Nghiên cứu nghiên cứu sản xuất kháng nguyên chẩn đoán bệnh cúm a/h5n1 bằng virus a/anhui 05-h5n1

Chủ động được nguồn nguyên liệu kháng nguyên H5N1 cho xét nghiệm là điều hết sức cĩ ý nghĩa đối với các phịng thí nghiệm trong điều kiện kinh tế hiện nay, đồng thời tăng cường được khả n

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-*** -

NGUYỄN THỊ HÀ

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT KHÁNG NGUYÊN CHẨN ðOÁN BỆNH CÚM A/H5N1 BẰNG VIRUS A/ANHUI 05-H5N1

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

HÀ NỘI – 2012

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

LỜI CAM ðOAN

- Tôi xin cam ñoan rằng: Số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược sử dung ñể bảo vệ một học vị nào

- Tôi xin cam ñoan rằng: Các thông tin trích dẫn trong luận văn này ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian học tập, rèn luyện tại trường và thực hiện nghiên cứu phục vụ Luận Văn Thạc sĩ, tôi ựã nhận ựược sự giúp ựỡ nhiệt tình của Ban Giám hiệu nhà trường, Viện đào tạo Sau đại học, các thầy cô giáo của trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội đến nay, tôi ựã hoàn thành Luận Văn Thạc sĩ với ựề tài ỘNghiên cứu sản xuất kháng nguyên chẩn ựoán bệnh Cúm A H5N1 bằng Virus A/Anhui/05-H5N1Ợ Nhân dịp này, tôi xin chân thành cảm ơn trường đại học Nông nghiệp Hà Nội, Viện Sau ựại học, Khoa Thú y, các Phòng, Ban cùng các thầy cô giáo trong nhà trường ựã tạo ựiều kiện cho tôi ựược học tập và thu thập nhiều kiến thức về lĩnh vực nghiên cứu khoa học

đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới toàn thể cán bộ công nhân viên chức ở Trung tâm chẩn ựoán Thú y trung ương- Cục Thú y, trực tiếp

là thầy giáo hướng dẫn khoa học PGS TS Tô Long Thành và PGS.TS Bùi Thị Tho Bộ môn Dược ỜNội chẩn Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội

Một lần nữa, tôi xin ựược bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới nhà trường, các thầy cô giáo, cơ quan, bạn bè ựồng nghiệp cùng người thân ựã ựộng viên, tạo ựiều kiện giúp ựỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu thực hiện ựề tài

Hà Nội, ngày 10 tháng 9 năm 2012

Tác giả

Nguyễn Thị Hà

MỤC LỤC

PHẦN I MỞ ðẦU 1

1.1 ðặt vấn ñề 1

1.2 Mục tiêu của ñề tài 2

1.3 Ý nghĩa khoa học và thục tiễn của ñề tài 2

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Sơ lược về bệnh cúm gia cầm 3

2.1.1 ðịnh nghĩa 3

2.1.2 Lịch sử bệnh cúm gia cầm 3

2.2 Tình hình dịch cúm gia cầm trong nước và trên thế giới 5

2.2.1 Tình hình dịch cúm gia cầm ở Việt Nam 5

2.2.2 Tình hình dịch cúm gia cầm trên thế giới 6

2.3 Triệu chứng bệnh tích bệnh Cúm gia cầm 10

2.3.1 Triệu chứng lâm sàng ñiển hình của bệnh cúm gia cầm chủng ñộc lực cao 11

2.3.2 Triệu chứng lâm sàng của bệnh do những chủng virus cúm ñộc lực thấp 12

2.4 Bệnh tích 12

2.5.Các chiến lược phòng chống bệnh cúm gia cầm 12

2.6 ðặc ñiểm sinh học của virus cúm typ A 14

2.6.1 ðặc ñiểm cấu trúc chung của virus thuộc họ Orthomyxoviridae 14

2.6.2 ðặc ñiểm hình thái, cấu trúc của virus cúm typ A 15

2.6.3 ðặc tính kháng nguyên của virus cúm typ A 16

2.6.4 Thành phần hóa học 18

2.6.5 Quá trình nhân lên của virus 18

2.6.6 ðộc lực của virus 20

2.6.7 Danh pháp 21

2.6.8 Nuôi cấy và lưu giữ virus cúm gà 21

2.6.9 Nguồn gốc của vi rút A/Anhui05-H5N1 24

PHẦN III NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU25

3.1 Nội dung 25

3.1.1 Tiêm truyền xác ựịnh nồng ựộ pha loãng tốt nhất cho nhân giống vi rút cúm A/H5N1 25

3.1.2 đánh giá ựộ an toàn (tắnh không ựộc) của vi rút 25

3.1.3 Vô hoạt vi rút bằng formaldehyde 25

3.1.4 đánh giá ựộ thuần khiết của sản phẩm kháng nguyên 25

3.1.5 Kiểm tra tắnh sinh miễn dịch của sản phẩm kháng nguyên 25

3.1.6 Kiểm tra ựộ nhạy và ựộ ựặc hiệu của chế phẩm kháng nguyên tự chế bằng phản ứng HI 25

3.1.7 So sánh ựánh giá ựộ nhạy của kháng nguyên tự chế với kháng nguyên của Anh bằng mẫu giám sát sau tiêm phòng lấy từ Hà Nội, Nam định và Vĩnh Phúc 25

3.1.8 Xác ựịnh thời gian bảo quản kháng nguyên tự chế 25

3.2 Nguyên liệu 25

3.3 Phương pháp nghiên cứu 26

3.3.1 Phương pháp tiêm truyền trên trứng ựể nhân giống vi rút (theo quy trình phân lập vi rút cúm gia cầm của CDC/WHO) 26

3.3.2 Phương pháp tiêm truyền cho gà ựể ựánh giá ựộ an toàn (tắnh không ựộc) của vi rút ựối với gà (theo hướng dẫn của USDA) 27

3.3.3 Phương pháp vô hoạt vi rút bằng formaldehyde 27

3.3.4 Phương pháp kiểm tra vô trùng ựối với sản phẩm kháng nguyên (theo quy trình kiểm nghiệm thông thường) 27

3.3.5 Kiểm tra tắnh sinh miễn dịch của sản phẩm kháng nguyên 28

3.3.6 Phương pháp kiểm tra ựộ nhạy và ựộ ựặc hiệu của chế phẩm kháng nguyên tự chế 34

3.3.6.1 Phương pháp ựánh giá ựộ nhạy 34

3.3.7 Phương pháp so sánh ựánh giá ựộ nhạy của kháng nguyên tự chế và kháng nguyên của Anh bằng mẫu giám sát sau tiêm phòng lấy từ Hà Nội, Nam định và

