Tuyển chọn, tách dòng và xác định trình tự gen cry1c mã hóa Protein tinh thể diệt côn trùng bộ cánh vảy từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis subsp. aizawai phân lập từ một số mẫu đất tỉnh Thái Nguyên

Bacillus thuringiensis là vi khuẩn Gram dương, trong giai đoạn sinh bào tử có khả năng tạo ra các protein tinh thể gây độc một cách đặc hiệu với các côn trùng thuộc bộ Cánh vảy Lepidopt

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

LÊ THỊ NGỌC THƯƠNG

TUYỂN CHỌN, TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN

cry1C MÃ HÓA PROTEIN TINH THỂ DIỆT CÔN TRÙNG BỘ CÁNH

VẢY TỪ VI KHUẨN Bacillus thuringiensis subsp aizawai PHÂN LẬP

TỪ MỘT SỐ MẪU ĐẤT TỈNH THÁI NGUYÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2012

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

LÊ THỊ NGỌC THƯƠNG

TUYỂN CHỌN, TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN

cry1C MÃ HÓA PROTEIN TINH THỂ DIỆT CÔN TRÙNG BỘ CÁNH VẢY TỪ VI KHUẨN Bacillus thuringiensis subsp aizawai PHÂN LẬP

TỪ MỘT SỐ MẪU ĐẤT TỈNH THÁI NGUYÊN

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60.42.30

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGÔ ĐÌNH BÍNH

Thái Nguyên - 2012

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi Các số liệu

và kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong các công trình nghiên cứu khác

Tác giả luận văn

Lê Thị Ngọc Thương

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và thực hiện luận văn, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ, hỗ trợ của thầy cô, bạn bè, đồng nghiệp và gia đình Tôi xin trân trọng cảm

ơn tất cả những tình cảm quý báu đó

Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn tới PGS TS Ngô Đình Bính, người thầy đã tận tình hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn này

Tôi cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn tới CN Đặng Văn Tiến cùng toàn thể cán bộ phòng Di truyền Vi sinh, Viện công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời thời gian dài thực tập

Bên cạnh đó, sự tạo điều kiện và hỗ trợ của Khoa Sau đại học, BCN Khoa và các đồng nghiệp tại Khoa Sinh – KTNN, Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên cũng là động lực rất lớn giúp tôi hoàn thành tốt luận văn của mình

Cuối cùng tôi xin cảm ơn bạn bè và gia đình, những người đã luôn ủng hộ tôi trong suốt thời gian qua!

Tác giả luận văn

Lê Thị Ngọc Thương

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

MỤC LỤC

Trang

Trang bìa phụ

Lời cam đoan

Lời cảm ơn

Mục lục i

Danh mục các chữ viết tắt iii

Danh mục các bảng iv

Danh mục các hình v

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Lịch sử nghiên cứu, ứng dụng vi khuẩn Bacillus thuringiensis 3

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu vi khuẩn Bacillus thuringiensis trên thế giới 3

1.1.2 Những nghiên cứu về Bacillus thuringiensis ở Việt Nam 5

1.2 Những đặc điểm của vi khuẩn Bacillus thuringiensis 7

1.2.1 Vị trí phân loại 7

1.2.2 Phân loại vi khuẩn Bacillus thuringiensis 8

1.2.3 Đặc điểm hình thái, sinh lý, hóa sinh của vi khuẩn Bacillus thuringiensis 9

1.3 Độc tố của vi khuẩn Bacillus thuringiensis 10

1.3.1 Độc tố Cry 11

1.3.2 Độc tố Cyt 11

1.3.3 Độc tố Vip 12

1.3.4 Cấu trúc của các nhóm độc tố tinh thể 12

1.3.5 Cơ chế tác động của protein độc tố tinh thể 14

1.4 Gen mã hóa protein độc tố tinh thể 16

1.4.1 Vị trí của các gen mã hóa độc tố của vi khuẩn Bacillus thuringiensis 17

1.4.2 Phân nhóm gen mã hóa độc tố 17

1.5 Tổng quan về dưới loài Bacillus thuringiensis subsp aizawai và gen cry1C 19

1.5.1 Một số đặc điểm của dưới loài Bta 19

1.5.2 Gen cry1C 20

1.6 Tổng quan về côn trùng thử nghiệm 22

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

1.6.1 Sâu tơ (Plutella xylostella) 22

1.6.2 Sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) 23

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 26

2.1 Vật liệu 26

2.2 Hóa chất và thiết bị 26

2.3 Phương pháp nghiên cứu 28

2.3.1 Phương pháp phân loại hình dạng tinh thể của các chủng Bt 28

2.3.2 Phương pháp phân loại Bacillus thuringiensis bằng phản ứng huyết thanh 28

2.3.3 Phương pháp định lượng mật độ bào tử 29

2.3.4 Phương pháp thử hoạt tính trên đối tượng sâu xanh và sâu tơ 29

2.3.5 Phương pháp tách DNA plasmid 30

2.3.6 Phương pháp PCR để khuếch đại gen cry1C 31

2.3.7 Phương pháp tách dòng gen cry1C 31

2.3.8 Phương pháp xác định trình tự nucleotid của đoạn gen tách dòng 34

2.4 Địa điểm nghiên cứu 35

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

3.1 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis subsp aizawai mang gen cry1C có hoạt tính diệt sâu tơ (Plutella xylostella) và sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) 36

3.1.1 Phân loại hình dạng tinh thể của các chủng Bacillus thuringiensis nghiên cứu 36

3.1.2 Phân loại Bacillus thuringiensis bằng phương pháp huyết thanh 38

3.1.3 Thử hoạt tính của các chủng Bacillus thuringiensis subsp aizawai trên sâu tơ (Plutella xylostella) và sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) 40

3.1.4 Kết quả khuếch đại gen cry1C ở các chủng Bacillus thuringiensis subsp aizawai bằng phương pháp PCR 43

3.2 Tách dòng và đọc trình tự gen cry1C 44

3.2.1 Tách dòng gen cry1C 44

3.2.2 Xác định trình tự đoạn gen cry1C 49

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Hình dạng tinh thể của các chủng Bacillus thuringiensis nghiên cứu 37

Bảng 3.2 Kết quả phân loại dưới loài của các chủng Bt sinh tinh thể 39

Bảng 3.3: Kết quả thử hoạt tính diệt sâu tơ của các chủng Bta sau 3 ngày thử nghiệm 41

Bảng 3.4 Kết quả thử hoạt tính diệt sâu xanh da láng của các chủng Bta 42

sau 3 ngày thử nghiệm 42

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Hình thái khuẩn lạc nhóm B.cereus (nguồn: Phòng DTVS) 7

Hình 1.2 Phản ứng ngưng kết của vi khuẩn Bacillus thuringiensis với kháng nguyên lông roi H [6] 8

Hình 1.3 Bào tử và tinh thể của Bacillus thuringiensis [24] 9

Hình 1.4 Bào tử và tinh thể Bacillus thuringiensis dưới kính hiển vi quang học khi nhuộm với fuchsin base (nguồn: Phòng DTVS) 10

