung cấp cho quá trình tổng hợp tinh bột và thành tế bào Ở lúa, người ta đã phát hiện được 3 gen cùng mã hóa cho sucrose synthase

1.3.3.2 Promoter và ứng dụng trong công nghệ gen thực vật

Về cơ bản việc chuyển gen ngoại lai vào sinh vật nhận để tạo sinh vật biến đổi gen cần phải tiến hành một số bước bắt buộc, trong đó có bước phân lập các gen riêng lẻ kiểm soát các tính trạng cụ thể, các gen này được nhân lên và gắn một promoter vào trước các gen này nhằm đảm bảo chúng có thể hoạt động tốt trong các sinh vật đích (nếu không có bước ghép với promoter thì gen ngoại lai cần chuyển sẽ không hoạt động) Promoter và gen cấu trúc được điều khiển biểu hiện đính kèm tạo thành một kết cấu biểu hiện gen hay kết cấu gen (gene – expression cassette hay gene construct ) Gen và promoter có thể được phân lập từ các nguồn sinh vật khác nhau như từ thực vật, vi khuẩn và virus Một số kết cấu gen biểu hiện được kết nối với nhau thành chuỗi trong vector, một hoặc vài gen trong số đó sẽ là gen kháng kháng sinh, giúp cho việc chọn lọc các tế bào tái tổ hợp Sau đó, các kết cấu gen này được chuyển vào trong sinh vật đích

Tìm kiếm và phân lập các loại promoter trong tự nhiên dạng cơ định cũng như đặc hiệu là một trong những hướng chính trong tạo giống cây trồng biến đổi gen Nhờ các promoter này, gen quan tâm có giá trị được biểu hiện ở những loại mô nhất định, ở những giai đoạn phát triển nhất định của cây, dưới sự tác động của từng loại môi trường hoặc chỉ biểu hiện ở nơi tế bào, mô bị tổn thương Chẳng hạn, người ta thường sử dụng Ubiquitin promoter của ngô hoặc Actin promoter của lúa

để điều khiển biểu hiện gen ở cây một lá mầm, promoter của gen mã hóa sucrose

sythase để điều khiển gen đặc hiệu ở bó mạch Để diệt bọ cánh cứng Colorado

(Leptinotarsa decemlineata) hại khoai tây, promoter đặc hiệu lá đã được sử dụng

thay thế cho promoter đặc hiệu ở củ Trong công nghệ gen thực vật, hiện nay, rất nhiều loại promoter được sử dụng để điều khiển biểu hiện các gen có giá trị trong cây trồng Các nghiên cứu chuyển gen thực vật thường sử dụng CaMV19S promoter [68], Ubiquitin của ngô [61] Hiện nay promoter của gen mã hóa sucrose synthase được phân lập và ứng dụng rộng rãi

1.3.4 Những nghiên cứu Sus1 promoter

Ở cây một lá mầm, sucrose được mã hóa ít nhất bởi hai gen: có thể là SH1 hoặc Sus1 [44], [51], [74] Ví dụ, ở lúa mạch có 2 gen sucrose synthase [22], lúa mì

có 2 gen [23], tulip có 2 gen [13], lúa gạo xuất hiện 3 gen [69], [72] Ngô xuất hiện

3 gen sucrose synthase [22], [33], [36], [42], [51], [62], [73] Trong số đó, SH1 và Sus1 được nghiên cứu nhiều Cả hai gen này đều nằm trên nhiễm sắc thể số 9 [49], [51], [52], [53], [71], [75] Khi so sánh trình tự gen DNA giữa SH1 và Sus1 đã thấy rằng hai gen có hơn 70% trình tự nucleotide giống nhau [51] Họ cũng tìm thấy các intron cuối cùng của SH1 (intron 15, không có mặt trong Sus1) Còn lại vị trí của intron 14 giống hệt nhau ở cả hai gen Dựa trên các bằng chứng này và trình tự giống, khác nhau trong 125 bp của intron15 và trong phần của exon 16, các nhà khoa học đề xuất hai gen phát sinh thông qua đột biến độc lập [50], [65] Gen Sus1 và SH1 mã hóa các protein Sus1 (92,9 Kda) và SH1 (91,7Kda) mã hóa protein tương ứng là SH1 Hai loại protein giống nhau tới 79% chuỗi amino acid [63], [64], [69]

