Nghiên cứu một số biện pháp kỹ thuật nhân giống cây cỏ ngọt (stevia rebaudiana bertoni) bằng phương pháp giâm cành

31 4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ α-NAA ñến khả năng ra rễ, sự sinh trưởng phát triển và chất lượng của cành giâm cây cỏ ngọt giống M3..... 4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chế

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-

NGUYỄN THỊ HẢO

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ BIỆN PHÁP KỸ THUẬT

NHÂN GIỐNG CÂY CỎ NGỌT (Stevia rebaudiana Bertoni)

BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIÂM CÀNH

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-

NGUYỄN THỊ HẢO

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ BIỆN PHÁP KỸ THUẬT

NHÂN GIỐNG CÂY CỎ NGỌT (Stevia rebaudiana Bertoni)

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu khoa học do tôi trực tiếp thực hiện, dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Vũ Quang Sáng Số liệu và kết quả công bố trong luận văn là trung thực, chưa từng ñược công bố và sử dụng trong các luận văn, luận án và các công trình khoa học nào trước ñây

Tôi xin cam ñoan rằng, mọi sự trích dẫn và giúp ñỡ trong luận văn này ñã ñược thông tin ñầy ñủ, trích dẫn chi tiết và chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2012

TÁC GIẢ LUẬN VĂN

NGUYỄN THỊ HẢO

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ sự biết ơn tới các thầy cô giáo Viện Sau ñại học, Khoa Nông học – trường ðH Nông nghiệp Hà Nội ðặc biệt xin chân thành cảm ơn thầy giáo PGS.TS Vũ Quang Sáng, người ñã hết sức chỉ bảo, hướng dẫn và giúp

ñỡ tôi tận tình trong suốt thời gian thực hiện ñề tài và trong quá trình hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn những ý kiến ñóng góp, ñịnh hướng quý báu của các thầy cô bộ môn Sinh lý thực vật trong quá trình thực hiện ñề tài và hoàn chỉnh luận văn

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia ñình, bạn bè ñồng nghiệp ñã ñộng viên khích lệ và giúp ñỡ tôi hoàn thành luận văn này Một lần nữa cho phép tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ñến tất cả các thành viên với sự giúp

ñỡ này

Hà Nội, ngày tháng năm 2012

TÁC GIẢ LUẬN VĂN

NGUYỄN THỊ HẢO

MỤC LỤC

Lời cam ñoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục bảng vi

Danh mục hình viii

Danh mục các chữ viết tắt ix

1 MỞ ðẦU 1

1.1 ðặt vấn ñề 1

1.2 Mục ñíchvà yêu cầu của ñề tài 2

1.2.1 Mục ñích 2

1.2.2 Yêu cầu 2

1.3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 3

1.3.1 Ý nghĩa khoa học 3

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Cơ sở khoa học và cơ sở thực tiễn của một số biện pháp giâm cành 4

2.1.1 Cơ sở khoa học 4

2.1.2 Cơ sở thực tiễn 5

2.2 Giới thiệu chung về cây cỏ ngọt 6

2.2.1 Nguồn gốc, phân bố 6

2.2.2 Phân loại thực vật 7

2.2.3 ðặc ñiểm thực vật học 7

2.3 Giá trị của cây cỏ ngọt 8

2.3.1 Giá trị y học 8

2.3.2 Tính an toàn khi sử dụng cỏ ngọt 12

2.4 Tình hình sản xuất và tiêu thụ cây cỏ ngọt 14

2.4.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ cây cỏ ngọt tại Việt Nam 15

2.5 Tình hình nghiên cứu về phương pháp nhân giống vô tính bằng giâm cành 17

2.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 17

2.5.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 19

2.6 Cơ sở khoa học của sự hình thành rễ bất ñịnh dưới tác ñộng của auxin 21 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

3.1 Vật liệu nghiên cứu 23

3.1.1 ðối tượng nghiên cứu 23

3.1.2 Vật liệu nghiên cứu 23

3.1.3 Thời gian và ñịa ñiểm nghiên cứu 24

3.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 24

3.2.1 Nội dung nghiên cứu 24

3.2.2 Phương pháp nghiên cứu 24

3.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm và các chỉ tiêu theo dõi 27

3.3.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 27

3.3.2 Cách tiến hành thí nghiệm 27

3.3.3 Các chỉ tiêu theo dõi 28

3.3.4 Phương pháp và thời gian theo dõi 29

3.3.5 Phương pháp phân tích số liệu 30

4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 31

4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ α-NAA ñến khả năng ra rễ, sự sinh trưởng phát triển và chất lượng của cành giâm cây cỏ ngọt giống M3 31

4.1.1 Ảnh hưởng của nồng ñộ α-NAA ñến tỷ lệ tạo callus và hiện tượng thối của hom giâm 31

4.1.2 Ảnh hưởng của nồng ñộ α-NAA ñến quá trình ra rễ của hom giâm 33

4.1.3 Ảnh hưởng của nồng ñộ α-NAA ñến sự sinh trưởng phát triển của mầm 38

4.1.4 Ảnh hưởng của nồng ñộ α-NAA ñến tỷ lệ cây con xuất vườn 40

4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chế phẩm giâm chiết cành ñến khả năng ra rễ, sự sinh trưởng phát triển và chất lượng của cành giâm cây cỏ ngọt

giống M3 41

4.2.1 Ảnh hưởng của một số chế phẩm giâm chiết cành ñến tỷ lệ tạo callus và hiện tượng thối của hom giâm 42

4.2.2 Ảnh hưởng của một số chế phẩm giâm chiết cành ñến quá trình ra rễ của hom giâm 43

4.2.3 Ảnh hưởng của một số chế phẩm giâm chiết cành ñến sự sinh trưởng phát triển của mầm 48

4.2.4 Ảnh hưởng của các loại chế phẩm khác nhau ñến tỷ lệ cây con xuất vườn 50

4.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại giá thể ñến khả năng ra rễ, sự sinh trưởng phát triển và chất lượng của cành giâm cây cỏ ngọt giống M3 51

4.3.1 Ảnh hưởng của một số loại giá thể ñến tỷ lệ tạo callus và hiện tượng thối của hom giâm 52

4.3.2 Ảnh hưởng của một số loại giá thể ñến quá trình ra rễ của hom giâm 53

4.3.3 Ảnh hưởng của một số loại giá thể ñến quá trình sinh trưởng phát triển mầm của hom giâm cây cỏ ngọt 59

4.2.4 Ảnh hưởng của một số loại giá thể ñến tỷ lệ cây con xuất vườn 61

4.4 Nghiên cứu ảnh hưởng thời vụ giâm ñến khả năng ra rễ, sự sinh trưởng phát triển và chất lượng của cành giâm cây cỏ ngọt giống M3 62

4.4.1 Ảnh hưởng của thời vụ giâm ñến tỷ lệ tạo callus và hiện tượng thối của hom giâm 62

4.4.2 Ảnh hưởng của thời vụ giâm ñến quá trình ra rễ của hom giâm 64

4.4.3 Ảnh hưởng của thời vụ giâm ñến tỷ lệ cây con xuất vườn 69

5 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 71

5.1 Kết luận 71

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần các chất trong cây cỏ ngọt 9 Bảng 2.2 Diện tích, năng suất cỏ ngọt một số vùng trồng ở Việt Nam 16 Bảng 4.1 Ảnh hưởng của nồng ñộ α-NAA ñến tỷ lệ tạo callus và hiện tượng thối của hom giâm 32 Bảng 4.2 Ảnh hưởng của nồng ñộ α-NAA ñến tỷ lệ ra rễ của hom giâm 33 Bảng 4.3 Ảnh hưởng của nồng ñộ α-NAA ñến sự sinh trưởng phát triển bộ rễ của hom giâm cỏ ngọt 37 Bảng 4.4 Ảnh hưởng của nồng ñộ α-NAA ñến sự sinh trưởng phát triển của mầm giâm cây cỏ ngọt 39 Bảng 4.5 Ảnh hưởng của nồng ñộ α-NAA ñến tỷ lệ cây con xuất vườn 40 Bảng 4.6 Tỷ lệ tạo callus và hiện tượng thối của hom giâm sau khi xử lý các loại chế phẩm khác nhau 42 Bảng 4.7 Ảnh hưởng của một số chế phẩm giâm chiết cành ñến tỷ lệ ra rễ của hom giâm 43 Bảng 4.8 Ảnh hưởng của một số chế phẩm ñến sự sinh trưởng phát triển bộ

rễ của hom giâm 45 Bảng 4.9 Ảnh hưởng của một số chế phẩm giâm chiết cành ñến sự sinh trưởng phát triển của mầm 49 Bảng 4.10 Ảnh hưởng của các loại chế phẩm khác nhau ñến tỷ lệ cây con xuất vườn 50 Bảng 4.11 Tỷ lệ tạo callus và hiện tượng thối của hom giâm ở các loại giá thể khác nhau 52 Bảng 4.12 Ảnh hưởng của một số loại giá thể ñến tỷ lệ ra rễ của hom giâm cỏ