Hình 1.8 Cây phân loại của hai họ độc tố Cyt và Vip [42] 12

Hình 1.6 Các block bảo thủ có mặt ở các loại độc tố Cry [26] 14

Hình 1.7 Mô hình cấu trúc chung của độc tố Cry [26] 14

Hình 1.5 Cơ chế tác động của protein tinh thể độc tố tới côn trùng đích [24] 16

Hình 1.9 Hình ảnh sâu tơ và (Plutella xylostella) thiệt hại do sâu tơ gây ra [10] 23

Hình 1.10 Vòng đời của sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) [10] 25

Hình 3.1 Hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus thuringiensis trên môi trường MPA sau 72 giờ nuôi cấy ở 280 C 36

Hình 3.2 Hình dạng bào tử và tinh thể của chủng TN1.12 và TN 36.3 37

Hình 3.3 Hình ảnh ngưng kết của chủng 4J4 (A) và TN 6.12 (B) với typ huyết thanh H7 dưới kính hiển vi quang học 39

Hình 3.4 Thử hoạt tính diệt sâu tơ của các chủng Bta nghiên cứu 41

Hình 3.5 Hình ảnh thử hoạt tính diệt sâu xanh da láng của các chủng Bta nghiên cứu 42

Hình 3.6 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của các chủng Bta nghiên cứu 44

Hình 3.7 Khuẩn lạc xanh và trắng trên đĩa thạch LBA sau 14 giờ nuôi cấy 45

Hình 3.8 Hình ảnh điện di sản phẩm colony - PCR với mồi M13 46

Hình 3.9 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt DNA plasmid tách chiết từ một số dòng khuẩn lạc trắng 47

Hình 3.10 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR gen cry1C từ DNA plasmid tái tổ hợp pGEM-T Easy – cry1C – TN28.6 - p3, pGEM-T Easy – cry1C – TN 36.3 - p1 và pGEM-T Easy – cry1C – TN 6.12 – p7 48

có nguồn gốc từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis chiếm thị phần gần như tuyệt

đối [8], [39]

Bacillus thuringiensis là vi khuẩn Gram dương, trong giai đoạn sinh bào tử

có khả năng tạo ra các protein tinh thể gây độc một cách đặc hiệu với các côn trùng thuộc bộ Cánh vảy (Lepidoptera), bộ Hai cánh (Diptera), bộ Cánh cứng (Coleoptera) … Các tinh thể là hỗn hợp của một hay nhiều loại protein thuộc 2 nhóm độc tố Cry và độc tố Cyt Các độc tố có tính đặc hiệu với côn trùng đích nhưng không gây độc cho người, động vật có xương sống, thực vật Các độc tố tinh

thể được mã hóa bởi các gen cry nằm trên các plasmid [39]

Bacillus thuringiensis subsp aizawai (Bta) là một trong 82 dưới loài của vi khuẩn Bacillus thuringiensis, có khả năng sinh nhiều loại protein tinh thể có tác dụng

diệt côn trùng thuộc nhiều bộ khác nhau Protein tinh thể độc Cry1C là một loại protein

do Bta sinh ra trong quá trình hình thành bào tử, có hoạt tính chống lại côn trùng bộ

Cánh vảy rất mạnh

Việc sàng lọc và tuyển chọn dưới loài Bacillus thuringiensis có khả năng tiêu diệt nhiều loại côn trùng đích cũng như tiếp tục nghiên cứu về trình tự các gen cry

là những hướng nghiên cứu được nhiều nhà khoa học trên thế giới và Việt Nam quan tâm

Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi chọn đề tài “Tuyển chọn, tách dòng

và xác định trình tƣ̣ gen cry1C mã hóa protein tinh thể diệt côn trùng bộ Cánh vảy tƣ̀ vi khuẩn Bacillus thuringiensis subsp aizawai phân lập tƣ̀ một số mẫu đất tỉnh Thái Nguyên”

2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu

2.1 Mục tiêu nghiên cứu

- Tuyển chọn được các chủng Bta có hoạt tính diệt sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) và sâu tơ (Plutella xylostella) cao

- Xác định được trình tự gen cry1C từ các chủng Bta đã tuyển chọn

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Thu thập các chủng vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus cereus phân lập tại một

số địa điểm tại Thái Nguyên

- Phân loại các chủng Bacillus thuringiensis subsp aizawai bằng phương

pháp huyết thanh học

- Xác định nồng độ bào tử của các chủng Bta đã phân loại được

- Sàng lọc các chủng Bta có hoạt tính diệt sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) và sâu tơ (Plutella xylostella) cao

- Phát hiện gen cry1C từ các chủng Bta có hoạt tính diệt sâu xanh (Spodoptera exigua) và sâu tơ (Plutella xylostella)

- Tách dòng, đọc trình tự gen cry1C và so sánh với các trình tự đã công bố

trên ngân hàng gen quốc tế

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Lịch sử nghiên cứu, ứng dụng vi khuẩn Bacillus thuringiensis

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu vi khuẩn Bacillus thuringiensis trên thế giới

Khả năng diệt côn trùng của Bacillus thuringiensis đã được biết đến từ rất

lâu Nhiều nghiên cứu còn cho rằng người Ai Cập cổ đã biết và sử dụng loại vi

khuẩn này để tiêu diệt nhiều côn trùng gây hại Tuy nhiên Bacillus thuringiensis

mới chỉ được phân lập năm 1901 bởi Sigetane Ishiwata khi ông nghiên cứu bệnh

dâu tằm, gọi là bệnh “sotto” Năm 1915, vi khuẩn này được mang tên Bacillus thuringiensis do được phân lập từ nhà máy bột vùng Thuringien của Đức [29]

Trải qua hơn 100 năm phát triển, lịch sử nghiên cứu vi khuẩn Bacillus thuringiensis

đã trải qua nhiều dấu mốc quan trọng, tập trung vào một số hướng chính như:

Tìm kiếm và phát hiện các dưới loài Bacillus thuringiensis mới có khả năng

diệt côn trùng thuộc nhiều bộ côn trùng khác nhau, từ đó sản xuất các loại chế phẩm

sinh học từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis

Năm 1930, Bacillus thuringiensis lần đầu được đưa vào thử nghiệm để chống

sâu đục thân ở ngô tại vùng Ostrinia Nubilalis ở châu Âu Năm 1938, thuốc trừ sâu

sinh học Bt đầu tiên đã được bán trên thị trường Pháp Năm 1957, công ty Sandoz (Thụy Sĩ) đã sản xuất thuốc “Thuricide” với số lượng lớn từ Bacillus thuringiensis var kurstaki Công nghiệp sản xuất thuốc trừ sâu Bt thực sự phát triển mạnh với việc phát hiện thêm các dưới loài Bacillus thuringiensis var kurstaki HD1 (1970)

và Bacillus thuringiensis var israelensis diệt ấu trùng thuộc bộ Hai cánh (1977) Năm 1983, Krieg và cs phát hiện dưới loài Bacillus thuringiensis subsp tenebrionis

diệt bọ Cánh cứng (Coleoptera) hại lá khoai tây vùng Colorado, Hoa Kỳ Các phát

hiện này chứng tỏ hoạt tính diệt côn trùng của Bacillus thuringiensis không chỉ giới

hạn trong bộ Cánh vảy (Lepidoptera) như quan niệm trước đây [15]

Phổ tác dụng của vi khuẩn Bacillus thuringiensis tiếp tục được mở rộng với các phát hiện về Bacillus thuringiensis diệt giun tròn thực vật (1988),

