Nghiên cứu sản xuất phôi invivo bò hmông tỉnh bắc kạn

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦ vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1: Diễn biến ựộng thái của các hormone trong máu ở các giai ựoạn Hình 2.2: Hì

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THU THẢO

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… i

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này trung thực và chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam ñoan số liệu và một số hình ảnh sử dụng trong luận văn ñã ñược sự ñồng ý của ThS Nguyễn Thị Thoa - chủ nhiệm ñề tài ”Nghiên cứu một số biện pháp khoa học và công nghệ ñể phục hồi và phát triển ñàn bò của ñồng bào Mông tỉnh Bắc Kạn”

Tôi xin cam ñoan rằng mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Thu Thảo

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦ ii

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt hai năm học tập và hoàn thành luận văn, với nỗ lực của bản thân, tôi ựã nhận ựược sự giúp ựỡ, hướng dẫn tận tình của nhiều cá nhân

và tập thể, cho phép tôi ựược tỏ lòng biết ơn và cảm ơn chân thành tới:

Ban Giám hiệu trường ựại học Nông nghiệp Hà Nội, viện đào tạo Sau ựại học, các thầy cô trong khoa Thú y và bộ môn Ngoại Sản ựã giúp

ựỡ, tạo ựiều kiện thuận lợi ựể tôi học tập, tiếp thu kiến thức của chương trình học

đặc biệt tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy hướng dẫn

khoa học TS Sử Thanh Long - bộ môn Ngoại Sản khoa Thú y ựã tận

tình hướng dẫn tôi trong quá trình nghiên cứu và xây dựng luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ, công nhân viên công tác tại bộ môn Sinh sản viện Chăn nuôi, ựặc biệt tôi xin chân thành cảm

ơn ThS Nguyễn Thị Thoa ựã giúp ựỡ và ựịnh hướng cho tôi từng bước

ựi trong khoa học

Xin chân thành cảm ơn Ban giám ựốc, tập thể cán bộ công nhân viên trung tâm Moncada - viện Chăn nuôi, trung tâm ứng dụng Khoa học

và Công nghệ tỉnh Bắc Kạn - sở Khoa học và Công nghệ Bắc Kạn, Bộ Khoa học và Công nghệ, các hộ nông dân tại 3 huyện Chợ đồn, Ba Bể, Pác Nặm - tỉnh Bắc Kạn ựã hướng dẫn, giúp ựỡ và tạo ựiều kiện tốt nhất cho chúng tôi thực hiện ựề tài

Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi ựược gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia ựình, người thân cùng bạn bè ựã ựộng viên giúp ựỡ tôi vượt qua mọi khó khăn trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu, thực hiện ựề tài

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Thu Thảo

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… iii

MỤC LỤC LỜI CAM ðOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC HÌNH vii

PHẦN I: MỞ ðẦU 1

1.1 ðặt vấn ñề 1

1.2 Mục ñích nghiên cứu của ñề tài 2

1.3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 2

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 Nghiên cứu trên thế giới 3

2.2 Nghiên cứu trong nước 5

2.3 Cơ sở khoa học của công nghệ sản xuất phôi invivo 6

2.3.1 Cơ chế hoạt ñộng của hormone sinh sản 6

2.3.2 Chu kỳ sóng nang trứng 7

2.3.3 Kích thích nang trứng phát triển ñồng loạt bằng sự tác ñộng hormone 9

2.3.4 Cơ chế thụ tinh 13

2.3.5 Quá trình phát triển của hợp tử ñến giai ñoạn phôi nang 15

2.3.6 Cấu tạo phôi bò 16

2.3.7 Cơ chế ñông lạnh phôi 21

2.3.8 Giải ñông phôi 25

2.3.9 Giới thiệu về bò H’Mông 26

PHẦN III: ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

3.1 ðối tượng, ñịa ñiểm và thời gian 29

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦ iv

3.2 Nội dung 29

3.3 Phương pháp 29

3.3.1 Phương pháp gây rụng trứng nhiều 29

3.3.2.Thu hoạch phôi 35

3.3.3 Phân loại phôi 37

3.3.4 đánh giá phân loại phôi theo chất lượng 38

3.3.5 Phương pháp ựông lạnh phôi 39

3.3.6 Phương pháp thu thập và xử lý số liệu 40

PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41

4.1 Tình hình chăn nuôi bò HỖMông tại 3 huyện Ba Bể, Chợ đồn và Pác Nặm 41

4.2 Kết quả nghiên cứu sản xuất phôi 44

4.2.1 Kết quả gây rụng trứng nhiều 44

4.2.2 Kết quả thu hoạch phôi 47

4.3 Kết quả ựánh giá phân loại phôi 54

4.3.1 đánh giá phân loại phôi sau khi thu hoạch 54

4.3.1.1 đánh giá phân loại phôi theo chất lượng 54

4.3.1.2 đánh giá phân loại phôi theo giai ựoạn phát triển 59

4.3.2 đánh giá phân loại phôi sau khi giải ựông 61

4.3.2.1 đánh giá phân loại phôi theo chất lượng 61

4.3.2.2 đánh giá phân loại phôi theo giai ựoạn phát triển 63

PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ đỀ NGHỊ 65

5.1 Kết luận 65

5.2 đề nghị 65

TÀI LIỆU THAM KHẢO 66

I Tiếng Việt 66

II Tiếng nước ngoài 67

PHỤ LỤC 74

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… v

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

anti-PMSG anti-Pregnant Mare Serum Gonadotropin

CIDR Controlled internal drug release

eCG Equine Chorionic Gonadotropin

FRH Folliculin Releasing hormone

FSH Follicle Stimulating hormone

LH-RH Lutein Releasing hormone

LRH Lutein Releasing hormone

PBS Phosphate-Buffered Saline

PGF2α Prostaglandin F2 alpha

PMSG Pregnant Mare Serum Gonadotropin

PRH Prolactin Releasing hormone

PRID Progesterone Releasing Intravaginal Device

TTNT Thụ tinh nhân tạo

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦ vi

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 4.1: Cơ cấu ựàn bò HỖMông tại các xã ựược ựiều tra 42

Bảng 4.3: Số phôi thu ựược qua các lần gây rụng trứng nhiều 48 Bảng 4.4a: Tỷ lệ số phôi thu ựược so với số thể vàng kiểm tra 51 Bảng 4.4b: Tỷ lệ số phôi thu ựược so với số thể vàng kiểm tra 52 Bảng 4.5a: Kết quả ựánh giá phân loại phôi theo chất lượng 56 Bảng 4.5b: Kết quả ựánh giá phân loại phôi theo chất lượng 57 Bảng 4.6: đánh giá phân loại phôi sau thu hoạch theo giai ựoạn phát triển 59 Bảng 4.7: đánh giá phân loại phôi sau giải ựông theo chất lượng 62

Bảng 4.8: đánh giá phân loại phôi sau giải ựông theo giai ựoạn phát triển 63

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦ vii

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1: Diễn biến ựộng thái của các hormone trong máu ở các giai ựoạn

Hình 2.2: Hình sóng nang trong một chu kỳ sinh dục Hình 2.3: Sự di chuyển và phát triển của phôi xuống tử cung

Hình 2.4: Cấu tạo phôi bò

Hình 4.10: đánh giá phân loại phôi sau giải ựông theo giai ựoạn phát triển 64

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 1

PHẦN I

MỞ ðẦU 1.1 ðặt vấn ñề

Bò H’Mông là giống bò mới ñược phát hiện ở các tỉnh miền núi phía Bắc từ năm 1997, ñây là giống bò ñược ñồng bào dân tộc H’Mông ở vùng cao nuôi giữ từ lâu theo phương thức chăn thả tự do Bò H’Mông có chất lượng thịt thơm ngon, thịt bò H’Mông Cao Bằng ñã ñược giới thiệu sản phẩm tại siêu thị BigC Hà Nội vào tháng 4/2009 và ñược người tiêu dùng rất quan tâm ñón nhận Việc phát triển chăn nuôi bò H’Mông là cần thiết, vừa ñáp ứng công tác bảo tồn ña dạng di truyền vật nuôi vừa ñáp ứng nhu cầu thịt bò chất

lượng cao của người tiêu dùng

Giống bò của ñồng bào H’Mông tỉnh Bắc Kạn là một trong những ñộng vật nuôi phổ biến và có nhiều ñặc ñiểm ưu việt như khả năng chống chịu cao

và có chất lượng thịt ngon Mặc dù vậy hiện nay giống bò này ñang có nguy

cơ bị thoái hoá về giống do vấn ñề cận huyết kéo dài Việc khai thác giống bò của ñồng bào H’Mông mang tính tự phát thiếu ñiều tiết ñã mang lại một số

bất cập mà chúng ta phải quan tâm như sau:

Số bò bán ñi thường là con to, có sản lượng thịt lớn Số còn lại kém hơn và thường giữ lại làm giống Việc bán hoặc thịt ñi một số bò tốt sẽ gây thoái hóa ñàn bò còn lại, bò ñực giống chưa ñược chọn lọc và phân bố hẹp vì

vậy cần phải phục hồi và phát triển ñàn bò

Phương thức chăn nuôi vẫn mang nặng tính truyền thống “thủ công, sản xuất nhỏ” không ñủ sức ñể cạnh tranh với thương trường Chưa có hệ thống chọn lọc nhân giống, quản lý giống ñể phát huy tiềm năng di truyền về năng xuất, sản lượng và chất lượng giống Hiện nay, các nghiên cứu về bò của ñồng bào H’Mông còn rất hạn chế, nội dung nghiên cứu chỉ tập trung chủ yếu vào ñặc ñiểm sinh học của bò

