Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết nấm fusarium oxysporum đến sinh trưởng, phát triển và tính chống chịu nấm bệnh của một số dòng cẩm chướng đột biến trong môi trường in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI NGUYỄN THỊ PHƯƠNG ANH NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA DỊCH CHIẾT NẤM Fusarium oxysporum ðẾN SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN VÀ TÍNH CHỐNG CHỊ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ PHƯƠNG ANH

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA DỊCH CHIẾT NẤM

Fusarium oxysporum ðẾN SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN VÀ

TÍNH CHỐNG CHỊU NẤM BỆNH CỦA MỘT SỐ DÒNG CẨM CHƯỚNG ðỘT BIẾN TRONG MÔI TRƯỜNG IN VITRO

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành: Trồng trọt

Mã số : 60.62.01

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Lý Anh

HÀ NỘI - 2012

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu

và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa từng ñược ai công bố trong bất cứ một luận văn nào

Tôi cũng xin cam ñoan mọi sự giúp ñỡ ñể thực hiện luận văn ñã ñược cám

ơn và mọi thông tin trích dẫn ñều ñược chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày 17 tháng 09 năm 2012

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn, ngoài sự cố gắng của bản thân, tôi ñã nhận ñược rất nhiều sự giúp ñỡ và ñộng viên của thầy cô, gia ñình và bạn bè

Trước hết tôi xin chân thành cảm ơn cô PGS.TS Nguyễn Thị Lý Anh - Viện trưởng Viện Sinh học Nông nghiệp - Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội, ñã tận tình hướng dẫn, quan tâm và chỉ bảo tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Bên cạnh ñó tôi xin cảm ơn thầy TS Hà Viết Cường - Giám ñốc Trung tâm nghiên cứu bệnh cây nhiệt ñới, trường ñại học Nông Nghiệp Hà Nội ñã tận tình quan tâm, giúp ñỡ tôi trong việc giải ñáp những vấn ñề thắc mắc về chủng nấm

Fusarium oxysporum

Tôi cũng xin cảm ơn toàn thể cán bộ công nhân viên Viện Sinh học Nông nghiệp Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội ñã giúp ñỡ và tạo mọi ñiều kiện tốt cho tôi trong suốt quá trình thực tập

Cuối cùng tôi xin gửi lời biết ơn tới gia ñình và bạn bè ñã quan tâm, ñộng viên tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 17 tháng 09 năm 2012

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ðOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

DANH MỤC ẢNH viii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ix

PHẦN I: MỞ ðẦU 1

1.1 ðặt vấn ñề 1

1.2.1 Mục ñích 2

1.2.2 Yêu cầu 2

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài 3

1.3.1 Ý nghĩa khoa học 3

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Giới thiệu chung về cây cẩm chướng 4

2.1.1 Phân loại thực vật 4

2.1.2 Nguồn gốc 4

2.1.3 ðặc ñiểm thực vật học của cây hoa cẩm chướng 4

2.1.4 Yêu cầu ngoại cảnh của hoa cẩm chướng 5

2.1.5 Tình hình sản xuất hoa cẩm chướng trong và ngoài nước 6

2.2 Giới thiệu chung về nấm Fusarium oxysporum 10

2.2.1 Phân loại 10

2.2.2 ðặc ñiểm chung 10

2.2.3 Môi trường sống 12

2.2.4 Cách thức xâm nhập và enzyme ngoại bào của nấm Fusarium nói

chung và Fusarium oxysporum nói riêng 12

2.3 Tình hình bệnh hại do nấm Fusarium oxysporum gây ra 14

2.3.1 Tình hình gây bệnh của nấm Fusarium oxysporum ñối với các cây trồng nói chung 14

2.3.2 Tình hình gây bệnh và một số nghiên cứu về ảnh hưởng của nấm Fusarium oxysporum ñến cây cẩm chướng 16

PHẦN III ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

3.1 Vật liệu, ñịa ñiểm và thời gian nghiên cứu 20

3.1.1 Vật liệu nghiên cứu 20

3.1.2 ðối tượng nghiên cứu 20

3.1.3 ðịa ñiểm nghiên cứu 21

3.1.4 Thời gian nghiên cứu 21

3.2 Nội dung nghiên cứu 21

3.3 Phương pháp nghiên cứu 23

3.3.1 Phương pháp thu dịch nuôi cấy nấm Fusarium oxysporum 23

3.3.2 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 25

3.3.3 Phương pháp lây nhiễm nhân tạo 25

3.3.4 Phương pháp ñánh giá tính chống chịu nấm bệnh

Fusarium oxysporum 26

3.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm 27

3.5 Các chỉ tiêu theo dõi ñánh giá 27

3.6 Phương pháp xử lý số liệu 28

PHẦN IV KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 29

4.1 Nuôi cấy và tách chiết dịch nấm Fusarium oxysporum gây bệnh trên

cây cẩm chướng 29

4.2 Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy nấm Fusarium oxysporum ñến khả năng sống, sinh trưởng in vitro của các dòng cẩm chướng nghiên cứu 31

4.2.1 Chu kỳ I 31

4.2.2 Chu kỳ II 46

4.3 Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy nấm Fusarium oxysporum ñến khả năng

ra rễ in vitro của các dòng cẩm chướng nghiên cứu 59

4.3.1 Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy nấm Fusarium oxysporum ñến khả năng sinh trưởng và phát triển của các dòng cẩm chướng nghiên cứu ñã nuôi cấy qua 2 chu kỳ trên môi trường ra rễ 61

4.3.2 Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy nấm Fusarium oxysporum ñến khả năng ra rễ in vitro của các dòng cẩm chướng nghiên cứu ñã qua nuôi cấy63 4.4 Lây nhiễm nhân tạo ngòai vườn ươm 68

PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 68

5.1 Kết luận 68

5.2 Kiến nghị 68

TÀI LIỆU THAM KHẢO 70

PHỤ LỤC 74

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 4.1 Một số ñặc ñiểm hình thái của nấm gây bệnh trên môi trường

PDA ñặc sau 7 ngày nuôi cấy 29

Bảng 4.2 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy ñến sinh trưởng của nấm 30

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy nấm Fusarium oxyspoum

ñến khả năng sống của các dòng cẩm chướng nghiên cứu 32

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của nồng ñộ dịch nấm ñến ñộng thái tăng trưởng số chồi của các dòng cẩm chướng nghiên cứu qua các tuần 36

Bảng 4.5 Ảnh hưởng của nồng ñộ dịch nấm ñến ñộng thái tăng trưởng số lá của các dòng cẩm chướng nghiên cứu qua các tuần 38

Bảng 4.6 Ảnh hưởng của nồng ñộ dịch nấm ñến ñộng thái tăng trưởng chiều cao của các dòng cẩm chướng nghiên cứu qua các tuần 40

Bảng 4.7 Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy nấm Fusarium oxyspoum ñến sự sinh trưởng của các dòng cẩm chướng nghiên cứu 42

Bảng 4.8 Ảnh hưởng của dịch nuôi nấm Fusarium oxyspoum ñến khả năng sống của các dòng cẩm chướng nghiên cứu ở chu kỳ II 46

Bảng 4.9 Ảnh hưởng của nồng ñộ dịch nấm ñến ñộng thái tăng trưởng

số chồi của các dòng cẩm chướng nghiên cứu qua các tuần 50

Bảng 4.10 Ảnh hưởng của nồng ñộ dịch nấm ñến ñộng thái tăng trưởng

số lá của các dòng cẩm chướng nghiên cứu qua các tuần 52

Bảng 4.11 Ảnh hưởng của nồng ñộ dịch nấm ñến ñộng thái tăng trưởng chiều cao chôi của các dòng cẩm chướng nghiên cứu qua

các tuần 54

Bảng 4.12 Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy nấm Fusarium oxyspoum ñến sự sinh trưởng của các dòng cẩm chướng nghiên cứu ở chu kỳ II 56

Bảng 4.13 Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy nấm Fusarium oxysporum ñến khả năng sống và sinh trưởng của các dòng cẩm chướng trên môi trường ra rễ 62

Bảng 4.14 Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy nấm Fusarium oxysporum ñến khả năng ra rễ của các dòng cẩm chướng nghiên cứu 64

Bảng 4.15 Ảnh hưởng của dịch nấm Fusarium oxysporum ñến sinh trưởng, phát triển của các dòng cẩm chướng nghiên cứu trong ñiều kiện vườn ươm 64

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 2.1 ðặc ñiểm bào tử của nấm Fusarium oxysporum 11

Hình 2.2 Bệnh do các loại nấm Fusarium gây ra 15

Hình 3.1 Các dòng, giống cẩm chướng nghiên cứu 20

Hình 4.1 Khuẩn lạc của nấm Fusarium oxysporum 29

Hình 4.2 Biểu ñồ so sánh khả năng sống và sinh trưởng in vitro của các dòng cẩm chướng nghiên cứu ở chu kỳ I theo % so với ñối chứng không bổ sung dịch nấm (sau 4 tuần) 33

Hình 4.3 ðồ thị mô tả ñộng thái tăng trưởng số chồi TB/ mẫu (chồi) của các dòng cẩm chướng nghiên cứu trên môi trường nuôi cấy có bổ sung dịch nấm Fusarium oxysporum ở các nồng ñộ khác nhau (chu kỳ I) 37