Bacillus thuringiensis diệt be, vét, mạt thuộc bộ Hrematoda hay Bacillus thuringiensis diệt kiến thuộc bộ Hymenoptera Đặc biệt năm 2003, Sakai và cs

đã công bố protein tinh thể của Bacillus thuringiensis diệt tế bào ung thư ở

người Năm 2005, Ohba M., và Binh, N.D đã phát hiện ra protein của 4 dưới

loài Bacillus thuringiensis phân lập ở Việt Nam chống tế bào ung thư cổ tử cung

của người [5], [7], [20]

Protein tinh thể độc tố của Bacillus thuringiensis cũng đã được nghiên cứu

một các chi tiết đến mức độ phân tử Năm 1953, Hannay và Fitzjame đã phát hiện ra thể vùi và công bố tinh thể có bản chất protein Năm 1956, Angus đã chứng minh hoạt tính diệt sâu là do tinh thể tách ra từ tế bào và bào tử Bằng kỹ thuật tia X và các kỹ thuật sinh học phân tử khác, trình tự amino acid và cấu trúc của các protein tinh thể độc tố đã được làm sáng tỏ Qua đó góp phần làm rõ cơ chế tác động của

độc tố Bacillus thuringiensis tới các côn trùng đích [26], [31]

Gen mã hóa độc tố tinh thể của Bacillus thuringiensis là hướng được tập

trung nghiên cứu và đạt được nhiều kết quả Năm 1981, gen mã hóa protein tinh thể

diệt sâu đầu tiên được tách dòng và đọc trình tự Từ đó, số lượng gen mã hóa

protein tinh thể của Bt được tách dòng và nghiên cứu đặc tính không ngừng tăng lên Những gen này chủ yếu thuộc 2 họ gen cry và cyt, được phân loại trong 30

nhóm khác nhau theo trình tự amino acid của protein mà chúng mã hóa Năm 1996, Estruch và cs đã phát hiện ra gen mã hóa protein Vip3A và Vip3B, sinh tổng hợp ở

tế bào sinh dưỡng Crick More và cs đã xây dựng khóa phân loại gen mã hóa độc tố

của vi khuẩn Bt, danh sách các gen cry, cyt được cập nhật từ các nghiên cứu trên khắp

thế giới, đồng thời liên kết với các trình tự công bố trên Gene Bank [36], [41], [42]

Những nghiên cứu về gen cry là cơ sở quan trọng cho công nghệ chuyển gen, tạo ra hàng loạt các cây trồng biến đổi gen có mang gen Bacillus thuringiensis,

trong đó nhiều loại đã được thương mại hóa rộng rãi trên thế giới Năm 1985 các

gen cry1Ab và gen cry1Ac đã được chuyển thành công vào cây ngô và bông Năm

1995, cây chuyển gen thương phẩm đầu tiên được đưa vào sản xuất Đến năm 2001, tính riêng tại Mỹ, 26% tổng diện tích ngô, 69% tổng diện tích bông là giống cây

chuyển gen Bacillus thuringiensis Năm 2005, ở Trung Quốc đã có 3,3 triệu ha

bông chuyển gen, đem lại nhiều lợi ích về kinh tế, môi trường, giảm thiểu việc sử dụng thuốc trừ sâu hoá học [14], [29]

Tình hình dịch bệnh, sâu hại trong nông nghiệp diễn biến ngày càng phức tạp với nhiều loại bệnh mới phát sinh, nhiều côn trùng biểu hiện kháng với các sản

phẩm Bacillus thuringiensis Điều này đòi hỏi lĩnh vực nghiên cứu về vi khuẩn Bacillus thuringiensis phải có những thay đổi phù hợp Dự báo trong những năm tới, các nghiên cứu về vi khuẩn Bacillus thuringiensis sẽ tập trung vào các vấn đề như:

- Nghiên cứu phát triển Bacillus thuringiensis thành một loại thuốc trừ sâu có

tác dụng bảo vệ kép (Dual control), vừa trừ sâu lại vừa chống bệnh cho cây trồng

- Nghiên cứu sâu và có hệ thống hơn về cơ chế kháng của côn trùng với các

protein tinh thể độc tố của Bacillus thuringiensis, từ đó tạo ra các loại thuốc Bacillus thuringiensis có độc lực mạnh hơn, cũng như khắc phục các loại chế phẩm

đã bị côn trùng kháng lại

- Tiếp tục sàng lọc tuyển chọn thêm các dưới loài Bacillus thuringiensis mới

- Tiếp tục tách dòng và đọc trình tự các gen cry mới làm cơ sở phục vụ cho

công nghệ chuyển gen

1.1.2 Những nghiên cứu về Bacillus thuringiensis ở Việt Nam

Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng về vi khuẩn Bacillus thuringiensis ở Việt

Nam được khoảng 40 năm chia làm 3 thời kỳ chính với nhiều công trình của các tác giả như Nguyễn Công Bình , Phạm Bá Nhạ, Ngô Đình Bính, những người đầu tiên

mở đường nghiên cứu về Bacillus thuringiensis tại Việt Nam [5]

1.1.2.1 Thời kỳ mở đầu nghiên cứu

Các công bố khoa học về nghiên cứu Bacillus thuringiensis ở thời kỳ này còn rất ít Vào thời kỳ này một số viện nghiên cứu đã tiến hành sản xuất Bacillus thuringiensis bằng phương pháp thủ công và bán công nghiệp trong phòng thí nghiệm

sử dụng các chủng Bacillus thuringiensis thuộc loài phụ Bacillus thuringiensis var thuringiensis, Bacillus thuringiensis var kurstaki Các chế phẩm Bacillus thuringiensis

này đã được sử dụng cho vùng rau ngoại thành Hà Nội và đã thu được các kết

quả tốt Tuy nhiên từ năm 1984 đến năm 1993, việc sản xuất chế phẩm Bacillus thuringiensis đã bị giảm sút vì các chế phẩm Bacillus thuringiensis sản xuất ra

có chất lượng không cao nên tốc độ tiêu thụ giảm [5]

1.1.2.2 Thời kỳ sản xuất và ứng dụng (1984-1994)

Ở thời kỳ này, các chế phẩm Bacillus thuringiensis sản xuất theo phương

pháp dịch thể được áp dụng rộng rãi, có hiệu quả phòng trừ rất rõ rệt, hơn nữa có giá thành hợp lý nên được nông dân ưa chuộng Sau đó, một số đơn vị thuộc các trường

đại học đề xuất phương án sản xuất chế phẩm Bacillus thuringiensis theo phương pháp

lên men hở không cần vô trùng nhưng đã không thu được kết quả tốt [5]

1.1.2.3 Thời kỳ nghiên cứu cơ bản, ứng dụng và phát triển (từ năm 1994 đến nay) Cuối thời kỳ sản xuất và ứng dụng, chế phẩm Bacillus thuringiensis kém chất lượng không tiêu thụ được Sản xuất và ứng dụng Bacillus thuringiensis bước vào

thời kỳ thoái trào, các nhà nghiên cứu buộc phải quay lại nghiên cứu cơ bản để phục

vụ cho xây dựng công nghệ sản xuất và cơ sở ứng dụng Do vậy các nhà khoa học

đã chuyển việc nghiên cứu Bacillus thuringiensis sang hướng mới như tìm kiếm các chủng Bacillus thuringiensis có phổ diệt sâu rộng, hoạt tính diệt sâu cao để phục hồi lại việc sản xuất thuốc trừ sâu Bacillus thuringiensis và ứng dụng công nghệ chuyển gen Bacillus thuringiensis phục vụ sản xuất [5]