Giống bò H’Mông mới ñược giới khoa học quan tâm từ năm 1998 Tuy nhiên, từ ñó ñến nay cũng chỉ ñược nghiên cứu về ñặc ñiểm sinh học, thiếu

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 2

các nghiên cứu mang tính chuyên nghiệp và tổng thể về ñiều kiện chăn nuôi,

nghiên cứu phục hồi và phát triển ñàn bò

Vấn ñề ñặt ra là cần phải có một số giải pháp về khoa học công nghệ sinh sản ñể phục hồi và phát triển giống bò của ñồng bào H’Mông Bắc Kạn nói riêng và của Việt Nam nói chung ðồng thời kết quả thu ñược sẽ góp phần ñịnh hướng trong công tác nghiên cứu khoa học và chuyển giao công nghệ phục hồi, khai thác và phát triển một cách hợp lý có hiệu quả nguồn gen quý hiếm giống bò H’Mông của Bắc Kạn và các ñịa phương khác trong việc phát triển nền chăn nuôi ña dạng sinh học và bền vững của Việt Nam Có thể nói, ứng dụng công nghệ cấy truyền phôi và các kỹ thuật liên quan trong ñó kỹ

thuật sản xuất phôi invivo là một trong những phương pháp có thể ñem lại

hiệu quả cao trong việc sử dụng nguồn gen quý ñể phục hồi và phát triển

giống bò H’Mông Bắc Kạn

Xuất phát từ thực tế, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài: “Nghiên cứu sản xuất phôi invivo bò H’Mông tỉnh Bắc Kạn”

1.2 Mục ñích nghiên cứu của ñề tài

Nghiên cứu ứng dụng công nghệ phôi invivo ñể khôi phục và phát triển

giống bò của ñồng bào H’Mông Bắc Kạn

Nâng cao năng suất sinh sản và bảo tồn nguồn gen quý hiếm giống bò H’Mông Bắc Kạn

1.3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

Chúng tôi hy vọng ñề tài sẽ cung cấp cho bạn ñọc những thông tin và

số liệu cụ thể về tình hình chăn nuôi, quy mô ñàn bò H’Mông trên ñịa bàn các huyện Chợ ðồn, Ba Bể, Pác Nặm - tỉnh Bắc Kạn ðồng thời với những tiến

bộ khoa học ñược áp dụng, giúp nâng cao hiệu quả chăn nuôi bò H’Mông

và tăng thu nhập cho người chăn nuôi

Các kết quả nghiên cứu thu ñược của ñề tài là cơ sở giúp cán bộ kỹ thuật, người chăn nuôi phát triển ñàn bò ñể giữ nguồn gen quý và tạo ra sản phẩm thịt ñạt cả về số lượng và chất lượng

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 3

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Nghiên cứu trên thế giới

Ngày nay, công nghệ sinh học hỗ trợ sinh sản trên ñộng vật ñang trở thành một ñộng lực thúc ñẩy sự phát triển ngành chăn nuôi của mỗi quốc gia trên thế giới Công nghệ sinh học hỗ trợ sinh sản sẽ tạo ra những bước nhảy vọt về năng suất, chất lượng giống vật nuôi Nó không những tạo ra các giống năng suất cao, chất lượng tốt mà còn thích nghi với ñiều kiện môi trường sinh thái khác nhau Cấy truyền phôi và những kỹ thuật liên quan là công nghệ sinh học sinh sản hiện ñại ñược rất nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu và ứng dụng trong chăn nuôi

Nghiên cứu ứng dụng công nghệ Cấy truyền phôi (CTP), ñã nhân nhanh những giống bò thuần ñịa phương nổi tiếng trên thế giới như bò Red Sind (Pakistan), bò Sahiwal (Ấn ðộ), giống bò ðen (Nhật Bản) Các giống bò

ôn ñới của châu Âu như Santa Gertrudis, Charolais, Limousin, ñây là những giống bò thịt bản ñịa có nguồn gen quý

Từ sau thí nghiệm của Heape (1890) về cấy truyền phôi trên thỏ ñược công bố, nghiên cứu cấy truyền phôi trên gia súc như dê, cừu, lợn, trâu, bò

ñã ñược nghiên cứu ứng dụng thành công ở nhiều nước

Trong lĩnh vực sinh sản ñại gia súc, bê con ñầu tiên trên thế giới ra ñời bằng kĩ thuật cấy phôi vào năm 1951 do Willet và cs nghiên cứu Việc tạo ra con non ñầu tiên sinh ra bằng phương pháp cấy truyền phôi ñã thúc ñẩy công nghệ CTP phát triển nhanh chóng Năm 1973, Wilmut và Rowson ñã cấy truyền phôi ñông lạnh thành công trên bò Năm 1974, Elsden và cs nghiên cứu gây rụng trứng nhiều bằng huyết thanh ngựa chửa (PMSG) và PGF2α trên

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 4

bò Boland và cs (1978), Newcomb và cs (1976) ñã sử dụng eCG ñể gây rụng trứng nhiều ở bò Năm 1982, vi phẫu thuật phôi bò thành công trong phòng thí nghiệm Năm 1985, Yandav và cs sử dụng progesterone và PGF trong gây rụng trứng nhiều ñể khống chế thời ñiểm, thời gian và mức ñộ ñộng dục có thể ñem lại những cải tiến về số lượng trứng rụng và chất lượng phôi Olivera-Angel và cs (1984) nghiên cứu về tỷ lệ thu phôi và chất lượng phôi khi gây rụng trứng nhiều bằng eCG (2000UI) trên bò thịt tơ và bò thịt ñang cho bú Theo sau ñó, năm 1986 kỹ thuật chia tách phôi ñã thành công ở giai ñoạn 8 phôi bào trên cừu, bò, ngựa Năm 1997, thế giới ghi nhận sự ra ñời của cừu Dolly bằng kỹ thuật nhân bản vô tính Năm 2002, Hai con lừa ra ñời bằng cấy truyền phôi ñông lạnh theo phương pháp thủy tinh thể tại Colorado Năm

2003, tại Idaho một con la và tại Italy một con ngựa lai ñã ra ñời bằng phương pháp cloning (Patrick M McCue, 2009)

Cùng với sự phát triển về kỹ thuật, các phương pháp sử dụng hormone sinh sản ñể gây rụng trứng nhiều và ñông lạnh phôi không ngừng ñược cải tiến và ứng dụng Sau khi nghiên cứu, triển khai có hiệu quả các phương pháp ñông lạnh phôi và sử dụng dimethyl sulfoside hay glycerol làm chất bảo vệ lạnh, CTP trở thành một công nghệ hiệu quả hơn, mà không còn phụ thuộc vào số bò nhận phôi Thành công ñầu tiên của việc ñông lạnh phôi ñộng vật

có vú ñược báo cáo ở chuột (Whittingham, 1971) Năm 1973, bê con ñầu tiên

ra ñời bằng phôi ñông lạnh- giải ñông (Wilmut và Rowson) Từ ñó ñến nay,

ñó có nhiều tác giả nghiên cứu cải tiến các phương pháp ñông lạnh truyền thống Những tiến bộ gần ñây trong ñông lạnh phôi ñộng vật có vú ñã ñạt ñược bằng phương pháp ñông lạnh thể thủy tinh (vitrification) Phương pháp ñông lạnh thể thuỷ tinh lần ñầu ñược Rall và Fahy (1985) ñề xuất Sau ñó phương pháp này ñã ñược nhiều tác giả nghiên cứu thành công ñã nâng cao

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 5

ñược tỷ lệ sống của phôi ñộng vật có vú sau ñông lạnh (Pugh và cs, 2000; Kasai, 2002)

2.2 Nghiên cứu trong nước

Ở Hà Giang có giống bò Mèo ñược dân tộc thiểu số nuôi tại các tỉnh vùng núi phía bắc Việt Nam, ñặc biệt tập trung tại các huyện vùng cao Hà Giang Giống bò này có khả năng sản xuất cao, tầm vóc lớn, phẩm chất thịt thơm ngon Nhận thấy ñược ñặc ñiểm quý của giống bò này, những năm 90 của thế kỷ trước một số tác giả ñã nghiên cứu giống bò này

Nguyễn Văn Niêm và cs (1999) ñã có một số kết quả nghiên cứu bò H’Mông như: bò ñực trưởng thành có khối lượng cơ thể ñạt 400-450 kg, bò cái trưởng thành có khối lượng cơ thể ñạt 250-280 kg, tỉ lệ thịt xẻ khá cao 52,12%, tỉ

lệ thịt tinh ñạt 40,33% (so với bò Vàng Việt Nam tỉ lệ này là 42% và 33%) Trịnh Quang Phong và Phan Văn Kiểm (2006) ñã tiến hành nghiên cứu một

số ñặc ñiểm sinh vật học tinh dịch và kỹ thuật ñông lạnh tinh bò ñực giống bò vùng cao Hà Giang

