đánh giá đặc điểm nông sinh học và so sánh trình tự gen ltp của một số dòng đậu xanh có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước

Đặc điểm, mức độ biến dị của một số tính trạng nông sinh học và yếu tố cấu thành năng suất của các dòng đậu xanh ở thế hệ R3 .... Sự thay đổi về lượng mưa trong năm và sự phân bố lượng m

TRỊNH XUÂN THẮNG

ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM NÔNG SINH HỌC VÀ SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN LTP CỦA MỘT SỐ DÕNG ĐẬU XANH CÓ

NGUỒN GỐC TỪ MÔ SẸO CHỊU MẤT NƯỚC

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2011

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Chu Hoàng Mậu

Thái Nguyên - 2011

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực, chưa được ai công bố

Tác giả

Trịnh Xuân Thắng

ơn ThS Bùi Hồng Xuyến đã cung cấp hạt của các dòng đậu xanh có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Sư phạm, Ban Chủ nhiệm Khoa Sinh- KTNN, Ban Giám hiệu Trường THPT Phú Lương, các đồng nghiệp, sự động viên của gia đình và bạn bè trong suốt thời gian tôi học tập và làm luận văn

Tác giả

Trịnh Xuân Thắng

MỤC LỤC

Trang

Trang bìa phụ i

Lời cam đoan ii

Lời cảm ơn iii

Mục lục iv

Danh mục các từ viết tắt vi

Danh mục bảng vii

Danh mục hình vẽ viii

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 CÂY ĐẬU XANH 4

1.1.1 Nguồn gốc, phân loại cây đậu xanh 4

1.1.2 Đặc điểm nông sinh học và giá trị kinh tế của cây đậu xanh 4

1.1.3 Đặc điểm hóa sinh của đậu xanh 8

1.1.4 Tình hình sản xuất đậu xanh trên thế giới và ở Việt Nam 9

1.2 GEN LTP VÀ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU XANH 11

1.2.1 Hạn và cơ sở hoá sinh, sinh học phân tử của tính chịu hạn 11

1.2.2 Protein vận chuyển lipid và gen LTP (Lipid Transfer Protein) 13

1.3 ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT TRONG CẢI TIẾN GIỐNG CÂY TRỒNG 15

1.3.1 Cơ sở tế bào học của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 15

1.3.2 Nghiên cứu chọn giống cây trồng bằng kỹ thuật chọn dòng tế bào soma 17

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 18

2.1.1 Vật liệu 18

2.1.2 Các hóa chất chuyên dụng 18

2.1.3 Thiết bị 18

2.2 Phương pháp nghiên cứu 19

2.2.1 Nghiên cứu ngoài đồng ruộng 19

2.2.2 Thống kê sinh học 19

2.2.3 Phân tích hóa sinh 20

2.2.4 Phân tích sinh học phân tử 21

2.2.5 Địa điểm nghiên cứu 27

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 ĐẶC ĐIỂM NÔNG SINH HỌC CỦA CÁC DÒNG ĐẬU XANH CHỌN LỌC VÀ GIỐNG GỐC 28

3.1.1 Đặc điểm nông sinh học của các dòng đậu xanh chọn lọc có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước ở thế hệ R2 28

3.1.2 Đặc điểm nông sinh học và yếu tố cấu thành năng suất của các dòng đậu xanh ở thế hệ R3 31

3.2 CHẤT LƯỢNG HẠT CỦA CÁC DÒNG ĐẬU XANH CÓ NGUỒN GỐC TỪ MÔ SẸO CHỊU MẤT NƯỚC 34

3.3 KẾT QUẢ PHÂN LẬP GEN LTP 35

3.3.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số 35

3.3.2 Kết quả nhân gen LTP từ hệ gen của dòng D15 và giống gốc 36

3.3.3 Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α 37

3.3.4 Kết quả chọn lọc dòng tế bào mang vecto tái tổ hợp 38

3.3.6 Kết quả xác định trình tự nucleotide của gen LTP 40

3.3.7 Kết quả so sánh trình tự nucleotide của gen LTP của các dòng đậu xanh nghiên cứu 42

3.3.8 Kết quả so sánh trình tự amino acid của các dòng đậu xanh nghiên cứu 45

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

ABA Abscisic acid

ASTT Áp suất thẩm thấu

DNA Deoxyribose nucleic acid

RNase Ribonuclease

Bp Base pair

EDTA Ethylene Diamin Tetraacetic acid

CTAB Cetyl Trymethyl Amonium Bromide

IPTG Isopropylthio- beta-D- glactoside

LB Luria Bertani

LTP Lipid transfer protein

OD Optical densyti

PCR Polymerase chain Reaction

TAE Tris- acetic acid- EDTA

X- gal 5- brom- 4- chlobo- 3- indolyl- β-D- galactosidase

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Danh mục các thiết bị sử dụng 18

Bảng 2.2 Thành phần của PCR 22

Bảng 2.3 Chu trình nhiệt độ trong phản ứng PCR 23

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng nối sản phẩm PCR vào vector tách dòng 25

Bảng 2.5 Thành phần của phản ứng cắt plasmid tái tổ hợpbằng enzym BamHI 26

Bảng 3.1 Đặc điểm và mức độ biến dị của một số tính trạng nông sinh học và yếu tố cấu thành nên năng suất 29

Bảng 3.2 Đặc điểm, mức độ biến dị của một số tính trạng nông sinh học và yếu tố cấu thành năng suất của các dòng đậu xanh ở thế hệ R3 32

Bảng 3.3 Hàm lượng protein, lipid của các dòng đậu xanh và giống gốc 34

Bảng 3.4 Trình tự mồi nhân gen LTP 36

Bảng 3.5 Vị trí sai khác trình tự nucleotide gen LTP ở VC1973A và D15 42

Bảng 3.6 Vị trí sai khác trình tự nuclotide của gen LTP ở hai mẫu đậu xanh VC1973A và D15 với các trình tự đã công bố trên GenBank 44 Bảng 3.7 Vị trí sai khác amino acid của gen LTP hai mẫu đậu xanh VC1973A, D15 với các trình tự đã công bố trên Genbank 46

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 19

Hình 2.2 Sơ đồ vector pBT 24

Hình 3.1 Các dòng đậu xanh có nguồn gốc từ mô seo chịu mất nước thế hệ R2 28

Hình 3.2 Các dòng đậu xanh có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước thế hệ R3 33