Hình 4.4 ðồ thị mô tả ñộng thái tăng trưởng Số lá TB/chồi (lá) của các dòng cẩm chướng nghiên cứu trên môi trường nuôi cấy có bổ sung dich nấm Fusarium oxysporum ở các nồng ñộ khác nhau (chu kỳ I) 39

Hình 4.5 ðồ thị mô tả ñộng thái tăng trưởng số lá TB/chồi (lá) của các dòng cẩm chướng nghiên cứu trên môi trường nuôi cấy có bổ sung dich nấm Fusarium oxysporum ở các nồng ñộ khác nhau (chu kỳ I) 41

Hình 4.6 Biểu hiện của cây cẩm chướng khi nuôi cấy trong môi trường bổ sung dịch nấm Fusarium oxysporum 45

Hình 4.7 Biểu ñồ so sánh khả năng sống và sinh trưởng in vitro của các dòng cẩm chướng nghiên cứu ở chu kỳ II theo % so với ñối chứng không bổ sung nồng ñộ dịch nấm (sau 4 tuần) 49

Hình 4.8 ðồ thị mô tả ñộng thái tăng trưởng số chồi TB/ mẫu (chồi) của các dòng cẩm chướng nghiên cứu trên môi trường nuôi cấy có bổ sung dịch nấm Fusarium oxysporum ở các nồng ñộ khác nhau (chu kỳ II) 51

Hình 4.9 ðồ thị mô tả ñộng thái tăng trưởng Số lá TB/chồi (lá) của các dòng cẩm chướng nghiên cứu trên môi trường nuôi cấy có bổ sung dich nấm Fusarium oxysporum ở các nồng ñộ khác nhau (chu kỳ II) 53

Hình 4.10 ðồ thị mô tả ñộng thái tăng trưởng chiều cao (cm) của các dòng cẩm chướng nghiên cứu trên môi trường nuôi cấy có bổ sung dịch nấm Fusarium oxysporum ở các nồng ñộ khác nhau (chu kỳ II) 55

Hình 4.11 Biểu ñồ so sánh khả năng tạo cây hoàn chỉnh và sinh trưởng in vitro của các dòng cẩm chướng nghiên cứu trên môi trường ra rễ có bổ sung dịch nấm theo % so với ñối chứng (sau 4 tuần nuôi cấy) 66

Hình 4.12 Lây nhiễm nhân tạo các dòng cẩm chướng ñã ñược chọn lọc ở thí nghiệm 3 (sau 4 tuần) 65

Hình 4.13 Biểu ñồ so sánh khả năng sống và sinh trưởng của các dòng cẩm chướng nghiên cứu khi lây nhiễm nhân tạo theo nồng ñộ nấm (sau 4 tuần) 66

DANH MỤC ẢNH

Ảnh 4.1 Chồi các dòng cẩm chướng nghiên cứu ở chu kỳ I theo dòng cây (sau

4 tuần nuôi cấy)

Ảnh 4.2 Chiều cao của từng dòng cẩm chướng nghiên cứu ở chu kỳ I theo

dòng cây (sau 4 tuần nuôi cấy)

Ảnh 4.3 Chồi các dòng cẩm chướng nghiên cứu ở cu kỳ I theo nồng ñộ bổ sung

dịch nấm (sau 4 tuần nuôi cấy)

Ảnh 4.4 Chồi các dòng cẩm chướng nghiên cứu ở chu kỳ II theo dòng cây (sau

4 tuần nuôi cấy)

Ảnh 4.5 Chiều cao của từng dòng cẩm chướng nghiên cứu ở chu kỳ II theo

dòng cây (sau 4 tuần nuôi cấy)

Ảnh 4.6 Chồi các dòng cẩm chướng nghiên cứu ở chu kỳ II trên các môi

trường nồng ñộ khác nhau của dịch nấm (sau 4 tuần nuôi cấy)

Ảnh 4.7 Các dòng cẩm chướng nghiên cứu trên môi trường ra rễ thí nghiệm 3

(sau 4 tuần nuôi cấy)

Ảnh 4.8 Chiều cao cây hoàn chỉnh của các dòng cẩm chướng nghiên cứu trên

môi trường ra rễ bổ sung dịch nấm với các nồng ñộ khác nhau

Ảnh 4.9 Chồi các dòng cẩm chướng nghiên cứu ở chu kỳ III trên các môi

trường nồng ñộ khác nhau của dịch nấm (sau 4 tuần nuôi cấy)

α NAA: α- Napthaleneaxetic axid

DNA: Acid deoxyribonucleocid

CLA: Carnation Leaf-Piece Agar

PDA: Potato Dextrose Agar

TB: Trung bình

PCR: Polymerase chain reaction

RAPD: Random Amplification of Polymorphic DNA

GFP: Green Fluorescent Protein

DsRedFP: Red Fluorescent Protein

EMS: Ethylmethane Sulphomate

PHẦN I: MỞ đẦU

1.1 đặt vấn ựề

Guồng quay của lịch sử ựang từng ngày thay ựổi nhanh chóng theo hướng ngày càng hiện ựại và sung túc hơn thì cuộc sống tinh thần của con người cũng ngày càng phong phú và ựang dạng hơn Cuộc sống tinh thần của con người phát triển theo hướng yêu thắch và tìm tòi cái ựẹp của cuộc sống, trong ựó có thú chơi hoa tao nhã và tinh tế Mỗi loài hoa có những ý nghĩa và vẻ ựẹp riêng có thể kể ựến như ly, hồng, lan và không thể không kể ựến loài hoa cẩm chướng

Hoa cẩm chướng còn có tên gọi là hoa phăng là nhóm hoa cắt cành phổ biến không kém hoa hồng, hoa cúc trên thế giới Hiện nay, trên thế giới có khoảng hơn 300 loài với rất nhiều giống lai khác nhau, và ựược trồng phổ biến ở rất nhiều nước trên thế giới như Italia, Thổ Nhĩ Kỳ, Trung Quốc , ở nước ta chúng cũng ựược trồng ở nhiều ựịa phương như: Hà Nội, Nam định, Hải Phòng,

đà Lạt, Sapa [10]

Hiện nay ở nước ta trồng hoa cẩm chướng cho hiệu quả kinh tế cao, tuy nhiên cũng như trồng các loài hoa khác những bất thuận về ựiều kiện tự nhiên cũng như sâu bệnh hại luôn là những bất cập ựặt ra khi trồng cẩm chướng Nước

ta sở hữu một nền khắ hậu nhiệt ựới ẩm gió mùa nên khi trồng cẩm chướng chúng rất dễ dàng bị nhiều loài sâu bệnh tấn công, trong ựó phải kể ựến bệnh

héo rũ do nấm Fusarium oxysporum gây nên

Nấm Fusarium oxysporum f.sp dianthi là loài gây hại cho các vùng trồng hoa

cẩm chướng ở Italy, Israel, Colombia, Hà Lan, Nhật BảnẦ[15] Nguồn bệnh của loài nấm này thường bảo tồn chủ yếu là dạng hạch nấm, sợi nấm và hậu bào

tử ở trong ựất và trong tàn dư cây bệnh, do vậy, việc phòng trừ nấm bệnh cho cây gặp rất nhiều khó khăn và thường phải sử dụng các biện pháp xử lý ựất trồng bằng các loại hoá chất ựộc hại như methyl bromide ựể xử lý (50-70gr/m2),

hay foocmon nó gây nên vấn nạn về ô nhiễm môi trường Vì vậy, ựể giải quyết triệt ựể vấn ựề này cần tạo ra các giống chống chịu với nấm bệnh này Một trong những phương pháp sàng lọc là sử dụng phương pháp in vitro với việc bổ sung các ựộc tố của tác nhân gây bệnh vào môi trường nuôi cấy nhằm rút ngắn thời gian sàng lọc, chi phắ và không phụ thuộc vào ựiều kiện tự nhiên

Trên thế giới ựã có nhiều nghiên cứu về nấm Fusarium trên nhiều ựối tượng

cây trồng khác nhau tuy nhiên những vấn ựề này ở Việt Nam còn tương ựối mới

mẻ ựặc biệt trên ựối tượng hoa cẩm chướng Do ựó, việc nghiên cứu ảnh hưởng

của nấm Fusarium oxysporum ựến sinh trưởng phát triển của các dòng cẩm

chướng sẽ là cơ sở ựể có thể chọn lọc và tạo ra ựược dòng hoa cẩm chướng có

ựặc tắnh tốt và có khả năng chống chịu nấm bệnh Fusarium oxysporum

Dựa trên cơ sở ựó tôi tiến hành nghiên cứu ựể tài: ỘNghiên cứu ảnh hưởng

của dịch chiết nấm Fusarium oxysporum ựến sinh trưởng, phát triển và tắnh chống chịu nấm bệnh của một số dòng cẩm chướng ựột biến trong môi trường

in vitroỢ

1.2 Mục ựắch và yêu cầu của ựề tài

1.2.1 Mục ựắch

Xác ựịnh ựược ảnh hưởng của nấm Fusarium oxysporum ựến sinh trưởng

phát triển của các dòng cẩm chướng ựột biến trong ựiều kiện in vitro làm cơ sở cho việc ựánh giá khả năng chống chịu nấm bệnh của chúng