Vĩnh Phúc 35

3.3.8 Phương pháp bảo quản chế phẩm kháng nguyên 36

PHẦN IV 37

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

4.1 Kết quả tiêm truyền xác ựịnh tắnh ổn ựịnh và nồng ựộ pha loãng tốt nhất cho nhân giống vi rút 37

4.2 Kết quả kiểm tra tắnh an toàn của giống vi rút H5N1 trên gà 39

4.3 Kết quả vô hoạt vi rút bằng Formaldehyde 41

4.4 Kết quả kiểm tra ựộ vô trùng của sản phẩm kháng nguyên tự chế 42

4.5 Kết quả kiểm tra tắnh kháng nguyên của sản phẩm kháng nguyên tự chế bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu gà (HA) 44

4.6 Kết quả ựánh giá chất lượng của các chế phẩm kháng nguyên 44

4.6.1 đánh giá ựộ nhạy và ựộ ựặc hiệu với các mẫu ựối chứng dương và âm 44

4.6.2 đánh giá ựộ ựặc hiệu với các kháng thể cúm gia cầm subtype khác 45

4.7 Kết quả so sánh kháng nguyên tự chế và kháng nguyên của Anh bằng phản ứng HI với các mẫu huyết thanh gia cầm ựược thu thập từ Hà Nội, Nam định và Vĩnh Phúc 46

4.9 Kết quả xác ựịnh thời gian bảo quản kháng nguyên tự chế 53

PHẦN V KẾT LUẬN VÀ đỀ NGHỊ 54

5.1 KẾT LUẬN 54

5.2 đỀ NGHỊ 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

DANH MỤC BẢNG

Bảng 4.1: Kết quả nhân giống vi rút H5N1 A/Anhui/05-H5N1 38

Bảng 4.2: Kết quả kiểm tra tính an toàn của vi rút A/Anhui/05-H5N1 41

Bảng 4.3: Kết quả xác ñịnh nồng ñộ formaldehyde dùng ñể vô hoạt vi rút A/Anhui/05-H5N1 42

Bảng 4.4 Kết quả kiểm tra ñộ nhạy và ñộ ñặc hiệu của kháng nguyên tự chế A/Anhui/05-H5N1 45

Bảng 4.5 Kết quả ñánh giá ñộ ñặc hiệu của các chế phẩm kháng nguyên tự chế với một số kháng thể chuẩn thuộc các subtype khác nhau 46

Bảng 4.6 Kết quả so sánh kháng nguyên tự chế và kháng nguyên chuẩn 47

Bảng 4.7 Kết quả xét nghiệm các mẫu huyết thanh gia cầm ñã ñược tiêm phòng vaccine H5N1-Re1 và H5N1-Re5 bằng phản ứng HI sử dụng kháng nguyên tự chế và kháng nguyên của Anh 49

Bảng 4.8 Phân bố kết quả xét nghiệm các mẫu huyết thanh theo hiệu giá HI và

mối tương quan giữa kháng nguyên A/Anhui/05-H5N1 và kháng nguyên chuẩn

của UK 51

Bảng 4.9: Kết quả xác ñịnh thời gian bảo quản chế phẩm kháng nguyên 53

PHẦN I

MỞ đẦU 1.1 đặt vấn ựề

Nhờ có chủ trương phát triển chăn nuôi ựúng ựắn của đảng và Nhà nước, trong những năm gần ựây, ngành chăn nuôi gia cầm ựã và ựang ựược chú trọng với ựầu tư khoa học kỹ thuật, nghiên cứu về giống, thức ăn, các biện pháp thú y

và tăng cường hợp tác quốc tế, liên doanh, liên kết với các quốc gia có nền chăn nuôi tiên tiến đàn gia cầm phát triển nhanh với hàng ngàn trang trại chăn nuôi gia cầm, thủy cầm có qui mô lớn và nhỏ khác nhau Ngành chăn nuôi ựã ựem lai lợi nhuận cho người chăn nuôi và ựóng góp ngân sách cho nền kinh tế quốc dân Song song với sự phát triển của ngành chăn nuôi, dịch bệnh luôn luôn tồn tại và xuất hiện các bệnh mới, gây thiệt hại kinh tế rất lớn khiến nhiều nhà nghiên cứu, các cơ quan thú y, các ựơn vị chức năng phải ựầu tư nhân tài, vật lực ựể tìm ra giải pháp phòng chống và thanh toán dịch bệnh Một trong số bệnh

mà hiện nay chúng ta ựang rất quan tâm là bệnh Cúm gia cầm Bệnh cúm gia cầm ựã ựược biết ựến từ lâu sau những vụ ựại dịch gây ra cho các ựàn gia cầm ở nhiều nước Hiện nay, bệnh cúm gia cầm thể ựộc lực cao (HPAI) ựang là mối quan tâm hàng ựầu của tất cả các nước trên thế giới Dịch bệnh xảy ra ựã giết chết hàng trăm triệu gia cầm, ựồng thời kéo theo ựó là hàng triệu gia cầm khác

bị tiêu hủy bắt buộc ựể tránh lây lan, gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi và nền kinh tế của các nước có dịch

Từ cuối năm 2003 ựến nay, bệnh cúm gia cầm H5N1 ựã xảy ra ở hầu khắp các tỉnh, thành trong cả nước, dẫn ựến hàng triệu gia cầm ựã bị tiêu hủy, gây thiệt hại lớn cho nền kinh tế (Cục Thú y, 2012) Bệnh ựặc biệt nghiêm trọng do bệnh ựã lây nhiễm và làm chết nhiều người Nhà nước ựã và ựang áp dụng một cách ựồng bộ các biện pháp phòng bệnh và khống chế không cho dịch bệnh lây lan nhằm, làm giảm thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi để tiêu diệt ựược bệnh thì chúng ta còn gặp nhiều khó khăn

ðể khống chế bệnh, một trong số các biện pháp đĩ là tiêm phịng và tiêm phịng phải giám sát huyết thanh xem hiệu giá kháng thể sau tiêm, muốn giám sát được ta cần phải cĩ nguyên liệu làm phản ứng và muốn cĩ nguyên liệu thì phải mua hoặc tự chế Ở các phịng thí nghiệm Việt Nam trong hệ thống chẩn đốn vẫn dùng nguyên liệu kháng nguyên nhập của Weibridge – Anh Tuy

nhiên, kháng nguyên này rất đắt hơn nữa chủng virút

A/Chicken/Scotland/59/H5N1 là loại vi rút cúm được phân lập tại Scotland từ năm 1959, nên về mặt kháng nguyên và di truyền hẳn cĩ những sai khác với các chủng vi rút đang lưu hành tại việt Nam

Bên cạnh đĩ, các chủng vi rút cúm H5N1 lưu hành tại Việt Nam thường

xuyên biến đổi, xuất hiện nhiều nhánh mới (Nguyễn Tùng và Ken Inui, 2011)

Chủ động được nguồn nguyên liệu kháng nguyên H5N1 cho xét nghiệm là điều hết sức cĩ ý nghĩa đối với các phịng thí nghiệm trong điều kiện kinh tế hiện nay, đồng thời tăng cường được khả năng giám sát sau tiêm phịng đối với bệnh cúm gia cầm khi cĩ nhiều nhánh vi rút lưu hành