Hình 3.3 Quả và hạt của hai dòng D15 và D40 33

Hình 3.4 Hình ảnh điện di DNA tổng số tách chiết từ mô lá của giống đậu xanh VC1973A và dòng D15 35

Hình 3.5 Hình ảnh điện di kết quả nhân gen LTP 36

Hình 3.6 Hình ảnh khuẩn lạc 37

Hình 3.7 Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR 38

Hình 3.8 Kết quả điện di plasmid tinh sạch chứa đoạn gen LTP 39

Hình 3.9 Kết quả điện di sản phẩm căt plasmid tái tổ hợp bằng enzyme 39

Hình 3.10 Trình tự nucleoitde của gen LTP ở hai mẫu đậu xanh D15 và VC1973A 41

Hình 3.11 Trình tự nucleotide của gen LTP ở hai mẫu đậu xanh VC1973A và D15 với các trình tự đã công bố 43

Hình 3.12 Sơ đồ hình cây về mối quan hệ giữa các trình tự gen LTP 44

Hình 3.13 So sánh trình tự amino acid gen LTP của hai mẫu đậu xanh VC1973A và D15 45

Hình 3.14 So sánh trình tự amino acid của gen LTP hai mẫu đậu xanh VC1973A và D15 so với các mẫu trên Genbank 46

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Cây đậu xanh (Vigna radiata L.Wilczek) là cây công nghiệp ngắn ngày

trồng lấy hạt giữ vị trí quan trọng của nhiều nước châu Á và Việt Nam Hạt đậu xanh chứa nhiều chất dinh dưỡng như: protein chứa khoảng 23%- 28%, 1.3% lipid, 4.79% chất sơ, 64.12% hydratcacbon, các loại Vitamin A, B1, B2,

C Một số nguyên tố khoáng và hàm lượng chất sắt rất cao Nước ta trồng nhiều đậu xanh, hạt đậu xanh dùng làm thực phẩm, bột đậu xanh rang chín hòa với nước sôi là loại nước uống rất bổ dưỡng Ngoài ra hạt đậu xanh còn là một loại dược liệu quí có tác dụng chữa một số bệnh như bệnh tiểu đường, bệnh phù thũng, giải nhiệt hà khí Đặc biệt đậu xanh còn có tác dụng giải độc

do thuốc và các chất kim loại Trồng đậu xanh ngoài thu hạt ra các phụ phẩm còn được dùng làm thức ăn cho gia súc và trồng đậu xanh có tác dung cải tạo

đất do rễ cây có những nốt sần chứa vi khuẩn cố định nitơ Rhizobium

Ở Việt Nam, cây đậu xanh được trồng lâu đời và phân bố ở nhiều vùng khác nhau trong cả nước, nhưng năng suất chưa cao Quá trình biến đổi khí hậu toàn cầu đã dẫn đến những hiện tượng thời tiết cực đoan và làm cho khí hậu ngày càng diễn biến phức tạp Việt nam, cũng là một trong những quốc gia chịu nhiều ảnh hưởng của biến đổi khí hậu Sự thay đổi về lượng mưa trong năm và sự phân bố lượng mưa không đồng đều giữa các vùng, hiện tượng hạn hán kéo dài cùng với các yếu tố bất lợi khác đã ảnh hưởng nghiêm trọng đến sự sinh trưởng và phát triển, làm giảm năng suất và sản lượng cây trồng, trong đó có cây đậu xanh Cây đậu xanh thuộc nhóm cây chịu hạn kém, vì vậy nghiên cứu nâng cao khả năng chịu hạn của cây đậu xanh trong điều kiện khí hậu hiện nay là một yêu cầu cấp thiết Chọn dòng biến dị soma trong công nghệ tế bào thực vật là một trong các biện pháp công nghệ hiện đại được áp dụng để cải thiện khả năng chịu hạn của cây đậu xanh

Tính chịu hạn của thực vật liên quan đến sản phẩm biểu hiện của nhiều gen, trong đó có gen LTP (Lipid transfer protein) Gen mã hóa LTPs thuộc họ gen pathogenesis – relate, có khả năng tổng hợp protein thúc đẩy quá trình vận chuyển phospholipid tới màng LTP còn hỗ trợ việc tạo ra lớp sáp hoặc lớp biểu bì giúp thực vật bảo vệ, phản ứng và đáp ứng lại những thay đổi của môi trường Ở cây trồng, LTP tham gia vào việc hình thành cutin, chống lại các tác nhân gây bệnh và quá trình thích nghi của cây đối với các điều kiện khác nhau của môi trường sống Khi gặp các điều kiện bất lợi của môi trường các nhân tố như hormone, các quá trình trao đổi ion, các con đường truyền tín hiệu sẽ điều khiển gen LTP hoạt động tổng hợp protein

và tăng cường vận chuyển phospholipid tới màng, tăng tính bền vững của thành tế bào và khả năng giữ nước của màng nhằm giúp cây trồng chống lại điều kiện khô hạn của môi trường

Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu cho

luận văn là: “Đánh giá đặc điểm nông sinh học và so sánh trình tự gen LTP

của một số dòng đậu xanh có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Chọn được dòng đậu xanh có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước ưu việt về một số đặc điểm nông sinh học và chất lượng hạt

Xác định được sự sai khác trong trình tự gen LTP của dòng đậu xanh thuộc nhóm chịu hạn tốt và chịu hạn kém

3 Nội dung nghiên cứu

- Phân tích di truyền số lượng của một số đặc tính nông sinh học của các dòng đậu xanh có nguồn gốc từ mô sẹo mất nước ở các thế hệ R2, R3

- Đánh giá chất lượng hạt trên phương diện hoá sinh của một số dòng đậu xanh có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước

- Nhân bản gen LTP bằng kỹ thuật PCR từ các dòng đậu xanh có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước

- Tách dòng và xác định trình tự gen LTP từ các dòng đậu xanh có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước

- So sánh trình tự gen, trình tự amino acid giữa các dòng đậu xanh nghiên cứu và các trình tự đã công bố trên Ngân hàng gen quốc tế

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY ĐẬU XANH

1.1.1 Nguồn gốc, phân loại cây đậu xanh

Đậu xanh (Vigna radiata L Wilczek), có bộ NST 2n = 22, là loại cây

đậu ăn hạt, thân thảo Đậu xanh có nguồn gốc từ Ấn Độ, được phân bố rộng rãi ở các vùng nhiệt đới trong đó chủ yếu là ở các nước Đông và Nam Á sau

đó được trồng phổ biến ở nhiều khu vực trên thế giới

Phân loại khoa học của cây đậu xanh:

- Giới (regnum): Plantae

- Ngành (division): Magnolyophita

- Lớp (class): Magnolyopsida

- Bộ (order): Fabales

- Họ (Familia): Fabaceae

- Chi (genus): Vigna

- Loài (species): V Radiata

Chi Vigna là một trong những chi lớn trong họ đậu, bao gồm 7 chi phụ

Chi phụ Ceratotropic còn được gọi là nhóm đậu châu Á mang những đặc

điểm điển hình cho Vigna Ceratotropic phân bố khắp các vùng nhiệt đới và á

nhiệt đới của châu Á, Ôxtrâylia và các nước khác thuộc châu Á Thái Bình

dương Dạng hoang dại của Vigna radiata được tìm thấy tại Madagasca và bờ

biển phía đông châu Phi [12]

1.1.2 Đặc điểm nông sinh học và giá trị kinh tế của cây đậu xanh

Bộ rễ cây đậu xanh thuộc loại rễ cọc bao gồm rễ chính và các rễ phụ

Rễ chính thường ăn sâu khoảng 20 - 30 cm, trong điều kiện thuận lợi có thể

ăn sâu tới 70 - 100 cm Rễ phụ thường gồm 30 - 40 cái, dài khoảng 20 - 25

cm, phân bố chủ yếu trên tầng mặt Trên rễ phụ có nhiều lông hút làm nhiệm vụ hút các chất dinh dưỡng từ đất bộ rễ của cây đậu xanh yếu hơn nhiều so với các cây đậu đỗ khác nên khả năng chịu hạn của cây đậu xanh tương đối kém Trên rễ

cây đậu xanh có nhiều nốt sần chứa vi khuẩn cổ định đạm Zhizobium Số lượng

nốt sần ở cây họ đậu không nhiều như một số cây đậu đỗ khác, trung bình có

20-30 nốt sần Số lượng và khả năng hoạt động của nốt sần là đảm bảo cho cây được cung cấp lượng đạm nhiều do đó có năng suất cao [5]

Thân và cành cây đậu xanh thuộc loại thân thảo, là cây hàng năm., hình trụ, phân đốt, cao khoảng 40 - 70 cm Thân có màu xanh hoặc tím Thân có 3 dạng: đứng thẳng, đứng nghiêng, bò lan trên mặt đất Dạng bò lan thường chỉ gặp ở vùng đồi núi của Ấn Độ và Mianma Thân đậu xanh nhỏ, tròn, có một lớp lông màu nâu sáng bao bọc Trên thân chia 7 - 8 đốt, ở giữa hai đốt gọi là lóng Độ dài của các lóng thay đổi tùy theo vị trí trên cây và điều kiện khác nhau Các lóng dài khoảng 8 - 10 cm, các lóng ngắn chỉ 3 - 4 cm Từ các đốt mọc ra các cành, trung bình có 1 - 5 cành Cây đậu xanh ít phân cành và thường phân cành muộn Cành mọc từ nách lá thứ 2, 3 trên mỗi cành có từ 2-

3 mắt, từ đó mọc ra các chùm hoa [5], [12]

Lá cây đậu xanh thuộc loại lá kép, có ba lá chét, mọc cách Trên mỗi thân chính có 7 - 8 lá thật, chúng xuất hiện sau khi xuất hiện lá mầm và lá đơn Lá thật hoàn chỉnh gồm có: lá kèm, cuống lá và phiến lá Cả hai mặt trên

và dưới của lá đều có lông bao phủ Tốc độ hình thành lá kép phụ thuộc vào thời vụ, giống và kĩ thuật chăm sóc Vị trí của lá kép trên thân hoặc trên cành thường mọc so le tại các phần giữa các đốt thân hay cành Kích thước của phiến lá và độ dài của cuống lá thay đổi tùy thuộc vào vị trí của tầng lá Điều này biểu hiện sự sinh trưởng và phát triển bình thường của cây đậu xanh [5]

Hoa đậu xanh là loại hoa lưỡng tính, hình thành trên các trục hoa, trên mỗi trục hoa có thể phát triển thành một hàng hoa mọc đối nhau Các chùm

hoa chỉ phát sinh ra từ các mắt thứ ba ở trên thân, nhiều nhất là ở mắt thứ tư, còn ở các cành thì tất cả các mắt đều có khả năng ra hoa Thường sau khi cây mọc 18 - 20 ngày thì mầm hoa hình thành , sau 35 - 40 ngày thì nở hoa Trong một chùm hoa, từ khi hoa đầu tiên nở đến hoa cuối cùng kéo dài 10 - 15 ngày Mỗi chùm hoa dài từ 2 - 10 cm và có từ 10 - 125 hoa Khi mới hình thành hoa

có hình cánh bướm, màu xanh tím, khi nở cánh hoa có màu vàng nhạt Trong

tự nhiên, hoa đậu xanh thường nở rải rác thành từng đợt khác nhau Căn cứ vào thời gian nở hoa các giống đậu xanh có thể chia làm 3 nhóm:

- Nhóm ra hoa tập trung: hoa nở kéo dài dưới 16 ngày

- Nhóm ra hoa trung gian: hoa nở kéo dài trong thời gian 16-30 ngày

- Nhóm ra hoa không tập trung: hoa nở liên tiếp trên 30 ngày

Quả non được hình thành sau khi hoa thụ phấn 2-3 ngày Quả đậu xanh thuộc loại quả giáp, có dạng hình trụ, dạng tròn hoặc dạng dẹt với đường kính 4 -

6 mm, có 2 gân nổi rõ dọc hai bên quả, đa số là quả thẳng, có một số hơi cong, khi còn non quả có màu xanh, khi chín vỏ quả có màu nâu vàng hoặc xám đen, đen, nhưng phổ biến hơn cả là màu đen và màu nâu, gặp nắng rễ bị tách vỏ Một cây trung bình có khoảng 20 - 30 quả, có chiều dài trung bình 8cm - 10cm, quả dài nhất là 15cm Trên vỏ quả được bao phủ một lớp lông mịn [5]

Hạt đậu xanh xanh nhạt Hạt có hình tròn, hình trụ, hình ô van, hình thoi và có nhiều màu sắc khác nhau như: màu xanh mốc, xanh bóng, xanh nâu, vàng mốc, vàng bóng nằm ngăn cách nhau bằng những vách xốp của quả Ruột hạt màu vàng, xanh Hạt không nội nhũ, phôi cong, hai lá mầm dày, lớn và chứa nhiều chất dinh dưỡng Màu sắc của vỏ hạt tương quan tương đối chặt chẽ với vùng địa lí phân bố Số lượng hạt trung bình trong 1 quả là một trong những yếu tố quyết định năng suất của đậu xanh Trung bình mỗi quả có