1.2.2 Yêu cầu

- Tách chiết ựược dịch nuôi cấy nấm bệnh Fusarium oxysporum

- đánh giá ựược sự sinh trưởng phát triển của các dòng cẩm chướng

nghiên cứu trên môi trường chứa dịch nấm bệnh Fusarium oxysporum ở các

nồng ựộ khác nhau qua 2 chu kỳ nuôi cấy

- Xác ựịnh ựược khả năng ra rễ in vitro của các dòng cẩm chướng sàng lọc

ựược khi nuôi cấy trên môi trường ra rễ chứa dịch nấm bệnh Fusarium

oxysporum ở các nồng ựộ khác nhau

- đánh giá ựược khả năng chống chịu nấm bệnh của các dòng cẩm chướng ựược sàng lọc trong vườn ươm

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ựề tài

1.3.1 Ý nghĩa khoa học

Ứng dụng phương pháp nuôi cấy mô ựể phát hiện ựược tương tác giữa dịch

nấm bệnh Fusarium oxysporum với sự sinh trưởng, phát triển của các dòng cẩm

chướng ựột biến trong ựiều kiện in vitro Các kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp những dữ liệu cơ bản làm cơ sở ựể ựánh giá khả năng chống chịu bệnh của các dòng cẩm chướng nghiên cứu

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Cung cấp thêm một phương thức hiệu quả ựể sàng lọc nguồn nguyên liệu

có khả năng chống chịu nấm bệnh Fusarium oxysporum phục vụ công tác chọn

tạo giống cẩm chướng

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu chung về cây cẩm chướng

2.1.1 Phân loại thực vật

Cây cẩm chướng, hay còn gọi là hoa Phăng, có tên tiếng Anh: Carnation, có

tên khoa học là Dianthus caryophyllus L, thuộc chi: Dianthus, họ:

Caryophyllaceae, bộ: Sentrospenmea ( Nguyễn Xuân Linh, 1999) [7]

2.1.2 Nguồn gốc

Hoa cẩm chướng có nguồn gốc ở địa Trung Hải, ựược bắt ựầu nuôi trồng từ thế kỷ XVI Năm 1750, các nhà làm vườn Pháp lần ựầu tiên ựã tạo ra giống cẩm chướng Remontant, cây cao, ra hoa nhiều lần trong năm đến 1846, họ ựã nuôi trồng ựược rất nhiều giống cẩm chướng hoang dại và ựiều khiển chúng ra hoa quanh năm Năm 1852, cây cẩm chướng từ châu Âu ựược nhập vào Mỹ Tại ựây hàng trăm giống hoa cẩm chướng mới với các hình dạng và màu sắc khác nhau

ựã ựược tạo ra, trong ựó các giống như North, Berwick, Maine và William Sim

ựã trở thành những giống hàng ựầu Từ những giống này, người ta ựã gây ựột biến và lai tạo ra rất nhiều giống cẩm chướng khác nhau trong ựó có các giống thuộc dòng Sim nổi tiếng nhất và ựược trồng khắp nơi trên thế giới [3]

Ở Việt Nam, hoa cẩm chướng ựược người Pháp ựưa vào trồng từ ựầu thế kỷ XIX, chủ yếu trồng ở những nơi có khắ hậu mát mẻ như đà Lạt, SaPa Những năm gần ựây, cẩm chướng ựã ựược trồng ở nhiều vùng trong cả nước [2]

2.1.3 đặc ựiểm thực vật học của cây hoa cẩm chướng

* Rễ cẩm chướng

Cẩm chướng có bộ rễ chùm, có rất nhiều nhánh phát triển mạnh ựể hút nước, dinh dưỡng Chiều dài của rễ 15-20 cm, phân bố tập trung ở tầng ựất mặt 20 cm, một số ắt có khả năng ăn sâu tới 40 Ờ 45 cm Ở trạng thái bình thường rễ và tán cây tỷ lệ tương ựương Nếu ựất quá nhiều phân, nhiều nước

rễ sẽ sinh trưởng không tốt Nhiệt ñộ ñất cao cũng ảnh hưởng ñến sự sinh trưởng, phát triển của rễ

* Thân cẩm chướng

Thân thảo, thân thẳng ñứng, phân nhánh nhiều, chiều cao cây khoảng 30 –

100 cm (tùy theo giống) và nửa hóa gỗ Thân rất dễ gẫy ở ñốt Các ñốt cẩm chướng thường gẫy khúc Thân thường có màu xanh nhạt, bao phủ một lớp phấn trắng xung quanh, có tác dụng chống thoát hơi nước và bảo vệ cây khỏi sâu bệnh

* Lá cẩm chướng

Lá kép mọc từ ñốt thân, lá mọc ñối Phiến lá dày hình lưỡi mác, mép lá trơn Mặt lá nhẵn không có ñộ bóng Trên mặt lá có phủ một lớp phấn trắng, mỏng và mịn có tác dụng làm giảm thoát hơi nước Tốc ñộ sinh trưởng của lá phụ thuộc vào thời tiết: mùa xuân, mùa hè thường 4-5 ngày, mùa thu, mùa ñông từ 7-10 ngày ra một ñôi lá

* Hoa cẩm chướng

Có 2 dạng hoa chính: hoa chùm và hoa ñơn Cánh hoa có thể xếp làm 2 loại: hoa ñơn hoặc hoa kép Hoa ñơn mọc từng chiếc một, hoa chùm có nhiều hoa trên một cành Hoa nằm trên ñầu cành và có nhiều màu sắc hoa khác nhau Ngay

cả trên một hoa cũng có thể có 2-3 màu khác nhau Hoa ñẹp, có mùi thơm thoang thoảng Nụ hoa có ñường kính 2-2,5 cm Khi hoa nở hoàn toàn có ñường kính 6-7

cm Chiều cao bông hoa (tính từ ñốt trên cùng của cành) khoảng 4 – 7,5 cm

* Hạt cẩm chướng

Hạt cẩm chướng nhỏ, nằm trong quả Mỗi quả thường có từ 300 – 600 hạt

2.1.4 Yêu cầu ngoại cảnh của hoa cẩm chướng

* Nước

Hàm lượng nước trong lá cẩm chướng chiếm khoảng 70 – 80%, trong cành

68 – 70%, trong rễ 80% Nước có vai trò vô cùng quan trọng ñối với cây trồng nói chung và cây hoa cẩm chướng nói riêng Ẩm ñộ thích hợp 60 – 70%, ẩm ñộ tối thích 70%

2.1.5 Tình hình sản xuất hoa cẩm chướng trong và ngoài nước

2.1.5.1 Tình hình sản xuất hoa cẩm chướng trên thế giới

Trong số các loại hoa, cẩm chướng là loại hoa ñược trồng rộng rãi và là một trong bốn loại hoa cắt cành chủ yếu trên thế giới (chiếm khoảng 17% tổng sản lượng hoa cắt) (Tạp chí hoa cây cảnh) [6] Cẩm chướng là loài hoa chủ lực phối hợp với hoa lay ơn, hoa baby làm thành lãng hoa, bó hoa, vòng hoa, hoa cài cùng các tác phẩm nghệ thuật trong ngày lễ, ngày tết, dịp sinh nhật…

Với sự ựa dạng về màu sắc và hương thơm cẩm chướng mang ựến cho người ta cảm giác khoẻ khoắn, ấm áp và lành mạnh Vì vậy các nước trồng nhiều hoa ựều có trồng loại hoa này

Ở Kenya, diện tắch trồng hoa cẩm chướng chủ yếu tập trung ở Ritf Valley Cây cẩm chướng cảnh ựược trồng ngoài ựồng không bảo vệ ở ựộ cao 1800m và cẩm chướng thường ựược trồng trong nhà plastic ở ựộ cao 2700m so với mực nước biển [18]

Italia là nước có diện tắch trồng hoa cẩm chướng nhiều nhất, năm 1995 sản lượng hoa cắt của nước này ựạt 2500 triệu cành

Ở Hà Lan, tuy diện tắch trồng hoa cẩm chướng không bằng diện tắch trồng hoa tulip nhưng sản lượng cũng ựạt trên 1800 triệu cành/năm, ựứng thứ hai trên thế giới và có xuất khẩu sang châu Âu, Bắc Mỹ và Nhật Bản

Ở Ba Lan, cẩm chướng chiếm 60% sản lượng hoa cắt, mỗi năm nước này sản xuất ựược khoảng 400 triệu cành ựứng thứ 3 trên thế giới (đặng Văn đông

và đinh Thế Lộc, 2003) [3]

Colombia là nước trồng cẩm chướng cho hoa tốt nhất thế giới và ựược gọi là thiên ựường của hoa cẩm chướng, chiếm tỷ lệ 40% tổng lượng hoa xuất khẩu Với ựiều kiện tự nhiên rất phù hợp, cây cẩm chướng ựã phát triển trên 25 năm, năm 1986 ựã có diện tắch gần 1000ha, cẩm chướng ựược trồng trong nhà che plastic [26]

Ở Thổ Nhĩ Kỳ, hoa cẩm chướng ựược trồng rộng rãi từ năm 1925, hiện nay diện tắch hoa cẩm chướng chiếm tỷ lệ 21% ựứng thứ 2 sau hoa hồng (24%) [24]