ðứng trước tình hình thiệt hại về mặt kinh tế hàng năm do dịch bệnh H5N1 gây ra, sự nguy hại đối với sức khỏe con người, sự biến chủng của virus,

chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu sản xuất kháng nguyên

chẩn đốn bệnh Cúm A H5N1 bằng Virus A/Anhui/05-H5N1”

1.2 Mục tiêu của đề tài

Nghiên cứu, sản xuất kháng nguyên H5N1 vơ hoạt sử dụng trong chẩn đốn xét nghiệm kháng thể kháng kháng nguyên H5 của vi rút cúm gia cầm bằng phương pháp HI

1.3 Ý nghĩa khoa học và thục tiễn của đề tài

-Ứng dụng sản xuất kháng nguyên H5N1 phục vụ cho việc chản đốn bệnh cúm A H5N1

- Chủ động được nguồn nguyên liệu kháng nguyên H5N1 cho xét nghiệm tiết kiệm chi phí do giảm nhập nguyên liệu kháng nguyên chuẩn

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược về bệnh cúm gia cầm

2.1.1 ðịnh nghĩa

Bệnh cúm gia cầm là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm có tốc ñộ lây lan nhanh với tỷ lệ chết cao trong ñàn gia cầm nhiễm bệnh Virus gây bệnh cúm gia cầm chủ yếu là loại H5, H7 và H9, gây bệnh cho gà, vịt, ngan, ngỗng, ñà ñiểu, các loại chim Virus còn gây bệnh cho người và có thể thành ñại dịch, vì thế bệnh cúm gia cầm ñang ngày càng trở nên nguy hiểm hơn bao giờ hết

2.1.2 Lịch sử bệnh cúm gia cầm

Bệnh cúm gia cầm hay bệnh cúm gà (Avian Influenza), là một bệnh

truyền nhiễm gây ra bởi virus cúm typ A thuộc họ Orthomyxoviridae với nhiều

subtyp khác nhau

Trước ñây bệnh ñược gọi là bệnh dịch tả gà (Fowl plague), nhưng từ hội nghị quốc từ lần thứ nhất về bệnh cúm gia cầm tại Beltsville, Mỹ năm 1981 ñã thay thế tên này bằng tên bệnh cúm truyền nhiễm cao ở gia cầm (HPAI) ñể chỉ virus typ A có ñộc lực mạnh

Bệnh cúm gia cầm là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm có tốc ñộ lây lan nhanh với tỷ lệ chết cao trong ñàn gia cầm nhiễm bệnh Virus gây bệnh cúm gia cầm chủ yếu là loại H5, H7 và H9, gây bệnh cho gà, vịt, ngan, ngỗng, ñà ñiểu, các loại chim Virus còn gây bệnh cho cả con người và có thể thành ñại dịch, vì thế bệnh cúm gia cầm ñang ngày càng trở nên nguy hiểm hơn bao giờ hết

Năm 412 trước công nguyên, Hippocrate ñã mô tả về bệnh cúm gia cầm Năm 1680, một vụ ñại dịch cúm ñã ñược mô tả kỹ và từ ñó ñến nay xảy ra 31 vụ ñại dịch Trong hơn 100 năm qua ñã xảy ra 4 vụ ñại dịch cúm vào các năm

1889, 1918, 1957, 1968

Năm 1878, ở Italy ñã xảy ra một bệnh gây tử vong rất cao ở ñàn gia cầm

và ñược gọi là bệnh dịch tả gà (Fowl plague), bệnh lần ñầu tiên ñược Porroncito

mô tả và ông nhìn nhận một cách sáng suốt rằng tương lai sẽ là một bệnh quan trọng và nguy hiểm Năm 1901, Centani và Savunozzi ựã ựề cập ựến ổ dịch này

và xác ựịnh ựược căn nguyên siêu nhỏ qua lọc (Filterable agent) là yếu tố gây bệnh đến năm 1955 Achafer ựã xác ựịnh căn nguyên gây bệnh thuộc nhóm virus cúm typ A thông qua kháng nguyên bề mặt là H7N1 và H7N7 gây chết nhiều gà, gà tây và chim hoang ở Bắc Mỹ, Châu Phi, Trung Cận đông

Năm 1963, virus cúm typ A ựược phân lập từ gà tây ở Bắc Mỹ do loài thủy cầm di trú dẫn nhập virus vào ựàn gà Cuối thập kỷ 60, phân typ H1N1 thấy ở lợn

và có liên quan ựến những ổ dịch ở gà tây Mối liên hệ giữa lợn và gà tây là dấu hiệu ựầu tiên về virus cúm ở ựộng vật có vú có thể lây nhiễm và gây bệnh cho gia cầm Những nghiên cứu ựều cho rằng virus cúm typ A phân typ H1N1 ựã ở lợn và truyền cho gà tây, ngoài ra phân typ H1N1 ở vịt còn truyền cho lợn

Năm 1971, Beard ựã mô tả khá kỹ virus gây bệnh và ựặc ựiểm bệnh lý lâm sàng của gà trong các ổ dịch cúm gà, gà tây khá lớn xảy ra ở Mỹ mà chủng gây bệnh là H7N1 Từ năm 1960 - 1979, bệnh ựược phát hiện ở Canada, Mêhicô, Achentina, Braxin, Nam Phi, Ý, Pháp, Anh, Hà Lan, Australia, Hồng Kông, Nhật Bản, các nước vùng Trung Cận đông, các nước thuộc liên hiệp Anh và Liên Xô cũ

Các công trình nghiên cứu có hệ thống về bệnh cúm gia cầm lần lượt ựược công bố ở Australia năm 1975, ở Anh năm 1979, ở Mỹ năm 1983 - 1984, ở Ailen năm 1983 - 1984 về ựặc ựiểm sinh học, bệnh học và dịch tễ học, các phương pháp chẩn ựoán miễn dịch và biện pháp phòng chống bệnh

Sự lây nhiễm từ chim hoang dã sang gia cầm ựã có bằng chứng từ trước năm 1970 nhưng chỉ ựược công nhận khi xác ựịnh ựược tỷ lệ nhiễm virus cúm cao ở một số loài thủy cầm di cư

Từ sau khi phát hiện ra virus cúm typ A, các nhà khoa học thấy rằng virus cúm có ở nhiều loài chim hoang dã và gia cầm nuôi ở những vùng khác nhau

trên thế giới Bệnh xảy ra nghiêm trọng nhất ñối với gia cầm thuộc phân typ H5

và H7 như ở Scotland năm 1959 là H5N1, ở Mỹ năm 1983 - 1984 là H5N2

ðến nay, dịch cúm gia cầm ñã xảy ra ở khắp các châu lục với mức ñộ ngày càng nguy hiểm hơn ñối với các loại gia cầm và sức khỏe của cộng ñồng,

ñã thôi thúc Hiệp hội các nhà chăn nuôi gia cầm tổ chức hội thảo chuyên ñề về bệnh cúm gà Hội thảo lần ñầu tiên tổ chức vào năm 1981, lần thứ hai tại Ailen năm 1987, lần thứ ba cũng tại Ailen năm 1992 Từ ñó ñến nay trong các hội nghị về dịch tễ trên thế giới, bệnh cúm gia cầm luôn là một trong những nội dung ñược coi trọng