8 - 9 hạt Quả lớn nhất có đến 18 hạt [5]

Sinh trưởng và phát triển của cây đậu xanh: Có 2 giai đoạn sinh trưởng

và phát triển chủ yếu ở đậu xanh:

- Các giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng: Được bắt đầu bằng thời kỳ SDm, là lúc hạt đậu xanh nảy mầm Tiếp theo là thời kỳ SDl, lúc này cây bắt đầu xuất hiện lá mầm Các thời kì tiếp theo là SD2, SD3 tương ứng với thứ

tự hình thành các đốt trên cây Kết thúc giai đoạn SDn tương ứng với số đốt cuối cùng trên cây Số đốt hình thành trên cây đậu xanh thay đổi tùy thuộc vào đặc điểm của giống

- Các giai đoạn sinh trưởng sinh thực: Được chia thành 8 thời kì bắt đầu

từ ST1 đến ST8, tương ứng với các thời kì hình thành hoa, quả, hạt đậu Cây đậu xanh có đặc điểm sinh trưởng vô hạn hoặc bán vô hạn, nên việc xác định các thời kì sinh trưởng sinh thực thường gặp nhiều khó khăn, vì trên một cây đồng thời vừa có cả nụ, hoa, quả non và quả chín Vì vậy, thời kì sinh thực của đậu xanh chỉ mang tính chất tương đối [5], [12]

Bên cạnh những cây lương thực có giá trị kinh tế như lúa, lạc, ngô, đậu tương thì đậu xanh cũng được coi là loại cây trồng đem lại giá trị kinh tế cao cho nông dân Trong hạt đậu xanh có nhiều các chất dinh dưỡng quan trọng như protein, lipid, các loại vitamin, khoáng chất Protein của đậu xanh có nhiều các amino acid không thể thay thế cho nên đậu xanh được dùng để làm thực phẩm rất bổ dưỡng và chế biến thành các món ăn đặc sản của nhiều địa phương được ưa chuộng ở trong nước và ngoài nước Đậu xanh còn được dùng trong các bài thuốc cổ truyền có tác dụng chữa bệnh rất tốt Ngoài ra, trồng cây đậu xanh còn có tác dụng cải tạo và bồi dưỡng đất Nhờ hệ rễ đậu

xanh có các nốt sần chứa các vi khuẩn cộng sinh thuộc chi Rhizobium có khả

năng cố định nitơ từ khí trời Vì vậy, đất sau khi trồng đậu xanh sẽ trở nên tơi xốp và giàu dinh dưỡng hơn [12]

1.1.3 Đặc điểm hóa sinh của đậu xanh

Hạt đậu xanh chứa 23 - 28% protein, 1,3% lipid, 56 - 60% glucid, 12% nước, các vitamin B1, B2, C… ,các muối khoáng như Ca, Na, Fe, K …

Đối với cây trồng thu hạt nói chung và cây đậu xanh nói riêng, đánh giá chất lượng hạt được thực hiện bằng những phân tích thành phần hoá sinh trong hạt như: hàm lượng protein, lipid, đường, thành phần amino acid, hàm lượng và hoạt độ của các enzyme trong hạt ở giai đoạn nảy mầm Trong đó, hai thành phần quan trọng có ảnh hưởng lớn đến sự nảy mầm của hạt và sự phát triển của cây là protein và lipid

Protein

Protein đậu xanh chiếm đầy đủ các loại amino acid không thay thế, là nguồn cung cấp đạm bổ dưỡng và dễ tiêu hóa cho con người và động vật Protein đậu xanh có đầy đủ các tính chất tốt và có ích của các loại protein nói chung Trong hạt đậu xanh, các phân tử protein chiếm khoảng 23 - 28%

và được chia thành hai nhóm: nhóm protein đơn giản và nhóm protein phức tạp Trong nhóm protein đơn giản chủ yếu là globulin, chiếm từ 60 - 80%, còn lại là albumin và một số loại khác Chức năng chính của protein dự trữ

là cung cấp amino acid và nitơ cho quá trình nảy mầm của hạt [12] Ngoài

ra, protein của đậu xanh còn có một số đặc tính tốt khác như khả năng hút nước, hòa tan chất đạm của nó trong nước Bột đậu xanh và protein của nó còn có khả năng tạo nhũ tương

Lipid

Lipid là một thành phần cơ bản trong cơ thể thực, động vật, là thành phần cấu tạo cơ bản lên màng sinh học và là nguồn cung cấp năng lượng quan trọng cho cơ thể Lipid cùng với protein và polysaccarid cung cấp năng lượng cho sự nẩy mầm của hạt Lipid không hoà tan trong nước nhưng tan trong các

dung môi hữu cơ không phân cực như ether, petroleum ether, benzen Hàm lương lipid trong hạt đậu xanh tương đối thấp, trung bình 1.3% nhưng ảnh hưởng lớn đến chất lượng hạt và phát triển của cây

1.1.4 Tình hình sản xuất đậu xanh trên thế giới và ở Việt Nam

Theo kết quả điều tra của của Trung tâm nghiên cứu và phát triển rau quả châu Á (AVRDC), hàng năm trên thế giới có ít nhất 23 nước sản xuất đậu xanh Hiện nay, đậu xanh là cây đậu đỗ quan trọng của Thái Lan, Sri lanka,

Ấn Độ Đậu xanh cũng được trồng nhiều ở Ôxtrâylia, Trung Quốc, Hàn Quốc, Hoa kỳ AVRDC cũng cho biết diện tích, năng suất và sản lượng đậu xanh của thế giới đang tăng qua các năm [5]

Tại Srilanka trong những năm 1965-1986 diện tích, sản lượng đều tăng nhanh, tuy nhiên, từ năm 1997-2001 tình hình sản xuất đậu xanh có xu hướng giảm về diện tích trồng Trung Quốc cùng là một trong những nước chính sản xuất đậu xanh của thế giới Trong những năm 1957, diện tích gieo trồng là 1,64 triệu ha và sản lượng là 800 000 tấn và năng suất vẫn còn thấp chỉ vào khoảng 488kg/ha, và suy giảm qua các năm tiếp theo Bắt đầu từ năm 1980 đến 2000,

do sự thay đổi trong chính sách của chính phủ và áp dụng các biện pháp khoa học kỹ thuật thì sản xuất đậu xanh lại được phục hồi và hiện nay, hàng năm Trung Quốc xuất khẩu đậu xanh tới hơn 60 nước và khu vực trên thế giới Năm 2000, thị trường xuất khẩu đậu xanh lớn nhất của Trung Quốc có thể kể đến là Nhật Bản (40000 tấn/ 88000 tấn), sau đó là Hoa kỳ (8144 tấn), Việt Nam (7645 tấn), Hàn Quốc (7199 tấn), Đài Loan (4466 tấn), Anh (2479 tấn), Canada (2495 tấn), Pháp (1289 tấn)… [12]