ngọt giống M3 53

Bảng 4.13 Ảnh hưởng của một số loại giá thể ñến sự sinh trưởng phát triển bộ

rễ của hom giâm cỏ ngọt 58

Bảng 4.14 Ảnh hưởng của một số loại giá thể ñến sự sinh trưởng phát triển của mầm giâm cây cỏ ngọt 60 Bảng 4.15 Ảnh hưởng của giá thể khác nhau ñến tỷ lệ cây con xuất vườn 61 Bảng 4.16 Tỷ lệ tạo callus và hiện tượng thối của hom giâm ở các thời vụ giâm khác nhau 63 Bảng 4.17 Ảnh hưởng của thời vụ giâm ñến tỷ lệ ra rễ của hom giâm 65 Bảng 4.18 Ảnh hưởng của thời vụ giâm ñến sự sinh trưởng phát triển bộ rễ của hom giâm cỏ ngọt 66 Bảng 4.19 Ảnh hưởng của thời vụ giâm ñến sự sinh trưởng phát triển mầm của hom giâm cỏ ngọt 68 Bảng 4.20 Ảnh hưởng của các loại chế phẩm khác nhau ñến tỷ lệ cây con xuất vườn 70

DANH MỤC HÌNH

Hình 4.1 Ảnh hưởng của nồng ñộ α-NAA ñến tốc ñộ ra rễ của hom giâm cỏ ngọt ở các giai ñoạn khác nhau 36 Hình 4.2 Ảnh hưởng của nồng ñộ α-NAA ñến tốc tăng trưởng chiều dài rễ của hom giâm cỏ ngọt ở các giai ñoạn khác nhau 36 Hình 4.3 Tỷ lệ cây con xuất vườn ở các công thức xử lý nồng ñộ α-NAA 41 khác nhau 41 Hình 4.4 Ảnh hưởng của các loại chế phẩm ñến tốc ñộ ra rễ của hom giâm cỏ ngọt ở các giai ñoạn khác nhau 47 Hình 4.5 Ảnh hưởng của một số chế phẩm ñến tốc ñộ tăng trưởng chiều dài rễ của hom cỏ ngọt ở các giai ñoạn khác nhau 47 Hình 4.6 Tỷ lệ cây con xuất vườn ở các công thức xử lý các loại chế phẩm khác nhau 51 Hình 4.7 Ảnh hưởng của một số loại giá thể ñến tốc ñộ ra rễ của hom giâm cỏ ngọt ở các giai ñoạn khác nhau 56 Hình 4.8 Ảnh hưởng của một số loại giá thể ñến tốc tăng trưởng chiều dài rễ của hom giâm cỏ ngọt ở các giai ñoạn khác nhau 56 Hình 4.9 Tỷ lệ cây con xuất vườn ở các công thức sử dụng các loại giá thể khác nhau 62 Hình 4.10 Tỷ lệ cây con xuất vườn ở các thời vụ giâm khác nhau 70

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

α -NAA : 1-Naphthaleneaxetic axit

Reb A : Ribaudioside A

1 MỞ đẦU

1.1 đặt vấn ựề

Cây cỏ ngọt (Stevia rebaudiana Bertoni) còn ựược gọi là cây Cỏ

ựường, Cỏ mật hay Cúc ngọt, có thân mảnh, khi nhấm thấy có vị ngọt rất ựậm Cây này có nguồn gốc từ Paraguay và các vùng núi Tây Nam của lục ựịa

Mỹ Latin Ở quê hương của nó, loại cỏ này ựược gọi là Caá-êhê, Azucá-caá hay Kaá-hê-e, có nghĩa là cỏ có vị ngọt [19]

Cỏ ngọt ựược dùng rộng rãi từ lâu ở Nam Mỹ Tại Nhật, Hàn Quốc, đài Loan, loại cỏ này ựược dùng làm thực phẩm từ khoảng 40 năm nay Ở Việt Nam, cỏ ngọt bắt ựầu ựược trồng và sử dụng từ cuối những năm 1980 [32] Trên thế giới, cỏ ngọt ựược sử dụng nhiều trong công nghệ thực phẩm, các chế phẩm chiết xuất từ lá cây cỏ ngọt ựược xem như một loại ựường có nguồn gốc thiên nhiên có thể dùng thay thế ựường mắa, củ cải ựường và ựường hoá học Chất steviosid, có trong lá cỏ ngọt là một loại ựường không có nitơ, với hàm lượng 3-10% trong lá khô, ựộ ngọt gấp 150-300 lần ựường mắa Hiện nay, chất tạo vị ngọt steviosid ựược sử dụng trong kẹo chewing gum, bánh trái, cafe và trong các loại nước ngọt như Coca Cola, pepsi đường steviosid không tạo calorie nên rất thắch hợp ựể làm giảm cân Thực phẩm có chứa ựường chiết xuất từ cây cỏ ngọt là sự lựa chọn hoàn hảo cho những người bị bệnh béo phì tiểu ựường và cao huyết áp [18][23]

Ngoài ra khoa học ựã chứng minh cây cỏ ngọt còn có khả năng làm giảm nhu cầu chất ựường và chất bột của người bệnh và cung cấp năng lượng cho cơ thể ở mức thấp, không gây tác dụng phụ và không ựộc hại Cỏ ngọt không làm bợn răng, không gây sâu răng, bảo vệ vệ sinh răng miệng, và cũng giúp vào việc làm lành càc vết thương ngoài da Bổ tim, lợi tiểu, làm giảm áp huyết ở những người cao huyết áp và ựặc biệt nhất là ựối với những người bị bệnh tiểu ựường, nó trợ giúp tụy tạng trong việc tiết chất insulin Do ựó, các

lương y khuyên những người mắc bệnh tiểu ựường, béo phì, tăng cholesterol trong máu và người cao tuổi nên dùng cỏ ngọt hoặc steviosid [27][28]

Ngày nay, cây Cỏ ngọt ựược thấy trồng tại rất nhiều quốc gia như: Brazil, Argentina, Paraguay, Mexico, Nhật bản, Trung Quốc, đài Loan, đại Hàn, Thái Lan, Việt Nam, Israel, và Hoa Kỳ Riêng Canada, cây Stevia cũng ựược thấy trồng ở các tỉnh bang Alberta, British Columbia, Ontario và Quebec Bộ Canh Nông và Thực phẩm Canada cũng có trồng thắ nghiệm loại thảo mộc này tại nông trại thực nghiệm Delhi (Ontario) Trung Quốc là quốc gia có diện tắch trồng cỏ ngọt lớn nhất thế giới với diện tắch trồng lên tới 300.000 ha [22] Ở Việt Nam, hiện nay cỏ ngọt ựược trồng nhiều nơi như: Hưng Yên, Hòa Bình, Bắc Giang, Nghệ An, Lâm đồngẦ và cho hiệu quả kinh tế khá cao [32]

Như vậy có thể thấy cây cỏ ngọt ựang ngày càng ựược trồng và sử dụng rộng rãi trên thế giới cũng như ở Việt Nam Chắnh vì vậy nhu cầu về cây giống cỏ ngọt là rất lớn, tuy nhiên hiện nay lượng cây giống sản xuất ra vẫn chưa ựáp ứng ựủ nhu cầu sản xuất Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn trên chúng

tôi tiến hành thực hiện ựề tài: ỘNghiên cứu một số biện pháp kỹ thuật nhân

giống cây cỏ ngọt (Stevia rebaudiana Bertoni) bằng phương pháp giâm cànhỢ Nhằm góp phần bổ sung, hoàn thiện các quy trình nhân nhanh giống

cây cỏ ngọt với số lượng lớn và nâng cao chất lượng cây con xuất vườn

1.2 Mục ựắchvà yêu cầu của ựề tài

1.2.1 Mục ựắch

- Xác ựịnh ựược thời vụ, giá thể và chế phẩm ra rễ thắch hợp cho sự ra

rễ, sinh trưởng, chất lượng của cành giâm nhằm góp phần xây dựng quy trình giâm cành cây cỏ ngọt, cung cấp cây giống có chất lượng cao cho sản xuất

1.2.2 Yêu cầu

- Xác ựịnh nồng ựộ α-NAA thắch hợp cho sự hình thành rễ và sinh

- Xác ñịnh ñược loại chế phẩm ra rễ có hiệu quả cao nhất ñể giâm cành

- Xác ñịnh ñược loại giá thể thích hợp cho việc giâm cành cây cỏ ngọt

- Xác ñịnh thời vụ tốt nhất ñể giâm mầm cây cỏ ngọt giống Morita 3

1.3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

1.3.1 Ý nghĩa khoa học

- Kết quả nghiên cứu của ñề tài sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học về ảnh hưởng của thời vụ, loại giá thể, nồng ñộ α-NAA và loại chế phẩm ra rễ phù hợp cho sự ra rễ và sinh trưởng phát triển của cành giâm cây cỏ ngọt