2.2 Tình hình dịch cúm gia cầm trong nước và trên thế giới

2.2.1 Tình hình dịch cúm gia cầm ở Việt Nam

Ngày 27/12/2003, dịch cúm gia cầm ñã xảy ra tại trại gà giống của Công

ty C.P (Thái Lan) ở xã Thủy Xuân Tiên, huyện Chương Mỹ, tỉnh Hà Tây (cũ) gây ốm chết 8.000 gà trong 4 ngày Ngày 2/1/2004, Công ty ñã tiến hành tiêu hủy 117.000 gà Dịch ñã nhanh chóng lây lan ra hầu hết các tỉnh trong cả nước Tính ñến nay, ñã có 6 lần dịch cúm gia cầm bùng phát tại Việt Nam:

* ðợt dịch thứ nhất từ tháng 12/2003 ñến 30/3/2004: Lần ñầu tiên trong

lịch sử nước ta dịch cúm gia cầm xuất hiện vào cuối tháng 12 năm 2003 ở tỉnh Hà Tây (cũ), Long An và Tiền Giang Dịch lây lan rất nhanh, chỉ trong vòng 2 tháng, ñến ngày 27/2/2004 dịch ñã xuất hiện ở 2.574 xã, phường (chiếm 24,6% số xã, phường), 381 huyện, quận, thị xã (60%) thuộc 57 tỉnh, thành phố trực thuộc Trung Ương Các tỉnh xảy ra dịch nặng là Long An, Tiền Giang, ðồng Tháp, Hà Tây, Hải Dương Tổng số gà và thuỷ cầm mắc bệnh, chết và tiêu huỷ hơn 43,9 triệu con, chiếm 16,79% tổng ñàn, trong ñó gà chiếm 30,4 triệu con, thuỷ cầm chiếm 13,5 triệu con Ngoài ra còn có 14,76 triệu con chim cút và các loại chim khác bị chết và tiêu huỷ

*ðợt dịch thứ hai từ tháng 4 ñến tháng 11/2004: Trong giai ñoạn này,

dịch phát ra rải rác với quy mô nhỏ ở các hộ gia ñình; bệnh xuất hiện ở 46 xã,

phường tại 32 huyện, quận, thị xã thuộc 17 tỉnh Thời gian cao ñiểm nhất là tháng 7 sau ñó giảm dần, ñến tháng 11 cả nước chỉ có 1 ñiểm phát dịch Tổng số gia cầm tiêu huỷ trong giai ñoạn này là 84.078 con, trong ñó 55.999 gà, 8.132 vịt và 19.947 chim cút

*ðợt dịch thứ ba từ tháng 12/2004 ñến tháng 5/2005: Trong khoảng thời

gian này dịch ñã xuất hiện ở 670 xã tại 182 huyện thuộc 36 tỉnh, thành phố (15 tỉnh phía Bắc, 21 tỉnh phía Nam) Số gia cầm tiêu huỷ là 470.495 gà, 825.689 vịt, ngan và 551.029 chim cút Bệnh xuất hiện ở tất cả các tỉnh, thành phố thuộc vùng ðồng bằng sông Cửu Long; những tỉnh bị dịch nặng là Long

An, Tiền Giang, Bạc Liêu, ðồng Tháp

số gia cầm tiêu hủy là 3.972.763 con, trong ñó 1.338.378 gà, 2.135.081 thuỷ cầm và loài khác

* Từ ñầu năm 2008 ñến nay, dịch xảy ra lẻ tẻ, rải rác với 74 ñàn gia cầm tại 57 xã, phường của 40 huyện thị thuộc 21 tỉnh phát dịch Tổng số gia cầm tiêu hủy là 60.090 con, trong ñó có 23.498 gà, 36.592 thủy cầm (Văn ðăng Kỳ, 2008)

2.2.2 Tình hình dịch cúm gia cầm trên thế giới

Dịch cúm gia cầm ñã xảy ra ở rất nhiều nơi trên thế giới Vụ dịch xảy ra lần ñầu tiên ở gia cầm ñược ghi nhận vào năm 1878 với tỷ lệ chết cao ñược gọi

là bệnh “ Dịch tả gia cầm”

Năm 1959 bệnh xảy ra trên ñàn gà ở Scotland do virus cúm A H5 gây ra Nhiều tác giả ñã cho rằng bệnh dịch nghiêm trọng nhất xảy ra ñối với gia cầm là

những chủng gây bệnh có ñộc lực cao thuộc subtyp H5 và H7, như ở Scotland năm 1959 là H5N1, ở Mỹ năm 1983 - 1984 là H5N2

Năm 1963, virus cúm typ A ñược phân lập từ gà tây ở Bắc Mỹ do loài thuỷ cầm di trú lây truyền virus vào ñàn gà

Từ cuối năm 2003, dịch cúm gia cầm ñã xảy ra với quy mô lớn, diễn biến hết sức phức tạp và tốc ñộ bùng phát rất nhanh ở các nước Châu Á và ñã lan sang các quốc gia khác

Cuối tháng 02/2004 ñó có rất nhiều nước và vùng lãnh thổ công bố dịch cúm gia cầm do virus H5N1 gây ra trong ñó có: Hàn Quốc, Thái Lan, Nhật Bản, Lào, Campuchia, Indonesia, Malaysia, Trung Quốc, Hồng Kông và Việt Nam

Bên cạnh các ổ dịch do virus cúm H5N1 nêu trên, còn có một số nước và vùng lãnh thổ cũng có các ổ dịch cúm gia cầm do các chủng virus khác gây ra như Pakistan do chủng H7N3 và H9N2, Canada do chủng H7N3, Mỹ do chủng H7N2, Nam Phi do chủng H6 và H5N2, Triều Tiên do chủng H7, Ai Cập do chủng H10N7

Sau khi dịch cúm gia cầm bùng phát một số nước công bố khống chế ñược dịch, một số nước lại bị tái phát trở lại, ñây là lần ñầu tiên trong lịch sử dịch cúm gia cầm xảy ra nhanh trên diện rộng và diễn biến phức tạp ở các nước Châu Á

ðến giữa năm 2005, dịch cúm gia cầm do H5N1 bắt ñầu xuất hiện tại Kazăkstan, Nga rồi nhanh chóng lan rộng sang các nước khác ở khu vực Châu

Âu như Rumani, Hy Lạp, Thổ Nhĩ Kỳ, Azerbaijan, rồi tràn sang Châu Phi và các nước khác thuộc khu vực Châu Á như ở vùng Vịnh, Trung Quốc và Iraq Theo ðỗ Ngọc Thuý (2007) , chính dòng virus mới Âu - Phi là thủ phạm ñã gây ra các trường hợp tử vong cho người Ai Cập và Iraq vào năm 2006