Việc ứng dụng công nghệ sinh học sinh sản ñộng vật ở Việt Nam ñược Bùi Xuân Nguyên và cs nghiên cứu năm 1978 tại trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia Từ năm 1980, các tác giả này cũng ñã bắt ñầu nghiên cứu cấy truyền phôi trên bò Năm 1986, bê con ñầu tiên ở nước ta ñược ra ñời từ công nghệ này Năm 1994, bò sinh ñôi trong ñó có một bê do trứng rụng tự nhiên trong chu kỳ ñộng dục và một bê do cấy truyền phôi ñã ñược thực hiện tại viện Chăn nuôi Ngày 03/03/2002, cặp bê cái sinh ñôi từ một phôi cắt thành 2 phôi ñã ra ñời ðây là thành công ñầu tiên ở Việt Nam

về công nghệ cloning từ tế bào phôi Ngày 14/01/2004, con bê ñầu tiên sinh ra

từ phôi thụ tinh ống nghiệm do cán bộ nghiên cứu viện Chăn nuôi quốc gia thực hiện Năm 2010, kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Thoa cho biết số phôi thu ñược ñạt 5,75 phôi/bò/lần thu phôi và 46 phôi/bò/năm, tỷ lệ có chửa

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 6

ñạt 38-41,83% và tỷ lệ ñẻ ñạt 28,11-30% Những kết quả trên chứng tỏ rằng chúng ta ñã nghiên cứu ứng dụng thành công công nghệ cấy truyền phôi trên ñộng vật ñồng thời khẳng ñịnh công nghệ phôi bò ñã ứng dụng thành công trong ñiều kiện chăn nuôi ở Việt Nam

Ở nước ta, nghiên cứu ñông lạnh phôi bò ñã ñược tiến hành từ năm

1984 Phương pháp ñông lạnh nhanh (tốc ñộ hạ nhiệt 120C/phút) sau khi khử nước bộ phận ở nhiệt ñộ hiện trường trên phôi bò ñã thành công (Nguyen và

cs, 1984) Năm 2003, Lưu Công Khánh và cs nghiên cứu tỷ lệ sống của phôi ñông lạnh-giải ñông ñạt 73,24% và ñã thành công trong việc nghiên cứu ứng dụng ñông lạnh chậm phôi bò bằng glycerol Năm 2006, Nguyễn Thị Thoa và

cs ñã nghiên cứu thành công ñông lạnh phôi bò bằng phương pháp tạo thể thủy tinh (Vitrification method, Hội nghị khoa học quốc tế lần thứ 3 năm 2006) Nguyễn Thị Thoa (2010) ñã nghiên cứu ñông lạnh phôi bò sữa, bò thịt,

tỷ lệ phôi sống sau ñông lạnh giải ñông ñạt 75-80% ðến nay ñã có hàng trăm

bê hướng sữa ñược sinh ra do cấy phôi ñông lạnh trong nước cũng như phôi ñông lạnh nhập khẩu

2.3 Cơ sở khoa học của công nghệ sản xuất phôi invivo

2.3.1 Cơ chế hoạt ñộng của hormone sinh sản

Chu kỳ ñộng dục ñược ñiều hòa bởi các hormone vùng dưới ñồi, các gonadotropin và các steroid của buồng trứng tiết ra Việc ñiều hoà tiết gonadotropin hormone của tuyến yên ñòi hỏi một sự cân bằng giữa các mối tác ñộng tương hỗ hormone Yếu tố giải phóng của hypothalamus gồm FSH-RH và LH-RH có tác ñộng kích thích thuỳ trước tuyến yên tiết nhiều FSH, LH, kích thích sự tăng trưởng của tử cung Sau khi rụng trứng, thể vàng ñược hình thành

và tiết progesterone Thời kỳ hoạt ñộng của thể vàng ñược gọi là pha lutein, kéo dài 16-17 ngày ở bò Sự thoái hoá của thể vàng do hoạt ñộng của nhân tố phân giải lutein là Prostaglandin F2 alpha (PGF2α) Prostaglandin ñược tiết ra từ mô tử

cung loài ñộng vật có vú (Nguyễn Tấn Anh và cs, 1995)

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 7

ðộng thái hormone sinh dục trong chu kỳ ñộng dục thể hiện qua hình dưới ñây:

Hình 2.1: Diễn biến ñộng thái của các hormone trong máu ở các

giai ñoạn trong chu kỳ ñộng dục ở bò cái

1 Các giai ñoạn ở chu kỳ ñộng dục

Nhiều tác giả cho thấy rằng tiềm năng sinh sản của bò lớn hơn rất nhiều

so với khả năng sinh sản thực của chúng Theo Erickson (1966) cho biết buồng trứng của bò có trên 70.000 nang trứng nguyên thuỷ có thể phát triển thành tế bào trứng ñể thụ tinh và tạo phôi

Ở bò, mỗi chu kỳ chỉ rụng 1 trứng, nếu thụ tinh chỉ ñược một bê, trong một ñời bò cái chỉ sinh ñược 7-8 bê như vậy trong thực tế số nang trứng ñược

sử dụng hữu ích rất ít, ñối với một ñời con cái cao sản thật là lãng phí

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 8

Nhiều nghiên cứu cho thấy trong một chu kì ở bò thường có 2 ñến 3 ñợt sóng nang phát triển cá biệt có tới 4 ñợt Sóng nang là sự phát triển của một

số nang trứng ở cùng một thời gian ðợt một bắt ñầu diễn ra sau khi rụng trứng vào ngày thứ 3-9 của chu kì, ñợt hai vào ngày 11-17, ñợt ba là ngày 18-

20 Mỗi ñợt sóng nang có thể huy ñộng tới 15 nang kích thước từ 5-7mm phát triển, sau này có một nang phát triển mạnh hơn gọi là nang trội (nang khống chế) Kích thước của nang khống chế ở ñợt 1, 2, 3 có thể ñạt 12-15mm và các ñỉnh kích thước nang tương ứng quan sát thấy vào các ngày 6, 13, 21 (Monget

và cs, 1995) ðặc ñiểm trong các ñợt phát triển nang là sự phát triển có tính tự ñiều khiển và cạnh tranh giữa các nang Mỗi ñợt có 1-2 nang trội, vài nang lớn phát triển và sự phát triển của các nang còn lại bị kìm hãm Tuy vậy, trong khi thể vàng còn tồn tại, nang khống chế và nang lớn sẽ bị thoái hoá, chỉ có ñợt cuối cùng khi thể vàng không còn thì nang khống chế mới phát triển tới chín và rụng ðây là lý do giải thích tại sao mỗi chu kì ñộng dục của bò chỉ có một trứng chín và rụng (cá biệt có 2 trứng) Do ñặc ñiểm này, các ñợt phát triển nang còn ñược gọi là các sóng nang phát triển Trong mỗi ñợt sóng như vậy sự tồn tại của các nang không phải nang khống chế dao ñộng từ 5-6 ngày Riêng nang khống chế có thể phát triển nhanh sau ngày 18 của chu kì, tốc ñộ phát triển của nang khống chế vào thời ñiểm này có thể ñạt 1,6mm một ngày (Savio và cs, 1988)

Hình 2.2: Hình sóng nang trong một chu kỳ sinh dục

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 9

2.3.3 Kích thích nang trứng phát triển ñồng loạt bằng sự tác ñộng hormone

Trên cơ sở nghiên cứu về quy luật phát triển của nang trên buồng trứng

và những hiểu biết hormone sinh sản, nhiều nhà khoa học ñã tạo cho trứng rụng ñồng loạt trong một chu kì và tạo ñược nhiều phôi có chất lượng vào ñiểm ñược xác ñịnh bằng kỹ thuật gây rụng trứng nhiều

Gây rụng trứng nhiều lần ñầu tiên ñược nghiên cứu trên chuột của Engle (1927); trên bò và cừu của Col và Miller (1933) Các phương pháp GRTN trong giai ñoạn này bước ñầu nghiên cứu chủ yếu trên cơ sở về mối tương quan tuyến yên-buồng trứng và sự phát hiện hormone eCG và estrogen

ở phụ nữ có thai và ngựa chửa (Zondek và Aschheim, 1927) Kết quả GRTN

ở giai ñoạn này còn rất hạn chế và vì vậy tỷ lệ thụ thai sau cấy phôi chỉ ñạt từ 2-10%

Nghiên cứu xây dựng các phương pháp GRTN một cách hệ thống và trên cơ sở hiểu biết ñầy ñủ về cơ chế ñiều khiển sự phát triển nang và rụng trứng bắt ñầu thực hiện từ những năm 1970 Những ñóng góp quan trọng liên quan ñến việc xây dựng các phương pháp GRTN trong giai ñoạn này ñã ñược thực hiện trên cơ sở nghiên cứu quy luật phát triển nang, rụng trứng và vai trò thể vàng trong hoạt ñộng chu kỳ tính buồng trứng Nghiên cứu của nhiều tác giả cho thấy sự rụng trứng chỉ xảy ra ở các nang ñã phát triển tới ñộ chín cần thiết, bao gồm sự tăng tối ña kích thước nang và xoang chứa dịch nang, và sự chín noãn ñược thể hiện qua các hiện tượng tan màng nhân, phân lập cầu cực

1, và phân bố thể nhiễm sắc ở giai ñoạn metaphase II (MII) (Thibault, 1985) ðiều kiện cần thiết ñể các quá trình chín và rụng trứng xảy ra là sự tăng cường phân tiết LH của tuyến yên trong máu ngoại vi Sự chín và rụng trứng chỉ xảy ra sau khi xuất hiện ñỉnh LH Quan sát ở bò cho thấy trong chu kỳ bình thường, sự tan màng nhân xuất hiện khoảng 5 giờ sau ñỉnh LH, sự hình thành nhiễm sắc thể M II xảy ra khoảng 17-22 giờ sau ñỉnh LH, và rụng trứng