Các nghiên cứu của Ngô Đình Bính và cs cho thấy các chủng Bacillus thuringiensis phân lập tại Việt Nam rất đa dạng về thành phần loài [2] Năm

2005, Lê Thị Minh Thành và cs khi nghiên cứu sự phân bố và đa dạng gen của

vi khuẩn Bt phân lập ở một số tỉnh thuộc vùng Đông Bắc Bộ đã phân loại được

22 dưới loài trên tổng số 82 dưới loài đã được phát hiện trên thế giới [3], [13]

Trên cơ sở phát hiện, tách dòng và đọc trình tự gen có trong các chủng

Bacillus thuringiensis phân lập tại Việt Nam, Ngô Đình Bính và cs đã tách dòng và biểu hiện gen mã hóa tổng hợp protein Cry1C và Cry1D diệt sâu khoang trong E coli

thu được các protein tái tổ hợp có hiệu quả diệt sâu cao hơn so với đối chứng [4]

Ở Việt Nam, những nghiên cứu về lĩnh vực chuyển gen kháng côn trùng vào cây trồng để tạo ra các cây có khả năng kháng các sâu bệnh mới đã được bắt đầu từ

cuối thế kỷ 20 Đã nhiều nghiên cứu chuyển gen cry1A kháng sâu vào cây trồng thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để tạo ra các giống cây trồng có khả

năng kháng sâu như: cây đậu xanh, cây cải bông [7], [9], [12] Năm 2003, Phan

Đình Pháp và cs đã chuyển gen cry1B vào cây lúa thông qua phương pháp sử dụng

súng bắn gen Năm 2005, gen kháng sâu trên được chuyển vào cây cà tím thông qua

vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens [15]

1.2 Những đặc điểm của vi khuẩn Bacillus thuringiensis

1.2.1 Vị trí phân loại

Bacillus thuringiensis thuộc chi Bacillus, gồm hơn 20 loài khác nhau, trong

đó có nhiều loài rất quan trọng như Bacillus subtilis là nguồn cung cấp enzyme trong công nghiệp, Bacillus cereus gây bệnh tiêu chảy và Bacillus anthracis, tác nhân gây bệnh than Các vi khuẩn thuộc chi Bacillus hầu hết là Gram dương, có khả

năng tạo bào tử và thường sống trong đất [29], [49], [50]

Nhóm Bacillus cereus gồm có Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus anthracis, Bacillus mycoides, Bacillus megaterium Khả năng sinh tinh thể là một đặc điểm phân biệt Bacillus thuringiensis với các vi khuẩn khác thuộc nhóm Bacillus cereus

[29], [49], [50]

Hình 1.1 Hình thái khuẩn lạc nhóm B.cereus (nguồn: Phòng DTVS)

1 B mycoides 2 B cereus 3 B thuringiensis 4 B megaterium 5 B anthracis

1.2.2 Phân loại vi khuẩn Bacillus thuringiensis

Khóa phân loại vi khuẩn Bt được sử dụng phổ biến và được trung tâm quốc tế Bacillus thuringiensis đặt tại viện Pasteur, Paris khuyến cáo sử dụng

cho tất cả các phòng thí nghiệm trên thế giới từ năm 1982 là khóa phân loại của

de Barjac và Bonnefoi [16],[17]

Phương pháp phân loại Bacillus thuringiensis của de Barjac và Bonnefoi dựa

vào phản ứng kháng nguyên và kháng thể, các tác giả đã mô tả 27 typ huyết thanh chính có hoạt tính diệt côn trùng thuộc bộ Cánh vảy, Hai cánh, Cánh cứng…phương pháp này được sử dụng chủ yếu do đơn giản và có tính đặc hiệu cao [16],[17]

Nguyên lý: Khi kháng nguyên tiêm mao kết hợp với kháng thể sẽ xảy ra phản ứng ngưng kết Kết quả của phản ứng là tạo cặn lắng màu trắng ở đáy ống nghiệm có thể quan sát bằng mắt thường Khi quan sát dưới kính hiển vi quang học

có thể thấy các tế bào bị cố định lại không chuyển động được [16], [17]

Ngày nay, phương pháp phân loại này đã được các nhà nghiên cứu Bacillus thuringiensis và Bacillus subtilis công nhận và là điều kiện bắt buộc khi muốn công

bố một trình tự gen mới trên ngân hàng dữ liệu gen quốc tế về Bacillus thuringiensis và Bacillus subtilis

Hình 1.2 Phản ứng ngƣng kết của vi khuẩn Bacillus thuringiensis

với kháng nguyên lông roi H [6]

Tế bào vi khuẩn với

kháng nguyên bề mặt

Phân tử kháng thể với

2 vị trí liên kết đặc hiệu

Phản ứng ngưng kết

1.2.3 Đặc điểm hình thái, sinh lý, hóa sinh của vi khuẩn Bacillus thuringiensis

Mỗi tế bào Bacillus thuringiensis khi trưởng thành có khả năng sinh bào tử

và tinh thể độc diệt côn trùng (hình 1.3) Bào tử hình thành trong điều kiện bất lợi như nhiệt độ cao, môi trường nghèo chất dinh dưỡng…khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử có thể nảy mầm thành tế bào sinh dưỡng Bào tử có hình oval, kích thước khoảng 0,5-1,2μm × 1,5 – 2,6μm, quá trình hình thành bào tử không làm biến đổi hình dạng tế bào [24], [49]

Các tinh thể độc tố được tổng hợp trong quá trình tạo bào tử Tinh thể có kích thước 0,6-2μm, có nhiều hình dạng như hình lưỡng tháp, hình ovan, hình lập phương hoặc có hình dạng không xác định … Khi ở trong tế bào sinh dưỡng thì bào tử và tinh thể thường nằm kề nhau, khi tế bào tan thì bào tử và tinh thể được giải phóng ra ngoài (hình 1.3) Tinh thể có thể chiếm tới 30% trọng lượng khô của tế bào Khi

nhuộm tế bào Bacillus thuringiensis bằng thuốc nhuộm fushin base và quan sát dưới kính hiển vi ta thấy tinh thể Bacillus thuringiensis bắt màu tím sẫm còn bào tử thì bắt

màu hồng nhạt (hình 1.4) [49]

Hình 1.3 Bào tử và tinh thể của Bacillus thuringiensis [24]

Bào tử

Tinh thể

Hình 1.4 Bào tử và tinh thể Bacillus thuringiensis dưới kính hiển vi quang học khi

nhuộm với fuchsin base (nguồn: Phòng DTVS)

1.2.3.2 Đặc điểm sinh hóa

Bacillus thuringiensis có khả năng sinh trưởng phát triển tốt ở nhiệt độ dao

động từ 15 – 450C Nhiệt độ tối ưu là 20-30 0C

Bacillus thuringiensis không lên men acid trong môi trường có chứa đường

arrabinose, xylose, manitol nhưng tạo acid trong môi trường có chứa glucose, có khả năng thủy phân tinh bột, khử nitrat thành nitrit, phát triển được ở môi trường có chứa 0,001 % lysozyme, 7 % NaCl với pH = 5.7, có phản ứng với lòng đỏ trứng gà [49], [50]