Ở Châu Á, hoa cẩm chướng ựược trồng nhiều ở Trung Quốc, Malaysia, SrilankaẦ Riêng Trung Quốc, hoa cẩm chướng cùng hoa hồng là hai loại hoa phổ biến nhất Cẩm chướng chiếm khoảng 25% tổng lượng hoa trên thị trường tại Bắc Kinh và Côn Minh Trung tâm sản xuất hoa cẩm chướng tập trung ở Côn

Minh và Thượng Hải Hầu hết các giống của Trung Quốc ựược nhập từ Israel,

Ngược lại, ở Philippin, cây cẩm chướng trồng ựược rất ắt và phải nhập khẩu từ các nước khác Tỷ lệ nhập khẩu hoa cẩm chướng là 22,05% ựứng thứ 2 trong tổng giá trị nhập khẩu hoa chỉ ựứng sau hoa cúc (36,98%) Năm 1996, lượng hoa cẩm chướng nhập khẩu của Philippin từ Hà Lan là 7691kg ( khoảng

620000 cành), từ Malaysia 5097kg (khoảng 260000 cành), từ Autralia 638kg (khoảng 32000 cành) và New Zealand 80kg (khoảng 4000 cành) (Teresita L Rosario (1998)

Tại Srilanka, hoa cẩm chướng là cây hoa ôn ựới quan trọng nhất Hoa cẩm chướng ựược trồng chủ yếu ựể xuất khẩu, còn các loại hoa khác chỉ tiêu thụ ựược ở nội ựịa Hai giống cẩm chướng châu Mỹ và cẩm chướng địa Trung Hải của Srilanka rất nổi tiếng trên thị trường thế giới Một phần diện tắch hoa cẩm chướng khá lớn ựược trồng trong môi trường bảo vệ hoàn toàn

2.1.5.2 Tình hình sản xuất hoa cẩm chướng tại Việt Nam

Ở Việt Nam, hoa cẩm chướng ựược trồng rộng rãi ở Hà Nội, Hải Phòng, đà Lạt, thành phố Hồ Chắ Minh Các vùng chuyên hoa như An Hải (Hải Phòng), Tây Tựu- Từ Liêm, Phú Thượng Ờ Tây Hồ (Hà Nội) trồng nhiều hoa cẩm chướng Trước ựây, vào mùa hè, hoa cẩm chướng trên thị trường nước ta chủ yếu phải nhập từ Côn Minh (Trung Quốc) và Hà Lan, vài năm gần ựây, ựể ựáp ứng nhu cầu thị trường cẩm chướng ựã ựược trồng ở đà Lạt, Lào Cai, SaPa và ựang dần chiếm lĩnh thị trường trong nước [13]

Hiện nay, ở nước ta ựã tiến hành trồng ựược 3 loài Dianthus làm hoa cảnh

tại đà Lạt là Dianthus barbatus L., D.sinensis L và D.caryophyllus L.Cây hoa

cẩm chướng phát triển ở vùng có ựộ cao khác nhau tuy nhiên chất lượng hoa khác nhau Vì vậy, tùy thuộc nên phổ biến cho người trồng hoa biết thêm những ựặc ựiểm về các loài hay giống cẩm chướng này ựể trồng cho phù hợp [10]

Tại đà Lạt, diện tắch trồng cẩm chướng ựạt 50ha chủ yếu trồng trong nhà che plastic, hàng năm cung cấp từ 100-120 triệu cành cẩm chướng cung cấp cho thị trường tiêu dùng (Dalat cut flower 2007)

Trồng hoa cẩm chướng sau 3 - 4 tháng ựã bắt ựầu cho thu hoạch Một sào Bắc Bộ trong một vụ cho thu từ 96000 - 120000 bông Như vậy thâm canh ựúng

kỹ thuật thì mỗi vụ phần lãi thu ựược là 17 - 30 triệu ựồng/sào [8]

Trước nhu cầu của thị trường, trong hai năm 2010-2011, Trung tâm Ứng dụng tiến bộ khoa học tỉnh Hải Dương ựã nghiên cứu và triển khai ựề tài khoa học "Xây dựng mô hình trồng thử nghiệm giống hoa Cẩm chướng đài Loan nhập nội và nhân rộng mô hình trồng hoa ựồng tiền trên ựịa bàn tỉnh Hải Dương" Mô hình này ựã ựem lại hiệu quả kinh tế rất cao tổng thu trên một sào Bắc bộ ựạt 13,5 triệu ựồng

đến năm 2011 Cẩm chướng và hoa cúc các loại là 2 mặt hàng ựược xuất khẩu nhiều nhất sang thị trường đài Loan trong 3 tháng qua Kim ngạch xuất khẩu hoa cẩm chướng ựạt 54,3 nghìn USD, tăng 7,1% so với cùng kỳ 2010 Xuất khẩu hoa cúc ựạt 24,7 nghìn USD, giảm 18,8% so cùng kỳ [40]

Có thể nói, cẩm chướng là loại hoa có triển vọng sản xuất cũng như không thể thiếu trong danh mục các loại hoa cắt cành xuất khẩu ở nước ta Như vậy có thể thấy cẩm chướng là một loại hoa có tiềm năng phát triển rất lớn, và

có ý nghĩa vô cùng quan trọng trong việc phát triển ngành sản xuất hoa của nước

ta nói riêng và thế giới nói chung

2.2 Giới thiệu chung về nấm Fusarium oxysporum

2.2.1 Phân loại

Về ñặc ñiểm của nấm C.Booth năm 1977 – 1979 ñã chú ý vào bản chất tế bào phân sinh mà từ ñó sinh ra bào tử nhỏ, là một trong những chỉ tiêu ñầu tiên ñể

phân loại nấm trên cơ sở ñó ông cho rằng nấm Fusarium oxysporum có số lượng

90 loài Burgess và cộng sự (1994) ñã ñưa ra cơ sở phân loại nấm Fusarium

oxysporum gồm 7 chỉ tiêu như sau:

1 Hình thành bào tử lớn

2 Hình thành bào tử nhỏ

3 Hình dạng và kiểu bào tử nhỏ

4 Kích thước của bào tử nhỏ

5 Sự có mặt hay không có mặt của bào tử hậu trên môi trường PGA

6 ðường kính tản nấm trên môi trường PGA

7 Hình thái tản nấm

Nấm Fusarium oxysporum ban ñầu gồm hơn 100 loài ñược mô tả dựa trên

kiểm nghiệm về cấu trúc của ổ sinh bào tử lớn là thực vật Theo phân loại của Weollenneper Reikinh (1935) số loài giảm xuống còn 65 loài, 55 giống và 22 dạng Bằng phương pháp cấy truyền ñơn bào tử dùng trong hệ thống phân loại

của Synder và Hanser ñã bổ sung sự giống và khác nhau giữa các loài Fusarium

oxysporum, Synder và Hanser ñã ñề nghị giảm số lượng xuống còn 9 loài

2.2.2 ðặc ñiểm chung

Khi sinh trưởng trên môi trường PDA, môi trường giàu dinh dưỡng cho sợi nấm

phát triển, nấm Fusarium oxysporum thường mọc thành tản thưa hoặc dày, với màu

sắc pha giữa màu trắng và màu tím violet, có khi có màu xanh hoặc xanh ñen, Nhìn chung, các sợi nấm trên không ñầu tiên xuất hiện màu trắng, và sau ñó có thể thay ñổi nhiều màu sắc khác nhau trong một số ñiều kiện chúng có thể có màu vàng, màu kem hoặc màu da cam (Smith et al, 1988) Còn khi sinh trưởng trên môi trường CLA, môi trường nghèo dinh dưỡng, chúng ta sẽ quan sát thấy các dạng bào tử của

nấm Fusarium oxysporum Nấm Fusarium oxysporum có 3 kiểu bào tử vô tính bao

gồm: Bào tử lớn (Macroconidia), bào tử nhỏ (Microconidia), bào tử hậu (bào tử vách dày - Chlamydospores) (Burges và cộng sự, 1999; John và Breet, 2006), (Agrios,

1988) Fusarium oxysporum sinh trưởng rất nhanh 4.5 cm trong vòng 4 ngày [38]

A – B: Macroconidia; C – D: Microconidia; E – F: Microconidia in situ on CLA A –

D, scale bar = 25 µm;E – F, scale bar = 50 µm [38]

Hình 2.1 ðặc ñiểm bào tử của nấm Fusarium oxysporum

- Bào tử lớn

Bào tử lớn nhiều nhân, ngắn ñộ dài vừa phải, mảnh mai và mỏng vách, có hình lưỡi liềm hoặc thân cong, chủ yếu là ba vách ngăn, cơ bản các tế bào có cuống nhỏ, 23-54 x 3-4,5µ m [32]

Bào tử lớn ñược sinh ra từ cuống bào tử, ñầu và cuống bào tử lớn thường thuôn nhọn Một vài bào tử lớn tách rời không gắn trên cuống bào tử, những tế bào sinh sản sinh bào tử lớn có dạng thể bình (phialide)

- Bào tử nhỏ

Bào tử nhỏ ñơn nhân, ñôi khi có 2 vách ngăn, có thể hình elip, hình oval, hình cầu hay hình trứng, ñược sinh ra từ các tế bào dạng thể bình hay những cuống bào tử phân nhánh hoặc không phân nhánh, 5-12 x 2,3-3,5 µm Nấm Fusarium oxysporum giai ñoạn bào tử nhỏ giống bào tử của Cephalosporium