Tuy nhiên, đến nay các nhà khoa học đã chứng minh rằng SH1 có mặt trong các mô ở ngô như: rễ, chồi và được biểu hiện rất mạnh [23], [51] Ngược lại Sus1 được biểu hiện phloem [23], [35], [54] Sus3 được biểu hiện trong rễ, lá cây và mầm hạt [22] Nolte và đồng tác giả chứng minh sucrose synthase có mặt tất cả ở các tế bào của vỏ cây, tế bào gân Nhưng trong ngô và cam quýt, những tế bào này trực tiếp tham gia vào cấu tạo mô vỏ cây, mô gân Sau khi nghiên cứu biểu hiện của sucrose synthase ở Arabidopsis, tác giả kết luận rằng enzyme này hoạt động trong quá trình trao đổi chất sucrose trong vỏ cây [58] Tuy nhiên, Heinlein và đồng tác

giả cho rằng không thể phát hiện sucrose synthase trong lá ngô nhập khẩu [25], [35] Mặc dù điều này mâu thuẫn với các công bố của nhiều tác giả khác Các tác giả khác cho rằng sucrose synthase có thể được biểu hiện mạnh trong mô vỏ cây, trong bó mạch và mức độ ngày càng tăng trong lớp biểu bì ngoài cùng Ngoài ra, sucrose synthase cũng được xác định trong nhu mô xylem và trong một số vỏ tế bào Sau đó thí nghiệm xác định hàm lượng sucrose synthase trong nhân hạt ngô đang phát triển được thực hiện bởi Heinlein và đồng tác giả [35] Khi hạt trưởng thành, hoạt động trong nội nhũ cho thấy có sự thay đổi dần dần hàm lượng sucrose synthase theo mức độ tăng dần [58]

Ngược lại, hoạt động của sucrose synthase đo trong mô được Koch và đtg cho rằng biểu hiện sucrose synthase trong các tế bào vỏ hạt cao hơn với các tế bào

lá mầm [33] Những kết quả này trùng hợp với quan sát trước đây [58] Khi xác định cấu tạo của các gen sucrose synthase (Sus3 và Sus4) ở khoai tây Các gen Sus3 được biểu hiện cao nhất trong thân và rễ Trong khi Sus4 biểu hiện và được giữ trong các mô mạch của củ Do đó, Sus3 được xem như là mạch máu của cây Cho đến nay, hai gen sucrose synthase cũng đã được phân lập ở mía [43] Hai dạng sucrose synthase được xác định trong rễ, lá, lóng ở ngô cho kết quả tương tự Sucrose synthase có nhiều trong lóng với mức độ biểu hiện khác nhau đáng kể

trong các phần của lóng và ở các giai đoạn phát triển khác nhau của cây [33]

Trong lá non, sucrose synthase có xu hướng hoạt động mạnh trong khi đó ở

lá trưởng thành sucrose synthase không hoạt động [23], [41] Ở một số cây biểu hiện của sucrose synthase là hằng số phát triển trong lá [44] Biểu hiện synthase sucrose được thay đổi ở các mô và tế bào [41], [42], [43]

SH1 và Sus1 phản ứng khác nhau trong điều kiện dinh dưỡng khác nhau được biểu hiện rõ ở ngô, mRNA SH1 được biểu hiện tối đa ở lượng đường thấp 0,2% glucse Trong khi đó, Sus1 biểu hiện cao nhất ở nồng độ đường glucse 2% Các loại đường metabolizable khác có tác dụng tương tự trên quy định biểu hiện

của scrose synthase [41]