Bacillus thuringiensis không mẫn cảm đặc biệt với pH, pH tối ưu cho sự phát triển của Bacillus thuringiensis là pH = 7 Bacillus thuringiensis có khả năng oxy

hóa hydrocacbon đến acid hữu cơ và dioxit cacbon theo chu trình Embden – Meyerhoff – Panas [49], [50]

1.3 Độc tố của vi khuẩn Bacillus thuringiensis

Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, vi khuẩn Bacillus thuringiensis có khả năng sinh ra 3 loại độc tố diệt côn trùng chính là độc tố Cry (Crystal δ

endotoxin), Cyt (Cytolytic) và Vip (Vegetative Insecticidal Protein) Trong đó, độc

tố Cry và độc tố Cyt thuộc loại độc tố tinh thể Dựa vào tính tương đồng của trình tự acid min, các họ độc tố này lại được chia thành các lớp khác nhau Ngoài 3 họ độc

tố trên Bacillus thuringiensis còn sinh ra một số độc tố khác như hemolysin,

enterotoxin, chitinase, phospholipase…[19], [20], [24], [35]

1.3.1 Độc tố Cry

Đây là họ độc tố có tác dụng diệt côn trùng mạnh nhất, có bản chất là một protein trong đó các amino acid như glutamic acid , asparaginic, chiếm trên 20% tổng

số amino acid trong phân tử protein, đây cũng là một nguyên nhân làm cho nội độc tố

có điểm đẳng điện thấp Lượng cysteine nhỏ hơn 20% tổng số amino acid, quy định sự không hòa tan của tinh thể, ngoài ra còn có các amino acid: arginine, threonine, leucine, isoleucine Xét về thành phần hóa học thì độc tố tinh thể chứa chủ yếu các nguyên tố C, H, O, N, S Ngoài ra còn có Ca, Mg, Si, Fe và một lượng nhỏ Ni, Ti, Zn,

Al, Cu, Mn, nguyên tố P hầu như không có [38], [26], [31]

Độc tố Cry không hòa tan trong các dung môi hữu cơ, chỉ tan trong môi trường có pH kiềm cao, không tan trong nước, rất bền nhiệt Khi đun nóng ở 650C trong 1 giờ không bị mất hoạt tính, chỉ khi đun ở 1000C trong 30 – 40 phút thì protein tinh thể bị mất tính độc [38], [26], [31]

1.3.2 Độc tố Cyt

Độc tố Cyt có bản chất là protein và cũng hình thành tinh thể như độc tố Cry Tuy nhiên, tính tương đồng của trình tự amino acid giữa 2 nhóm độc tố Cry và Cyt hầu như không đáng kể Khi nghiên cứu 3 protein tinh thể: Cry3A, Cry1Aa và Cyt2A thấy rằng Cry3A và Cry1Aa có tới 36% amino acid tương đồng trong khi Cyt2A chỉ có độ tương đồng chưa đến 20% so với 2 độc tố Cry Điểm khác biệt lớn nữa giữa 2 nhóm độc tố thể hiện ở cấu trúc phân tử protein Trong khi các độc tố Cry có cấu trúc chung gồm 3 vùng, độc tố Cyt2A chỉ có 1 vùng đơn gồm có 2 chuỗi xoắn α, bao bên ngoài là một tấm β [26]

Độc tố Cyt đầu tiên được Waallwijk phát hiện năm 1985 là Cyt1Aa1 Hiện nay người ta đã phát hiện 40 độc tố Cyt thuộc 3 nhóm Cyt1, Cyt2 và Cyt3 Các độc

tố này có khối lượng phân tử khoảng 25- 30 kDa [42]

Độc tố Cyt được phát hiện chủ yếu ở các dưới loài B isralensis, morrisoni, medellin, terebrinois [41]

Hình 1.8 Cây phân loại của hai họ độc tố Cyt và Vip [42]

1.3.4 Cấu trúc của các nhóm độc tố tinh thể

Kết quả nghiên cứu của Hofte và Whiteley về trình tự amino acid tương đồng giữa các độc tố cho thấy có 5 “vùng” (block) amino acid bảo thủ có mặt ở hầu hết các độc tố Cry So sánh các đầu tận cùng C ở các trình tự với trên 1000 “residues” cho thấy còn có thêm 3 block nằm ngoài nhân độc (trung tâm hoạt động) của các độc tố [26], [31]

Cấu trúc không gian của protein tinh thể đã được làm sáng tỏ nhờ kỹ thuật nghiên cứu tinh thể bằng tia X với những nghiên cứu đầu tiên về cấu trúc Cry3A và Cry1Aa, sau đó được mở rộng cho các độc tố khác Các protein tinh thể có cấu trúc chung gồm 3 vùng (domain) riêng biệt:

Vùng I gồm 1 bó 7 chuỗi α, trong đó chuỗi α-5 nằm ở trung tâm được bao quanh bởi 6 chuỗi còn lại 6 chuỗi α này có tính lưỡng cực và đủ dài để bắc cầu xuyên qua lớp kị nước dầy 30 Å của màng kép và tạo nên kênh trên màng Để tạo

được lỗ rò xuyên qua màng tế bào, những chuỗi α bên ngoài phải biến đổi đảo ngược để mặt kị nước của nó tiếp xúc lớp màng photpholipid trong khi mặt ưa nước kết hợp với vùng II tạo ra một lỗ rò không có tính đặc hiệu Một số nghiên cứu gần đây phát hiện ra những vị trí amino acid rất quan trọng trong hoạt động của nội độc

tố Khi bị mất Glu-129, Arg-131, Asp-136 của chuỗi α-4 thì Cry1Aa không còn độc

tính với côn trùng, trong khi mất Arg-127 và Asn-138 thì độc tính không hề bị ảnh hưởng [19], [26], [31]

Vùng II gồm 3 tấm β đối song song quấn quanh một lõi kị nước Nhiều nghiên cứu cho rằng vùng II đóng vai trò quan trong trọng việc gắn kết với thụ thể

Có một sự tương đồng lớn giữa cấu trúc 3 tấm β này với 3 loại thụ thể glycoprotein

ở nhiều loài côn trùng (Amino peptidase N, Cadherin - like protein và Anionic glycoconjugates) Những kết quả trên đưa đến giả thuyết các móc (loop) của vùng II

có thể tham gia gắn vào các thụ thể khác nhau, tương tự như vị trí liên kết kháng nguyên - kháng thể [26], [30], [31]

Vùng III gồm 2 tấm β xoắn lại, nằm ở đầu C của phân tử độc tố, cấu trúc của

nó có thể bảo vệ độc tố Bacillus thuringiensis tránh khỏi sự phân giải quá mạnh của

protease ruột giữa côn trùng Vùng III có thể còn tham gia vào quá trình nhận diện thụ thể và điều khiển kênh ion Chức năng của vùng III còn đang được nghiên cứu thêm [26], [31], [38]

Nghiên cứu cho thấy, khi phân tử độc tố Cry1Ab chỉ có 2 vùng I, II thì vẫn

có khả năng gắn với thụ thể, nhưng chỉ là gắn thuận nghịch không bền vững, quá trình gắn bền vững, không thuận nghịch yêu cầu phải có sự chèn của vùng I vào màng biểu mô ruột giữa côn trùng [26]