- Bào tử hậu

Bào tử hậu hình tròn hoặc hình trứng, vách dày, nằm tận cùng hoặc giữa sợi nấm giả Chúng có thể phát triển ñơn hoặc thành chuỗi, khi gặp ñiều kiện thuận lợi, chúng tách ra và mọc các ống mầm Bào tử hậu rất bền và tồn tại trong thời gian dài, 5-13 µm

Nấm Fusarium oxysporum không có diệp lục, dinh dưỡng dị dưỡng nên sử

dụng các chất hữu cơ sẵn có chủ yếu là các nguồn cacbon, nguồn ñạm, nguồn chất khoáng và vitamin của cây cẩm chướng thông qua tác ñộng của hệ thống các enzyme nội, ngoại bào, các ñộc tố ñể hoàn thành chu kì phát triển của chúng

trên cây trồng Chu kì phát triển của nấm Fusasium oxysporum cũng giống như

chu kì phát triển của nấm bệnh nói chung là vòng ñời bao gồm các giai ñoạn sinh trưởng, phát dục, sinh sản tuần tự kế tiếp nhau theo một trình tự nhất ñịnh

ñể trở lại giai ñoạn ban ñầu Giai ñoạn ban ñầu của quá trình sinh sản là bào tử Sau khi bào tử nảy mầm xâm nhập tiến tới giai ñoạn sinh trưởng thể dinh dưỡng (thể sợi) kí sinh phát ra triệu chứng bệnh rồi ñến giai ñoạn phát dục hình thành

cơ quan sinh sản và tạo ra các bào tử thế hệ mới vô tính tái xâm nhiễm và hữu tính (Lê Lương Tề, 2007) [11]

2.2.3 Môi trường sống

F oxysporum có thể ñược tìm thấy gần như ở khắp mọi nơi Bản ñồ phân bố

cho thấy rằng loại nấm này ñã xâm chiếm miền Bắc và Nam Mỹ, Châu Âu, Châu Phi, Châu Á, và Châu ðại Dương [34]

ðây là một loại nấm phát triển ở mọi môi trường sống, nhiệt ñộ ñất tối

ưu cho nhiễm trùng gốc là 30°C hoặc cao hơn, nhưng lây nhiễm qua hạt giống có thể xảy ra ở nhiệt ñộ thấp như 140C [39], mặc dù nó phát triển tối

ưu ở 28°C [35]

2.2.4 Cách thức xâm nhập và enzyme ngoại bào của nấm Fusarium nói chung và Fusarium oxysporum nói riêng

Giống như các nấm bệnh hại cây trồng khác, nấm Fusarium do không có

diệp lục nên chúng sử dụng các chất hữu cơ sẵn có chủ yếu là các nguồn cacbon,

nguồn ñạm, chất khoáng và vitamin của cây lily thông qua tác ñộng của hệ thống các enzyme nội, ngoại bào, các ñộc tố ñể hoàn thành chu kì phát triển của chúng trên cây trồng Chu kì phát triển của các nấm bệnh nói chung bao gồm các giai ñoạn sinh trưởng, phát dục sinh sản tiến hành tuần tự kế tiếp nhau theo một trình tự nhất ñịnh ñể trở lại giai ñoạn ban ñầu Giai ñoạn ban ñầu của chu kì thường là bào tử Sau khi bào tử nảy mầm xâm nhập, tiến tới giai ñoạn sinh trưởng thể dinh dưỡng (thể sợi) kí sinh phát ra triệu chứng bệnh rồi tới giai ñoạn phát dục hình thành các cơ quan sinh sản và tạo ra các bào tử thế hệ mới vô tính tái xâm nhiễm và hữu tính [13]

Nấm xâm nhập vào cây kí chủ bằng sợi nấm hoặc bào tử, nhưng phần lớn nấm xâm nhập bằng bào tử Trước khi xâm nhập, bào tử nấm tiếp xúc với bề mặt ký chủ, khi gặp ñiều kiện thuận lợi chúng nảy mầm thành ống mầm xâm nhập trực tiếp hoặc gián tiếp vào bên trong cây Trong quá trình xâm nhiễm gây bệnh nấm luôn tiết ra các enzyme phân hủy vách tế bào như: cutinase, pectinase, cellulase, hemicelulase, ligninase và các enzyme phân giải vật chất bên trong tế bào như: Protease, peptidase, amylase, maltase, lipase, phospholipase…

Nhiều loại nấm có thể xâm nhập trực tiếp qua bề mặt nguyên vẹn cây kí chủ nhờ lực cơ học và enzyme Một số loại nấm khác sẽ xâm nhập vào cây qua

lỗ mở tự nhiên như khí khổng, thủy khổng, bì khổng Một số khác có thể xâm nhập qua các vết thương cơ giới hoặc các vết nứt tự nhiên Bào tử nấm

Fusarium oxysporum nảy mầm thành ống mầm xâm nhập qua vết nứt hình thành

khi rễ bên nhú ra từ rễ chính

Năm 1998, các tác giả Skovgaard K và Rosendahl S (ðại học Copenhagen) ñã

chứng minh nấm Fusarium trong quá trình sống chúng tạo ra 5 enzyme nội bào:

esterase, superoxide dehydrogenase, malate dehydrogenase, dihydrolipoamide dehydrogenase và succinate dehydrogenase và 4 enzyme ngoại bào: protease, cellulase, amylase, và lipase [29]

Năm 2002, Ricardo Andrade Barata và cộng sự ñã chỉ ra rằng loài Fusarium

oxysporum var.lini sản sinh ra một loại protease kiềm có khả năng thủy phân

Nα-benzoyl-DL arginine nitroanilide Sau quá trình tinh chế, làm sạch ñã xác ñịnh trọng lượng phân tử của protein này là 41 kDa, cũng như các ñiều kiện tốt nhất cho enzyme hoạt ñộng là: nhiệt ñộ 450, pH 8 [28]

Năm 2006, Janaina Nicanuzia và cộng sự ñã xác ñịnh ñược những ñiều kiện cho sự hoạt ñộng của enzyme lipase (enzyme ñược ứng dụng trong sản

xuất chất tẩy) do loài F.oxysporum sản sinh ra: pH kiềm, nhiệt ñộ 500C, enzyme bị ức chế hoạt ñộng khi có mặt của SDS… ðiều này có ý nghĩa rất lớn vì việc sử dụng enzyme mà vi sinh vật tạo ra trong ngành công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa không những mang lại hiệu quả kinh tế mà còn không gây hại cho môi trường [21]

2.3 Tình hình bệnh hại do nấm Fusarium oxysporum gây ra

2.3.1 Tình hình gây bệnh của nấm Fusarium oxysporum ñối với các cây

trồng nói chung

F oxysporum ñóng vai trò của một sát thủ thầm lặng - các chủng gây bệnh

của loại nấm này có thể không hoạt ñộng trong 30 năm trước khi trở lại ñộc tính

và lây nhiễm F oxysporum khét tiếng là gây ra một tình trạng gọi là bệnh héo

Fusarium, ñó là gây tử vong một cách nhanh chóng cho các cây trồng - bởi thời

gian một cây trồng cho thấy bất kỳ dấu hiệu bên ngoài của nhiễm trùng, nó ñã

quá muộn, và cây trồng sẽ chết Ngoài ra, F oxysporum không phân biệt ñối xử,

nó có thể gây bệnh gần như cho mọi cây trồng nông nghiệp quan trọng [33]

Ngoài ra, bào tử F oxysporum có thể tồn tại trong không khí trong thời gian dài Tóm lại, bệnh héo Fusarium oxysporum là một gánh nặng tài chính cho

người nông dân, ñiều này làm tăng chi phí sản xuất nông nghiệp mà cuối cùng làm tăng giá thành sản phẩm

Bệnh héo cây trồng do nấm Fusarium oxysporum gây ra là một trong những

loại bệnh phổ biến và nguy hiểm gây thiệt hại lớn cho nhiều loại cây trồng Do phổ

ký chủ rộng, nó có thể xâm nhiễm ký sinh gây hại trên nhiều loại cây trồng khác nhau, trong ñó có nhiều loại cây trồng ñặc biệt có giá trị như lạc, vừng, cà chua, khoai tây…(Nguyễn Thị Kim Thoa và cộng sự, 2007) [11]

Các bệnh héo Fusarium do các dạng loài của F oxysporum gây ra Mỗi dạng loài thường chỉ có thể gây héo trên một loài ký chủ Ví dụ: F oxysporum f sp Lycopersici héo trên cây cà chua, F oxysporum f sp.dianthi héo trên cây cẩm chướng

Hình 2.2 Bệnh do các loại nấm Fusarium gây ra

a: héo trầm trọng gây chết cây, b: thân cây héo với nhiều khối bào tử sinh màu trắng

trên bề mặt Héo Fusarium f.sp pisi gây héo ñậu Hà Lan, c: các triệu chứng héo trên ñồng ruộng (chú ý các ñám cây chết), d: hóa nâu mạch dẫn ở cành bị héo, e: Fusarium f.sp pisi gây héo ñậu Hà Lan, f: quả thể của F gramjnearum trên thân ngô; Héo Fusarium trên chuối do

Fusarium oxysporum f.sp cubenseg: các triệu chứng héo trầm trọng, h: các triệu chứng nứt

thân, k: khối bào tử phân sinh Fusarium oxysporum f.sp.zingiberi trên củ gừng [1]