- Kết quả nghiên cứu của ñề tài có thể sử dụng làm tài liệu tham khảo cho việc nghiên cứu trong nhân giống cây vô tính cỏ ngọt bằng kỹ thuật giâm cành

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn

- Kết quả nghiên cứu của ñề tài góp phần vào việc xây dựng quy trình nhân giống vô tính cây cỏ ngọt bằng kỹ thuật giâm cành ñể tạo cây giống có chất lượng phục vụ nhu cầu sản xuất ngày càng tăng tại Việt Nam

- Các kết quả nghiên cứu cũng giúp cán bộ kỹ thuật và người sản xuất lựa chọn ñược biện pháp kỹ thuật thích hợp ñể nâng cao hiệu quả trong nhân giống bằng giâm cành cây cỏ ngọt

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Cơ sở khoa học và cơ sở thực tiễn của một số biện pháp giâm cành

2.1.1 Cơ sở khoa học

Tất cả các loại thực vật ñều có ñặc tính tái sinh, ñó là khi tách rời một

cơ quan bộ phân nào ñó của cây ra khỏi cây mẹ thì lúc ñó trạng thái nguyên vẹn của cây bị vi phạm, nhờ có ñặc tính tái sinh mà cây có khả năng phục hồi trạng thái nguyên vẹn của mình Trong biện pháp nhân giống vô tính ở cây trồng thì khả năng ra rễ bất ñịnh của cành giâm, cành chiết hoặc liền vết ghép ñều dựa vào ñặc tính tái sinh ñể ñảm bảo tính nguyên vẹn của cây [8]

Sự hình thành rễ bất ñịnh là quá trình phản phân hóa của tế bào tiền tượng tầng và quá trình tái phân hóa ñể hình thành rễ bất ñịnh Nói một cách

cụ thể là các tế bào ở bề mặt vết cắt vốn ñã ngừng phân chia nhưng do bị tổn thương gây kích thích nên bắt ñầu phân chia trở lại, cùng với sự biến ñổi của các tế bào tiền tượng tầng và các tế bào nhu mô ở cạnh, mô sẹo ñược hình thành Sự hình thành mô sẹo ở cành non và bánh tẻ thường mạnh hơn ở cành già Mô sẹo lúc ñầu là một khối tế bào nhu mô (vách mỏng) sau ñó phân hóa thành mô dẫn, tượng tầng và hình thành ñiểm sinh trưởng, từ ñiểm sinh trưởng phát sinh ra rễ bất ñịnh

Các nghiên cứu của Vanderlek (1925), Bouilenne, Went (1933), Laibach (1935) ñều cho rằng sự phát sinh rễ trên mô sẹo ñược kích thích bởi các chất ñiều tiết sinh trưởng Các chất này ñều chứa trong lá mầm Chúng có tác dụng làm hoạt hóa khả năng ra rễ tiềm ẩn trong mô tế bào

Kết quả nghiên cứu của Turenxkaia (dẫn theo Lâm Thị Bích Huệ, 2001) cho biết dưới tác dụng của heteroauxin ñường trong lá ñược vận chuyển về phía gốc Ông cho rằng các chất kích thích sinh trưởng có thể tăng cường hình thành rễ là do sự nâng cao quá trình trao ñổi chất và tăng cường vận chuyển các chất dễ hòa tan hướng về phía gốc cành giâm

Sự tái sinh rễ bất ựịnh của cành giâm phụ thuộc vào các chất kắch thắch sinh trưởng và các chất dinh dưỡng có trong cành giâm, cũng có nghĩa nó phụ thuộc vào từng giống, tình trạng sinh trưởng của cây giống, chất lượng cành giâm (hom giâm) Nhưng ựể giâm cành thành công thì cần phải có ựiều kiện ngoại cảnh thuận lợi, kết hợp với các thao tác kỹ thuật hợp lý trong từng ựiều kiện cụ thể [1]

2.1.2 Cơ sở thực tiễn

Những kết quả nghiên cứu trước về thuật giâm cành ựã chỉ ra rằng: mỗi loài cây, giống cây trồng có yêu cầu rất khác nhau về biện pháp kỹ thuật cũng như ựiều kiện ngoại cảnh tác ựộng Nó ảnh hưởng rất lớn ựến quá trình hình thành rễ và sinh trưởng phát triển cũng như chất lượng của cành giâm

Các nghiên cứu về phương thức nhân giống Cỏ ngọt cho thấy rằng nhân giống vô tắnh bằng phương pháp giâm cành là thắch hợp nhất trong ựiều kiện sản xuất ở Việt Nam Nghiên cứu của Trần đình Long và cộng sự chỉ ra rằng:

- Cành Cỏ ngọt ựược sử dụng ựể nhân giống nên lấy ở cây mẹ từ 4 tháng ựến 1 năm tuổi là tốt nhất

- Giâm trên môi trường cát, ựất và bùn ao cho tỷ lệ ra rễ sớm nhất và cao nhất Tuy nhiên, giâm trên môi trường cát sẽ thuận lợi cho nhân giống ựại trà và cho hiệu quả kinh tế cao hơn Giâm trên ựất và bùn ao cho cây con cứng cáp, bộ rễ phát triển mạnh nhưng chi phắ cao và tốn nhiều công trong quá trình nhổ cây con ựồng thời gây bất tiện khi phải vận chuyển ựi xa Trong những thời gian nóng bức, nhiệt ựộ, ựộ ẩm không khắ cao, giâm trên bùn ao cho tỷ lệ cây sống cao và chất lượng cây giống khỏe (Trần đình Long và CS,1996) [4]

- đối với việc sử dụng chất ựiều hòa sinh trưởng, α-NAA là có hiệu lực cao nhất trong việc kắch thắch ra rễ cành giâm và thời gian ra rễ ngắn nhất Nồng ựộ α-NAA thắch hợp nhất cho cây ra rễ là 30 - 50ppm (trong ựiều kiện

nhân giống vào mùa hè) và từ 150 - 200 ppm (trong ựiều kiện nhân giống vào mùa ựông giá rét) (Trần đình Long và CS,1996) [4]

Hiện nay, cỏ ngọt là cây trồng ựem lại hiệu quả kinh tế rất cao cho người trồng Tuy nhiên lượng giống sản xuất ra vẫn chưa ựáp ứng ựủ nhu cầu, ựặc biệt ựối với các giống mới nhập từ nước ngoài cho năng suất và tỷ lệ ựường cao như M3 chưa ựược ựầu tư nghiên cứu biện pháp kỹ thuật ựể nhân giống hiệu quả Do vậy, nghiên cứu các biện pháp giâm cành cỏ ngọt là rất cần thiết có ý nghĩa thực tiễn cao

2.2 Giới thiệu chung về cây cỏ ngọt

2.2.1 Nguồn gốc, phân bố

Cỏ ngọt (Stevia rebaudiana Bertoni) còn ựược gọi là cây cỏ ựường, cỏ

mật, trạch lan hay cúc ngọt, có nguồn gốc ở thung lũng Rio Monday nằm về phắa ựông bắc của xứ Panama giữa Paraguay và Brasil Ở quê hương của nó, loại cỏ này ựược gọi là Caá-êhê, Azucá-caá hay Kaá-hê-e, có nghĩa là cỏ có vị

ngọt (theo thông tin KHCN 4/1995) Vào thế kỷ XVI, các thủy thủ Tây Ban

Nha ựã từng ựề cập ựến sự hiện diện của loại thảo mộc này và O Rebaudi là người ựầu tiên ựặt tên: Eupatorium rebaudianum cho nó Năm 1899, M.C Bertoni một nhà thảo mộc người Paraguay, xác ựịnh nó là cây thuộc chi

Stevia, họ Cúc Asteraceae đến năm 1905 ông ựã miêu tả rành mạch về

nguồn gốc xuất xứ, ựặc ựiểm hình thái, phân loại thực vật của cây cỏ ngọt và

chắnh thức ựặt tên nó là Stevia Rebaudiana Bertoni Từ khi ựược biết ựến loại

cây này ựã thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới, ựến năm

1915, R Robert tìm ra ựược trong cỏ một chất hóa học ựặc trưng và ông gọi tên nó là Eupatorin Sau ựó Bertoni ựề nghị sửa tên Eupatorin thành Estevina hay Stevin Liên hiệp Quốc tế Hóa học họp ở Copenhague năm 1924 chỉ ựịnh

tên Steviosid cho chất này [19][31]