Đậu xanh là một trong những loại cây trồng truyền thống ở Việt Nam Trên cơ sở các điều kiện khí hậu, đặc điểm sinh thái của từng vùng mà các vùng trồng đậu xanh của nước ta như sau:

+ Vùng núi phía Bắc: các tỉnh ở vùng này trồng nhiều đậu xanh gồm: Sơn La, Lai Châu, Cao Bằng, Hà Giang Vùng này khí hậu có mùa đông lạnh

từ tháng 11 đến tháng 2, các tháng còn lại nóng ẩm, cây đậu xanh cũng được gieo trồng vào dịp này Đậu xanh trồng ở vùng này ít được thâm canh, năng suất trung bình 600-700kg/ ha [5]

+ Vùng Đồng bằng và Trung du Bắc bộ: Đậu xanh trồng ở vùng này thường được chăm sóc đầy đủ hơn, thâm canh cao hơn và tưới tiêu hợp lý hơn, tăng năng suất Thực hiện luân canh 3-4 vụ/ năm, năng suất trung bình 8- 10 tạ/ ha [5]

+ Vùng Duyên Hải Nam Trung bộ: Đây là vùng có diện tích trồng đậu xanh lớn, sản lượng cao do ít chịu ảnh hưởng của mùa đông Khí hậu thuận lợi phân chia rõ rệt mùa mưa và mùa khô Đậu xanh có triển vọng phát triển mạnh ở vùng này [5]

+ Vùng Đông Nam bộ: Cây đậu xanh ở vùng này có diện tích lớn nhất, chiếm 26% diện tích gieo trồng của cả nước Mặc dù vậy năng suất trung bình chưa cao, chỉ đạt 5 tạ/ ha Nguyên nhân do sử dụng các giống đậu xanh kém chất lượng, các giống cũ, năng suất thấp, không có điều kiện thâm canh [5]

Hiện nay, có một số giống đậu xanh trồng phổ biến như: ĐX044, V123,HL- 115 Giống ĐX044 đang được trồng nhiều ở vùng đồng bằng và trung du Bắc bộ; giống V123 (3V123) năng suất 1800 - 2000 kg/ha, thâm canh có thể đạt 2000 – 7000 kg/ ha, có thể trồng 3 vụ/ năm; T135 năng suất

2900 kg/ha, 28% protein, ruột vàng thơm ngon, trồng ở các tỉnh phía Bắc; giống V91 – 15 (VC3528A) năng suất từ 1200 – 1400 kg/ ha, cây cứng, ít đổ,

ít nhiễm bệnh vàng lá, trồng được trên nhều loại đất ở các tỉnh phía Nam; giống HL – 115 năng suất từ 1000 – 1300 kg/ ha trong vụ hè và 1400 – 2200 kg/ha trong vụ thu đông tại các tỉnh phía Nam

1.2 GEN LTP VÀ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU XANH 1.2.1 Hạn và cơ sở hoá sinh, sinh học phân tử của tính chịu hạn

Khái niệm hạn dùng để chỉ tình trạng thiếu nước của thực vật do môi trường gây nên, làm ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của thực vật

[10] Có 3 dạng hạn đối với thực vật là: hạn đất, hạn không khí và hạn sinh lý

- Hạn đất

Khi lượng nước dự trữ trong đất trở lên cạn kiệt thì xảy ra hạn đất Do

đó cây không thể lấy nước từ đất cung cấp đủ cho hoạt động sống dẫn đến mất cân bằng nước Hạn đất thường xảy ra ở các vùng có lượng mưa trung bình thấp và mùa khô kéo dài

- Hạn không khí

Khi độ ẩm trong không khí quá thấp sẽ xảy ra hạn không khí, dẫn đến làm cho quá trình thoát hơi nước ở cây mạnh có thể làm mất cân bằng nước Hạn không khí thường xảy ra ở các vùng có gió khô nóng như gió Tây nam ở miền trung

- Hạn sinh lý

Khi trạng thái sinh lý của cây không cho phép cây hút nước từ đất, mặc

dù trong môi trường nước không thiếu nước Rễ cây không lấy được nước trong khi đó quá trình thoát hơi nước ở lá vẫn diễn ra cũng làm mất cân bằng nước trong cây

Mỗi cây trồng đều có một giới hạn đối với các nhân tố sinh thái của môi trường Nếu ngoài giới hạn đó sẽ gây hại cho cây trồng như: giảm năng suất, giảm khả năng sinh trưởng và phát triển Khi tình trạng hạn xảy ra cây sẽ phản ứng lại bằng cách đóng khí khổng, giảm thoát hơi nước, giảm quang hợp, tăng tích lũy ABA, prolin, manitol, sorbitol [47]

Đối với thực vật, nước là một yếu tố rất quan trọng liên quan đến năng suất Nước là sản phẩm trung gian và cuối cùng của quá trình chuyển hóa, là

môi trường để các phản ứng hóa sinh xảy ra trong tế bào Đậu xanh là một cây chịu hạn kém nên thiếu hụt nước sẽ ảnh hưởng đến sự phân cành, ra hoa, kết quả, chất lượng hạt Thiếu hụt nước nặng sẽ dẫn đến thay đổi tính chất lý hóa của hệ thống keo nguyên sinh, chuyển từ dạng sol sang dạng gel, quá trình quang hợp bị giảm sút