Theo thống kê của Tổ chức Dịch tễ Thế giới - OIE (2006) , tính ñến ngày 2 tháng 8 năm 2006 chủng virus ñộc lực cao H5N1 ñã có mặt tại 51 quốc gia và vùng lãnh thổ trên hầu hết các Châu lục, tập trung chủ yếu ở Châu Á và Châu Âu

Năm 1977, ở Minesota ñã phát hiện dịch trên gà tây do chủng H7N7

Năm 1983 - 1984, ở Mỹ, dịch cúm gà xảy ra do chủng virus H5N2 ở 3 bang Pensylvania, Virginia, Newtersey làm chết và phải tiêu huỷ hơn 19 triệu gia cầm Cũng trong thời gian này, tại Ireland người ta ựã phải tiêu huỷ 270 nghìn con vịt tuy không có triệu chứng lâm sàng nhưng ựã phân lập ựược virus cúm chủng ựộc lực cao ựể loại trừ bệnh một cách hiệu quả, nhanh chóng

Năm 1986, ở Australia dịch cúm gà xảy ra tại bang Victoria do chủng H5N2 Năm 1997, ở Hồng Kông dịch cúm gà xảy ra do virus cúm typ A subtyp

H5N1 Toàn bộ ựàn gia cầm của lãnh thổ này ựã bị tiêu hủy vì ựã gây tử vong cho con người Như vậy ựây là lần ựầu tiên virus cúm gia cầm ựã vượt Ộrào cản

về loàiỢ ựể lây cho người ở Hồng kông làm cho 18 người nhiễm bệnh, trong ựó

có 6 người chết

Năm 2003, ở Hà Lan dịch cúm gia cầm xảy ra với quy mô lớn do chủng

H7N7, 30 triệu gia cầm bị tiêu huỷ, 83 người lây nhiễm và 1 người chết, gây thiệt hại về kinh tế hết sức nghiêm trọng

Cuối năm 2003 ựầu năm 2004 ựã có 11 quốc gia ở Châu Á thông báo có dịch cúm là Nhật Bản, Hàn Quốc, Thái Lan, Lào, Campuchia, Inựônêxia, Trung Quốc, Hồng Kông, đài loan, Việt Nam và Pakistan

Từ cuối năm 2003 ựến nay dịch cúm gia cầm diễn biến hết sức phức tạp,

ựã có hơn 50 nước trên thế giới phát hiện thấy virus cúm gia cầm, dịch ựã tái xuất hiện trở lại ở một số quốc gia như Việt Nam, Thái Lan

- Hàn Quốc: Dịch cúm gia cầm xảy ra từ ngày 12/12/2003 ựến ngày 24/3/2004 do chủng virus H5N1 gây bệnh cho gà đợt dịch thứ 2 kết thúc ngày 10/12/1004 do chủng virus H5N2 gây ra

- Nhật Bản: Dịch cúm gia cầm H5N1 phát ra ngày 12/1/2004 ựến ngày 5/3/2004, ựã tiêu huỷ 275.000 gà đợt dịch thứ 2 xảy ra từ ngày 1/7/2005 ựến ngày 9/12/2005 do chủng virus H5N2 gây bệnh cho gà

- Thái Lan: Ổ dịch ựầu tiên ựược xác ựịnh vào ngày 23/1/2004 ở tỉnh Chiang

Ma do chủng virus H5N1 gây bệnh cho gà, vịt, ngỗng, chim cút, gà tây, cò, hổ đợt

dịch thứ 2 từ ngày 3/7/2004 ñến 14/2/2005 Sau ñó dịch vẫn xảy ra rải rác, ngày 17/3/2005 dịch xảy ra trên một ñàn gà 50 con ở tỉnh Sukhothai Tháng 8/2006 dịch

ñã tái phát trở lại ở gia cầm và ở người

- Campuchia: Dịch H5N1 xảy ra từ ngày 24/1/2004, ổ dịch cuối cùng ñược ghi nhận vào tháng 4/2005, virus gây bệnh cho gà, vịt, ngỗng, gà tây, gà nhật, chim hoang

- Lào: Dịch H5N1 bắt ñầu xuất hiện từ 27/1/2004 ñến 13/2/2004 ở 3 tỉnh,

ñã tiêu huỷ hơn 155.000 gà

- Inñônêxia: Ổ dịch ñầu tiên xuất hiện ngày 6/2/2004, ñợt dịch thứ hai xảy

ra ngày 25/11/2005 do chủng virus H5N1 gây bệnh cho gà, vịt, chim cút và lợn (lợn không có triệu chứng lâm sàng)

- Trung Quốc: Ổ dịch ñầu tiên phát hiện ngày 6/2/2004, virus phân lập từ

gà, vịt, ngỗng, chim cút, bồ câu, chim trĩ, thiên nga ñen, ngỗng ñầu khoang, mòng ñầu ñen, mòng ñầu nâu, vịt lông ñỏ và chim cốc

- Malaysia: Ổ dịch ñầu tiên phát hiện ngày 19/8/2004 ở tỉnh Kalantan, ñợt dịch thứ hai phát ra ngày 22/11/2004, số gia cầm tiêu huỷ trên 18.000 con Trong tháng 7 và tháng 8 năm 2006, dịch xảy ra rất nặng nề trên người

- Hồng Kông: Dịch xảy ra ngày 26/1/2004, ca bệnh cuối cùng ghi nhận vào ngày 10/1/2005, virus ñược phân lập từ chim cắt, diệc xám, diệc Trung Quốc

- Pakistan: Ổ dịch ñầu tiên ghi nhận ngày 28/1/2004 do các subtyp H7N3 và

H9N2 xảy ra trên gà tây, ổ dịch cuối cùng ñược ghi nhận vào tháng 11/2005

- Canada: Dịch cúm gia cầm xảy ra do các subtyp H7N3, H3, H5, H5N2 ở

gà, gà tây vào các ngày 19/2/2004 và 9/3/2004 Ca bệnh cuối cùng ñược ghi nhận vào ngày 22/11/2005

- Hoa Kỳ: Một ổ dịch cúm gia cầm H7N2 (chủng virus ñộc lực thấp) duy nhất xảy ra trên gà vào ngày 11/2/2004 tại bang Delaware

- Nam Phi: Một ổ dịch cúm H6 xảy ra ở gà công nghiệp và kết thúc ngày 25/3/2004; một ổ dịch khác do H5N2 xảy ra ngày 6/8/2004 ở ñà ñiểu và kết thúc

vào ñầu tháng 12/2004

- Ai Cập: Trong năm 2004, ñã phát hiện một ổ dịch H10N7 trên vịt hoang dã

- Cộng hoà dân chủ nhân dân Triều Tiên: Từ ngày 25/2 - 26/3/2005 dịch cúm gia cầm H7 ñã xảy ra ở Bình Nhưỡng

- Cuối tháng 3/2005, tại Myanmar ñã phát hiện hàng ngàn gà chết nghi bệnh cúm gia cầm, tuy nhiên ñến nay chưa có báo cáo xác ñịnh bệnh cúm xảy ra