Cỏ ngọt xuất hiện ựầu tiên ở thung lũng Rio Monday của lục ựịa Nam

bố nhiều nơi trên khắp thế giới như: Brasil, Argentina, Paraguay, Mexico,

Mỹ, Canada, Israel, Nhật Bản, Trung Quốc, đài Loan, Hàn Quốc, Thái Lan, Việt NamẦ đặc biệt cây cỏ ngọt phát triển với diện tắch lớn ở các quốc gia: Canada và Trung Quốc [34][5]

tự nhiên phân nhánh mạnh Hệ rễ của cây cỏ ngọt có thể ăn lan rộng với

ựường kắnh tới 40 cm (Trần và đình Long CS) [4]

* Lá

Lá mọc ựối từng cặp hình thập tự, mép lá có từ 12-16 răng cưa Lá có hình

ô van, trứng ngược hơi thuôn dài Lá trưởng thành dài khoảng 50-70 mm, rộng

15-25 mm, có 3 gân song song và các gân phụ phân nhánh Cây con gieo từ hạt có 2 lá mầm hình tròn, ựến cặp lá thứ 4 mới xuất hiện răng cưa, lá có màu xanh nhạt hoặc xanh ựậm phụ thuộc vào các giống khác nhau (Trần đình Long và CS) [4][10]

* Hoa

Hoa lưỡng tắnh Hoa có hình dạng ựặc trưng của họ Asteraceae gồm

4-7 hoa ựơn họp dày trên 1 ựế hoa Mỗi hoa ựơn hình ống có cấu trúc gồm 1 ựế tròn, với 5 dải màu xanh, 5 cánh tràng màu trắng dài khoảng 5 mm, các lá bắc tiêu giảm thành sợi ựể dễ phát tán, nhị 4 - 5 dắnh trên tràng có màu vàng sáng, các chỉ nhị rời còn bao phấn dắnh mép với nhau, ựắnh gốc và kéo dài lên phắa trên bởi một phần của trung ựới Bầu hạ 1 ô, 1 noãn, vòi nhụy mảnh chẻ ựôi, các nhánh hình chỉ cao hơn bao phấn, do ựó khả năng tự thụ phấn thấp hoặc hầu như không có (Trần đình Long và CS) [4]

* Quả, hạt

Quả cỏ ngọt nhỏ, thuộc loại quả bế, khi chắn màu nâu thẫm, dài từ 2 - 2,5 mm Hạt có 2 vỏ hạt, có phôi nhưng nội nhũ rất ắt nên tỷ lệ nảy mầm thấp, hạt dễ mất sức nẩy mầm khi bảo quản Khối lượng 1000 hạt khoảng 0,35 - 0,4g Cây con gieo từ hạt có khả năng sinh trưởng phát triển chậm (Trần đình Long và CS) [4][10]

2.3 Giá trị của cây cỏ ngọt

2.3.1 Giá trị y học

a) Thành phần hóa học

Cây cỏ ngọt có hàm lương các chất rất phong phú và ựa dạng, bao gồm: Carbohydrates, Protein, Lypid, Stevioside, các chất hòa tan trong nướcẦ Hàm lượng các chất trong cây cỏ ngọt cụ thể như sau:

Tiếp tục nghiên cứu, khi sử dụng phương pháp sắc kí bản mỏng, sắc ký khí, sắc ký lỏng cao áp, người ta thu ñược 11 chất chủ yếu là các chất có ñộ ngọt và ñiểm nóng chảy khác nhau, nhưng chủ yếu gồm bốn chất chính: Stevioside (5-10 %), rebaudioside A (2- 4 %), rebaudioside C (1-2 %), và dulcoside A (0.5 – 1 %) Hai loại phụ là rebaudioside D và E ñể tạo nên ñộ ngọt trong lá cây cỏ ngọt [17].

(1)Stevioside (Steviolglycosides)

Công thức hoá học: C38H60O18

Khi thuỷ phân một phân tử Stevioside sẽ cho 3 phân tử Steviol và Isosteviol Stevioside là tinh thể hình kim, có ñiểm nóng chảy từ 202 - 2040C, 1gr tan trong 800ml nước, ít tan trong cồn ðộ ngọt gấp 300 lần ñường

Saccarose, ñặc biệt là không không chứa nitơ, không tạo calorie và rất ổn ñịnh

ở nhiệt ñộ cao 198oC (388oF ) Chứa trong cây với tỷ lệ 5 - 10% [17]

Bảng 2.2 Cấu trúc các chất ngọt trong cây cỏ ngọt

ðộ ngọt so với ñường mía

ðường Reb A là chất kết tinh không màu có ñộ nóng chảy từ 242 -

244oC ðường này có ñộ ngọt rất cao bằng 250 - 400 lần ñường Saccarose Hàm lượng: 2 - 4% trọng lượng chất khô Reb A là chất có vị ngon nhất, ñộ tinh khiết cao nhất và ngọt nhất với yêu cầu cầu kỹ thuật cao như: ổn ñịnh với nhiệt ñộ và pH [20]

(3)Rebaudioside C (Dulcoside – B)

Công thức hoá học: C44H70O23.3H2O

Nó ngọt gấp 120 - 500 lần Saccarose, ñộ nóng chảy từ 235 - 238oC Hàm lượng: 1 - 2% trọng lượng chất khô

Các nhà nghiên cứu còn xác ñịnh ñược trong cỏ ngọt còn có nhiều chất khác: gồm 3 sterol, 8 flavonoit, 2 chất dễ bay hơi Các kim loại có trong cỏ ngọt theo thứ tự nhiều ñến ít như sau: Ca, Mg, Fe, Mn, Sr, Cu, Cr, Cd (Brandle, J E and Rosa, N, 1992, 72, 1263–1266) là những kim loại cần cho hoạt ñộng sống của con người [9]

* Tính vị, công năng

Toàn thân có vị ngọt, chất ngọt tập trung nhiều nhất ở lá Người ta sử dụng bột lá cỏ ngọt khô ñể làm chất ñiều vị ngọt cho trà túi lọc, trà thuốc, hoặc chiết xuất tinh thể steviosid dùng cho các nhu cầu trong ñời sống Cỏ ngọt ñược dùng như một loại trà dành cho những người bị bệnh tiểu ñường, béo phì hoặc cao huyết áp Một thí nghiệm ñược tiến hành trên 40 bệnh nhân cao huyết áp ñộ tuổi 50, cho thấy, loại trà này có tác dụng lợi tiểu, người bệnh thấy dễ chịu, ít ñau ñầu, huyết áp tương ñối ổn ñịnh [7][32]

* Tác dụng dược lý

Một số nghiên cứu ñã kết luận: trong lá cỏ ngọt hai chất kháng sinh,

chúng có tác dụng lên Pseudomonas aeruginosa và Proteus vulgaris Phần chiết stevia có tính chất ức chế rotavirus, chống vi khuẩn Helicobacter pylori

nên ñược ñề nghị ñem dùng trị u khối Những flavonoid trong cây (4,57 %) có

tính chất chống những vi khuẩn Bacillus subtilus, Staphylococcus aureus,

Escherichia coli [25]

Cỏ ngọt ñã ñược dùng ñể khử dioxin trong ñất Ngoài ra, lá và cành có tính chất chống histamin nên có thể dùng ñể hạn chế các triệu chứng như ngứa ngáy, ñau ñớn Lá, cành và rễ cây stevia ñược trộn lẫn với nhau làm sợi dệt áo quần, khăn bàn, mùng màn,… và giấy chống vi khuẩn [6]

Thử trên thỏ và chuột cống trắng cho thấy cao nước lá cỏ ngọt có tác dụng làm hạ ñường huyết ở thỏ với một chế ñộ ăn giàu hydrat cacbon Một nghiên cứu khác cũng trên chuột cống trắng, cho một chế ñộ ăn có 0,1 – 0,5 steviosid trong thời gian 30 - 56 ngày, kết quả cũng không thấy thay ñổi có ý nghĩa về mức glucose – huyết Thử nghiệm lâm sàng ở Paraguay (1970) trên những bệnh nhân ñái tháo ñường thấy trung bình mức glucose giảm 35% Một thử nghiệm khác ở Braxin (19810 với liều mỗi lần 0,25g steviosid, ngày 4 lần cũng làm ñường huyết giảm rõ rệt (Thamolwan, S and C Narongsak, 1997) [24] Chất steviosid trong cỏ ngọt có tiềm năng làm chất dịu vị, trong ñó có steviosid là chất chống nội tiết tố (phụ nữ Mỹ sử dụng cỏ này như thuốc tránh thai) [9]

Steviosid có tác dụng giãn mạch toàn thân rõ rệt (ðỗ Huy Bích và cs, 2004) [2]

ðộc tính cấp: cho chuột cống uống steviosid với liều lượng 2g/1kg không thấy có chuột chết và cũng không thấy biểu hiện ñộc sau 2 tuần theo dõi (Toyoda, K và cs,1997) [26]

ðộc tính bán cấp: cho chuột cống trắng ăn liều hàng ngày 0,5g/kg trong

56 ngày Các thông số theo dõi gồm cân nặng, các chỉ tiêu huyết học, các chỉ tiêu hóa sinh và xét nghiệm tổ chức học gan ñều bình thường (Toyoda, K và cs,1997) [26]