D

- Bệnh héo vàng do nấm F.oxysporum schlecht gây hại trên khoai tây, làm

giảm 40% năng suất khoai tây (Lê Lương Tề, 2007) [11]

Fusarium oxysporum là loài nấm Fusarium gây bệnh trên cây trồng vùng Hà Nội

năm 2002 -2003 ựược đỗ Tấn Dũng nghiên cứu gồm 11 loài cây với mức ựộ gây hại

khác nhau Một số cây ký chủ của loài nấm Fusarium ựược phát hiện ở vùng Hà Nội

là cây khoai lang, hoa loa kèn, cây riềng, cây cỏ lồng vực, cây ựinh lăng [4]

Ước tắnh thiệt hại cho sản xuất cây trồng do nấm Fusarium oxysporum gây ra

khoảng 5-12% Mặc dù ựã áp dụng nhiều biện pháp kỹ thuật canh tác nhằm giảm thiểu mức ựộ thiệt hại như thay ựổi cơ cấu mùa vụ, sử dụng giống cây trồng ắt mẫn cảm, tuy nhiên hiệu quả ựạt ựược lại rất thấp do bản thân mầm bệnh có thể tồn tại trong môi trường một thời gian rất dài, khi gặp ựiều kiện thuận lợi sẽ bùng phát trở lại (John và Breet, 2006) [22]

2.3.2 Tình hình gây bệnh và một số nghiên cứu về ảnh hưởng của nấm

Fusarium oxysporum ựến cây cẩm chướng

Nấm Fusarium oxysporum dianthi là loài gây hại cho các vùng trồng hoa cẩm

chướng ở Italy, Israel, Colombia, Hà Lan, Nhật Bản,Ầ(Annalisa và cộng sự, 1999) [15]

Trên cây hoa cẩm chướng, tác nhân gây bệnh héo rũ bao gồm nhiều loại nấm

thuộc loài Fusarium.sp như: nấm Fusarium oxysporum dian, nấm Fusarium

avennaceum, nấm Fusarium poace nấm Fusarium graminearum Với mỗi loại

nấm thì chúng gây hại trên các bộ phận với dấu hiệu và triệu chứng khác nhau

Nấm Fusarium avennaceum làm héo và rụng ở nách cây, thối ựọt và nhánh bị cắt của những cây già, nấm Fusarium graminearum làm mục thân, héo ựọt với biểu hiện là các sọc ựỏ tắa dọc theo thân, nấm Fusarium poace làm búp hoa có

màu nâu úa, thối, cánh hoa nở không ựều nhau (Hiệp hội hoa đà Lạt) Nấm

Fusarium oxysporum dianthi làm cành úa dẫn ựến cây chết

Nấm Fusarium oxysporum phân bố ựa số trên các ựới khắ hậu, chúng có khả

năng thay ựổi tắnh biến dị về ựặc ựiểm hình thái và sinh lý do sự khác nhau về ựiều kiện tự nhiên của từng vùng (Burges và cộng sự, 1999) [17]

Trên thế giới và ở Việt Nam ựã có những công trình nghiên cứu về ảnh hưởng

của nấm Fusarium oxysporum ựến cây cẩm chướng:

- Kiểm soát Fusarium oxysporum f sp dianthi qua việc khử trùng ựất bằng

việc bổ sung một lượng nhỏ metan natri và methyl bromide Bệnh quan trọng

nhất ựối với cây cẩm chướng vẫn là bệnh do nấm Fusarium oxysporum f sp

dianthi gây nên Bài viết này so sánh việc xông hơi khử trùng ựất truyền thống

với methyl bromide ựược ựề nghị (70 g /m2) và việc bổ sung methyl bromide (14 g/m2, 28 g/m2) hoặc metam natri (35 g/m2, 70 g/m2) trong ựất bị nhiễm

Fusarium oxysporum f sp dianthi Tập trung vào khử trùng ựất, ựặc biệt với

liều cao methyl bromide, ựồng thời sử dụng giống chống chịu hoặc kháng nấm

ựã cải thiện ựược ựáng kể việc chống chịu nấm bệnh của cây trồng [37]

Garibaldi và Denmik ựã xác ựịnh ựược hai chủng nấm Fusarium

oxysporum.sp gây hại cho cây cẩm chướng phổ biến ở Italia và một số khu vực

của châu Âu Chúng là tác nhân gây hại nhất trong ựất ựối với cây cẩm chướng

Chúng làm tác mạch dẫn của cây và gây bệnh héo Fusarium (Garibaldi, 1977;

1983; Denmik et al., 1989) [19]

Tác giả Wenner và Irzykowska ựã sử dụng kỹ thuật RAPD phân tắch tắnh ựa

hình và ựã phân biệt ựược các chủng nấm Fusarium oxysporum gây hại trên cây

hoa cẩm chướng (Wenner và Irzykowska, 2007) [31]

đã chuyển ựược gen chỉ thị của Fusarium oxysporum.f.sp.dianthi với hệ

thống GFP và DsRedFP vào cây cẩm chướng ựể phát hiện ựược sự tồn tại của chúng trong mạch dẫn (Sarrocco và cộng sự, 2007) [29]

Thakur và cộng sự ựã tiến hành nuôi cấy và tái sinh thành công cẩm chướng

trên môi trường có nấm Fusarium oxysporum.f.sp.dianthi trong ựiều kiện in

vitro: Callus của cẩm chướng ựược nuôi cấy trong môi trường MS + 0,5mg/l

NAA + 0,5 mg/l 2,4-D và bổ sung 0%, 5%, 7,5%, 10%, 12,5%, 15%, 17,5% và 20% (v/v) trong 25 ngày với nhiệt ñộ 23 -27oC Kết quả, ở nồng ñộ 15%v/v trở lên thấy xuất hiện có callus màu xanh và các callus màu vàng xuất hiện ở nồng

ñộ 15%v/v trở lên Ở nồng ñộ 20%v/v chỉ có một vài callus sống sót Tiến hành nuôi cấy và chọn lọc tiếp ở các chu kỳ tiếp theo (hơn 2 chu kỳ với 25 ngày/chu kỳ) Các callus sống sót ñược nuôi cấy trên môi trường tái sinh sau ñó ñược chuyển ra kiểm chứng trong ñiều kiện in vivo (Thakur và cộng sự, 2002) [23] Mercuri và cộng sự ñã tiến hành nuôi cấy hạt phấn của 8 loại hoa cẩm chướng trên môi trường nảy mầm bổ sung dịch nấm ở các nồng ñộ 0%, 7,5%, 15%, 30% và cho thấy rằng sàng lọc các giống kháng thông qua khảo nghiệm phấn hoa thu ñược kết quả rất khả thi (Mercuri và cộng sự)

Mosquera và cộng sự ñã tiến hành tuyển chọn giống kháng nấm Fusarium

oxysporum.f.sp.dianthi bằng cách ñồng nhất lá cẩm chướng và dịch nấm ñã ñược

nuôi cấy trong 7 ngày, sau ñó bổ sung vào môi trường tái sinh với nồng ñộ từ 0% ñến 40%v/v rồi hấp vô trùng Sau ñó tiến hành nuôi cấy và thu ñược kết quả:

Ở nồng ñộ cao nhất, không có sự cảm ứng callus và tái sinh cây con Ở các nồng

ñộ còn lại, có ñến 10% callus cảm ứng và 5% cây con tái sinh Những cây con này có ñặc ñiểm hình thái và sinh lý ví dụ như sức sống và khả năng tái sinh rất nhanh (Mosquera và cộng sự) [26]

Các nhà nghiên cứu tại Viện Nghiên cứu Nông nghiệp Quốc gia Pháp (INRA) ñã phát triển một phương pháp sinh học ñể kiểm soát các chủng gây

bệnh của Fusarium oxysporum Fusarium oxysporum là một loại nấm phổ biến

mà ñược tìm thấy trong các loại ñất trên toàn thế giới Một trong số nhiều chủng của nó là gây bệnh, trong khi những chủng khác là không gây bệnh và có thể bảo vệ thực vật chống lại nhiễm trùng do một chủng gây bệnh Hiện tượng bảo

vệ này ñã ñược biết ñến trong nhiều năm, và bây giờ các nhà khoa học ñã cô lập một chủng gọi là Fo47 mà cung cấp sự bảo vệ ñặc biệt hiệu quả [36]

Tác giả ðồn Thị Thanh đã tiến hành phân tích đa dạng di truyền gen đối với

các lồi nấm Fusarium của Việt Nam và các nước khác thơng qua việc sử dụng

kí thuật PCR và nhân bản DNA Kết quả chuẩn đốn được 4 lồi nấm

Fusarium.sp như: Fusarium oxysporum.f.sp.arpense trên chuối ở Việt Nam, Fusarium moniliforum ở hành ta, cỏ đinh lăng ở Việt Nam, Ai Cập, Hàn Quốc,

nịi Fusarium solani ở trên cây khoai tây, cà chua ở 3 nước trên và Fusarium

avanaceum ở Hàn Quốc [12]