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 10

xảy ra 22 giờ sau ñỉnh LH (Dieleman và cs, 1993) Vào thời ñiểm sắp rụng trứng, sự tăng các thể tiếp nhận LH ñược quan sát thấy trong các nang khống chế sẽ dẫn tới tăng tổng hợp progesterone và PGF Những nghiên cứu về cơ chế hoạt ñộng của các hormone gây sự vỡ nang góp phần ñưa ra các chỉ dẫn

về vai trò và phương thức sử dụng LH hoặc hCG trong GRTN Ngoài ra, ñã

có rất nhiều tác giả nghiên cứu về các phương pháp và sử dụng các loại hormone khác nhau ñể GRTN ở bò cho phôi

Theo Elsden và cs (1976), kết hợp PMSG với PGF2α gây rụng trứng nhiều trên bò cho kết quả tốt hơn khi dùng một mình PMSG Savage và cs (1987) ñã sử dụng Estradiol-17β hoặc GnRH với FSH-P Với số bò là 54 ñược gây rụng trứng nhiều từ ngày 10-12 của chu kì ñộng dục với liều 28 FSH-P, mỗi ngày tiêm hai lần với liều giảm dần, trong 4 ngày liên tục Sau khi tiêm 48h mỗi bò ñược tiêm 500mg PGF2α Số trứng rụng trung bình là 12,3±2,3, số phôi thu ñược là 0,35±2,7, số trứng ñược thụ tinh là 6,3±5,4 trên tất cả bò thí nghiệm

Gây rụng trứng nhiều cho bò bằng Norgestomet và FSH ñã ñược Hill

và cs (1986) rút ra kết luận rằng dùng Norgestomet kết hợp với FSH ñể gây rụng trứng nhiều cần quan tâm ngày của chu kì ñộng dục của bò và ñây là một phương pháp tốt và có hiệu quả Bằng phương pháp này chúng ta không mất nhiều thời gian phát hiện ñộng dục và tạo ñộng dục ñồng pha ñối với bò cho phôi trong kỹ thuật cấy truyền phôi

Năm 1986, tác giả Kostov và cs ñã tiến hành gây rụng trứng nhiều ở bò bằng Synchromate B và Estradiol, PMSG và PGF2α Kết quả bò ñã ñộng dục sau tiêm 96 giờ và có 17,6% số bò không ñộng dục Số bò có thể vàng từ 2-4; 5-10; 11-15 và trên 15 tương ứng là 3; 6; 2 và 4 con Dieleman và cs (1987) báo cáo kết quả gây rụng trứng nhiều ở bò bằng sử dụng PMSG, PGF2α và anti-PMSG Bình quân số trứng rụng và nang trứng tương ứng là 15,7±2,5 và

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 11

15,4±1,6 cho mỗi bò thí nghiệm Kết quả ở bò thí nghiệm cao gấp 2 lần so với

bò ñối chứng về số lượng trứng rụng và ñộ tin cậy (P<0,05)

Theo Crister và cs (1988) sử dụng FSH và eCG ñể GRTN tuy không dẫn tới sự khác nhau về số trứng rụng (10 thể vàng) nhưng có thể ảnh hưởng dương tính lên chất lượng phôi Tuy vậy, Alcivar và cs (1984) trong thí nghiệm so sánh sử dụng FSH (26mg, liều giảm dần) và Pergonal (1500UI) tiêm vào ngày 9-11 của chu kỳ ñã thông báo số thể vàng và số phôi thu ñược

ở lô bò ñược xử lý FSH (11 thể vàng, 9 phôi) cao hơn so với lô dùng Pergonal (10 thể vàng, 7,5 phôi), song số phôi cấy ñược không khác nhau giữa 2 thí

nghiệm Theo Aoygi và cs (1987) sự biến ñổi nồng ñộ hormone progesterone

và estradiol trong máu ngoại vi của bò ñược gây rụng trứng nhiều bằng FSH

và eCG không khác nhau rõ rệt

Theo Yadav và cs (1986), Ellington và cs (1987) việc sử dụng progesterone và PGF trong gây rụng trứng nhiều ñể khống chế thời ñiểm, thời gian và mức ñộ ñộng dục có thể ñem lại những cải tiến về số trứng rụng và chất lượng phôi Trong trường hợp bò cho phôi có hoạt ñộng sinh sản kém, kết quả gây rụng trứng nhiều thấp, thì việc sử dụng PGF (50mg) tiêm nhiều lần (3 lần, cách nhau 6 giờ thay vì tiêm 2 lần cách nhau 12 giờ) có thể tăng ñáng kể tỷ lệ ñộng dục (96% so với 86%), tỷ lệ phôi thụ tinh (62% so với 51%), số phôi tốt thu ñược (5,4 so với 3,8) (Donaldson và cs, 1986)

Estradiol cũng có ảnh hưởng quan trọng lên kết quả gây rụng trứng

nhiều Bổ sung 20mg estradiol-17β vào ngày thứ 1-2 sau khi xử lý eCG, làm tăng số nang phát triển và tăng số trứng thụ tinh Kết quả sử dụng estradiol-

17β bổ sung vào FSH hoặc eCG ñể gây rụng trứng nhiều ở bò Simental ñược Broadbent và cs (1995) thông báo gần ñây là 15 thể vàng với số bò ñược xử lý FSH, và 16 thể vàng với bò ñược xử lý eCG

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 12

Lindsell và cs (1986), xử lý FSH vào ngày thứ 9 của chu kỳ của bò cho kết quả rụng trứng và chất lượng phôi cao hơn hẳn so với xử lý vào ngày thứ 3 hoặc 6 Gouding và cs (1990) cũng thông báo kết quả tương tự trên ñối tượng bò thịt

Về góc ñộ sinh lý và môi trường, các nghiên cứu ñã ñược công bố cho thấy các yếu tố cá thể, giống, mùa vụ ñều ảnh hưởng lớn tới kết quả gây rụng trứng nhiều ở bò Kết quả thí nghiệm của Foote và Onuma (1970) cho thấy tùy thuộc theo trạng thái cá thể phản ứng rụng trứng ở bò có thể dao ñộng từ 0-14 trứng rụng/con

Trong trường hợp gây rụng trứng nhiều bằng cùng một quy trình, bò có trạng thái sinh sản bình thường cho 10 trứng rụng trong ñó có 6,4 trứng tốt, trong khi bò vô sinh chỉ cho 6 trứng rụng và 2,4 trứng dùng ñược Phản ứng rụng trứng ở bò có chu kỳ ngắn hơn 15 ngày cũng kém hơn so với bò có chu

kỳ dài 15-27 ngày (Crister và cs, 1988)

Tuổi bò lúc gây rụng trứng nhiều cũng ảnh hưởng ñến kết quả tạo phôi Phản ứng rụng trứng nhiều ở bò tơ chưa ñẻ và bò ñẻ 1-5 lần thường cao hơn

so với bò ñã ñẻ trên 6 lần (Greve, 1982) Chất lượng phôi thu ñược sau gây rụng trứng nhiều ở bò sữa 12 tháng tuổi kém hơn so với bò sữa ñã ñẻ 1-2 lứa, trong trường hợp bò tơ, số trứng rụng có xu hướng cao hơn nhưng tỷ lệ phôi ñạt tiêu chuẩn cấy phôi rất thấp (Schilling và cs, 1981)

Olivera-Angel và cs (1984) nghiên cứu về tỷ lệ thu phôi và chất lượng của phôi sau khi gây rụng trứng nhiều bằng eCG (2000UI) trên bò thịt tơ và

bò thịt ñang cho bú cho thấy ở bò tơ tỷ lệ thu phôi chỉ ñạt 15% và tỷ lệ phôi phát triển bình thường là 40%, thấp hơn nhiều so với tỷ lệ thu phôi ñạt 39%

và tỷ lệ phôi phát triển bình thường 67% ở bò ñang cho bú

Phản ứng rụng trứng nhiều cũng rất khác nhau giữa các giống bò, theo Gauthier (1983), số trứng rụng trung bình trong các xử lý gây rụng trứng

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 13

nhiều bằng eCG là 2,9 ở bò Pied-noir, 6,2 ở bò Charolaise, 4,9 trứng ở bò lai Holstein-Fresian và 8,2 trứng ở bò Holstein

Kết quả gây rụng trứng nhiều cũng có thể thay ñổi do ảnh hưởng của các ñiều kiện ñịa lý khí hậu khác nhau Phản ứng buồng trứng và chất lượng phôi thu ñược trong mùa ñông-xuân thường tốt hơn so với mùa hè-thu

Theo thông báo của Hasler và cs (1983) khi GRTN vào mùa ñông-xuân

số thể vàng thu ñược của bò Holstein nuôi trong ñiều kiện ôn ñới cao hơn nếu ñược xử lý vào mùa hè-thu Tương tự, kết quả rụng trứng nhiều và thụ tinh ở

bò Holstein nuôi tại ñiều kiện nhiệt ñới châu Phi xử lý eCG vào mùa ñông cao hơn xử lý vào mùa hè (Gordon và cs, 1987)

Qua kết quả nghiên cứu về ứng dụng GRTN trong cấy truyền phôi của nhiều tác giả, có thể ñưa ra nhận xét rằng hầu hết các phương pháp GRTN ñược sử dụng phổ biến hiện nay, ñều ñược sử dụng các hormone sinh sản và ở mức ñộ các cơ chế ñiều khiển nội tiết-thần kinh thể dịch