Các nghiên cứu sucrose synthase ở ngô

Sucrose synthase đóng vai trò quan trọng trong sự tăng trưởng và phát triển của cây ngô [42], [65] Phân tích di truyền sinh hóa cho thấy mối quan hệ giữa sucrose synthase và kiểu hình đóng vai trò trung tâm của sự biểu hiện gen chức năng Cho đến nay ngô được xác định có ba gen sucrose synthase là SH1, Sus1 và Sus3 [22], [23], [36], [41], [62], [73] SH1 là gen synthase sucrose đầu tiên được xác định và nghiên cứu bởi Chen và Chourey vào năm 1989 [23] Các nghiên cứu cho rằng SH1 mất chức năng gây đột biến đồng hợp tử lặn và phôi ngô bi teo dần dẫn đến chết [23] Lúc đầu các nhà nghiên cứu cho rằng SH1 được tham gia vào sinh tổng hợp tinh bột do giảm mức độ hàm lượng tinh bột dẫn đến hiện tượng nội nhũ bị teo lại [23] Tuy nhiên đến nay khi synthase sucrose thứ hai (Sus1) được nghiên cứu cho thấy đột biến Sus1 dẫn đến thiếu một kiểu hình có thể nhìn thấy trong hạt ngô [23] Các nghiên cứu sau đó phân tích kiểu hình đột biến của Synthase sucrose về chiều dài thân, số lá, số lóng trong quá trình tăng trưởng của cây cũng như trọng lượng hạt và tỷ lệ nảy mầm của hạt Ngoài ra bằng các phân tích đột biến cấu trúc và sinh hóa cho thấy sucrose synthase có thể là trung tâm sinh tổng hợp thành tế bào [23], [42], [57] Hơn nữa, một bằng chứng cho thấy sucrose synthase cũng có mặt trong màng tế bào [21], [44] Những nghiên cứu này cho thấy chức năng chính của sucrose synthase trong quá trình phân cắt đường sucrose và sử dụng UDP – glucose sản phẩm như một chất nền trực tiếp cho cellulose tổng hợp lên vách tế bào [62]

1.4 Agrobacterium tumefaciens và cơ chế chuyển gen vào thực vật

1.4.1 Giới thiệu chung về Agrobacterium tumefaciens

A tumefaciens là vi khuẩn gây bệnh cây sống trong đất, có khả năng xâm

nhiễm thực vật, kích thích tạo khối u ngay tại các vết thương của cây chủ Trong tự

nhiên, A tumefaciens chủ yếu tấn công cây hai lá mầm, đặc biệt là nhóm thực vật

có hoa Hoàn toàn khác với mô và tế bào thực vật bình thường, khối u do A

tumefaciens sinh ra phát triển rất mạnh ngay trong điều kiện thiếu hoocmon sinh

trưởng (auxin và cytokinin) Đó là do A tumefaciens đã chuyển một đoạn T - DNA

(Transfer DNA) sang tế bào thực vật và T - DNA điều khiển quá trình sinh tổng hợp

các chất đó Ngoài ra, các khối u cũng sinh tổng hợp các opin là các axit amin, đặc

biệt là các dẫn xuất của đường Dạng opin được tổng hợp có thể là nopalin, octopin,

agrocinopin, mannozapin và agropin phụ thuộc vào từng chủng A tumefaciens

Trong đó, octopin và nopalin là hai dạng opin phổ biến Opin được vi khuẩn sử dụng thay cho nguồn cacbon và nitơ nhờ hoạt động của gen chuyển hóa opin trên

plasmid gây khối u thực vật (Tumor inducing plasmid - Ti-plasmid) [37] Cơ chế

phân tử của sự hình thành khối u đã được quan tâm nghiên cứu nhằm tìm ra một phương thức phòng bệnh cho cây Khi phát hiện ra Ti-plasmid và khả năng tự chuyển T-DNA vào genome thực vật, người ta đã đặc biệt chú ý và khai thác khả năng sử dụng chúng như một vectơ tự nhiên để chuyển các gen quan tâm vào thực

vật nhằm tạo cây trồng mang những tính trạng mong muốn [8]

1.4.2 Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid

Ti-plasmid được phát hiện ở tất cả các chủng A tumefaciens gây nhiễm và tồn tại

bền vững ở nhiệt độ dưới 300C Đây là một phân tử DNA dạng mạch vòng, sợi kép và tồn tại trong tế bào như một đơn vị sao chép độc lập, có kích thước khoảng 200 kb Phân tích

di truyền cho thấy, Ti-plasmid dạng octopin và dạng nopalin là hai dạng phổ biến nhất, có

4 vùng tương đồng, trong đó vùng T-DNA và vùng gây độc (Virulence Region-vùng Vir), liên quan trực tiếp tới sự hình thành khối u ở thực vật Vùng gây độc có chứa các gen mã

hóa các protein/enzyme Vir Có 9 loại protein Vir là A, B, C, G, B1-11, D1-2, E1-2, F, H,

J/AcvB Các protein Vir này có vai trò quan trọng trong việc chuyển T-DNA sang tế bào thực vật Hai vùng còn lại chứa gen mã hóa cho việc sao chép plasmid và chuyển nạp