Khi nghiên cứu về khả năng sinh enzyme ngoại bào: amylase, protease,

cellulose từ nấm Fusarium Nguyễn Thị Hương Giang đã xác định: Trong

khoảng 4 đến 5 ngày nuơi cấy lượng enzyme amylase, protease, cellulose được sinh ra nhiều nhất Hiệu số đường kính vịng phân giải đo được lớn nhất vào ngày thứ tư, enzyme cellulase là 14 mm, enzyme amylase là 14.5 mm, thấp nhất

là enzyme protease với 6mm [5]

KS Bùi Thị Thanh Quyên đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của dịch

nuơi cấy nấm bệnh Fusarium oxysporum đến khả năng sống sinh trưởng của một

số dịng cẩm chướng đã xử lý đột biến bằng tia gamma trong điều kiện in vitro

và đạt được kết quả: đã phân lập, làm thuần thành cơng được chủng nấm bệnh

Fusarium oxysporum từ cây cẩm chướng; xác định được dịch nuơi cấy nấm Fusarium oxysporum cĩ ảnh hưởng đến khả năng sống và sinh trưởng của các

dịng cẩm chướng nghiên cứu và xác định được ngưỡng LD50 của cây cẩm chướng in vitro là khi bổ sung vào mơi trường nuơi cấy 30%v/v dịch nuơi cấy

nấm Fusarium oxysporum [9]

PHẦN III ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu, ñịa ñiểm và thời gian nghiên cứu

3.1.1 Vật liệu nghiên cứu

ðoạn thân mang mắt ngủ của các cây cẩm chướng in vitro

3.1.2 ðối tượng nghiên cứu

Thí nghiệm ñược tiến hành trên các dòng cẩm chướng ñã ñược xử lý ñột biến E1, E16, Sp5 và giống ðỏ

Các dòng ñột biến ñược xử lý ñột biến như sau:

3.1.3 ðịa ñiểm nghiên cứu

- Phòng nuôi cấy mô và phòng sinh học phân tử của Viện Công nghệ sinh học - ðại học Nông nghiệp Hà Nội

- Khu thí nghiệm của khoa Công nghệ sinh học – ðại học Nông nghiệp

Hà Nội

3.1.4 Thời gian nghiên cứu

Từ tháng 6/2011 – tháng 4/2012

3.2 Nội dung nghiên cứu

Thí nghiệm 1: Nuôi cấy và tách chiết ñược dịch nấm Fusarium oxysporum

gây bệnh trên cây cẩm chướng

Nuôi cấy mẫu nấm Fusarium oxysporum ñã ñược phân lập và làm thuần

trên môi trường PDA ñặc ñể hoạt hoá tăng khối lượng, sau ñó ñể tiến hành nuôi cấy chúng trong môi trường PDA lỏng ñể tăng sinh khối Sau khoảng 7 – 10 ngày tiến hành lọc dịch ñể thu dịch chiết

Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy nấm Fusarium oxysporum

ñến khả năng sống, sinh trưởng in vitro của các dòng, giống cẩm chướng nghiên cứu

Mỗi dòng, giống ñược tiến hành nuôi cấy trên môi trường có bổ sung dịch

nấm bệnh Fusarium oxysporum ở các nồng ñộ khác nhau trong 2 chu kỳ:

- Chu kỳ I

Chu kỳ 1 ñược bố trí như sau:

Nền môi trường là môi trường MS bổ sung 6,2g/l agar và 30g/l saccaroza,

pH = 5,8

CT1: Môi trường nền

CT2: Môi trường nền + 15% v/v dịch nấm Fusarium oxysporum

CT3: Môi trường nền + 30% v/v dịch nấm Fusarium oxysporum

CT4: Môi trường nền + 45% v/v dịch nấm Fusarium oxysporum

2 Chu kỳ II

Cây sống của các dòng, giống cẩm chướng ở chu kỳ I sau khi ñược phục hồi qua môi trường MS bổ sung 6,2g/l agar và 30g/l saccaroza, pH = 6,2 ñược tiếp tục nuôi cấy chu kỳ II trên các môi trường sau:

CT1: Môi trường nền

CT2: Cây sống CT2 chu kì I + 30% v/v dịch nấm Fusarium oxysporum CT3: Cây sống CT2 chu kì I + 45% v/v dịch nấm Fusarium oxysporum CT4: Cây sống CT2 chu kì I + 45% v/v dịch nấm Fusarium oxysporum

Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy nấm Fusarium oxysporum ñến

khả năng ra rễ in vitro của các dòng cẩm chướng nghiên cứu

Cây sống của các dòng, giống cẩm chướng ở chu kỳ 2 sau khi ñược nuôi cấy phục hồi qua môi trường MS bổ sung 6,2g/l agar và 30g/l saccaroza, chuẩn

pH = 6,2 thì sẽ chuyển nuôi cấy trên môi trường ra rễ có bổ sung 30% dịch nấm Thí nghiệm ñược bố trí như sau:

Nền môi trường là môi trường MS bổ sung 6,2g/l agar, 30g/l saccaroza , 0,5g/l than hoạt tính và 0,5 mg/l α-NAA, pH = 6,2

CT1: Môi trường nền

CT2: Cây sống CT2 chu kì II + 30% v/v dịch nấm Fusarium oxysporum CT3: Cây sống CT2 chu kì II + 30% v/v dịch nấm Fusarium oxysporum CT4: Cây sống CT2 chu kì II + 30% v/v dịch nấm Fusarium oxysporum

Kết thúc thí nghiệm 3 sẽ phân lập ñược mẫu cẩm chướng có khả năng

chống chịu nấm Fusarium oxysporum trong ñiều kiện in vitro

Thắ nghiệm 4: đánh giá khả năng chống chịu nấm bệnh bằng lây nhiễm nhân tạo

Sử dụng mẫu cẩm chướng ựã ựược nuôi cấy sau thắ nghiệm 3 trồng trong vườn ươm và lây nhiễm nhân tạo nấm bệnh ựể ựánh giá khả năng chống chịu của các dòng

Công thức thắ nghiệm:

CT1: Không bổ sung dịch bào tử nấm vào giá thể trồng cây

CT2: Bổ sung dịch bào tử nấm vào giá thể trồng cây

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương pháp thu dịch nuôi cấy nấm Fusarium oxysporum

thạch PDA nuôi trong ựiều kiện tối ở nhiệt ựộ 25 Ờ 30oC Sau 7 ngày nuôi cấy, mẫu nấm ựược cấy chuyển sang môi trường PDA lỏng Các thao tác ựược tiến

hành trong ựiều kiện vô trùng Bình môi trường PDA lỏng chứa nấm Fusarium

oxysporum ựược nuôi lỏng lắc 150 vòng/phút trong ựiều kiện tối ở 25 Ờ 30oC Sau 5 -7 ngày nuôi cấy tùy theo ựiều kiện nhiệt ựộ nuôi cấy, thì tiến hành lọc dịch nấm

Mẫu nấm nghiên cứu ựược lọc theo các bước sau:

Bước 1: Lọc sơ bộ

- Toàn bộ dịch nuôi cấy bao gồm cả xác nấm Fusarium oxysporum ựược lọc

2 lần qua màng gồm 3 lớp vải màn xếp chồng lên nhau Thu lấy dịch lọc, loại bỏ phần cặn bã

- Toàn bộ dịch lọc ựược lọc 2 lần qua màng lọc giấy Walkman hoặc ựem quay li tâm 15000 vòng trong 5 phút sau ựó thu lấy dịch lọc, loại bỏ cặn bã

Bước 2: Thu dịch nuôi cấy nấm Fusarium oxysporum vô trùng Minisart kắch

thước 0.2 ộm

- Dịch lọc thu ñược từ bước lọc sơ bộ ñược lọc qua màng lọc vô trùng Minisart kích thước 0.2 µm trong ñiều kiện vô trùng Thu lấy dịch nuôi cấy nấm

Fusarium oxysporum vô trùng

Thành phần các môi trường nuôi cấy nấm Fusarium oxysporum

− pH: 5,7 ± 0,1

Môi trường giàu dinh dưỡng giúp nấm phát triển mạnh hệ sợi

Phương pháp giữ giống

Môi trường giữ giống: Môi trường PDA

Cấy khuẩn lạc của chủng nấm Fusarium oxysporum ñã phân lập dựa vào

môi trường PDA trong các ñĩa petri sau ñó dán giấy parapin rồi gối vào giấy báo

và ñể trong tủ ñịnh ôn 28 – 300C trong khoảng 4,5 ngày sau ñó bảo quản trong

tủ lạnh

Giữ giống trong dung dịch gkyxeron: Dùng pipet hút dịch nấm ñã ñược nuôi trong môi trường dịch thể lỏng trong khoảng 3 ngày hút 500µm dịch

glyxerol cho vào ống efpendol 1000µm bảo quản trong tủ lạnh ở 00C sau 1 ngày, rồi chuyển sang tủ lạnh – 300C ñể khoảng 1 – 2 ngày, cuối cùng bảo quản trong

tủ lạnh sâu – 800C

3.3.2 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

Sử dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô hiện hành

- Môi trường cơ bản: MS (Muarahige & Skoog, 1963 với 6,2 g/l agar, 30 g/l sacarose và 100 mg/l innositot), pH = 5.8 – 6.0

- Môi trường ñược hấp khử trùng ở nhiệt ñộ 1210C trong 20 phút

- ðiều kiện thí nghiệm: các thí nghiệm ñược tiến hành trong ñiều kiện nhân tạo, ñiều kiện ánh sáng, nhiệt ñộ, ñộ ẩm luôn ñược giữ ổn ñịnh;