Những nghiên cứu gần đây còn cho biết trình tự amino acid từ cuối vùng II đến đầu vùng III liên quan chặt chẽ đến tính gắn của tinh thể độc vào niêm mạc ruột côn trùng Khi trình tự này biến đổi làm mất đi tính gắn đó côn trùng có hiện tượng kháng thuốc Vì thế vùng II và III được coi là vùng quyết định đến tính kháng thuốc của côn trùng [26]

Hình 1.6 Các block bảo thủ có mặt ở các loại độc tố Cry [26]

Hình 1.7 Mô hình cấu trúc chung của độc tố Cry [26]

1.3.5 Cơ chế tác động của protein độc tố tinh thể

Cơ chế tác động của protein tinh thể là nguyên nhân tạo nên tính đặc hiệu

của Bacillus thuringiensis cũng như các chế phẩm từ Bacillus thuringiensis với côn

trùng đích Cơ chế tác động của các độc tố tinh thể có thể được chia thành 3 giai

đoạn: Quá trình hòa tan của tinh thể độc tố, quá trình hoạt hóa độc tố, cuối cùng là quá trình tạo kênh, lỗ rò trên màng ruột giữa của côn trùng [26], [31]

Quá trình hòa tan tinh thể độc tố: Khi côn trùng ăn phải tinh thể độc, tinh thể

sẽ được hoà tan nhờ pH kiềm cao trong môi trường ruột giữa Sự khác biệt về độ hòa tan đôi khi cũng giải thích sự khác biệt về độc tính giữa các loại tinh thể độc khác nhau Sự giảm độ hòa tan cũng có thể là một trong những cơ chế của hiện

tượng kháng thuốc Bacillus thuringiensis ở côn trùng [26], [31]

Quá trình hoạt hóa độc tố: sau khi hòa tan, nhiều độc tố phải được hoạt hóa bởi hệ enzyme protease của ruột giữa côn trùng để trở thành độc tố hoạt động Phần lớn protease ở côn trùng bộ Cánh vảy là dạng trypsin hoặc chymotrypsin Cũng có những dẫn chứng cho thấy DNA cũng có liên quan đến quá trình phân giải protein tinh thể [26], [29], [31]

Quá trình tạo kênh , tạo lỗ rò : Độc tố Cry ở dạng hoạt hóa có 2 chức năng chính là gắn với thụ thể và hoạt động tạo kênh ion

Quá trình gắn của độc tố với thụ thể đặc hiệu gồm có 2 bước: gắn thuận nghịch và không thuận nghịch Bước thứ 2 được cho là có liên quan đến sự gắn chặt của độc tố với thụ thể và sự chèn của độc tố vào màng ruột Các độc tố Cry có thể

có thụ thể đặc hiệu khác nhau Ở Manduea sexta, thụ thể của Cry1Ab là dạng

protein màng cadeherin có khối lượng phân tử khoảng 210 kDa, trong khi Cry1Ac

và Cry1C lại có thụ thể đặc hiệu là APN (aminopeptidase N) với khối lượng phân tử lần lượt là 120 kDa và 106 kDa [26], [31], [36]

Hình 1.5 Cơ chế tác động của protein tinh thể độc tố tới côn trùng đích [24]

Đặc điểm quan trọng nhất trong cơ chế tác động của độc tố lên côn trùng là

sự gắn kết của độc tố với thụ thể và hình thành lỗ rò (kênh ion) Độc tố Cry hoạt động như một kênh ion thực sự trên màng lipid kép và biểu mô ruột giữa côn trùng Trong môi trường kiềm của ruột giữa, độc tố có chức năng như kênh cation do lợi dụng graient K+ cao có sẵn Khi pH giảm do tế bào bị phá hủy, độc tố lại hoạt động như kênh anion, tiếp tục gây tổn thương mạnh cho các tế bào biểu mô Với một số lượng lớn, độc tố Cry có thể tạo những lỗ rò rất lớn làm cho phá hủy tế bào, gây thủng biểu mô ruột giữa côn trùng [26], [30], [31]

1.4 Gen mã hóa protein độc tố tinh thể

Năm 1982, Held và cs đã lần đầu tiên sử dụng chữ viết tắt cry từ chữ Crystal (tinh thể) để đặt tên các gen tổng hợp protein tinh thể diệt sâu Các chủng Bacillus thuringiensis sinh tổng hợp 3 dạng độc tố đó là: Độc tố Cry (dạng chủ yếu – tinh thể độc) được mã hóa bởi các gen cry, độc tố Cyt (độc tố phân huỷ tế bào) do gen cyt

mã hoá và độc tố Vip (vegetative insecticidal protein) do gen vip mã hoá tổng hợp Gen này không xếp vào họ gen cry vì không sinh tinh thể [11], [27]

1.4.1 Vị trí của các gen mã hóa độc tố của vi khuẩn Bacillus thuringiensis

Các gen mã hoá protein diệt côn trùng thường nằm trên các plasmid có hệ số copy thấp Tuy nhiên, cũng có những công bố về sự tồn tại của gen mã hoá protein

tinh thể diệt sâu trên nhiễm sắc thể ở một số dưới loài như: kustaki HD1 entomocidus, aizawai 7.92, dendrolimus và wuhanensis Những nghiên cứu của Carlton và Gonzalez trên 21 loài phụ Bacillus thuringiensis cho thấy các chủng

nghiên cứu có số plasmid dao động từ 2 đến 12 Các thí nghiệm lai gen đã cung cấp bằng chứng về sự tồn tại của các gen tổng hợp nhiều loại độc tố trong một tế bào

Bacillus thuringiensis như plasmid của Bacillus thuringiensis var aizawai và kurstaki HD1 có 5 gen mã hóa protein diệt côn trùng [18], [26], [27], [29]

Nhiều nhóm nghiên cứu đã tách dòng gen ICP (Insecticidal Crystal Protein) ở một số dưới loài Bacillus thuringiensis Năm 1981, Schnepf và Whiteley công bố đã tách dòng và biểu hiện gen cry từ Bacillus thuringiensis var kustaki HD1 trong chế phẩm Dipel có hoạt lực đối với ấu trùng Manduca sexta Hiện nay, đã có hơn 600 gen

đã được tách dòng và đăng kí trên ngân hàng dữ liệu gen (Gene Database) [29], [42]

1.4.2 Phân nhóm gen mã hóa độc tố

Hệ thống phân loại các gen cry đầu tiên của HÖfte và Whiteley được xây dựng dựa vào bộ côn trùng đích của độc tố mà gen mã hóa để xây dựng cây phân loại gồm có 4 nhóm chính

Nhóm gen cryI: mã hóa protein gây độc cho côn trùng bộ Cánh vảy

Nhóm gen cryII: mã hóa protein gây độc cho côn trùng bộ Hai cánh, Cánh vảy Nhóm gen cryIII: mã hóa protein gây độc cho côn trùng bộ Cánh cứng

Các gen cryIV: mã hóa protein gây độc cho côn trùng bộ Hai cánh

Những gen mã hóa nhiều loại protein mà không tác động đến những vật chủ

thông dụng trên được xếp vào nhóm cryV

Hệ thống phân loại này đơn giản, dễ sử dụng nhưng cũng bộc lộ hạn chế bởi có những gen rất gần nhau về mặt phân loại nhưng lại mã hóa độc tố diệt các côn trùng

thuộc các bộ khác nhau như gen cry1C mã hóa độc tố diệt côn trùng bộ Hai cánh và Cánh vảy trong khi protein cry1B lại gây độc với bộ Cánh cứng và Hai cánh [41]