Trên Ti-plasmid, chỉ có vùng T-DNA được chuyển từ vi khuẩn sang hệ gen của

các cây bị bệnh và tồn tại bền vững ở trong đó Tuy nhiên, vùng này lại không mã hóa những sản phẩm trung gian cho quá trình chuyển T-DNA mà cần có sự trợ giúp đặc biệt

của các gen gây khối u nằm trên vùng VIR và trên nhiễm sắc thể vi khuẩn Vùng VIR dài

khoảng 40 kb đảm nhiệm chức năng gây nhiễm Ở Ti-plasmid dạng octopin, vùng VIR

chứa tới 24 gen gây độc Sản phẩm protein do các gen này mã hóa đã kích thích sự tách

biệt T-DNA, bao bọc, che chở và giúp chúng tiếp cận với hệ gen cây chủ Hình 1 3 [37]

Hình 1.3 : Bản đồ Ti- plasmid dạng octopin

1.4.3 Cấu trúc và chức năng của các đoạn T-DNA

Kết quả phân tích trình tự gen trên T- DNA ở các Ti - plasmid khác nhau cho thấy, T - DNA được giới hạn bởi một đoạn trình tự lặp lại gần như hoàn toàn từ khoảng 25 base pair (bp) và gọi là đoạn biên Chúng là dấu hiệu nhận biết cho quá trình chuyển T - DNA và xâm nhập của T - DNA vào tế bào thực vật Ở đoạn biên bên phải (Right border- RB) có yếu tố điều khiển cis cần cho quá trình chuyển T - DNA Đoạn bên trái (Left border - LB) gián tiếp tham gia vào quá trình chuyển T - DNA và là dấu hiệu để quá trình này kết thúc bình thường [2], [55]

Ở Ti - plasmid dạng nopalin, T - DNA xâm nhập vào genome thực vật ở dạng một đoạn liên tục dài 22 kb Trong khi ở Ti - plasmid dạng octopin, T - DNA

là một đoạn gen liên tục dài 13 kb T - DNA mang rất nhiều gen như: (1) các gen

mã hóa những enzyme cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp opin; (2) các gen gây khối u như tms1, tsm2, tmr mã hóa cho các enzyme liên quan đến quá trình sinh tổng hợp auxin và cytokinin [37]

1.4.4 Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens

Các tế bào cây bị tổn thương sẽ tiết ra các hợp chất hóa học dẫn dụ vi khuẩn như: Acetosyringon, Hydroxy-acetosyringon Dưới tác dụng của các hợp chất này,

A tumefaciens nhận biết rồi bám vào thành tế bào chủ và chuyển T - DNA vào tế

bào thực vật Quá trình này được sự trợ giúp đặc biệt của các gen Vir và RB, LB [8] Cũng chính các hợp chất này, với vai trò cảm ứng, giúp cho các gen vùng Vir

hoạt động và tăng cường biểu hiện

Hoạt động của các gen Vir sinh ra sợi đơn T - DNA làm xuất hiện bản sao

sợi bên dưới của T - DNA Chỉ đoạn sợi đơn DNA giữa hai trình tự biên (LB và RB) của T - DNA mới được chuyển vào tế bào thực vật, và được gắn vào hệ gen

của tế bào Đó là yếu tố hoạt động cis của hệ thống vận chuyển T - DNA Protein

Vir D1, D2 đóng vai trò là chìa khóa trong bước này, chúng nhận ra trình tự biên T -

DNA và cắt sợi bên dưới tại mỗi bên Điểm cắt là điểm đầu và kết thúc của sợi tái

sinh Sau đó, protein Vir D2 vẫn còn gắn kết với đầu cuối 5’ của sợi T - DNA và tế

bào thực vật Nếu gây đột biến hay loại bỏ đọan RB thì hầu như mất hoàn toàn khả năng chuyển T - DNA, còn nếu đột biến LB sẽ làm giảm hiệu quả chuyển T - DNA (Hill J và cs., 1983) Điều đó chứng tỏ tổng hợp sợi T - DNA là từ đầu 5’đến 3’, được bắt đầu từ đoạn RB và kết thúc ở LB

Sau khi T - DNA qua màng tế bào chúng đi thẳng vào nhân và kết hợp với

hệ gen thực vật, bắt đầu hoạt động và sản sinh ra auxin, cytokinin và opin gây nên sự phát triển thái quá của hàng loạt tế bào lân cận dẫn đến sự hình thành khối u Hình 1 4 [37]