Nguyên tắc chung của các phương pháp

Khống chế thể vàng bằng các hormone có hoạt tính làm tiêu thể vàng

như oestrogen, prostaglandin và dẫn xuất của chúng

Khống chế hoặc làm mất nang khống chế bằng các hormone Estradiol, hCG

Tăng khả năng huy ñộng nang mới phát triển, và khả năng phát triển

các nang ñã ñược huy ñộng bằng FSH, eCG

Tạo sự chín ñều và rụng trứng cùng lúc cho các nang ở con cho, hoặc

giữa con cho và con nhận, bằng cách sử dụng kết hợp progestin và PGF

2.3.4 Cơ chế thụ tinh

Quá trình thụ tinh (quá trình thụ thai) là quá trình sinh lý phức tạp của

tế bào trứng và tinh trùng ñã hoàn toàn thành thục gặp nhau phát sinh ñồng hoá và dị hoá ñể tạo ra một tế bào sống mới mang ñặc tính di truyền của cả bố

và mẹ (Trần Tiến Dũng và cs, 2002)

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 14

Người ta chia quá trình thụ tinh thành 3 giai ñoạn:

Giai ñoạn tiếp xúc

Giai ñoạn tinh trùng ñi vào tế bào trứng

Giai ñoạn ñồng hoá, dị hoá lẫn nhau giữa tế bào trứng và tinh trùng

Giai ñoạn tiếp xúc (giai ñoạn sinh lý bình thường)

Sau khi tinh trùng ñược ñưa vào ñường sinh dục con cái, nhờ ñặc tính vận ñộng ngược dòng, ñặc tính ưa vật lạ của tinh trùng cùng với sự hấp dẫn bởi chất nữ bào tố fertilizin và tác ñộng của dịch tiết trong ñường sinh dục cái, tinh trùng vận ñộng lên vị trí thích hợp (1/3 phía trước ống dẫn trứng) gặp tế bào trứng và chúng vây xung quanh tế bào trứng

Giai ñoạn tinh trùng ñi vào tế bào trứng (giai ñoạn phá vỡ màng bao)

Giai ñoạn phá vỡ màng phóng xạ

Tinh trùng sau khi vây xung quanh tế bào trứng chúng ñồng loạt bong

xoang Acrosom giải phóng men hyaluronidaza (men này không ñặc trưng cho

loài) có tác dụng làm dung giải axít hyaluronilic làm phân giải các tế bào hình trụ, hình nang

Giai ñoạn ñi qua màng trong suốt

Sau khi phá vỡ màng phóng xạ tinh trùng tiếp tục công phá màng trong

suốt của tế bào trứng Ở màng này có men ñặc trưng cho loài zonalizinase chỉ

cho phép những tinh trùng cùng loài vào mà thôi Sau khi qua màng trong suốt vào khoảng trống tinh trùng nghỉ ngơi một thời gian nhất ñịnh ñể lấy sức chuẩn bị chui qua màng nguyên sinh chất

Giai ñoạn ñi qua màng nguyên sinh chất

Rất nhiều tinh trùng bám xung quanh màng nguyên sinh chất nhưng chỉ

có duy nhất một tinh trùng chui qua ñược màng nguyên sinh chất mà thôi nhờ

men muraminidaza Màng nguyên sinh chất chuyển ñộng theo cơ chế ñông

máu với sự tham gia của ion Ca2+, nó rung chuyển liên tục chỉ tạo ra một khe

hở duy nhất khi ñầu của 1 tinh trùng khỏe nhất chui qua, màng sẽ khép lại làm cho cổ và ñuôi tinh trùng bị ñứt lại phía ngoài, tất cả các tinh trùng còn lại sẽ

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 15

bị chết và thân xác của chúng sẽ trở thành chất dinh dưỡng phục vụ cho việc nuôi dưỡng hợp tử sau này

Giai ñoạn ñồng hoá, dị hoá lẫn nhau giữa tế bào trứng và tinh trùng

Sau khi ñầu tinh trùng chui qua màng nguyên sinh chất vào gặp nhân của tế bào trứng, tinh trùng bộc lộ nhân của mình Sau ñó nhân của tế bào trứng và nhân tinh trùng hiệu ứng lẫn nhau làm sao cho tương ứng về kích thước, tiếp ñó là sự phối kết hợp lẫn nhau giữa 2 loại tế bào ñực và cái phát sinh hàng loạt phản ứng ñồng hoá, dị hoá cuối cùng tạo ra 1 tế bào sống (hợp tử) mang 1/2 số nhiễm sắc thể của bố và 1/2 số lượng nhiễm sắc thể của mẹ Trường hợp nếu tinh trùng mang nhiễm sắc thể X, hợp tử sẽ mang giới tính cái và ngược lại nếu tinh trùng mang nhiễm sắc thể Y thì sẽ cho ra con ñực

2.3.5 Quá trình phát triển của hợp tử ñến giai ñoạn phôi nang

Sau khi hợp tử hình thành cùng với sự phát triển và di chuyển ñến nơi làm tổ theo qui ñịnh của giống loài, hợp tử bắt ñầu phân chia theo cấp số nhân thành 2, 4, 8, 16, 32, 64 tế bào Do sự phân chia mà hình thành nên ñường biên giới giữa các tế bào gọi là cầu phân chia, quá trình phân chia này diễn ra

ở ống dẫn trứng

Một ñặc ñiểm nữa của phôi là giai ñoạn ñầu của quá trình phân chia không làm phôi lớn lên về kích thước vì toàn bộ quá trình phân chia diễn ra trong màng trong suốt Trong quá trình phân chia, cầu phân chia nhỏ ñi hình thành các ñám tế bào có xoang chứa dịch keo to dần lên, lúc này kích thước phôi mới tăng lên, cuối cùng phá vỡ màng trong suốt, phôi chui ra ngoài gọi

là phôi nang thoát màng (hatching blastocyst), giai ñoạn này tương ứng với ngày thứ 9-11 sau khi thụ tinh Thông thường phôi ở ngày thứ 5, 6 có 32 hoặc

64 phôi bào trở lên ñược gọi là phôi dâu (morula) và nó nổi lên giống như quả dâu Giai ñoạn giữa và cuối của phôi dâu khó xác ñịnh ñược số phôi bào ñó phân chia Những tế bào phôi sẽ tiết ra một ít dịch và hình thành nên một

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 16

xoang gọi là xoang phôi, xoang này dần lớn lên và có thể nhận biết qua kính hiển vi, phôi khi ñó hình thành xoang gọi là phôi nang (blastocyst) Xoang phôi lớn dần lên ñẩy khối tế bào về một cực, khối tế bào này gọi là ñĩa phôi hay mầm phôi Mầm phôi sau này biệt hóa hình thành nên các cơ quan bộ phận cơ thể Khối tế bào bao bọc mầm phôi và thành vách của xoang phôi gọi

là lớp màng nuôi hay dưỡng bào (trophoblast) sau hình thành nên hệ thống nhau thai

Dựa vào ñặc ñiểm về cấu tạo và sự phát triển của phôi cùng kết quả của các nghiên cứu, người ta thường thu phôi vào ngày thứ 7 sau khi phối giống Phôi ở thời ñiểm này thích hợp nhất ñể thu phôi và sử dụng cho cấy truyền cũng như các nghiên cứu khác

(Nguồn: Jaana Peippo và cs, 2011)

Hình 2.3: Sự di chuyển và phát triển của phôi xuống tử cung

2.3.6 Cấu tạo phôi bò

Hình thái chung của phôi

Ở giai ñoạn 7 ngày tuổi sau khi thụ tinh, phôi thường có kích thước

100-200µm Phôi có hình cầu dẹt, khi quan sát qua kính hiển vi thì có hình tròn,

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 17

ngoài cùng là màng trong suốt (zonapellucida), tiếp ñến là lớp màng nuôi (trophoblast), trong cùng là khối tế bào Khối tế bào phôi ñược tạo bởi các phôi bào (blatstocyt)

(Nguồn: http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/pathphys/reprod/fert/cleavage.html)

Hình 2.4: Cấu tạo phôi bò

Mức ñộ phân chia tế bào

Số lượng phôi bào thường phụ thuộc vào giai ñoạn phát triển, ñầu tiên là

một tế bào rồi 2, 4, 8 phôi dâu, phôi nang

Dựa vào ñộ tập trung và mối liên kết của các tế bào phôi, số lượng tế bào tách rời nói lên mối liên kết lỏng lẻo của các phôi

Trong quá trình phát triển, số phôi bào tăng lên theo cấp số nhân cho ñến giai ñoạn 16 tế bào, sau giai ñoạn 16 tế bào sự phân chia tế bào trở nên không ñồng thời và các tế bào riêng rẽ khó phân biệt Ở giai ñoạn 32 tế bào (vào ngày thứ 5-6), các tế bào bắt ñầu dính chặt vào nhau tạo thành một khối trông giống quả dâu, ở ngày thứ 6-9 sau khi phối giống những tế bào phôi sẽ tiết ra một ít dịch và hình thành nên một xoang gọi là xoang phôi, phôi khi ñã hình thành xoang gọi là phôi nang (blastocyst) Xoang phôi lớn dần lên ñẩy khối tế bào về một cực, khối tế bào này gọi là ñĩa phôi hay mầm phôi, mầm phôi sau này biệt hóa hình thành nên các cơ quan bộ phận cơ thể