2.3.2 Tính an toàn khi sử dụng cỏ ngọt

Ngày 14/4/2010 vừa qua, Cơ quan an toàn thực thẩm châu Âu ñưa ra kết luận, theo ñó, liều dùng an toàn của các chất ngọt chiết xuất từ cây stevia là 4mg trên 1 kilogramme trọng lượng cơ thể (tức là 1 người 50kg sẽ ñược sử dụng 200mg/ngày) [35]

ða số các nghiên cứu khoa học xung quanh Cỏ ngọt và chất chiết xuất

từ Cỏ ngọt là rebaudioside có liên quan ñến tính an toàn của nó Một nghiên

chất (tháng 7 năm 2008, Vol 46, bổ sung 1, trang S1-S92), thấy rằng rebiana - Rebaudioside ñộ tinh khiết cao từ Cỏ ngọt - an toàn ñể sử dụng như một chất làm ngọt cho thực phẩm và ñồ uống [34]

Các nghiên cứu bổ sung trên các tạp chí của các nhà khoa học từ Cola, Cargill, và một nghiên cứu ñộc lập về ñộc chất nói rằng các nghiên cứu ñã tìm thấy thành phần ñáp ứng tất cả JEFCA (Joint FAO/WHO Uỷ ban chuyên gia

Coca-về phụ gia thực phẩm) thông số kỹ thuật cho glycosides steviol [34]

Trước ñó, tháng 8/2008, một ủy ban hỗn hợp của Tổ chức lương thực

và Tổ chức y tế thế giới ñã công bố kết luận khoa học về tính vô hại của các chất gây ngọt bao gồm rebaudiosid A và các chất ngọt khác chiết xuất từ cây

Cỏ ngọt Các chất này không chứa các yếu tố gây ung thư, không làm hại gen, không có ảnh hưởng ñến hệ sinh sản hay tăng trưởng của người

Tháng 12/2008 FDA Hoa Kỳ kết luận rằng rebiana (Reb A) ở ñộ tinh khiết 95% trở lên, có GRAS (nói chung ñược công nhận là an toàn) và công nhận nó như một chất làm ngọt mục ñích chung cho thực phẩm và ñồ uống, không chỉ là một bổ sung ðiều này ñã làm dấy lên một làn sóng sử dụng chất ngọt tự nhiên trên toàn thế giới Hiện nay Stevioside là sự lựa chọn ñầu tiên làm chất ngọt trong công nghệ thực phẩm và ñồ uống ở thị trường Mỹ

Tiếp ñó, vào tháng 11 năm 2009, cơ quan an toàn thực phẩm của Pháp ñã

cho phép sử dụng rebaudiosid A (RA) như một thành phần thực phẩm Một quy

ñịnh khác vào ñầu tháng 1 năm 2010 của chính phủ Pháp tiếp tục cho phép sử dụng rebaudiosid A với hàm lượng cao hơn Quy ñịnh này có giá trị trong hai năm, trong khi chờ ñợi quyết ñịnh của các cơ quan châu Âu có thẩm quyền Ngay lập tức, tại Bretagne, tháng hai vừa qua công ty Phare Ouest ñã ñưa vào thị trường sản phẩm nước giải khát Breizh Cola với ñường làm từ stévia Tuy nhiên,

việc sử dụng lá cây stevia khô ñể cho vào các ñồ uống vẫn bị cấm tại Pháp [35]

Tại Hoa Kỳ và châu Âu, việc sử dụng cây stevia ñã bị cấm trong một thời gian dài Hơn mười năm trước (1999), vì không ñủ các dữ kiện chứng

minh tắnh vô hại của chúng, Ủy ban châu Âu ựã từ chối cho phép sử dụng cây

và lá cỏ ngọt sấy khô ựể chế biến thức ăn và làm phụ gia thực phẩm Kể từ ựó, nhiều nghiên cứu ựã ựược tiến hành [35]

Báo cáo từ các nhà nghiên cứu Ấn độ trong năm 2007 cũng cho thấy rằng stevia cũng có thể là một nguồn giàu chất chống oxy hóa và có thể bảo

vệ chống lại tổn thương DNA và ung thư Theo kết quả trong tạp chắ Nông

nghiệp và Thực phẩm Hóa học (2007, Vol 55, pp 10.962-10.967), các nhà

nghiên cứu dẫn ựầu bởi Srijani Ghanta từ Viện Hóa học Sinh học tại Kolkata

Ấn độ báo cáo rằng một chiết xuất từ lá cây Stevia rebaudiana ựã ựược tìm

thấy có chứa một lượng phong phú các chất có khả năng chống oxy hóa polyphenol, bao gồm cả quercitrin, apigenin, và kaempferol Ghanta và các ựồng nghiệp sử dụng methanol và ethyl acetate khai thác, kiểm tra sau ựó cho thấy rằng chiết xuất có thể bảo vệ chống lại sự cắt sợi DNA bởi các gốc hydroxide [30][33]

Ở Việt Nam, công ty cổ phần Stevia Ventures và các ựối tác nước ngoài ựang vận ựộng, gửi công văn ựến Bộ Y tế và Cục An toàn - Vệ sinh thực phẩm ựể công nhận chất stevioside trở thành thực phẩm thông thường, dùng hàng ngày Việc chấp thuận các ựề xuất của chúng tôi chỉ còn là vấn ựề thời

gian [35]

2.4 Tình hình sản xuất và tiêu thụ cây cỏ ngọt

2.4.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ cây cỏ ngọt trên thế giới

Ngày nay, cây cỏ ngọt ựược trồng tại rất nhiều quốc gia trên thế giới như: Brasil, Argentina, Paraguay, Mexico, Mỹ, Canada, Nhật Bản, Trung Quốc, đài Loan, Hàn Quốc, Thái Lan, Israel, Việt Nam [33][35]

Trung quốc là nước ựứng ựầu thế giới về sản xuất và xuất khẩu Stevia Năm 2000, giá trị xuất khẩu của Trung Quốc từ các chất chiết xuất từ Cỏ ngọt ắt hơn 1 triệu USD Sau ựó ắt năm Trung Quốc có sự tăng trưởng nhanh

ựạt 84,30 triệu USD ựến năm 2009 ựã tăng 132% so với cùng kỳ năm trước, trong khi khối lượng xuất khẩu khoảng 3.350 tấn, tăng 14,40% so với cùng kỳ năm trước Hiện nay, Trung Quốc cũng là quốc gia có diện tắch trồng cỏ ngọt lớn nhất thế giới với diện tắch trồng lên tới 300.000 ha [34]

Là một trong những quốc gia ựầu tiên ựược tham gia vào ngành công nghiệp chiết xuất ựường từ stevia rebaudiana, sản lượng chiết xuất từ stevia rebaudiana của Trung Quốc ựã từng chiếm 80% khối lượng cung ứng toàn cầu Trong năm 2009, chiết xuất từ stevia rebaudiana sản lượng của Trung Quốc là khoảng 4.000 tấn, trên 80% trong số ựó là dành cho xuất khẩu [34] Nhật Bản là quốc gia sử dụng cây cỏ ngọt nhiều nhất trên thế giới Mỗi năm kỹ nghệ Nhật tiêu thụ từ 700 tấn ựến 1000 tấn lá cỏ ngọt, giá trị thương mại khoảng 3 - 5 tỷ yên/năm Tuy nhiên, lượng sản xuất trong nước không ựủ cho nhu cầu tiêu dùng Vì vậy, Nhật Bản ựã nhập thêm từ Hàn Quốc, đài Loan và Trung Quốc Họ sử dụng chất tạo vị ngọt stevioside trong trong rất nhiều sản phẩm như: bánh kẹo, trong các loại nước ngọt như Coca cola, Pepsi, trong các loại trà uống hàng ngày [34]

2.4.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ cây cỏ ngọt tại Việt Nam

Cây cỏ ngọt ựược nhập và trồng thử nghiệm tại Việt Nam từ năm 1988 Qua thử nghiệm trồng cho thấy cỏ ngọt không yêu cầu khắt khe về ựất ựai, cỏ ngọt thắch ứng với những vùng khắ hậu khác nhau của nước ta, sinh trưởng tốt Tuy nhiên, nó là loại cây ưa ẩm nhưng lại không chiu ựược úng nên việc lựa chọn ựất ựể trồng cỏ ngọt phải cao ráo, thoát nước nhanh ựồng thời phải chủ ựộng việc tưới tiêu Hiện nay, cây cỏ ngọt ựã ựược trồng trên khắp cả nước: Hà Nội, Hưng Yên, Hoà Bình, Vĩnh Phú, Yên Bái, Bắc Giang Sông Bé, Lâm Đồng, Đắc LắcẦ Giống Cỏ ngọt vẫn ựược bà con nông dân sản xuất rộng rãi từ trước ựến nay là ST88, nó có nguồn gốc từ Argengtina ựược nhập nội vào Việt Nam từ cuối những năm 90 của thế kỷ trước, ựược công nhận giống quốc gia vào tháng 1/1995 [4][35]