Hình 1.4 Quá trình chuyển T - DNA vào tế bào thực vật

1.4.5 Tương tác giữa T - DNA và genome tế bào thực vật

Trong tế bào thực vật, phức ss-T - DNA được đưa qua màng nhân vào nhân

Hai protein đóng vai trò quan trọng trong bước này là Vir D2 và Vir E2 Tín hiệu định vị trong nhân của Vir D2 và Vir E2 đóng vai trò chủ yếu Protein Vir D2 có

chức năng xác định vị trí cho T - DNA trong nhân Phức ss - T - DNA là phức

nucleoprotein lên đến 20 kb chứa một đầu 5’ gắn với protein Vir D2 Nhưng phức được bao bọc bởi số lượng lớn phân tử Vir E2 (xấp xỉ 600/ 20 kb T - DNA) và mỗi phức này có hai tín hiệu định vị trong nhân Hai tín hiệu này của Vir E2 đóng vai trò

quan trọng đối với việc nhận liên tục phức T - DNA của nhân, có khả năng kích thích mở lỗ màng nhân Khả năng nhận phức của nhân được điều khiển bởi protein kết hợp tín hiệu định vị đặc trưng trong nhân, protein được tìm thấy trong tế bào chất của tế bào thực vật [34]

Bước cuối cùng trong quá trình vận chuyển T - DNA là sự tương tác trong genom tế bào thực vật Các phản ứng trong sự tương tác T - DNA không có tính điển hình Sự tương tác này tìm thấy bởi sự tái tổ hợp không theo quy luật Theo cách nhìn nhận việc cắt bỏ bớt base, như microhomologies, được cần đến đối với

bước lặp lại giữa cặp vận chuyển T - DNA với Vir D2 và DNA thực vật Sự

tương đồng này rất thấp và cung cấp đặc trưng nhỏ nhất đối với quá trình tái tổ

hợp bởi sự xác định vị trí của Vir D2 để gắn kết Ở trình tự gần kề hay đầu 3’ của

T - DNA tìm thấy một vài sự tương đồng nhỏ với DNA thực vật, kết quả ở sự tương tác đầu tiên giữa sợi T - DNA và DNA thực vật là tạo lỗ hổng ở sợi 3’-5’ của DNA thực vật Sau đó DNA thực vật được cắt ở vị trí đầu 3’ của lỗ hổng bởi

endonuclease và nucleotit của đầu 5’ bắt cặp với Vir D2 bởi một nucleotit của đầu 5’ bắt cặp với Vir D2 bởi một nucleotit trong đầu sợi (5’ - 3’) DNA thực vật

Phần 3’ nhô ra của T - DNA cũng như DNA thực vật thay thế bị phân hủy bởi endonuclease hay 3’- 5’ enxonuclease Đầu 5’ của T - DNA gắn với Vir D2 còn đầu 3’ kia cặp đôi với DNA thực vật kéo dài từ bước đầu của quá trình tương tác, nối liền với vết cắt trong sợi DNA dưới của thực vật Sự đưa vào của sợi T-DNA trong sợi 3’ - 5’ của DNA thực vật được bổ sung, tình trạng xoắn sinh ra bởi vết cắt trong sợi đối ngược được sản sinh

Tình trạng này hoạt hóa phản ứng sửa chữa của tế bào thực vật và sợi bổ sung được tổng hợp sử dụng để chèn dễ dàng sợi T - DNA như là sợi khuôn Vir D2

có vai trò hoạt hóa trong sự hòa hợp chính xác sợi T - DNA vào nhiễm sắc thể thực vật Phóng thích protein Vir D2 có thể cung cấp năng lượng chứa đựng trong các liên kết phosphodieste, như Tyr 29 với nucleotit đầu tiên của sợi T - DNA, qui định đầu 5’ của sợi T - DNA không còn Ngoài ra, quá trình chuyển T - DNA còn có sự

tương tác với các protein do gen trên nhiễm sắc thể của A tumefaciens quy định và

protein trong tế bào thực vật [37]

1.4.6 Một số phương pháp biến nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Kể từ khi vai trò của A tumefaciens được phát hiện và nghiên cứu thì chúng

đã trở thành công cụ chuyển gen hữu hiệu vào thực vật Phương pháp biến nạp gen

thông qua vi khuẩn A tumefaciens gồm có 2 hệ thống chính

1.4.6.1 Hệ thống chuyển gen in vitro

Khó khăn chính trong việc xây dựng hệ thống chuyển gen in vitro là phải có được sự kết hợp giữa sự xâm nhiễm của A tumefaciens và khả năng tái sinh của các

tế bào sau khi lây nhiễm với vi khuẩn [19]