Khối tế bào bao bọc mầm phôi và thành vách của xoang phôi gọi là lớp màng nuôi hay dưỡng bào, sau này hình thành nên hệ thống nhau thai

Màng trong suốt

Màng nuôi

Khối nhân

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 18

Màu sắc của tế bào

Màu sắc có liên quan ñến mức ñộ sống chết hay thoái hóa của các tế bào phôi Phôi có chất lượng tốt là phôi có mầu ñặc trưng của các khối tế bào, không quá tối cũng không quá sáng

Từ những cơ sở trên có rất nhiều quan ñiểm ñánh giá phân loại phôi ñược ñưa ra, tuy nhiên có hai quan ñiểm ñược sự ñồng tình của ñông ñảo các nhà khoa học và ñược áp dụng rộng rãi ñó là:

Dựa vào giai ñoạn phát triển của phôi

Dựa vào chất lượng tốt hay xấu của phôi

Phân loại theo giai ñoạn phát triển

Phương pháp này dựa vào giai ñoạn phát triển của phôi, ứng với từng giai ñoạn là tuổi của phôi và vị trí của nó trong ñường sinh dục con cái

Bảng 2.1: Trình tự phát triển của phôi bò (Nguyễn Thị Ước, 1996)

Các sự kiện Vị trí Thời ñiểm tính từ khi bắt

Phôi nang ra khỏi màng

Phôi nang dài

Tiếp xúc với thành tử cung

Làm tổ

Buồng trứng Vòi trứng Vòi trứng Vòi trứng Vòi trứng Vòi-tử cung

7 8-9

10

11

23

35 Wright (1981) phân loại như sau:

Phôi dâu: Ở ngày thứ 5-7 phôi có từ 16-32 tế bào, có dạng tế bào tròn các phôi bào liên kết chặt chẽ với nhau ít có tế bào tách rời, các tế bào này rất

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 19

khó phân biệt với nhau Khối tế bào của phôi chiếm phần lớn khoảng trống giữa màng trong suốt và khối tế bào

Phôi dâu chặt: các phôi bào riêng rẽ kết thành một khối chắc, khối phôi chiếm 60-70% khoảng trống (Perivitelline) trong màng trong suốt

Phôi nang sớm: ñó là phôi mà nó hình thành nên một khoảng trống chứa ñầy dịch ñược gọi là xoang phôi, khối tế bào phôi chiếm 70-80% khoảng trống trong màng trong suốt, ở giai ñoạn phát triển này có thể nhìn thấy sự khác nhau giữa màng nuôi và khối tế bào bên trong

Phôi nang: xoang phôi lúc này ñó lớn >50% diện tích khối tế bào và ñẩy mầm phôi về một cực, xoang về một cực

Phôi nang trương nở: ñường kính của phôi tăng 1,2-1,5 lần, ñồng thời màng trong suốt mỏng ñi 1/3 so với ban ñầu

Phôi thoát màng: màng trong suốt vỡ ra, phôi ñang hoặc ñã chui ra khỏi màng, hình dáng của phôi lúc này không cố ñịnh Nó bao gồm khối tế bào phôi (mầm phôi) và màng nuôi bao bọc xung quanh

Linder và Wright (1983) ñã chia sự phát triển của phôi bò thu ñược vào ngày thứ 5-9 sau khi ñộng dục thành 6 giai ñoạn, trong khi Glenn Selk (2007)

ñã phân thành 9 giai ñoạn, gần giống như cách phân loại của Linder và Wright (1983)

Như vậy, phôi bò sau thu hoạch vào ngày thứ 7 sau khi ñộng dục phối giống, chủ yếu là phôi dâu và phôi nang Số còn lại có thể là trứng không thụ tinh hoặc phôi không ñúng với giai ñoạn phát triển Phôi không ñúng với giai ñoạn phát triển có thể do nhiều nguyên nhân (Hoàng Kim Giao và cs, 1997)

Phân loại theo chất lượng

Ngoài trứng không thụ tinh, phôi chết, thoái hóa, số phôi có thể sử dụng thông thường ñược chia ra làm 4 loại: A, B, C, D hoặc rất tốt, tốt, trung bình, kém hoặc 1, 2, 3, 4 Sự phân loại này ñã ñược hội Khoa học Kỹ thuật Nhật Bản (1995)

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦ 20

tổng kết trên cơ sở nghiên cứu của Wright (1981), Linder và Wright (1983) theo bảng sau:

Bảng 2.2: Phân loại chất lượng phôi bò

Rất tốt 4 1 A Phôi ựiển hình cho giai ựoạn phát triển, không có

khuyết ựiểm gì

Tốt 3 2 B đúng với giai ựoạn phát triển, màu sắc của tế bào

ựẹp, có một vài tế bào tách rời

Trung bình 2 3 C Hình thái không ựặc trưng, số tế bào tách rời

nhiều, màu sắc không ựặc trưng

Hình thái không tốt, nhiều tế bào tách rời, sự liên kết không chặt chẽ, không ựặc trưng cho giai ựoạn phát triển, màu sắc không ựều

Hoàng Kim Giao và cs (1997) ựã phân loại như sau ựể thuận tiện cho công tác ựánh giá:

Trứng không thụ tinh

Phôi chậm phát triển

Phôi thoái hóa: là phôi có ựầy ựủ tế bào nhưng khối tế bào trông không bình thường hoặc ựang bị thoái hóa Theo phân loại ựây là phôi loại kém (D) Phôi có thể sử dụng ựược: bao gồm phôi nang và phôi dâu ở các giai ựoạn phát triển khác nhau, ựược chia làm 3 loại chắnh:

Loại rất tốt (A): phôi dâu bình thường với màng trong suốt tròn và các

phôi tế bào liên kết chặt chẽ, ựôi khi ựám tế bào phân chia không ựều hoặc vòng trong suốt hình ovan và nhăn, không phẳng

Loại tốt (B): đúng với giai ựoạn phát triển và gần giống với loại A,

nhưng ựôi khi có sự chậm trong quá trình phát triển

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 21

Loại trung bình (C): khối tế bào phôi có ñến 30-50%, cũng có thể màng

trong suốt hoặc màng bên trong khối mầm phôi không phẳng, nhăn nheo, nhiều tế bào tách rời, ñồng thời gần 1/2 khối tế bào mầm chui ra ngoài màng trong suốt

Nói chung, sự phân loại phôi theo chất lượng chỉ mang tính tương ñối

vì nó phụ thuộc vào kỹ thuật, trình ñộ, kinh nghiệm của người thao tác, ñánh giá và cấy chuyển phôi

2.3.7 Cơ chế ñông lạnh phôi

Nghiên cứu về cơ chế ñông lạnh tế bào, theo ñịnh luật Loi Raoult, ñộ

hạ băng ñiểm của dung dịch phụ thuộc vào nồng ñộ các chất hoà tan Khi hạ nhiệt ñộ, lúc xuất hiện tinh thể nước ñầu tiên là bắt ñầu thay ñổi giai ñoạn ñông băng ðiều này chỉ có thể xảy ra khi nhiệt ñộ thấp hơn hoặc bằng ñộ hạ băng ñiểm của dung dịch Nhiều nghiên cứu cho biết bên trong tế bào chứa hơn 80% nước, nồng ñộ nước này cao hơn bên ngoài tế bào Vì vậy, sự thay ñổi giai ñoạn ñông lạnh nội bào xảy ra ở nhiệt ñộ thấp hơn nhiệt ñộ bên ngoài

Trong quá trình ñông lạnh, trước tiên ở môi trường bên ngoài tế bào những tinh thể nước ñược tạo thành, làm tăng nồng ñộ chất hòa tan nhanh chóng Sự tăng áp suất thẩm thấu này, nước sẽ ñi ra ngoài tế bào, làm giảm thể tích tế bào Mức ñộ mất nước tế bào phụ thuộc vào tốc ñộ ñông lạnh (hạ nhiệt nhanh hay chậm), tốc ñộ này phải ở trên tốc ñộ giới hạn, mà tốc ñộ giới hạn lại thay ñổi theo loại tế bào, khả năng tạo băng ñá nội bào tăng lên cũng gây ra những tổn hại tế bào do ñông lạnh hay giải ñông Tốc ñộ lạnh ở dưới tốc ñộ giới hạn thì sự sống của tế bào gắn liền với sự biến ñổi các tính chất của dung dịch, trong ñó nồng ñộ chất hoà tan cũng ñồng thời tăng lên ở bên ngoài tế bào Trong môi trường huyền phù (vừa thể lỏng vừa tinh thể) nước tạo thành băng ñá một cách từ từ và bên trong tế bào sẽ mất nước ñể duy trì sự cân bằng áp suất thẩm thấu với bên ngoài tế bào, mọi trao ñổi chất của tế bào ngừng hoạt ñộng, tế bào sống tiềm sinh Như vậy, sự hiện diện của tinh thể

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 22

nước ñá nội bào và những hiệu ứng của dung dịch là hai yếu tố chủ yếu chuyển biến theo tốc ñộ ñông lạnh ñể quyết ñịnh khả năng sống sót của tế bào