- Kazăctan: Ổ dịch ñầu tiên ñược ghi nhận ngày 2/8/2005 do subtyp H5N1gây bệnh cho ngỗng, vịt Ổ dịch cuối cùng ñược ghi nhận vào ngày 19/8/2005

- Nga: Ổ dịch ñầu tiên ñược ghi nhận ngày 24/7/2005 do subtyp H5N1 gây bệnh cho gà, gà tây, ngỗng, vịt Ổ dịch cuối cùng ñược ghi nhận vào ngày 19/12/2005

- Rumani: Ổ dịch ñầu tiên ñược ghi nhận ngày 22/10/2005 do subtyp

H5N1 gây bệnh cho gà, gà tây, vịt, thiên nga, diệc Ổ dịch cuối cùng ñược ghi nhận vào ngày 21/12/2005

- Ukraina: Ổ dịch ñầu tiên ñược ghi nhận ngày 8/12/2005 do subtyp H5N1

gây bệnh cho gà

2.3 Triệu chứng bệnh tích bệnh Cúm gia cầm

Chúng ta phải chấp nhận 256 kiểu dạng cúm(Lê Văn Năm, 2004).cho ñến

tại thời ñiểm này các nhà khoa học trên toàn thế giới ñang dựa vào mức ñộ biểu hiện, tỷ lệ mắc và chết do Cúm gây ra ñể phân dạng cúm thành 2 loại :

+Loại có ñộc lực cao với biểu hiện bệnh rõ rệt,tốc ñộ lây lan nhanh và gây chết tới 100% gà mẫn cảm.(HPAI-High Pathogenic Avian Influenza)

+Loại có ñộc lực thấp và trong nhiều trường hợp Cúm Gà xảy ra mà ta không quan sát ñược vì thiếu biểu hiện lâm sàng rõ rệt(LPAI –Low Pathogenic Avian Influenza)

Thời gian ủ bệnh không ổn ñịnh có thể ngắn từ vài giờ tới vài ngày, tùy theo số lượng, ñộc lực của vi rút, ñường nhiễm bệnh, loài cảm nhiễm vi rút gây

bệnh Một số nghiên cứu cho thấy thời gian ủ bệnh trong nhiều trường hợp có

thể dài hơn ñến 7 ngày và lâu nhất có thể ñến 14 ngày (Lê Văn Năm, 2004)

Nói chung triệu chứng lâm sàng của bệnh Cúm gia cầm rất phức tạp và ña

dạng phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: chủng vi rút, số lượng vi rút, loài cảm

nhiễm, tuổi, giới tính, ñiều kiện môi trường (nhiệt ñộ, ánh sáng, thành phần

không khí…), chế ñộ dinh dưỡng, tình trạng miễn dịch của vật chủ trước khi

nhiễm bệnh, sự bội nhiễm của một số vi sinh vật khác

Trên thực tế khi Bệnh xảy ra thường ghép thêm một hoặc một số bệnh

khác(ví dụ như bệnh Newcastle, Tụ huyết trùng, E coli…) làm cho bức tranh

biểu hiện triệu trứng, bệnh tích ngày càng phong phú ña dạng

2.3.1 Triệu chứng lâm sàng ñiển hình của bệnh cúm gia cầm chủng ñộc lực cao

Khi nhiễm các chủng vi rút ñộc lực cao (HPAI):

+ Gia cầm thường chết ñột ngột

+Tỷ lệ tử vong khá cao có khi lên ñến 100% trong vài ngày

+ Lúc ñầu mới phát Gà sốt cao,nước mắt, nước miệng chảy giàn dụa

gà rất khó thở ñiển hình như ho khẹc, hắt hơi, thở khò khè, vảy mỏ, há mồ thở

dốc nhiều gà phải rướn cao, rướn dài cổ ñể hít khí,…

+Tiếp theo là mi mắt bị viêm, mặt phù nề, sưng mọng

+ Mào tích dày lên do thủy thũng, tím tái, có nhiều ñiểm xuất huyết Thịt

gà bị bệnh thường thâm xám

Bên cạnh các triệu chứng về hô hấp, gia cầm bị bệnh cúm còn có biểu

hiện thần kinh: Gà lười ñi lại hoặc ñi lại không bình thường, run rẩy, mệt mỏi,

nằm li bì tụ ñống với nhau Ngoài ra khi gia cầm mắc cúm thường tiêu chảy

mạnh, phân loãng trắng hoặc xanh, năng suất trứng giảm mạnh

Xuất huyết dưới da ống chân và kẽ ngón

2.3.2 Triệu chứng lâm sàng của bệnh do những chủng virus cúm ñộc lực thấp

Gia cầm bị nhiễm các chủng vi rút có ñộc lực yếu hơn triệu chứng nhẹ hơn so với gia cầm mắc chủng ñộc lực cao ñôi khi ít có biểu hiện ñiển hình tuy nhiên cũng có những triệu chứng tương tự như ở bệnh do những chủng có ñộc lực cao gây ra, nhưng mức ñộ biểu hiện nhẹ hơn và tỷ lệ chết thấp hơn

Tuy nhiên khi có sự cộng thêm với vi khuẩn hoặc vi rút khác có khả năng gây bệnh hoặc ñiều kiện môi trường bất lợi thì tỷ lệ tử vong có thể ñạt 60-70%

và các triệu chứng lâm sàng cũng dần nặng hơn

2.4 Bệnh tích

Cũng như triệu chứng lâm sàng, mức ñộ tổn thương ñại thể của bệnh cúm gia cầm cũng rất ña dạng, phụ thuộc rất nhiều vào ñộc lực của vi rút và quá trình diễn biến của bệnh

Các biến ñổi ñặc trưng về tổ chức học bao gồm:

+Phù nề

+Xuất huyết lấm tấm lớp mỡ vành tim

+Xung huyết có khi xuất huyết :Lách, phổi, mào tích, gan, thận,cơ và tổ chức thần kinh

ði sâu nghiên cứu, nhiều tác giả ñã nêu lên một số khác biệt về ñặc ñiểm tổn thương do từng chủng vi rút cúm gây ra Khi bị nhiễm H9N5, có hoại tử nặng ở hệ lâm ba và xuất hiện ñốm hoại tử ở lách nhưng khi nhiễm H5N2, H5N1 lại không có hoại tử ở hệ lâm ba Hay hoại tử ở cơ tim, viêm cơ tim thường thấy ở các gia cầm mắc chủng H5N3 Những chủng vi rút gây ra các triệu chứng thần kinh thì tổn thương thấy mạch vành xưng, hoại tử các tế bào thần kinh mà ít thấy tụ huyết, xuất huyết ở các mô thần kinh

2.5.Các chiến lược phòng chống bệnh cúm gia cầm

- Phòng bệnh cúm gia cầm ở nước ta hiện nay chủ yếu vẫn là phòng bằng Vaccine

- Chữa Bệnh Cúm gia cầm thì vẫn còn ñang là vấn ñề cần phải bàn tới trong ngành Chăn nuôi- thú Y