Hiện nay, cỏ ngọt (ST88) vẫn ñược trồng nhiều ở một số vùng như Khoái Châu (Hưng Yên), Hoà Bình, Nghệ An… với mục ñích sử dụng duy nhất là làm dược liệu Tuy nhiên, năng suất của giống này ñang sụt giảm nghiêm trọng do bị thoái hóa sau một thời gian dài canh tác liên tục bằng phương pháp nhân giống vô tính Hàm lượng ñường tổng số và hàm lượng Stevioside trong Cỏ ngọt ST88 thấp, chưa ñáp ứng ñược yêu cầu xuất khẩu của một số công ty nhập khẩu Cỏ ngọt lớn trên thế giới hiện nay do ñó việc sản xuất cỏ ngọt trên diện tích lớn của nước ta còn có nhiều hạn chế

Hiện nay, giống Cỏ ngọt Morita (M3) ñược công ty Cổ phần Stevia ventures nhập nội vào Việt Nam có những ñặc ñiểm sinh trưởng phát triển, năng suất chất lượng vượt trội hơn ST88 ñang ñược triển khai sản xuất ở một

số tỉnh trong cả nước như: Hà Nội, Bắc Giang, Hòa Bình, Hưng Yên, Nghệ

An, Quảng Bình, Kiên Giang… bước ñầu cho năng suất, chất lượng và hiệu quả kinh tế khá cao [35]

Bảng 2.1 Diện tích, năng suất cỏ ngọt một số vùng trồng ở Việt Nam

Do nhu cầu cỏ ngọt từ thị trường thế giới, giá trị thương mại của cây

Cỏ ngọt ñược tăng lên rất nhanh trong vài năm gần ñây, nắm bắt kịp nhu cầu

ngừng ñược mở rộng ở một số ñịa phương trên cả nước như Bắc Giang, Hòa Bình, Hưng Yên, Nghệ An, Lâm ðồng… Tuy nhiên, diện tích trồng và năng suất của cây Cỏ ngọt tại Việt Nam vẫn còn rất khiêm tốn so với các nước trên thế giới Mặc dù vậy, tiềm năng năng suất và giá trị thương mại của Cỏ ngọt trong những năm tới ở Việt Nam ñược dự báo là rất cao Có thể coi Cỏ ngọt là cây trồng của tương lai, và có thể nhìn nhận cỏ ngọt trên phương diện là một cây công nghiệp sản xuất với diện tích lớn chứ không ñơn thuần chỉ là một cây dược liệu với diện tích trồng hạn chế như hiện nay [35]

2.5 Tình hình nghiên cứu về phương pháp nhân giống vô tính bằng giâm cành

2.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Trên thế giới hình thức nhân giống vô tính bằng phương pháp giâm cành ñã ñược nghiên cứu từ rất sớm như: ở Trung Quốc bắt ñầu nghiên cứu từ năm 1900, ở Ấn ðộ năm 1911, ở Gruzia năm 1928, Nhật Bản năm 1936, Srilanka năm 1938)[1] ðặc biệt từ những năm 30 của thế kỷ XX, khi mà công nghệ hóa học phát triển mạnh mẽ, con người ñã tổng hợp ñược nhiều dạng auxin ngoại sinh khác nhau và ñem nó sử dụng trong kỹ thuật giâm cành Nhờ vậy, ñã biến giâm cành trở thành một phương pháp nhân giống phổ biến và ứng dụng rộng rãi mang tính công nghiệp, sản xuất hàng loạt với quy

mô lớn [13]

Theo Mary Weich - Keesey và B.Rosie Lemer (2006) thì sử dụng auxin

ñể kích thích sự hình thành rễ sẽ nâng cao tỷ lệ hình thành cây Hai hợp chất thường ñược sử dụng thường xuyên nhất là IBA và α-NAA ðối với cây thân thảo và thân gỗ mềm thì sử dụng ở nồng ñộ <1000ppm (0,1%), cây thân gỗ nửa cứng thì sử dụng ở nồng ñộ 3000ppm (0,3%), còn cây thân gỗ cứng thì sử dụng nồng ñộ là 8000ppm (0,8%) [21]

Hai tác giả trên cũng cho rằng:

- ðể tất cả năng lượng tập trung nuôi rễ mới hình thành của hom giâm thì phải cắt hết hoa và quả trên hom nếu không chúng sẽ sử dụng phần lơn năng lượng của hom giâm

Trong quá trình giâm cành ñiều kiện nhiệt ñộ thích hợp nhất là 18,3 23,90C, tránh ñể quá nóng hoặc quá lạnh

Khi giâm phải ñặt dưới cường ñộ ánh sáng nhẹ, không ñể dưới ánh sáng mặt trời trực tiếp quá gay gắt

- ðộ dài của hom giâm là 5 - 15 cm tùy loại cây

- ðể hạn chế sự mất nước của hom giâm thì tuốt bỏ hoặc căt 1/2 – 2/3

lá [21]

Những nghiên cứu của C.J.Hansen (1958); Hartmanm, W.H.Grigss, C.J.Hansen (1963) và cộng sự cho rằng: mùa giâm cành trong năm như một yếu tố chìa khóa quyết ñinh sự thành công của quá trình nhân giống và có những kết luận sau: ñối với các loại cây rụng lá, gỗ cứng thường lấy cành giâm vào giai ñoạn cây bước vào thời kỳ ngủ nghỉ còn ñối với các cây gỗ mềm, nủa cứng không rụng lá, cây thân thảo thì nên lấy cành giâm vào mùa sinh trưởng

S.H.Freeman (1960) khi nghiên cứu về ñiều kiện ngoại cảnh ảnh hưởng ñến sự ra rễ của cành giâm ñã cho kết luận như sau:

- Về ánh sáng: Ánh sáng ức chế sự phát sinh hình thành rễ, duy trì sự thiếu hụt ánh sáng sẽ kích thích sự ra rễ ðể xúc tiến quá trình ra rễ có thể sử dụng các vật liệu che phủ mờ ñục như: nilon ñen, trắng, lưới ñen, lá khô, rơm rạ… ñể làm giảm cường ñộ ánh sáng tác ñộng lên cành giâm Sự suy yếu ánh sáng có thể ảnh hưởng ñến sự tập trung auxin và những chất khác dễ bị phân hủy bởi ánh sáng mạnh

- Về nhiệt ñộ: Nhiệt ñộ không khí ở mức vừa phải từ 20 - 260C sẽ làm giảm bớt sự hô hấp của cành giâm, giảm sự tiêu hao năng lượng ñồng thời

ức chế quá trình hình thành rễ Vì vậy, ựảm bảo ựiều kiện nhiệt ựộ thắch hợp

là rất quan trọng trong quá trình giâm cành

- Về ẩm ựộ: độ ẩm thấp là nguyên nhân dẫn ựến sự khô héo của cành giâm, gây nên sự thất bại trong quá trình giâm cành Chắnh vì vậy, việc ựảm bảo ựộ ẩm không khắ luôn ở mức bão hòa bằng phương pháp phun mù, phun

mù gián ựoạn rất có ý nghĩa trong quá trình giâm cành

Theo Jean Miche (1977), việc sử dụng phương pháp xông hơi nóng ựể duy trì nhiệt ựộ ở vùng rễ khoảng 25,40C làm cho quá trình ra rễ ựược thuận lợi vì nó kắch thắch sự phân chia tế bào, phần ở trên không khắ có thể ở ựiều kiện mát, làm giảm sự thoát hơi nước và giảm bớt hô hấp Nhiệt ựộ ban ngày khoảng 21 - 26,70C là thuận lợi cho quá trình ra rễ của phần lớn các cây [13]

2.5.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Ở Việt Nam, nhân giống bằng phương pháp giâm cành cũng ựã ựược nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong sản xuất ựối với rất nhiều loại cây trồng như: cam, chanh, quất, cúc, ựàoẦ

Kết quả nghiên cứu của bộ môn Rau - Quả trường đH Nông nghiệp Hà Nội từ những năm 1976 cho thấy:

- Giâm cành trong vụ xuân hè và vụ thu nên dùng giá thể là cát sông sạch với ựiều kiện ánh sáng trực xạ và giữ ẩm mặt lá cành giâm

- Những loại cây ăn quả giâm cành tương ựối thuận lợi như: chanh ta, chanh Eureka, chanh yên, dâu ăn quả, quất, mận [13]