+ Cường ñộ ánh sáng: 2000 Lux

+ Thời gian chiếu sáng: 16h sáng/8h tối

+ ðộ ẩm: 70% - 80%

+ Nhiệt ñộ: 20 – 220C

3.3.3 Phương pháp lây nhiễm nhân tạo

Nấm Fusarium oxysporum ñược phân lập, làm thuần ñược nuôi cấy trên

môi trường CLA ñể nhân bào tử

* Môi trường CLA:

trùng ñể nguội dần ñến 60 -700C rồi ñổ ra các ñĩa petri nhỏ (ñường kính 6cm) ñã

có chứa sẵn 4 -5 mẫu lá cẩm chướng khô, bố trí mỗi ñĩa sao cho lá cẩm chướng dồn vào xung quanh ñĩa và nổi lên trên bề mặt thạch

Các mẫu nấm sau khi ñược cấy trên môi trường CLA ñể phát sinh bào tử ñược ñặt trong tủ ñịnh ôn 28 – 300C, trong thời gian 10 ngày Khi soi thấy bào

tử ñã mọc kín bề mặt ñĩa thì pha loãng với dung dịch huyền phù

- Dung dịch huyền phù: 0.5 g Agar + 1l nước cất Dung dịch cũng ñược hấp khử trùng ở nhiệt ñộ 1200C, 1.4 atm, trong 40 phút

- Pha loãng dung dịch huyền phù với 10 ñĩa petri nuôi cấy bào tử nấm với nồng ñộ 10ml/ 1 ñĩa Các ñĩa petri ñã chứa dung dịch huyền phù ñựơc lắc ñều và thu ñược 100ml dung dịch bào tử nấm Số lưọng dung dịch bào tử nấm này ñược pha loãng với 3 l nước, rồi ñem nhỏ vào giá thể trồng cây mỗi cây 15ml dịch bào tử

Giá thể bao gồm: 40% ñất + 30% bã nấm + 20% trấu hun + 10% NPK Giá thể ñược khử trùng qua hai bước

+ Bước 1: sấy khử trùng ở 1210C trong 3 – 5 h

+ Bước 2: hấp khử trùng ở nhiệt ñộ 1200C, 1.4 atm, trong 40 phút

Thí nghiệm ñược bố trí 10 cây trên 1 lần nhắc lại với 4 dòng: E1 ñã chọn lọc, E1 không chọn lọc, E16 ñã chọn lọc, E16 không chọn lọc

3.3.4 Phương pháp ñánh giá tính chống chịu nấm bệnh Fusarium oxysporum

3.3.4.1 Phương pháp ñánh giá khả năng sống và sinh trưởng in vitro của các dòng cẩm chướng nghiên cứu trên môi trường bổ sung dịch nuôi cấy nấm bệnh

ðược ñánh giá ở hai giai ñoạn: Nhân chồi in vitro và tạo cây in vitro hoàn chỉnh

* Giai ñoạn nhân chồi in vitro:

- Thắ nghiệm ựược tiến hành trên vật liệu là ựoạn thân mang mắt ngủ của các dòng, giống cẩm chướng nghiên cứu Các mẫu cấy ựược nuôi cấy trên

môi trường MS cơ bản bổ sung dịch nấm Fusarium oxysporum ở các nồng ựộ

khác nhau

- Hoàn thành các chỉ tiêu theo dõi về tỷ lệ sống sót, tỷ lệ bật chồi, các chỉ tiêu hình thái của các dòng cây nghiên cứu sau 1 tuần, 2 tuần, 3 tuần nuôi cấy

* Giai ựoạn tạo cây in vitro hoàn chỉnh

- Thắ nghiệm tiến hành trên vật liệu chồi mang mắt ngủ của các dòng, giống cẩm chướng ựã qua chọn lọc ở chu kỳ 2 của thắ nghiệm 2 Các dòng này ựược nuôi cấy trên môi trường ra rễ MS + 0.5 ppm α NAA/l + 0.5 g/l than hoạt tắnh, pH= 5.8 Ờ 6.0) bổ sung các nồng ựộ khác nhau của dịch nấm

- Hoàn thành các chỉ tiêu theo dõi về tỷ lệ sống sót, tỷ lệ bật chồi, các chỉ tiêu hình thái của các dòng cây nghiên cứu sau 2 tuần, 3 tuần, 4 tuần nuôi cấy

3.3.4.2 đánh giá khả năng sống, sinh trưởng của các dòng cẩm chướng tại vườn ươm sau lây nhiễm nhân tạo nấm bệnh

- Thắ nghiệm tiến hành trên vật liệu là các dòng cẩm chướng E1 và E16 ựã ựược chọn lọc in vitro của thắ nghiệm 3 Các dòng này ựược trồng trên giá thể: 40% ựất + 30% bã nấm + 20% trấu hun + 10% NPK có bổ sung dịch bào tử nấm

- Hoàn thành các chỉ tiêu theo dõi về tỷ lệ sống sót, các chỉ tiêu hình thái (chiều cao, số lá) của các dòng cây nghiên cứu sau 4 tuần nghiên cứu

3.4 Phương pháp bố trắ thắ nghiệm

- Thắ nghiệm 2 nhân tố bố trắ kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên Ba lần lặp lại cho

1 công thức Ba mươi mẫu trên 1 lần lặp lại Sau 2 tuần thu thập số liệu lần 1, sau ựó sau 1 tuần thu thập số liệu 1 lần

3.5 Các chỉ tiêu theo dõi ựánh giá

Các chỉ tiêu theo dõi ựánh giá in vitro ựối với các cây cẩm chướng của các dòng nghiên cứu

− Tỷ lệ mẫu sống (%) = (Tổng số mẫu sống/ Số mẫu cấy) *100

− Tỷ lệ mẫu chết (%) = (Tổng số mẫu chết/ Số mẫu cấy) * 100

− Tỷ lệ mẫu bật chồi (%) = (Tổng số mẫu bật chồi/Tổng số mẫu sống) * 100

− Tỷ lệ mẫu bật rễ (%) = (Tổng số mẫu tạo rễ/ Tổng số mẫu sống) *100

Các ñặc ñiểm về hình thái:

− Chiều cao (cm): ðo chiều cao chồi xuất hiện ñầu tiên, tính chiều cao TB

Chiều cao TB = Tổng chiều cao/Tổng số mẫu

− Số lá (lá): ðếm số cặp lá thật trên chồi xuất hiện ñầu tiên sau ñó nhân với 2, tính số lá TB/chồi

Số lá TB/chồi = Tổng số lá/Tổng số mẫu

− Số chồi TB/mẫu = Tổng số chồi xuất hiện/Tổng số mẫu bật chồi

− Số rễ TB = Tổng số rễ/Tổng số mẫu xuất hiện rễ

− Chiều dài rễ (cm): ðo chiều dài của rễ xuất hiện ñầu tiên sau ñó tính chiều dài rễ TB

− Chiều rễ TB = Tổng chiều dài rễ/Tổng số mẫu xuất hiện rễ

ðặc ñiểm hình thái riêng: màu sắc lá, màu sắc thân

3.6 Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu ñược tính toán trên máy tính theo chương trình Microsoft Execl và chương trình IRRISTART

PHẦN IV KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

4.1 Nuôi cấy và tách chiết dịch nấm Fusarium oxysporum gây bệnh trên cây

cẩm chướng

Khuẩn lạc của nấm Fusarium oxysporum sau khi ñược cấy trên môi

trường PAD ñặc có một số ñặc ñiểm sau:

Bảng 4.1 Một số ñặc ñiểm hình thái của nấm gây bệnh trên môi trường

PDA ñặc sau 7 ngày nuôi cấy

dày

màu phớt hồng hoặc màu hồng, có khi có màu tím violet

Màu sắc môi trường nuôi cấy Màu tím nhạt hoặc màu xanh ñen

Mặt trên của khuẩn lạc nấm Mặt dưới của khuẩn lạc nấm

Hình 4.1 Khuẩn lạc của nấm Fusarium oxysporum

- Tiến hành nuôi cấy chủng nấm gây bệnh trên môi trường PDA ở nhiệt

ñộ 30oC trong ñiều kiện tối Kết quả thu ñược thể hiện qua bảng 4.2

Bảng 4.2 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy ñến sinh trưởng của nấm

cm, trong 2 ngày từ ngày thứ 4 ñến ngày thứ 5 ñường kính tản nấm chỉ tăng

0,41cm Sang ngày thứ 6 ñường kính tản nấm Fusarium oxysporum bắt ñầu tăng

mạnh và sau 7 ngày nuôi cấy ở 30oC ñã ñạt 5,78 cm

* Tiến hành nuôi cấy chủng nấm gây bệnh trên môi trường CLA ở nhiệt ñộ

30oC trong ñiều kiện tối, sau 10 ngày nuôi cấy lấy bào tử nấm sinh ra quan sát

dưới kính hiển vi ñiện tử Kết quả thu ñược như sau:

- Bào tử lớn cong hình lưỡi liềm, có từ 3 ñến 5 vách ngăn ngang

- Bào tử nhỏ hình hạt gạo, ñơn bào, không có vách ngăn ngang

- Sợi nấm không có vách ngăn ngang

- Cành bào tử ngắn