Một số trợ giúp kỹ thuật trong quá trình biến nạp đã cải thiện hiệu quả của hệ

thống chuyển gen in vitro nhờ A tumefaciens bao gồm:

Xử lý sóng siêu âm

Xử lý một thực vật với A tumefaciens trong điều kiện sóng siêu âm tạo ra các tổn thương nhỏ, đồng nhất ở mô thực vật, cho phép vi khuẩn A tumefaciens dễ

dàng xâm nhập vào tế bào thực vật Bằng phương pháp này đã cải thiện rõ rệt hiệu

quả chuyển gen, biểu hiện gus tạm thời đã tăng từ 100 lên 1400 lần ở các tế bào đậu

tương, đậu đũa, lúa mỳ và ngô [67]

Ly tâm tế bào

Phương pháp chuyển gen thông qua A tumefaciens kết hợp với ly tâm đã

được áp dụng thành công khi biến nạp vào huyền phù tế bào phôi hóa nhận được từ

hoa chuối đực nuôi cấy in vitro của hai giống chuối thương mại Cavendish và Lady

Finger Tần số chuyển gen đã được cải thiện đáng kể bằng cách áp dụng chế độ ly tâm tế bào thực vật trong quá trình nuôi cấy cộng sinh với vi khuẩn [40]

1.4.6.2 Hệ thống chuyển gen in vivo

Phương pháp này dựa trên cơ sở của việc chuyển gen vào nguyên cây (in

planta) và rất phổ biến đối với loài A thaliana, một trong những loài cây mô hình

đối với các nghiên cứu về di truyền học Phương pháp chuyển gen này tốn ít thời gian, bỏ qua công đoạn nuôi cấy mô và tái sinh sau biến nạp, vì thế loại bỏ được các biến dị soma và số lượng cây chuyển gen thu được lớn hơn Kỹ thuật này đã được

mô tả ở các cây trồng khác nhau như đậu tương, Arabidopsis, hoa hướng dương và cây lạc Hệ thống chuyển gen in vivo sử dụng một số phương pháp sau [40]:

Phương pháp chuyển gen vào hạt

Phương pháp ngâm cụm hoa

Phương pháp thấm lọc chân không

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU

2.1 Nguyờn liệu

Nguyờn liệu thực vật

Trong nghiờn cứu này, chỳng tụi đó sử dụng giống ngụ Q411 do Viện Nghiờn cứu Ngụ cung cấp, được gieo trong phũng thớ nghiệm để lấy mầm làm nguyờn liệu tỏch DNA tổng số

Mẫu nghiờn cứu

- Cỏc chủng vi sinh vật, plasmid

+ Chủng E.coli DH5α và chủng A tumefaciens C58 (pGV2260)

+ Plasmid

- Vector tỏch dũng: pJET1.2/blunt (Fermentas)

- Vector tỏi tổ hợp pRTRA7/3 mang gen cryIA(c) d-ới sự điều khiển của đoạn

khởi động 35S promoter do Phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học thiết kế

Hóa chất

Các hóa chất được sử dụng cho công việc nghiên cứu được mua của các hãng khác nhau và được đưa ra ở Bảng 2.2:

Bảng 2.2 Các hóa chất sử dụng

BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit Appied Biosystems

 Các môi trường và dung dịch sử dụng

- Môi trường nuôi cấy vi sinh vật:

+ Môi trường LB lỏng: Hỗn hợp Lucia Bertani bao gồm Bacto -Tryptone 10

g/l; Yeast extract 5 g/l; NaCl 10 g/l; NaOH 2 mM

+ Môi trường LB đặc: Bao gồm môi trường LB lỏng bổ sung thêm Bacto

-Agar 15 g/l

- Các dung dịch tách DNA plasmid:

+ Dung dịch I: Glucose 50mM; Tris - Cl 25 mM, pH 8,0; EDTA 10 mM,

pH 8,0

+ Dung dịch II: NaOH 0,2 M; SDS 1%

+ Dung dịch III: CH3COOK 3 M; CH3COOH 5 M

- Dung dịch dùng để chạy điện di DNA trên gel agarose:

Bảng 2.3 Trang thiết bị dùng trong nghiên cứu

Máy xác định trình tự ABI PRISM 3100-Avant

Instrument

Máy làm khô chân không (Speed Vacuum Sc 110A) Savant

Máy soi DNA (Mini trans-illuminator) Bio - Rad

Máy đo pH (Digital pH Meter Delta 320) Mettler Toledo