Trong nhiều năm qua, phòng thắ nghiệm của bộ môn Sinh lý thực vật trường đH Nông nghiệp Hà Nội ựã tập trung nghiên cứu cơ sở sinh lý của sự tái sinh rễ ở cành giâm đã ứng dụng vào kỹ thuật nhân giống vô tắnh bằng phương pháp giâm cành cho nhiều ựối tượng cây trồng khác nhau Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng auxin ngoại sinh ựã kắch thắch sự ra rễ của cành giâm, phương pháp xử lý nhanh, nồng ựộ cao (4000 - 6000) là cho hiệu quả cao hơn

cả, ánh sáng tán xạ, ựộ ẩm bão hòa là ựiều kiện tối ưu cho sự ra rễ của cành giâm [13]

Theo Hoàng Ngọc Thuận (2000):

Lấy cành giâm là những cành bánh tẻ có thể non hơn hoặc già hơn tùy chủng loại Nên loại bỏ những cành sâu bệnh hại Cành phải cắt vào thời gian không có nắng Nếu gặp trời nắng hanh hoặc nắng nóng thì sau khi cắt cành ra khỏi cây phải phun nước ngay rồi mới ựưa vào chỗ mát ựể sửa cành và xử lý Nhiệt ựộ thắch hợp cho sự ra rễ của nhiều loại cây trồng là 21,6 - 26,50C [15][16]

đặng Văn đông và đinh Thế Lộc (2003) ựã chỉ ra rằng:

Giá thể giâm cây hoa cúc có thể là ựất phù sa, ựất thịt nhẹ hay ựất bùn

ao, nhưng qua các kết quả thắ nghiệm cho thấy tốt nhất là chọn cát sạch Chọn cành bánh tẻ, chiều dài hom giâm là 6 - 8 cm, có khoảng 3 - 4 lá/hom Các lá trên cành xanh tốt, không bị sâu bệnh, sức sống cành giâm khỏe Mật ựộ giâm phụ thuộc vào giống và thời vụ Có thể là 1000 hom/m2 ựối với những cành to khỏe, lá nhiều và 1600 hom/m2 ựối với những giông cành nhỏ, ắt lá Mùa thu nên giâm dày hơn mùa hè [3]

Khi nghiên cứu ảnh hưởng của số ựốt trên hom giâm ựến khả năng ra rễ của hom Saphia, Nguyễn Mai Thơm và Vũ Văn Liết (2003) ựã chỉ ra rằng: hom có 3 ựốt và hom có 4 ựốt cho tỷ lệ sống cao nhất Hai tác giả này cũng nhận thấy thời vụ giâm cành có ảnh hưởng rất lớn ựến khả năng nhân giống cây cảnh Saphia Thời vụ nhân giống thắch hợp nhất là từ 15/3 - 20/3 và sử dụng hom giữa, hom gốc cho tỷ lệ ra rễ cao, sinh trưởng của hom giâm là tốt nhất [12]

Theo nghiên cứu của nhiều tác giả thì ở nước ta thời vụ giâm cành tốt nhất là vụ xuân (10/2 - 20/4) và vụ thu (20/9 - 20/10)

Các nghiên cứu về phương thức nhân giống Cỏ ngọt cho thấy rằng

kiện sản xuất ở Việt Nam Nghiên cứu của Trần đình Long và cộng sự chỉ ra rằng:

- Cành Cỏ ngọt ựược sử dụng ựể nhân giống nên lấy ở cây mẹ từ 4 tháng ựến 1 năm tuổi là tốt nhất

- Giâm trên môi trường cát, ựất và bùn ao cho tỷ lệ ra rễ sớm nhất và cao nhất Tuy nhiên, giâm trên môi trường cát sẽ thuận lợi cho nhân giống ựại trà và cho hiệu quả kinh tế cao hơn Giâm trên ựất và bùn ao cho cây con cứng cáp, bộ rễ phát triển mạnh nhưng chi phắ cao và tốn nhiều công trong quá trình nhổ cây con ựồng thời gây bất tiện khi phải vận chuyển ựi xa Trong những thời gian nóng bức, nhiệt ựộ, ựộ ẩm không khắ cao, giâm trên bùn ao cho tỷ lệ cây sống cao và chất lượng cây giống khỏe (Trần đình Long và CS,1996) [4]

- đối với việc sử dụng chất ựiều hòa sinh trưởng, α-NAA là có hiệu lực cao nhất trong việc kắch thắch ra rễ cành giâm và thời gian ra rễ ngắn nhất Nồng ựộ α-NAA thắch hợp nhất cho cây ra rễ là 30 - 50ppm (trong ựiều kiện nhân giống vào mùa hè) và từ 150 - 200 ppm (trong ựiều kiện nhân giống vào mùa ựông giá rét) (Trần đình Long và CS,1996) [4]

2.6 Cơ sở khoa học của sự hình thành rễ bất ựịnh dưới tác ựộng của auxin

Trong sự hình thành rễ, ựặc biệt là rrễ bất ựịnh, auxin có tác dụng rất ựặc biệt, vì vậy có khi người ta xem auxin là chất hình thành rễ

Sự hình thành rễ bất ựịnh của cành chiết, cành giâm có thể chia làm ba giai ựoạn:

- đầu tiên là sự phản phân hoá tế bào mạnh mẽ ở vùng tiền thượng tầng, trụ bìẦ, nơi xuất phát của rễ bất ựịnh, thành một ựám tế bào lộn xộn

- Giai ựoạn tiếp theo là xuất hiện mầm rễ

- Cuối cùng, rễ sinh trưởng, ựâm thủng vỏ và kéo dài thành các rễ bất ựịnh Trong 3 giai ựoạn trên thì giai ựoạn ựầu, giai ựoạn khởi xuơngswj hình thành rễ cần hàm lượng auxin rất cao cho sự phản phân hoá tế bào Các giai

ñoạn sau cần hàm lượng thấp hơn và ñôi khi không cần Nguồn auxin có thể

là nguồn nội sinh và cũng có thể do bổ sung từ ngoài vào Thường ñể xúc tiến quá trình hình thành rễ nhanh chóng ở cành chiết, cành giâm, người ta thường

xử lý auxin ngoại sinh như : IBA, IPA, α-NAA, 2,4D… [11]

Vai trò của Auxin ñối với sự hình thành rễ ñược chứng minh rõ trong nuôi cấy mô tế bào Nếu chỉ có mặt của auxin trong môi trường nuôi cấy, mô chỉ phát sinh rễ mà thôi ðể tạo cây hoàn chỉnh thì cần phải có chồi nữa, tức phải bổ sung xytokynin vào môi trường nuôi cấy [11]

Có 3 phương pháp ñể xử lý auxin cho sự ra rễ bất ñịnh:

- Phương pháp xử lý nồng ñộ loãng: nồng ñộ xử lý vài chục ppm

Với phương pháp giâm cành thì ngâm phần gốc vào dung dịch trong thời gian 12 – 24h rồi cắm cành giâm vào giá thể

Với phương pháp chiết cành thì trộn dung dịch xử lý với ñất bó bầu trước khi bó bầu xung quanh vết khoanh vỏ [8]

- Phương pháp xử lý nồng ñộ ñặc: Nồng ñộ xử lý khoảng vài nghìn

- Sử dụng dạng bột: có nhiều chế phẩm giâm chiết cành dạng bột, trong

thành phần có chứa auxin với một tỷ lệ nhất ñịnh ñược phối trộn với loại bột nào ñó, khi giâm cành chỉ cần chấm vết cắt của cành giâm vào chế phẩm bột rỗi cắm vào giá thể [8]

3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu nghiên cứu

3.1.1 ðối tượng nghiên cứu

Cây cỏ ngọt (Stevia rebaudiana Bertoni), giống Morita 3 (M3) của tập

đồn Pure Circle (Mỹ), tập đồn hàng đầu thế giới về cây cỏ ngọt Giống được cơng ty CP Stevia Ventures nhập nội và phân phối trên tồn quốc

Giống cỏ ngọt M3 cĩ dạng thân bụi, chiều cao 60-70 cm, thâm canh tốt

cĩ thể đạt 80-90 cm, phân cành cấp một nhiều Lá mọc đối từng cặp hình thập

tự hoặc mọc cách, mép lá cĩ từ 12-16 răng cưa, lá hình trứng ngược, lá trưởng thành dài khoảng 50-70 mm, rộng 17-20 mm Hoa phức, giao phấn, khả năng

tự thụ phấn thấp Quả mầu nâu thẫm, năm cạnh khi chín dài 2-2,5 mm, hạt cĩ rất ít nội nhũ Cây con gieo từ hạt sinh trưởng chậm

Thời gian từ khi trồng đến thu hoạch từ 45-60 ngày, hàm lượng đường tổng số Steviol glucoside >12%, trong đĩ hàm lượng Rebaudioside A (Reb A)

>60% Reb A là chất ngọt chính trong cây cỏ ngọt, khơng mang năng lượng

và ở độ tinh khiết 98% thì ngọt gấp đường mía 350-400 lần

3.1.2 Vật liệu nghiên cứu

* Giá thể:

- Trấu hun: vỏ trấu đem hun cháy trong điều kiện hiếm khí nên cháy khơng hồn tồn, cĩ tính thốt nước, thơng thống, nhẹ, tạo độ tơi xốp cho giá thể và khơng làm thay đổi pH của giá thể

- Xơ dừa: trước khi sử dụng cần ngâm nước để xơ dừa mềm đồng thời loại bỏ các chất độc tố Xơ dừa cũng cĩ tác dụng tạo độ tơi xốp, thơng thống cho giá thể

- Cát non: cánh cát nhỏ, chứa ít silic, màu xám, giữ ẩm và thốt nước tốt

* Hoá chất:

- Naphtalein axetic axit (α-NAA) là Auxin ngoại sinh có tác dụng kích thích cành giâm ra rễ

- Một số chế phẩm ra rễ:

+ Chế phẩm Pisomix-Y15 (công ty YAMADA CO.,LDT)

+ Chế phẩm giâm chiết cành MD.910 (công ty CP sinh hóa Minh ðức) + Chế phẩm Bimix (công ty CP cây trồng Bình Chánh)

* Vật tư:

- Khay giâm: dùng khay xốp có ñục lỗ ở ñáy ñể thoát nước

- Giầm, bình tưới nước và phun thuốc

3.1.3 Thời gian và ñịa ñiểm nghiên cứu

Thí nghiệm ñược tiến hành trong thời gian từ tháng 5 năm 2011 ñến tháng 3 năm 2012 trong nhà lưới có mái che tại khu thí nghiệm khoa Nông học - trường ðH Nông nghiệp Hà Nội

3.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ α-NAA ñến sự ra rễ của cành

giâm cây cỏ ngọt giống Morita 3

- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chế phẩm ra rễ ñến sự ra rễ của

cành giâm cây cỏ ngọt giống Morita 3

- Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể ñến sự ra rễ của cành giâm cây cỏ

ngọt giống Morita 3

- Nghiên cứu ảnh hưởng của thời vụ ñến sự ra rễ của cành giâm cây cỏ

ngọt giống Morita 3

3.2.2 Phương pháp nghiên cứu

* Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng ñộ α-NAA ñến khả năng ra

rễ, sự sinh trưởng phát triển và chất lượng của cành giâm cây cỏ ngọt

- Cách xử lý: nhúng phần gốc của hom giâm vào dung dịch α-NAA

trong khoảng thời gian 3-5 giây rồi nhấc ra và cắm hom giâm vào giá thể ñã chuẩn bị sẵn

- Thời gian thí nghiệm: tháng 8/2011

* Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của một số chế phẩm giâm chiết cành ñến khả năng ra rễ, sự sinh trưởng phát triển và chất lượng của cành giâm cây cỏ ngọt

- Công thức thí nghiệm:

Thí nghiệm ñược bố trí 5 công thức với 4 công thức thí nghiệm là 4 loại chế phẩm giâm chiết cành khác nhau và một công thức ñối chứng (nước sạch) CT1 (ñ/c) : Nước sạch

CT3 : Pisomix-Y15 của công ty YAMADA CO.,LDT

CT4 : Bimix của công ty cây trồng Bình Chánh - TP HCM CT5 : MD.901 của công ty CP sinh hóa Minh ðức

- Nền giá thể là: cát ẩm, ñã xử lý thuốc phòng nấm bệnh phổ rộng

- Cách xử lý:

+ ðối với NAA: nhúng phần gốc của hom giâm vào dung dịch

α-NAA trong khoảng thời gian 3-5 giây rồi nhấc ra và cắm hom giâm vào giá thể ñã chuẩn bị sẵn

+ ðối với các chế phẩm khác: pha dung dịch với nồng ñộ ñã ñược hướng dẫn sẵn ghi trên bao bì (với ñối tượng cành giâm là loài thân thảo) Nhúng phần gốc của hom giâm vào dung dịch ñã pha sẵn (theo chỉ dẫn của nhà sản xuất) rồi cắm hom giâm vào giá thể ñã chuẩn bị sẵn

- Thời gian thí nghiệm: tháng 11/2011

* Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của một số loại giá thể ñến khả năng ra

rễ sự sinh trưởng phát triển và chất lượng của cành giâm cây cỏ ngọt

CT4 Cát + Trấu hun + Xơ dừa (tỷ lệ 1:1:1) C + T + XD (1:1:1)

- Giá thể: xử lý thuốc phòng nấm bệnh phổ rộng ñối với các loại giá thể

- Cách xử lý: sau khi cắt hom giâm, xử lý hom bằng cách ngâm trong

dung dịch có hòa thuốc phòng trừ nấm bệnh rồi cắm vào các hỗn hợp giá thể

ñã chuẩn bị sẵn (xử lý chất ra rễ Bimix)

- Thời gian thí nghiệm: tháng 11/2011

* Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của thời vụ giâm ñến khả năng ra rễ

và sinh trưởng phát triển của cành giâm cỏ ngọt

- Cách xử lý: sau khi cắt hom giâm, xử lý hom bằng cách ngâm trong

dung dịch có hòa thuốc phòng trừ nấm bệnh rồi cắm vào các hỗn hợp giá thể

Tiêu chuẩn của cành giâm là khoẻ mạnh; bánh tẻ (tức là không quá non

và quá già); không bị nhiễm sâu bệnh; không có nụ hoa

Dùng kéo cắt hom, vết cắt gọn và vát một góc 45o Chiều dài cành cắt

từ 5cm-7cm, tương ñương với 4-5 cặp lá/mầm

Chọn cắt mầm giâm ở những cành bánh tẻ có ñộ tuổi sinh học ở mức trung bình, không quá già hoặc quá non

Cành ñể giâm phải ñược cắt vào lúc sáng sớm hoặc chiều mát ñể tránh cho không bị héo Sau khi cắt xong phải xử lý ñể giâm ngay, bảo quản nơi râm mát Giá thể ñược phối trộn theo yêu cầu từng công thức thí nghiệm, trộn thuốc phòng nấm bệnh sau ñó tưới ẩm khoảng 70% - 80%

Tiến hành giâm cành vào giá thể theo từng yêu cầu cụ thể của mỗi thí nghiệm Hom giâm sau khi cắt về tiến hành tuốt bỏ lá, chỉ ñể 2-3 cặp lá, sau ñó bó thành các bó nhỏ và ngâm trong nước sạch có xử lý thuốc phòng nấm bệnh phổ rộng ñể phòng chống nấm bệnh gây hại trước khi nhúng vào chế phẩm ra rễ Trong thời gian hom giâm chưa xuất hiện rễ phải thường xuyên phun

mù và ñảm bảo ñộ ẩm không khí ñạt 90 – 95% ñộ ẩm không khí bão hoà

3.3.3 Các chỉ tiêu theo dõi

- Tỷ lệ hom thối (%): là tỷ lệ những hom bị thối ñen, nhũn ở gốc, không

có khả năng tạo callus và ra rễ so với tổng số cành giâm

Số hom thối

Tỷ lệ hom thối (%) =

Tổng số hom theo dõi x 100

- Tỷ lệ hom tạo callus (%): là tỷ lệ những hom tạo callus (mô sẹo) so

với tổng số cành ñem giâm

Số hom tạo callus

Tỷ lệ hom tạo callus (%) =

Tổng số hom theo dõi x 100

- Tỷ lệ hom ra rễ (%): là tỷ lệ những hom ra rễ so với tổng số hom ñem giâm

Số hom ra rễ

Tỷ lệ hom ra rễ (%) =

Tổng số hom theo dõi x 100

- Chiều dài trung bình của bộ rễ (cm): ño tất cả các rễ của hom giâm

theo dõi, sau ñó tính chiều dài trung bình của bộ rễ

Tổng chiều dài bộ rễ của các hom theo dõi Chiều dài TB của bộ rễ (cm) =

Tổng số hom theo dõi

- Chiều dài của rễ dài nhất (cm): ño rễ dài nhất của các hom giâm theo

dõi, tính chiều dài trung bình

Tổng chiều dài rễ dài nhất của các hom theo dõi Chiều dài TB của rễ dài nhất (cm) =

Tổng số hom theo dõi

- Tốc ñộ sinh trưởng của rễ (cm/ngày): ñược xác ñịnh theo công thức

Chiều dài lần ño sau – Chiều dài lần ño trước

- Tỷ lệ cây con xuất vườn (%): ñược tính bằng tỷ số giữ số cành ñưa

vào giâm và số cây con ñạt tiêu chuẩn xuất vườn

Tổng số cây xuất vườn

Tỷ lệ cây xuất vườn (%) =

Tổng số cây mang vào giâm x 100

3.3.4 Phương pháp và thời gian theo dõi

- Mỗi lần nhắc lại của mỗi công thức theo dõi 10 hom, theo phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên Kết quả của thí nghiệm ñược tính bằng trung bình của 3 lần nhắc lại