Tốc ñộ làm lạnh ảnh hưởng ñến các hiện tượng vật lý xảy ra tiếp theo bên trong tế bào Nếu nhiệt ñộ giảm chậm, tế bào có khả năng mất nước nhanh do ngoại thẩm thấu làm tăng nồng ñộ các chất nội bào ñủ ñể loại bỏ nhiệt ñộ lạnh chưa tạo ñá và duy trì tiềm năng các chất hoá học nội bào cân bằng với tiềm năng các chất hóa học ngoại bào Kết quả tế bào mất nước và không ñông lạnh bên trong tế bào Nhưng nếu tế bào ñược ñông lạnh quá nhanh, nó không có khả năng mất nước nhanh ñể duy trì cân bằng, vì vậy nhiệt ñộ lạnh chưa tạo ñá (supercooling) tăng lên và cuối cùng ñạt ñược sự cân bằng bằng việc ñông lạnh nội bào

Có nhiều chất bảo vệ lạnh ñược sử dụng với các nồng ñộ khác nhau và thường ñược dùng kết hợp với nhau Những chất bảo vệ lạnh ñược dùng phổ biến hiện nay gồm glycerol và dimethylsulphoxide (DMSO) và một số glycol (ethylene glycol, propylene glycol )

Glycerol (C3H5(OH)3) có phân tử lượng 92, có tính ñộc nhẹ, có tác dụng như một chất chống ñông, có khả năng thẩm thấu cao qua màng tế bào, hòa tan trong nước và cồn Trong quá trình cân bằng, glycerol xâm nhập vào bên trong tế bào thay thế các phân tử nước thấm xuất ra ngoài tế bào làm cho

tế bào không bị giảm dung tích Khi vào bên trong tế bào, các phân tử glycerol nằm xen kẽ với các phân tử nước, nên nước ñóng băng ở dạng nha, loại trừ ñược sự giãn nở của tinh thể nước có kích thước lớn, ngăn cản ñược

sự phá vỡ màng và tế bào Vì vậy mà glycerol giữ ñược sự ổn ñịnh về nồng

ñộ của các chất hoà tan, không làm thay ñổi áp suất thẩm thấu và hạn chế sự phá hủy protein của tế bào trong quá trình ñông lạnh

Ethylene glycol (EG) có phân tử lượng thấp hơn (62,07) so với của glycerol, chất này có tác dụng tương tự glycerol và có thể dùng thay thế cho

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 23

glycerol trong ñông lạnh phôi bò Ưu ñiểm của việc dùng ethylene glycol trong ñông lạnh phôi bò là khi giải ñông không cần rút chất này ra khai phôi bò theo các bước mà chất này tự thẩm xuất ra ngoài (Voelkel và Hu, 1992)

ðường (sucrose, lactose) và protein (bovine serum albumin, hyaluronic acid) cũng ñược dùng như những chất bảo vệ lạnh nhưng chúng thường ñược dùng với các chất bảo vệ lạnh khác

Kasai (1996) ñã tổng kết rằng, các phòng thí nghiệm trên thế giới có thể sử dụng một chất bảo vệ lạnh duy nhất hoặc sử dụng kết hợp nhiều chất bảo vệ lạnh như dimethyl sulphoside, acetamide, propylene glycol, glycerol, ethylene glycol, polyethylene glycol, BSA, sucrose, trehalose và glucose với các nồng ñộ khác nhau ñể ñông lạnh phôi ñông vật có vú

Theo Nguyen (1997), việc sử dụng các chất bảo vệ lạnh và khả năng sống của phôi ñông lạnh có sự khác nhau giữa các loài ðối với thỏ, khả năng sống của phôi ñông lạnh trong hỗn hợp sucrose và glycerol hay DMSO rất thấp (0-5%) so với ñông lạnh bằng propaneol (92%) ðối với phôi dâu-phôi nang bò, sử dụng chất bảo vệ lạnh propaneol tốt hơn so với sử dụng glycerol (75% so với 0,0%) Trong khi ñó, phôi bò ñược ñông lạnh trong hỗn hợp chất bảo vệ lạnh sucrose-glycerol có tỷ lệ sống cao hơn so với trong hỗn hợp sucrose-propaneol (65% so với 0,0%) Sự khác biệt về khả năng sống của phôi khi sử dụng các chất bảo vệ lạnh khác nhau giữa các loài khác vẫn chưa

có nhiều kết quả nghiên cứu

Với quan ñiểm sinh học lạnh, các tế bào phôi không khác biệt với các loại tế bào sống khác ðiều quan trọng nhất của quá trình ñông lạnh là loại bỏ nước nội bào trước khi chúng ñược ñông lạnh Các nghiên cứu về kỹ thuật ñông lạnh nghiên cứu về loại chất bảo vệ lạnh và nồng ñộ sử dụng của chúng, tốc ñộ hạ nhiệt ñộ, nhiệt ñộ tạo ñá và nhiệt ñộ chuyển phôi sang Nitơ lỏng cũng như nhiệt ñộ và tốc ñộ giải ñông

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦ 24

Theo nghiên cứu trước ựây, ựông lạnh phôi có thể chia làm 2 phương pháp là ựông lạnh chậm và ựông lạnh nhanh đông lạnh chậm là phương pháp

mà ở ựó quá trình làm mất nước nội bào và việc hạ nhiệt ựộ có kiểm soát xảy

ra chậm trước khi phôi ựược chuyển vào bảo quản trong Nitơ lỏng đối với phương pháp ựông lạnh chậm, phôi ựược chuyển vào môi trường có chất bảo

vệ lạnh theo nhiều bước với nồng ựộ chất bảo vệ lạnh tăng dần hay chuyển thẳng vào môi trường có nồng ựộ chất bảo vệ lạnh thắch hợp Thời gian cân bằng trong phương pháp này thường 10-30 phút Sau ựó cọng rạ chứa phôi ựược chuyển ngay vào máy ựông lạnh và việc tạo ựá ựược thực hiện ở nhiệt

ựộ -30C ựến -70C Tạo tinh thể ựá (seeding) là thuật ngữ dùng ựể mô tả việc hình thành ựá có kiểm soát ở nhiệt ựộ lạnh, bằng cách dùng panh ựã ựược nhúng trước vào Nitơ lỏng chạm vào thành của cọng rạ Ngay sau khi tạo tinh thể ựá, ựá sẽ ựược hình thành nhanh chóng trong toàn bộ cọng rạ chứa phôi, và việc hạ nhiệt ựộ vẫn ựược thực hiện với tốc ựộ 0,30C/phút xuống -350C, từ nhiệt ựộ này, phôi ựược chuyển vào Nitơ lỏng ựể bảo quản (Saitoh và cs, 1995)

Phương pháp ựông lạnh nhanh là phương pháp ựông lạnh mà thời gian

từ lúc khử nước nội bào ựến lúc kết thúc quá trình ựông lạnh xảy ra rất nhanh Phôi sau khi ựã ựược khử nước nội bào ựược chuyển thẳng vào niơ lỏng mà không cần phải sử dụng máy ựông lạnh có kiểm soát nhiệt ựã ựược lập trình sẵn Một trong những phương pháp ựông lạnh nhanh ựược nghiên cứu rộng rãi là phương pháp thủy tinh hoá (vitrification) Thủy tinh hoá là thuật ngữ chỉ quá trình ựông cứng mà không tạo thành tinh thể ựá không có sự cô ựọng các chất hòa tan như trong các phương pháp ựông lạnh truyền thống, có sự tăng ựột ngột sự ựặc quánh (viscosity) trong môi trường lưu phôi, tạo nên chất rắn dạng thủy tinh Phương pháp ựông lạnh thủy tinh hóa lần ựầu ựược Rall và

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 25

Fahy ñề xuất năm 1985 Sau ñó, phương pháp này ñã ñược nhiều tác giả nghiên cứu thành công ñể ñông lạnh phôi ñông vật có vú (Kasai, 2002)

Ưu ñiểm của phương pháp này là thời gian ñông lạnh nhanh, không cần thiết bị ñông lạnh ñắt tiền và ñiều quan trọng là tỷ lệ sống của phôi sau khi ñông lạnh-giải ñông cao Gần ñây, George E Seidel (Colorado State University) ñã nghiên cứu cải tiến phương pháp ñông lạnh thủy tinh thể (Vitrification method) phôi bò cực nhanh bằng Syngrod (Bioniche Animal Health)+polyvinyl alcohol 0,1% (w/v), Ethylene Glycol (EG), Galactose Thời gian cân bằng ở nhiệt ñộ phòng trong vòng 45 giây, cọng rạ chứa phôi ñược khử nước một phần trên hơi Nitơ lỏng trong 1 phút với mục ñích nâng cao tỷ lệ phôi sống sau ñông lạnh và giải ñông

2.3.8 Giải ñông phôi

Tế bào phôi ñông lạnh ñược bảo quản trong Nitơ lỏng -1960C, trước khi sử dụng, tế bào phôi phải ñược phục hồi sự sống trong ñiều kiện bình thường ở trạng thái ban ñầu, không có tinh thể nước ñá và không có chất bảo

vệ lạnh ở trong và ngoài tế bào phôi, tế bào phôi tiếp tục sống và phát triển trong ñiều kiện mới Nhìn chung, tế bào phôi từ trạng thái sinh học bình thường chuyển sang trạng thái sinh học tiềm sinh lạnh (-1960C) rồi lại trở về trạng thái sinh học bình thường của môi trường, sức sống của tế bào phôi có thể bị giảm ñi rất nhiều, số lượng tế bào phôi chết có thể tăng lên

Về nguyên tắc, việc tách chất bảo vệ lạnh khỏi tế bào phôi phụ thuộc vào phương pháp ñông lạnh và bổ sung chất bảo vệ lạnh Trong các quy trình pha loãng chất bảo vệ lạnh thông thường, phôi ñược tiếp xúc với nồng ñộ chất bảo vệ lạnh giảm dần (Prather và cs, 1987) ðầu những năm 1980, một số tác giả ñã nghiên cứu phương pháp giải ñông mới thay thế cho phương pháp giải ñông nhiều bước Theo Renard và cs (1982) phôi bò ñông lạnh-giải ñông