Đặc tính chịu hạn ở thực vật đã được nghiên cứu và khẳng định có sự liên quan đến sự phát triển bộ rễ, khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu, abscisic acid (ABA), aquaporin, các nhân tố ức chế protease [10] Theo nhiều nghiên cứu cho thấy khả năng hút nước của cây phụ thuộc vào bộ rễ Những cây có bộ rễ dài, to, khỏe có khả năng đâm sâu vào tầng đất để hút nước, cho nên khi gặp hạn những cây này vẫn phát triển Trong điều kiện hạn thì khả năng hấp thụ nước của bộ rễ được xem là chỉ tiêu đánh giá khả năng chịu hạn Khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu (ASTT): trong điều kiện khô hạn lượng nước trong đất rất ít, vì vậy ASTT tăng lên giúp tế bào có thể hút nước từ đất ASTT liên quan trực tiếp đến khả năng cạnh tranh nước của bộ rễ đối với đất, qua đó thực vật có thể vượt qua tình trạng hạn cục bộ Điều chỉnh ASTT liên quan đến một số chất: ion K+; các amino acid như prolin, estonine; các chất đường như sucarose, fructant, manitol, pinitol và các chất khác như glycine betain, - alanin betain Các chất này có khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu nhờ khả năng hút nước và giữ nước vào tế bào hoặc ngăn chặn sự xâm nhập của ion Na+

[20] Một trong các chất liên quan đến áp suất t hẩm thấu là proline Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng proline có thể tăng từ 10 đến 100 lần ở thực vật dưới tác động của ASTT

Axit Abscisic (ABA): là một hormone ức chế sinh trưởng của thực vật liên quan đến sự điều chỉnh sinh lý, sinh trưởng và phát triển đáp ứng với môi trường của thực vật khi gặp stress Khi gặp hạn ABA sinh ra ở rễ cây nhờ gen cis-epoxycarotenoids với sự tham gia của enzyme 9-cis-epoxycarotenoid

dioxygenase ABA điều chỉnh sự trao đổi nước trong cây, hạn chế sự mất nước làm cây thích nghi với đời sống khô hạn Ngoài ra ABA còn đóng vai trò then chốt trong nhiều hoạt động sống của thực vật Cơ chế tác động của ABA cho rằng làm biến đổi điện thế hoá qua màng và do đó điều tiết sự tiết ion K+

[34]

Nghiên cứu về cơ chế phân tử liên quan đến tính chống chịu hạn ở thực vật người ta chú ý đến các gen mã hoá các loại protein liên quan đến khả năng chịu hạn, bao gồm các loại protein chức năng và protein điều hoà Các loại protein chức năng trực tiếp liên quan đến sự biểu hiện khả năng chịu hạn, ví

dụ như: P5CS, LTP, LEA, PLC, HSP, cystatin… và protein điều hoà như chất môi giới phân tử, nhóm protein DREB, các nhân tố protein tham gia vào quá trình biểu hiện của nhóm gen chịu hạn

1.2.2 Protein vận chuyển lipid và gen LTP (Lipid Transfer Protein)

LTP là tên thường gọi của một nhóm protein có khả năng vận chuyển lipid, có liên quan đến tính chịu hạn ở thực vật

LTP có khả năng tạo phức với một số acid béo và xúc tác cho quá trình vận chuyển lipid qua màng tế bào, giúp hạn chế sự mất nước LTP được gắn tại một vị trí cố định trên màng sinh chất của tế bào, nó có đặc điểm như một receptor vận chuyển acid béo qua màng tế bào Phức hợp LTP - linoleic acid đã được chiết ra từ màng sinh chất của cây thuốc lá trong điều kiện gây hạn nhân tạo [35]

LTP có khả năng xúc tác tới sự vận chuyển phospholipid giữa các lớp màng của tế bào LTP có thể hỗ trợ việc tạo ra các lớp sáp hoặc lớp biểu bì giúp thực vật bảo vệ, phản ứng và đáp ứng lại những thay đổi của môi trường [26], [29]

Nghiên cứu gần đây cho thấy sự mở rộng in vitro các phân tử cellulose

xuloglucan của thành tế bào thực vật có thể được gây ra do các LTP Mặc dù

chưa có bằng chứng in vitro song khám phá này chắc chắn sẽ đem lại câu hỏi

thú vị về cơ chế mở rộng thành tế bào thực vật LTP còn liên quan đến quá trình hình thành tầng cutin của tế bào thực vật, làm tăng khả năng chống chịu

và hạn chế tác hại của stress muối và stress hạn Bên cạnh đó LTP còn tham gia vào hệ thống miễn dịch của thực vật, các nghiên cứu trên cây lúa, cây đậu

đã được nghiên cứu

LTP được chia thành hai dạng khác nhau về khối lượng phân tử Dạng thứ nhất có khối lượng phân tử khoảng 9 kDa (LTP1) và dạng thứ hai có khối lượng phân tử khoảng 7 kDa (LTP2) Cả LTP1 và LTP2 đều có một vùng bảo thủ gồm 8 amino acid loại cystatin và 4 amino acid loại prolin [33]

Gen LTP thuộc họ gen pathogenesis relate, có khả năng tổng hợp ra protein thúc đẩy quá trình vận chuyển phospholipid giữa các màng Khi gặp các điều kiện cực đoan của môi trường, các nhân tố như hormone, các quá trình trao đổi ion, các con đường truyền tín hiệu… sẽ điều khiển gen LTP hoạt động và tổng hợp nên các sản phẩm protein tương ứng nhằm giúp cho cây tăng khả năng chống chịu

Các phân tử protein do gen LTP tổng hợp thường có nhiều đặc điểm chung như: điểm đẳng điện cao, và với sự có mặt của 8 phân tử cystein làm nhiệm vụ tạo ra 4 cầu nối dissulfide Khi gặp những điều cực đoan của môi trường , các nhân tố như hormone, các quá trình trao đổi ion, các con đường truyền tín hiệu sẽ điều khiển gen LTP hoạt động và tăng tổng hợp lên các sản phẩm protein tăng cường vận chuyển photpholipid tới màng, tăng khả năng giữ nước của màng tế bào nhằm giúp cho cây tăng khả năng stress hạn

Hiện nay, LTP ở thực vật được biết có 4 nhóm lớn:

- Nhóm I: Bao gồm các CsLTP chứa các bộ mã hoá protein đã được cô lập và biểu hiện ở trong quả

- Nhóm II: Bao gồm những gen LTP tổng hợp ra protein được biểu hiện trong hạt

- Nhóm III: Bao gồm các gen LTPs tổng hợp ra protein được biểu hiện trong mô lá

- Nhóm IV: Bao gồm các gen LTP tổng hợp nên các chuỗi polypeptide được cô lập và biểu hiện trong hoa [33], [39].