Hệ thống phân loại mới do Crickmore và cs đề xuất có nhiều điểm đổi mới hiện được sử dụng rộng rãi So với hệ thống phân loại cũ, tên của các gen được giữ nguyên, chỉ thay thế chữ số La mã bằng số Ả rập [41]

Gen mã hóa protein tinh thể được chia thành các lớp khác nhau dựa vào tỷ lệ

amino acid tương đồng của protein mà chúng mã hóa Lớp 1 (cry, cry2, cry3,…) có

độ tương đồng dưới 45%, lớp 2 (cry1A, cry1B, cry1C…) có độ tương đồng từ 45% - 78%, lớp 3 (cry1Aa, cry1Ab, ) có tỷ lệ amino acid tương đồng khoảng 78% - 95%,

lớp 4 là các gen mã hóa độc tố tinh thể có độ tương đồng về amino acid lên tới 99% [20], [35], [41]

Cho tới nay, hơn 600 gen mã hóa cho tổng hợp độc tố Cry đã được đọc trình

tự và xếp vào trong 70 họ Gen cry được tách dòng mới nhất được cập nhật trên cơ

sở dữ liệu của Crickmore là gen cry56Aa23 (05/2012) [42]

Nhóm gen cry2:

Gồm 3 lớp phụ cry2A, cry2B, cry2C mã hóa cho các protein có trọng lượng phân

tử 70 kDa, thể vùi hình lập phương, protein cry2A không chỉ gây độc với H ivesens, L dispar, M sexta, T ni, P brassie thuộc bộ Cánh vảy mà còn gây độc với cả Aedes aegypti thuộc bộ Hai cánh Ngược lại protein Cry2B, Cry2C chỉ độc với ấu trùng bộ

Cánh vảy [43]

Nhóm gen cry3:

Nhóm này gồm cry3A, cry3B, cry3C, cry3D Trong đó, các gen cry3A, cry3B, cry3C mã hóa protein trọng lượng 73 kDa, tạo thành tinh thể hình tháp, riêng cry3D

tổng hợp protein trọng lượng 129 kDa và có tinh thể hình tháp Độc tố do cry3 tổng

hợp tác động lên ấu trùng bộ Cánh cứng [43]

Nhóm gen cry4:

Protein Cry4 có phổ tác dụng đặc trưng với côn trùng bộ Hai cánh Nhóm gen cry4 gồm 4 gen từ cry4A, cry4B, cry4C, cry4D tổng hợp protein riêng biệt có trọng lượng

phân tử lần lượt là 135 kDa, 128 kDa, 74 kDa, 72 kDa Những protein này cùng với

protein 27 kDa do gen CytA tổng hợp sinh ra phức hợp tinh thể hình trứng [27], [41]

khoa học quan tâm nghiên cứu [25], [45]

1.5 Tổng quan về dưới loài Bacillus thuringiensis subsp aizawai và gen cry1C

1.5.1 Một số đặc điểm của dưới loài Bta

Bacillus thuringiensis subsp aizawai là một trong số 82 dưới loài của vi khuẩn Bt, thuộc typ huyết thanh số 7 theo khóa phân loại của Bonnefoi và de Barjac,

1963 Trong số các chủng Bt phân lập ở Việt Nam có 15% số chủng là Bacillus thuringiensis subps aizawai [3], [6]

Bacillus thuringiensis subps aizawai hình thành tinh thể diệt sâu trong chu

kì phát triển ở pha ổn định Tinh thể có dạng hình lưỡng tháp và hình cầu nhỏ là chủ

yếu Dưới loài Bta mang gen mã hóa nhiều loại protein tinh thể của nhóm Cry1 như Cry1C, Cry1D, Cry1Aa, Cry1Ab Vì thế Bta là một trong những dưới loài được sử dụng phổ biến nhất trong các chế phẩm từ vi khuẩn Bt Bta có khả năng diệt nhiều loài sâu hại quan trọng như: sâu tơ (Plutella xylostella), sâu khoang (Spodoptera litura)

và sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) Bta vẫn có hiệu quả diệt sâu trên những vùng

đã có biểu hiện kháng độc tố của Bacillus thuringiensis subsp kurstaki [40]

Những nghiên cứu về an toàn sinh học về Bta và các chế phẩm từ Bta cho thấy các sản phẩm thương mại từ Bta không gây độc hay ảnh hưởng tới nhiều đối

tượng sinh vật như: chim, các động vật có xương sống ở nước…Cơ quan bảo vệ

môi trường Hoa Kỳ (UEPA) đã công nhận các sản phẩm từ Bta hiện đăng ký sản

xuất là loại thuốc sinh học an toàn để sử dụng trên tất cả các cây nông nghiệp như cây ăn quả, rau, ngô, bông, và cả những loài rau ăn sống [40]

Trên thị trường hiện nay, chế phẩm Xentari (Abbot), Novartis (Certa)

sản xuất từ Bacillus thuringiensis subsp aizawai được sử dụng rộng rãi và có

hoạt tính diệt các loại sâu hại quan trọng đã kháng lại thuốc trừ sâu hóa học

như: sâu tơ (Plutella xylostella), sâu khoang (Spodoptera litura) và sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) [20], [29]

1.5.2 Gen cry1C

Gen cry1C mã hóa protein tinh thể có khối lượng phân tử khoảng 130kDa Gen cry1C có kích thước khoảng 3kb trong đó đoạn bảo thủ mã hóa độc tố có kích

thước tương đối nhỏ khoảng 288 bp Cho đến thời điểm hiện tại đã có trên 16 gen

thuộc phân nhóm cry1C được tách dòng và công bố trên cơ sở dữ liệu của Crickmore, trong đó mới nhất là gen cry1CAa14 [42]

Nhóm gen cry1 nói chung và gen cry1C nói riêng là những gen được nhiều nhà nghiên cứu Bt trên thế giới và Việt Nam quan tâm Protein tinh thể do gen cry1C mã hóa có hoạt tính mạnh với rất nhiều loài côn trùng thuộc bộ Cánh vảy

Năm 2004, các tác giả Chen Yuehua, Li Hongxiu, Wang Jinhong, Cai Jun, Ren Gaixin của trường Đại học Nankai, Trung Quốc đã sử dụng cặp mồi đặc hiệu

1CaA/1CaB để khuếch đại toàn bộ gen cry1C từ Bacillus thuringiensis subsp colmeri

Sản phẩm PCR có kích thước khoảng 4.0 kb gồm toàn bộ khung đọc mở và vùng điều

hòa của gen cry1C Gen cry1C sau đó được biểu hiện trong loại vi khuẩn Bacillus cereus 9509, một loài lợi khuẩn Kết quả là vi khuẩn này đã sản sinh được protein tinh thể dạng lưỡng tháp có trọng lượng 60 kD có hoạt tính với Spodoptera exigua [23]