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 26

ñược chuyển từ môi trường có chất bảo vệ lạnh sang môi trường ưu trương có các chất dinh dưỡng không thẩm thấu như sucrose Khi quá trình này xảy ra, các chất bảo vệ lạnh nội bào thẩm thấu ra ngoài phôi ñể duy trì sự cân bằng áp suất thẩm thấu Khi phôi không còn chứa các chất bảo vệ lạnh nội bào nữa, nó

co lại tới một thể tích do áp suất thẩm thấu của dung dịch sucrose và phôi nhanh chóng ñược pha loãng trong môi trường ñẳng trương Ngày nay, cùng với phương pháp ñông lạnh cải tiến, phương pháp giải ñông phôi trở nên ñơn giản, dễ ứng dụng vào sản xuất và thuận lợi hơn rất nhiều so với trước ñây

2.3.9 Giới thiệu về bò H’Mông

Bò H’Mông còn có tên gọi khác là bò Mèo, bò Mông

Màu sắc da, lông

Lông bò H’Mông ña số vàng nhạt, sẫm hoặc cánh gián, một số ít màu ñen nhánh hoặc loang trắng Bò H’Mông có 3 nhóm màu lông ñiển hình: màu vàng cánh gián, màu vàng tơ và màu ñen tuyền

Nhóm bò lông vàng cánh gián

Màu lông nổi bật là vàng cánh gián, có lẫn những mảng tối ở hai bên

cổ, u vai và dọc lưng Mõm và xung quanh hố mắt có màu sáng, bò cái có

màu lông toàn thân là màu vàng cánh gián

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 27

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 28

Bò có thân hình cao to, cân ñối gần giống bò Red Sindhi, mắt và lông

mi hơi hoe vàng, xung quanh hố mắt có màu vàng sáng rõ

Bò H’Mông có kết cấu cơ thể vững chắc, H’Mông tròn, cơ bắp nổi, u

và yếm phát triển, bò ñực có u to, ñỉnh trán có u gồ hoặc phẳng Mặt ngắn, trán lõm, tai to ñưa ngang hoặc hơi vểnh, sừng ngắn và tù Sườn khum ñuôi thấp và xuôi về phía sau Xương ống chân thon nhỏ, lưng hơi võng, mông dài nhưng hơi lép, ngực sâu, chân cao Nhìn chung tầm vóc to và thô

Khối lượng sơ sinh 15-16kg/con, bò cái trưởng thành có khối lượng trung bình 250-270kg/con, bò ñực ở ñộ tuổi từ 24 tháng tuổi ñến 48 tháng tuổi

có khối lượng 250-280kg, bò ñực ở ñộ tuổi trên 48 tháng tuổi có khối lượng bình quân là 310-380 kg, bò ñực trưởng thành 380-390kg, bò ñực trên 60 tháng tuổi có trọng lượng trung bình là 400-500kg

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦ 29

PHẦN III đỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 đối tượng, ựịa ựiểm và thời gian

đề tài ựược tiến hành nghiên cứu trên ựối tượng bò HỖMông trong ựộ tuổi sinh sản (24-36 tháng tuổi) của 3 huyện Chợ đồn, Ba Bể, Pác Nặm tỉnh Bắc Kạn

Thời gian nghiên cứu: 11/2011- 6/2012

3.2 Nội dung

Gây rụng trứng nhiều ở bò cho phôi và thụ tinh nhân tạo

Thu hoạch phôi, ựánh giá phân loại phôi sau thu hoạch

đánh giá phân loại phôi theo giai ựoạn phát triển

đánh giá phân loại phôi theo chất lượng (A,B,C)

đông lạnh phôi

đánh giá phân loại phôi sau ựông lạnh giải ựông

đánh giá phân loại phôi theo giai ựoạn phát triển

đánh giá phân loại phôi theo chất lượng (A, B, C)

3.3 Phương pháp

3.3.1 Phương pháp gây rụng trứng nhiều

Chọn bò cái cho phôi

Chọn 7 bò cái tại Bắc Kạn, ở ựộ tuổi 24-36 tháng, ựưa về nuôi ở trung

tâm Thực nghiệm và Bảo tồn vật nuôi, viện Chăn nuôi

Những bò này ựạt các tiêu chuẩn sau:

Có tầm vóc khỏe mạnh, sức khoẻ tốt, khối lượng cơ thể 250-300kg, nhanh nhẹn, không hung dữ và ựã ựược tiêm phòng ựịnh kỳ các bệnh theo quy ựịnh Không mắc bất cứ một khuyết tật hoặc một bệnh di truyền nào

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 30

Bộ phận sinh dục không bị viêm, buồng trứng mềm và hoạt ñộng nhạy cảm, trên buồng trứng có thể vàng phát triển tốt

Khả năng sinh sản tốt, chu kỳ ñộng dục bình thường, biểu hiện các giai ñoạn của chu kỳ rõ ràng Bò có ít nhất hai chu kỳ ñộng dục trước ñó ñược phát hiện với khoảng cách chu kỳ 20-21 ngày, dao ñộng 17-24 ngày Cổ tử cung dễ dàng thực hiện việc ñưa các dụng cụ thu phôi ñi qua

Gây rụng trứng nhiều

Gây siêu bào noãn hay gây trứng rụng nhiều trứng là một quá trình tác ñộng ñể một lần ñộng dục buồng trứng bò có nhiều trứng phát triển, chín và rụng ñồng thời Áp dụng các sơ ñồ sử dụng hormone ñể gây rụng trứng nhiều với PMSG và FSH

Phương pháp gây rụng trứng nhiều

Chuẩn bị dụng cụ và hormone (CIDR và FSH, PG, Estradiol)

ðặt CIDR vào xoang âm ñạo (ngày ñặt là ngày 0 của quy trình)

Tiêm FSH từ ngày thứ 10 kể từ khi ñặt CIDR theo liều giảm dần 3 ml; 2,5ml; 2,0ml; 1,5ml lần lượt cho 4 ngày tiếp theo (ngày 10, ngày 11, ngày 12, ngày 13) mỗi ngày tiêm bắp 2 lần vào buổi sáng và buổi chiều với khoảng cách 12 giờ

Ngày thứ 12 tiêm 2ml FSH và tiêm 5ml PGF2α (ñồng thời rút CIDR vào

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 31

Lọc dung dịch rửa phôi, soi tìm phôi trên kính hiển vi soi nổi, ñánh giá chất lượng phôi sau khi thu hoạch ngày thứ 7 ứng với giai ñoạn phôi dâu và phôi nang, ñây là giai ñoạn thích hợp cho ñông lạnh bảo quản và cấy truyền Sau khi thu phôi, tiêm PGF2α cho bò thu phôi, sau 8-14 ngày tiến hành

ñặt CIDR lặp lại quy trình như trên lần tiếp theo

Bảng 3.1: Quy trình gây rụng trứng nhiều

Ngày thứ Thời gian tiêm Liều tiêm FSH giảm dần

12

Sáng Chiều

2ml FSH Rút PRID hoặc CIDR 2ml FSH và 5ml PGF2α

Chiều

1,5 ml FSH 1,5 ml FSH

Thụ tinh nhân tạo

ðể thụ tinh nhân tạo chúng tôi tiến hành phối giống bằng tinh bò ñực

H’Mông ñông lạnh với hoạt lực của tinh trùng A (%) >40%, nồng ñộ 28-30

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 32

triệu tinh trùng/ml (Bò H’Mông ñực ñược mua từ Bắc Kạn ñưa về trung tâm Moncada ñể khai thác tinh)

Giải ñông tinh dịch

Chuẩn bị nước ấm 35-380C ñể tan băng, không ñược vượt quá 400C vì

sẽ làm chín tinh trùng Có thể sử dụng dụng cụ làm tan băng bằng ñiện và theo dõi nhiệt ñộ thích hợp bằng ñèn báo hiệu

Mở nắp bình Nitơ, gác nắp lên miệng bình, nâng cóng ñựng tinh lên cách miệng bình 5cm, dùng panh kẹp lấy cọng tinh trong vòng 10 giây Bỏ ngay cọng tinh vào cốc làm tan băng theo chiều ñầu bông xuống dưới và ñậy nắp bình lại vị trí cũ, thời gian làm tan băng trong vòng 30 giây

Lưu ý: Thời gian từ khi cọng tinh ñã tan băng ñến khi hoàn thành công

việc phối giống không chậm hơn 10 phút, tinh ñã làm tan băng không ñược bỏ lại vào bình chứa tinh

Chuẩn bị súng bắn tinh

Trong thời gian làm tan băng, tranh thủ chuẩn bị súng bắn tinh, nếu trời lạnh thì nên dùng giấy vệ sinh chà xát nhiều lần vào súng ñể nâng nhiệt ñộ của súng lên Kéo pít-tông ra một khoảng ít nhất 13cm và ñể ở vị trí thuận lợi, sạch sẽ chuẩn bị sẵn sàng cho việc nạp cọng tinh vào súng

Nếu dẫn tinh quản có nút tiếp nhận bên trong thì kiểm tra lại vị trí sao cho nút tiếp nhận nằm cách ñầu dẫn tinh quản khoảng 2-3cm