Trong những năm gần đây, gen LTP đã được nghiên cứu ở một số thực

vật như: Arabidopsis thaniana L [23], Zea mays L [41], Vigna radiata L [36], Triticum L [38],, Nicotiana tabacum L [37], [40], Oryza sativa L [45],

Valencia orange [46], Lycopesium esculentum [43] Liu K.H và cs (2003) đã

phân lập thành công hai dạng khác nhau của gen LTP và đặt tên là Vrltp1 và Vrltp2 [36] Trình tự các amino acid suy diễn của Vrltp1 và Vrltp2 đều có hai đoạn pentapeptide mang tính bảo thủ cao ở thực vật Trong hạt đậu xanh ở giai đoạn nảy mầm, nhóm nghiên cứu chỉ tìm thấy mRNA của Vrltp1, còn trong mô sinh dưỡng thì mRNA của cả Vrltp1 và Vrltp2 chỉ tìm thấy ở lá và thân, không có ở chóp rễ Các tác giả cũng nhận thấy, khi gặp điều kiện bất lợi như stress hạn hay muối hoặc khi hàm lượng ABA ngoại bào quá cao sẽ làm tăng tốc độ phiên mã của mRNA Vrltp1 và Vrltp2 Từ đó đưa ra giả thuyết rằng gen LTP có ảnh hưởng rõ rệt tới sự phát triển các mô non và rất

có thể đóng vai trò quan trọng trong sự thích nghi của thực vật trong điều kiện khô hạn

1.3 ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT TRONG CẢI TIẾN GIỐNG CÂY TRỒNG

1.3.1 Cơ sở tế bào học của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

Một trong những đặc điểm của tế bào thực vật đó là tính toàn năng, từ một mô sống bất kỳ của tế bào thực vật (bao phấn, đỉnh sinh trưởng, lá mầm, thân, cành ) nếu được nuôi cấy trong môi trường thích hợp sẽ phát triển thành một cây hoàn chỉnh và có khả năng sinh trưởng bình thường Các mô

ngoài khả năng phát triển thành cây hoàn chỉnh còn có khả năng phát triển thành các mô sẹo Mô sẹo là các loại tế bào phân chia liên tục và có khả năng phát triển thành phôi, chồi và cây hoàn chỉnh

Các mô hoặc quần thể tế bào thực vật được nuôi cấy với số lượng lớn

và không đồng nhất, cho nên khi tái sinh cây sẽ xuất hiện nhiều đặc điểm về kiểu hình, kiểu gen do ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy và các chất điều

hòa sinh trưởng Các tế bào nuôi cấy in vitro thường có biến dị với tỉ lệ cao vì

vậy có thể chọn được các cá thể xuất hiện nhiều biến dị và thời gian cũng giảm đáng kể so với các phương pháp chọn giống thông thường

Hiện nay, các kỹ thuật nuôi cấy được sử dụng trong nuôi cấy chọn dòng

tế bào soma bao gồm:

- Nuôi cấy mô sẹo: Mô sẹo là khối mô thực vật gồm các tế bào chưa phân hóa, có khả năng phân chia liên tục và tính biến động di truyền cao Trong nuôi cấy in vitro mô sẹo được tạo ra từ các bộ phận sinh dưỡng của cây (lá, thân ) với môi trường dinh dưỡng thích hợp sẽ phát triển thành cây hoàn chỉnh Những cây phát triển từ mô sẹo có biến đổi di truyền phong phú có ý nghĩa quan trọng đối với quá trình chọn giống

- Nuôi cấy tế bào huyền phù: Là kỹ thuật nuôi cấy tế bào đơn hoặc cụm nhỏ tế bào trong môi trường lỏng, các tế bào này cũng tạo ra từ các tế bào mô sẹo có nguồn gốc khác nhau

- Nuôi cấy tế bào trần: Tế bào thực vật bị phá bỏ lớp thành tế bào bao bọc bên ngoài còn lại khối nguyên sinh chất gọi là tế bào trần.Các tế bào trần nuôi cấy trong môi trường thích hợp sẽ phát triển thành mô sẹo và tái sinh thành cây hoàn chỉnh Nhìn chung, nuôi cấy tế bào trần ở thực vật tỉ lệ tái sinh

ở cây thấp, cho nên ứng dụng của tế bào trần chủ yếu tạo cây lai tế bào thông qua dung hợp tế bào trần

1.3.2 Nghiên cứu chọn giống cây trồng bằng kỹ thuật chọn dòng tế bào soma

Ngày nay, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đang được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực chọn giống cây trồng, đặc biệt là chọn giống chống chịu được các stress môi trường: chịu lạnh, chịu muối, chịu nhôm [2]

Chu Hoàng Mậu và đồng tác giả (2006) tiến hành xử lý bằng thổi khô

mô sẹo các giống lạc MĐ7, L17, L14, L18, ĐBG đã nhận thấy mô sẹo của 5 giống lạc đều bị mất nước nhanh, khả năng chịu mất nước của các giống có sự khác nhau rõ rệt, cao nhất là ĐBG và thấp nhất là L18 [16]

Nguyễn Thị Tâm (2004), đã tạo được 197 dòng mô có khả năng chịu nóng ở 400C, 420C và 520 dòng cây lúa Từ 33 dòng qua 5 thế hệ đã chọn được 2 dòng nổi bật là HR128 với đặc điểm là cây thấp, số hạt chắc/bông cao, hàm lượng protein, đường tan, amino acid liên kết trong hạt cao, có khả năng chịu nóng, cứng cây và dòng HR499 với khả năng đẻ nhánh hữu hiệu, số hạt chắc/bông, năng suất khóm, có khả năng chịu nóng cao hơn so với giống gốc [21]

Lê Trần Bình và cs (1998) đã chọn được hai dòng có khả năng chịu muối là C0 và C8 Bằng phương pháp nuôi cấy tế bào huyền phù từ mô sẹo lúa trong môi trường có bổ sung AlCl3 ở nồng độ từ 0 – 600ppm có pH tương ứng từ 5,8 – 2,71

Bằng kĩ thuật nuôi cấy in vitro, Nguyễn Thị Vinh, Lê Duy Thành và

cộng sự (1995) nghiên cứu khả năng chịu nhôm và axit của các giống lúa : ĐC3, CM10, Pokaly, Cườm, Chiêm bầu, CR203, NN8, OM 861-20, OM296

và Tép lai, đã thu được các dòng mô sẹo của giống Pokaly và Cườm có khả năng chịu được AlCl3 ở 600ppm và pH là 2,71 Mô sẹo của giống Tép lai, CR203 chịu được AlCl3 ở 400ppm và pH là 2,98 [22]

Ngoài ra, nhiều công trình nghiên cứu của các tác giả về việc ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật trong cải tiến giống cây trồng trên các đối tượng khác nhau cũng đã được nghiên cứu