Năm 2005, Kao Suey-Sheng và các cs đã tiến hành sàng lọc, tách dòng, và

biểu hiện nhóm gen cry1 từ 855 chủng Bt được phân lập tại các vùng trồng lúa ở

Đài Loan Các tác giả đã sử dụng kỹ thuật PCR – RFLP để phát hiện những gen

mới thuộc nhóm cry 1 Kết quả cho thấy có tới 29 gen được phát hiện trong đó gồm: cry1Ac, cry1C, cry1Cb, [47]

Cũng trong năm 2005, nhóm tác giả Đài Loan Cheng Jen-Chieh, Hsieh

Feng-Chia, Liu Bing-Lan và Kao Suey-Sheng đã tách dòng riêng rẽ bốn gen cry (cry1Aa, cry1Ab, cry1C và cry1Da) từ sản phẩm thương mại Xentari (một chế phẩm

có sử dụng vi khuẩn Bacillus thuringiensis var aizawai) và biểu hiện trong Thuringiensis acrystalliferous B (Cry-B) [32]

Gen cry1C đã được nghiên cứu biểu hiện trên hệ thống vi khuẩn (Pseudomonas fluorescens) và thực vật bậc cao như cải bắp, súp lơ, thuốc lá, lúa Strizhow và cs đã tạo

ra những dòng thuốc lá và cỏ alfalfa chuyển gen cry1C Sự biểu hiện của protein cry1C

ở cây chuyển gen đã có hiệu quả bảo vệ trước sâu ăn lá bông Ai Cập (Spodoptera littoralost) và sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) [46]

Trong chương trình hợp tác giữa đại học Cornell của Mỹ và Viện Max –

Planck, Đức, Elizabeth Earle đã biểu hiện ở mức độ cao sự tổng hợp protein cry1C

ở cây súp lơ xanh chuyển gen Cây chuyển gen này kháng được sâu tơ, sâu đo, và sâu xanh bướm trắng [21], [22]

Theo một nghiên cứu mới từ Trung Quốc, Qifa Zhang đã tạo ra lúa chuyển

gen cry1C Cây lúa chuyển gen kháng được sâu cuốn lá lúa và sâu đục thân [48]

Tại Việt Nam, năm 2003, Ngô Đình Bính cùng các cs đã tách dòng và biểu

hiện thành công gen mã hóa protein cry1C diệt sâu khoang từ Bacillus thuringiensis subsp.aizawai phân lập từ mẫu đất ở Hà Tĩnh và Hà Nội Protein tái tổ hợp có hoạt

tính diệt sâu cao hơn so với các chủng đối chứng [4]

Qua các dữ liệu trên có thể thấy, các kết quả nghiên cứu về gen cry1C trên

thế giới là khá phong phú Trong khi đó, số lượng công trình nghiên cứu ở Việt Nam đã công bố có liên quan đến gen này vẫn còn tương đối hạn chế

1.6 Tổng quan về côn trùng thử nghiệm

1.6.1 Sâu tơ (Plutella xylostella)

Sâu tơ (còn gọi là sâu dù) Sâu có tên khoa học là Plutella xylostella Curtis, còn có tên khác là Plutella maculipennis Curtis, thuộc họ Yponomeutidae, bộ Lepidoptera (Cánh vảy)

Sâu tơ phát triển ở hầu hết các quốc gia trồng rau cải trên thế giới Sâu được ghi nhận là phá hoại trên rất nhiều loại rau cải khác nhau như cải bắp, cải bẹ xanh, cải

bẹ trắng, cải ngọt, cải bông, nhưng trầm trọng nhất là trên cải bắp, cải bông Ngoài ra, sâu còn gây hại trên một số loại cây họ Cà như khoai tây, cà chua [10]

Vòng đời của sâu kéo dài khoảng 21 – 40 ngày, gồm 3 giai đoạn:

Giai đoạn trưởng thành: Bướm dài từ 6-10 mm Sải cánh rộng từ 10-15 mm

Cánh trước màu nâu xám, trên có nhiều chấm nhỏ màu nâu; từ chân cánh ra đến cạnh ngoài của cánh trước có một dải hình răng cưa màu trắng trên bướm đực và màu vàng trên bướm cái, dải này gợn sóng, nhìn có cảm giác óng ánh và lấp lánh Thời gian sống của bướm từ 4 đến khoảng 17 ngày tùy giống cái hay đực và tùy điều kiện sống Một bướm cái có thể đẻ đến 200 trứng, trung bình 90 trứng Trứng hình bầu dục, dẹp, màu vàng nhạt, đường kính từ 0,3-0,5 mm Thời gian ủ trứng từ 3-8 ngày [10]

Giai đoạn sâu non: Sâu có 4 tuổi, phát triển từ 7-15 ngày tùy điều kiện thức

ăn và thời tiết Mình sâu nở to chính giữa, hai đầu nhọn, thân chia đốt rõ ràng, mỗi đốt có nhiều lông mọc thẳng đứng Sâu có ba cặp chân giả từ đốt bụng thứ năm Chi tiết ở từng giai đoạn tuổi như sau:

Tuổi 1: thân màu trắng đục, dài khoảng 0,8 mm Đến cuối tuổi này cơ thể sâu dài từ 1,2-1,5 mm Tuổi 1 phát triển từ 2-4 ngày

Tuổi 2: mình sâu bắt đầu chuyển sang màu hơi xanh nhưng vẫn còn đục Sâu dài từ 1,5-3,5 mm Ở tuổi 2 sâu phát triển trong thời gian từ 1-3 ngày

Tuổi 3: mình sâu màu xanh lục tươi, dài từ 3,5-5,5 mm và phát triển từ 1-3 ngày

Tuổi 4: sâu có màu xanh lục sậm hơn, kích thước cơ thể từ 5,5-9 mm, phát triển từ 1-4 ngày

Sâu tuổi 1 đục một lỗ nhỏ ở mặt dưới lá, ăn nhu mô lá, chỉ chừa lại biểu bì Sâu tuổi 2 gặm ăn mặt dưới lá để lại lớp biểu bì mặt trên lá tạo thành những đốm trong mờ Cuối tuổi 2 trở đi sâu gặm thủng lá Trên một cây cải bắp bị hại nặng có thể có từ 100-300 sâu [10]

Giai đoạn nhộng: Nhộng có màu vàng, nằm trong kén mỏng

Hình 1.9 Hình ảnh sâu tơ và (Plutella xylostella) thiệt hại do sâu tơ gây ra [10]

1.6.2 Sâu xanh da láng (Spodoptera exigua)

Sâu xanh da láng có tên khoa học là Spodoptera exigua Hubner, thuộc họ

Noctuidae (Ngài Đêm), Lepidoptera (bộ Cánh vảy) [10]

Ở Việt Nam, nhất là ở vùng đồng bằng sông Cửu Long, từ năm 1981 sâu là đối tượng gây hại chính trên đậu nành, đậu xanh, hành, ớt và một số loại hoa màu ngắn ngày khác

Vòng đời của sâu khoảng 30 đến 40 ngày, chia thành 3 giai đoạn:

Giai đoạn trưởng thành: Bướm thuộc loại bướm đêm, màu trắng xám,

chiều dài thân từ 7-10 mm, sải cánh rộng từ 20-25 mm Đầu màu xám, mang nhiều lông, hai mắt kép to, màu đen, râu đầu hình sợi chỉ, dài từ 5-6 mm Ngực màu nâu

đỏ, được phủ kín bởi một lớp phấn màu xám tro có ánh kim Cánh trước màu xám