Hiện tại có hai quan ñiểm tồn tại song hành trong việc sử dụng vaccine phòng chống bệnh cúm gia cầm thể ñộc lực cao:

- Quan ñiểm của OIE: Việc sử dụng vaccine trong bệnh cúm gia cầm thể ñộc lực cao là một biện pháp hỗ trợ song song với các biện pháp tổng hợp khác Quan ñiểm của OIE trong việc sử dụng vaccine là ñể dập dịch, hạn chế thiệt hại trực tiếp và hạn chế sự lây lan của virus Trên thực tế, các nước thuộc cộng ñồng chung Châu Âu (EU) cũng như một số nước ñã sử dụng vaccine cho gà như Mêxico và Pakistan ñều không có kinh nghiệm phòng chống cúm gia cầm trên thuỷ cầm

- Quan ñiểm của Trung Quốc: Một mặt tuân thủ các nguyên tắc phòng chống dịch cúm gia cầm của OIE khi dịch nổ ra nghĩa là tiêu huỷ triệt ñể ñàn gia cầm mắc bệnh, quan ñiểm của Trung Quốc trong việc sử dụng vaccine phòng bệnh cúm gia cầm là ñể phòng bệnh ðiều ñó ñược xuất phát từ cơ sở Trung Quốc là nước có lượng thuỷ cầm (chủ yếu là vịt) chiếm 75% tổng số vịt trên toàn thế giới nên việc tiêu huỷ ñàn vịt có kháng thể kháng lại virus cúm gia cầm không bao giờ có tính khả thi Trung Quốc ñã sử dụng các biện pháp ñồng loạt song song với việc sử dụng vaccine cúm gia cầm trong cả nước nhằm hạn chế, dập tắt các ổ dịch xảy ra và phòng trừ lây lan từ nước ngoài, từ ñịa phương có dịch sang các ñịa phương khác Chiến lược của Trung Quốc như sau:

Vùng cưỡng chế: Là vùng xảy ra ổ dịch, tiêu huỷ toàn bộ gia cầm tại khu

vực dịch trong vòng bán kính 3 km, thực hiện tiêm chủng bắt buộc ñối với 100% gia cầm ở khu vực từ 3 - 8 km xung quanh ổ dịch Áp dụng biện pháp cấm vận chuyển gia cầm trong vòng bán kính 10 km tính từ ổ dịch

Vùng bị uy hiếp: Là vùng nằm ngoài bán kính của vùng cưỡng chế, tại

vùng này cũng ñược yêu cầu tiêm 100% số gia cầm

Vùng an toàn: Là vùng không bị bệnh việc tiêm phòng dịch cúm gia cầm

ñược Nhà nước khuyến khích Riêng ñối với gà chỉ ñược lấy thịt ñến dưới 70 ngày tuổi không sử dụng vaccine

2.6 ðặc ñiểm sinh học của virus cúm typ A

2.6.1 ðặc ñiểm cấu trúc chung của virus thuộc họ Orthomyxoviridae

Virus cúm gia cầm thuộc họ Orthomyxoviridae, có vỏ với bộ gen là ARN

cực âm một sợi Sợi ARN chia làm 8 mảnh và nối với nhau nhờ các protein có

vỏ bọc Virus ñược bọc bên ngoài bằng các Protein và có màng Lipid ở ngoài cùng Bề mặt ngoài màng phủ bằng 2 hệ thống Protein có các phản ứng ngưng kết hồng cầu và phản ứng trung hoà ñược kết hợp với nhau một cách riêng biệt (Kawaoka, 1988)

Họ Orthomyxoviridae gồm có 3 nhóm virus là:

+ Nhóm virus cúm A: Gây bệnh cho mọi loài chim, một số ñộng vật có

vú và cả con người

+ Nhóm virus cúm B: Chỉ gây bệnh cho người

+ Nhóm virus cúm C: Gây bệnh cho người, lợn

Virus thuộc họ Orthomyxoviridae có ñặc tính cấu trúc chung là hệ gen

chứa ARN một sợi, có cấu trúc là sợi âm ñược kí hiệu là ss (-) ARN (Negative Single Stranded ARN) Sợi âm ARN của hệ gen có ñộ dài từ 10.000 - 15.000 nucleotid (tùy loại virus), mặc dù nối với nhau thành một sợi ARN liên tục, nhưng hệ gen lại chia thành 6 - 8 phân ñoạn (segment), mỗi phân ñoạn là một gen chịu trách nhiệm mã hóa cho mỗi loại protein của virus Hạt virus (virion)

có cấu trúc hình khối, ñộ dài ñường kính khoảng 80 - 120 nm Vỏ virus có bản chất protein, có nguồn gốc từ nguồn tế bào mà virus ñó gây nhiễm, bao gồm một số protein ñược Glycosyl hóa (Glycoprotein) và một số protein dạng trần không ñược Glycosyl hóa (non Glycosylated protein) Protein bề mặt có cấu trúc từ các loại Glycoprotein, ñó là những gai, mấu có ñộ dài 10 - 14 nm, ñường kính 4 - 6 nm Nucleocapsid bao bọc lấy nhân virus là tập hợp của nhiều protein phân ñoạn, cấu trúc ñối xứng xoắn, kích thước 130 - 150 nm, tạo viền (lớp) ở giới hạn cuối

của mỗi phân ñoạn và liên kết với nhau qua cầu nối peptid Phân tử lượng của hạt virus vào khoảng 250 triệu dalton

2.6.2 ðặc ñiểm hình thái, cấu trúc của virus cúm typ A

Phân bố trên bề mặt của virus là loại protein gây ngưng kết hồng cầu có tên gọi là Hemagglutinin (HA) và một loại enzyme phá hủy thụ thể của virus có tên gọi Neuraminidae (NA), chúng là các glycoprotein riêng biệt

Hạt virion có cấu trúc là acid ribonucleic sợi âm ở dạng ñơn, ñộ dài 13.500 nucleotid chứa 8 phân ñoạn kế tiếp nhau mã hóa cho 10 loại protein khác nhau của virus là HA, NA, NP, M1, M2, BP1, BP2, PA, NS1, NS2 Tám phân ñoạn của sợi ARN có thể tách và phân biệt rõ ràng nhờ phương pháp ñiện di Qua

kính hiển vi ñiện tử, các virus họ Orthomyxoviridae có dạng gần như hình cầu

hoặc các hạt mỏng, ñường kính chung của hạt virus từ 80 - 100 nm

- Phân ñoạn 1 - 3: Mã hóa cho protein PB1, PB2 và PA là enzyme polymerase tổng hợp acid ribonucleic nguyên liệu cho hệ gen và các ARN thông tin tổng hợp protein của virus