Chương 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ

2.1.1 Vật liệu

Giống đậu xanh VC1973A do bộ môn hệ thống canh tác của Viện nghiên cứu ngô cung cấp, nhập nội từ Trung tâm Cải tiến Rau màu Quốc tế, có hạt tròn, màu xanh nâu –bóng, chịu hạn kém Các dòng đậu xanh có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước của giống VC1973A bao gồm: D15, D40, D02, D20 do Bộ môn

Di truyền và Sinh học hiện đại, khoa Sinh- KTNN, trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên cung cấp

2.1.2 Các hóa chất chuyên dụng

Hóa chất dùng trong các phân tích hóa sinh và phân tích sinh học phân

tử gồm các loại hóa chất mua của các hãng của Anh, Đức, Mỹ, Trung Quốc, như: EDTA, CTAB, TAE, aragose…và các hóa chất thông dụng khác Bộ kit của hãng BIONEER, cặp mồi dùng cho phản ứng PCR đặt của hãng

BIONEER, enzyme giới hạn: BamHI

2.1.3 Thiết bị

Bảng 2.1 Danh mục các thiết bị sử dụng

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Qui trình tiến hành thí nghiệm thực hiện theo sơ đồ sau:

Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 2.2.1 Nghiên cứu ngoài đồng ruộng

Thí nghiệm trên đồng ruộng được tiến hành tại xã Phấn Mễ- Huyện Phú Lương Các dòng đậu xanh có nguồn gốc từ mô sẹo mất nước và giống đối chứng được trồng trong cùng điều kiện và theo dõi sự phát triển của các dòng qua các giai đoạn phát triển trong vụ đông xuân Đánh giá đặc điểm nông học thông qua các chỉ tiêu: chiều cao cây, số nhánh/cây, số quả chắc/cây, chiều dài quả, khối lượng quả, số hạt/ cây, khối lượng 1000 hạt, tỉ lệ nhân

Trồng ngoài đồng ruộng

Đánh giá đặc điểm nông học Phân tích chỉ tiêu hóa sinh

Hạt của các dòng chọn lọc ở thế hệ R3

Dòng triển vọng Trồng ngoài đồng ruộng

Đánh giá đặc điểm nông học Phân lập gen LTP

số biến động ( Cv) Các số liệu được xử lý trên máy tính theo chương trình Excel theo tài liệu của Chu Văn Mẫn (2003) [14]

2.2.3 Phân tích hóa sinh

Định lượng lipid tổng số

Xác định hàm lượng lipid dựa trên nguyên tắc hòa tan của lipid trong dung môi hữu cơ là ete dầu hỏa (petroleum ether) Hạt đậu xanh được sấy khô ở 700C đến khối lượng không đổi, nghiền mịn, cân 0,05 g bột mẫu cho vào ống eppendorf 2 ml, thêm 1,5 ml petroleum ether, lắc đều trong 10 phút, bảo quản mẫu ở 40C trong 24 giờ Sau đó mang đi li tâm 12000 vòng/phút ở

40C trong 20 phút, loại bỏ dịch Lặp lại quy trình như trên 3 lần

Hàm lượng lipid tính bằng hiệu số khối lượng mẫu trước và sau khi chiết phần trăm khối lượng khô

Công thức tính: % L =   100 %

a

b a

Trong đó: a: Khối lượng mẫu trước khi chiết

b: Khối lượng mẫu sau khi chiết L: Hàm lượng lipid

Định lượng protein

Định lượng protein trong đậu xanh theo phương pháp của Lowry được

mô tả trong tài liệu của Phạm Thị Trân Châu, 1998 [3] Sử dụng đệm chiết protein là phosphat citrat pH = 10, NaCl 1M và nước cất Protein được chiết ở

4oC trong 24 giờ Dịch chiết chứa protein hòa tan đem xác định hàm lượng cùng protein chuẩn là albumin huyết thanh bò theo phương pháp quang phổ hấp thụ bước sóng 750 nm với thuốc thử Foling Đơn vị tính hàm lượng protein là phần trăm khối lượng khô

Hàm lượng protein được tính theo công thức

X%    100

g

H a

% Trong đó: X: Hàm lượng protein khô

a: Số đo trên máy quang phổ ( mg/ml )

H: Hệ số loãng

2.2.4 Phân tích sinh học phân tử

 Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ lá đậu xanh

Phương pháp tách DNA tổng số theo Gawel và cs năm 1991 có cải tiến

[30] như sau:

- Lấy 200mg lá non nghiền trong nitơ lỏng thành bột mịn

- Bổ sung 0,8 ml đệm rửa (Tris HCl 1M, EDTA 0,5M, pH=8), Sobitol 2M, NaH2PO4 0,4 %, H2O), li tâm 15 phút tốc độ 12000 vòng /phút, loại bỏ dịch nổi Thêm 700 μl đệm tách (Tris HCl 1M, pH=8, NaCl 5M, EDTA 0,5M, CTAB 4%, H2O), trộn nhẹ Ủ 650C ít nhất 1 giờ, 5 phút lắc đều 1 lần, lấy ra

để ở nhiệt độ phòng 5 phút

- Thêm 600 μl chloroform : isoamyl (24:1), trộn đều 5 phút

- Li tâm 13000 vòng/phút trong 15 phút

- Hút 500 μl dịch trong sang ống 1,5 ml, bỏ tủa

- Thêm 500 μl isopropanol, để tủa DNA trong 30 phút ở -200C

- Li tâm 13000 vòng /phút trong 15 phút, bỏ dịch, úp xuống giấy cho khô

- Bổ sung 500 μl cồn 70% búng nhẹ

- Li tâm 7000 vòng/phút, 5 phút, loại bỏ cồn, thu cặn

- Làm khô DNA bằng máy speed vac

- Hoà tan DNA trong H2O khử ion

Định lượng và kiểm tra độ tinh sạch của DNA tổng số

Kiểm tra độ tinh sạch của DNA bằng 2 phương pháp:

(1) Phương pháp quang phổ hấp thụ: Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA trên máy quang phổ ở bước sóng 260nm và 280nm Nồng độ DNA trong dung dịch tách chiết được tính theo công thức:

Nồng độ DNA (ng/μl) = A260 x 50 x hệ số pha loãng

Độ sạch của DNA được xác định bằng tỷ lệ A260/A280 Dung dịch chứa DNA có tỷ lệ A260/A280 là 1,8- 2,0 được coi là đảm bảo chất lượng