- Phân ñoạn 4: Mã hóa cho protein Hemagglutinin (HA) là một protein bề mặt cắm gốc vào bên trong, có chức năng bám dính vào thụ thể của tế bào, có khả năng gây ngưng kết hồng cầu, có khả năng hợp nhất vỏ virus với màng tế bào nhiễm và tham gia vào phản ứng trung hòa virus HA là polypeptid gồm 2 chuỗi HA1 và HA2 nối với nhau bằng ñoạn Oligopeptid ngắn, thuộc loại hình

mô typ riêng ựặc trưng cho các subtyp H (H1 - H16) trong tái tổ hợp tạo nên biến chủng Mô typ của chuỗi Oligopeptid này chứa một số acid amin cơ bản làm khung, thay ựổi ựặc hiệu theo từng loại hình subtyp H Sự thay ựổi thành phần của chuỗi nối quyết ựịnh ựộc lực của virus thuộc biến chủng mới

- Phân ựoạn 5: Mã hóa cho protein Nucleoprotein (NP) một loại protein ựược Phosphoryl hóa, có biểu hiện tắnh kháng nguyên ựặc hiệu theo nhóm (Group - Specific), tồn tại trong hạt virion trong dạng liên kết với mỗi phân ựoạn ARN nên loại NP còn ựược gọi là Ribonucleoprotein

- Phân ựoạn 6: Mã hóa cho protein Neuraminidae (NA) là một enzyme phân cắt HA sau khi virus vào bên trong tế bào nhiễm

- Phân ựoạn 7: Mã hóa cho 2 tiểu phần protein ựệm (Matrix protein) M1

và M2 là protein màng không ựược Glycosyl hóa, có vai trò làm ựệm bao bọc lấy ARN hệ gen M2 là một Tetramer có chức năng tạo khe H+ giúp cởi bỏ virus sau khi xâm nhập vào tế bào cảm nhiễm M1 có chức năng tham gia vào quá trình tổng hợp và nảy mầm của virus

- Phân ựoạn 8: Có ựộ dài ổn ựịnh (890 nucleotid) mã hóa cho 2 tiểu phần protein không cấu trúc NS1 và NS2 có chức năng chuyển ARN từ nhân ra kết hợp với M1, kắch thắch phiên mã, chống Interferon

2.6.3 đặc tắnh kháng nguyên của virus cúm typ A

Các loại kháng nguyên ựược nghiên cứu nhiều nhất là protein nhân (Nucleoprotein, NP), protein ựệm (matrix protein, M1), protein gây ngưng kết hồng cầu (Hemagglutinin, HA) và protein enzyme cắt thụ thể (Neuraminidase, NA) NP và M1 là protein thuộc loại hình kháng nguyên ựặc hiệu giống (genus- specific antigen), kắ hiệu là gs kháng nguyên; HA và NA là protein thuộc loại hình kháng nguyên ựặc hiệu typ và dưới typ (typ - specific antigen), ký hiệu là ts kháng nguyên

Một ựặc tắnh quan trọng là virus cúm có khả năng gây ngưng kết hồng cầu của nhiều loài ựộng vật đó là sự kết hợp giữa mấu lồi kháng nguyên HA trên bề

mặt của virus cúm với thụ thể cĩ trên bề mặt hồng cầu, làm cho hồng cầu ngưng kết với nhau tạo thành mạng ngưng kết thơng qua cầu nối virus, gọi là phản ứng ngưng kết hồng cầu HA (Hemagglutination test)

Kháng thể đặc hiệu của kháng nguyên HA cĩ khả năng trung hịa các loại virus tương ứng, chúng là kháng thể trung hịa cĩ khả năng triệt tiêu virus gây bệnh Nĩ cĩ thể phong tỏa sự ngưng kết bằng cách kết hợp với kháng nguyên HA Do vậy thụ thể của hồng cầu khơng bám vào được để liên kết tạo thành mạng ngưng kết Người ta gọi phản ứng đặc hiệu KN - KT cĩ hồng cầu tham gia là phản ứng ngăn cản ngưng kết hồng cầu HI (Hemagglutination inhibition test)

Phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA) và phản ứng ngăn cản ngưng kết hồng cầu (HI) được sử dụng trong chẩn đốn cúm gia cầm

Theo Ito và Kawaoka (1998), sự phức tạp trong diễn biến kháng nguyên của virus cúm là sự biến đổi và trao đổi trong nội bộ gen dẫn đến sự biến đổi liên tục về tính kháng nguyên Cĩ 2 cách biến đổi kháng nguyên của virus cúm:

+ ðột biến điểm (đột biến ngẫu nhiên hay hiện tượng trơi trượt, lệch lạc

về kháng nguyên - antigenic drift) ðây là kiểu đột biến xảy ra liên tục thường xuyên trong quá trình tồn tại của virus mà bản chất là do cĩ sự thay đổi nhỏ về trình tự nucleotid của gen mã hĩa, đặc biệt đối với kháng nguyên H và kháng nguyên N Kết quả là tạo ra các phân typ cúm hồn tồn mới cĩ tính thích ứng lồi vật chủ khác nhau và mức độ độc lực gây bệnh khác nhau Chính nhờ sự biến đổi này mà virus cúm A tạo nên 16 biến thể gen HA (H1- H16) và 9 kháng nguyên N (N1 - N9)

+ ðột biến tái tổ hợp di truyền (hiện tượng thay ca - antigenic shift) Hiện tượng tái tổ hợp gen ít xảy ra hơn so với hiện tượng đột biến điểm Hiện tượng này chỉ xảy ra khi 2 hoặc nhiều loại virus cúm khác nhau cùng nhiễm vào một tế bào chủ do sự trộn lẫn 2 bộ gen của virus ðiều này tạo nên sự sai khác cơ bản

về bộ gen của virus cúm đời con so với virus bố mẹ Khi hiện tượng tái tổ hợp

gen xuất hiện có thể sẽ gây ra các vụ dịch lớn cho người và ñộng vật với mức ñộ nguy hiểm không thể lường trước ñược Vụ dịch năm 1918 - 1819 làm chết 40 -

50 triệu người mà tác nhân gây bệnh là virus H1N1 từ lợn lây sang người kết hợp với virus cúm người tạo ra chủng virus mới có ñộc lực rất mạnh

Do hạt virus cúm A có cấu trúc là 8 ñoạn gen nên về lý thuyết từ 2 virus

có thể xuất hiện 256 kiểu tổ hợp của virus thế hệ sau

Khi nghiên cứu về ñặc tính kháng nguyên của virus cúm thấy giữa các biến thể tái tổ hợp và biến chủng subtyp về huyết thanh học không hoặc rất ít có phản ứng chéo ðây là ñiểm trở ngại lớn cho việc nghiên cứu nhằm tạo ra vaccine cúm ñể phòng bệnh cho người và ñộng vật

Khi xâm nhập vào cơ thể ñộng vật, virus cúm A kích thích cơ thể sản sinh

ra kháng thể ñặc hiệu, trong ñó quan trọng hơn cả là kháng thể kháng HA, chỉ có kháng thể này mới có vai trò trung hòa virus cho bảo hộ miễn dịch Một số kháng thể khác có tác dụng kìm hãm sự nhân lên của virus, kháng thể kháng M2

ngăn cản chức năng M2 không cho quá trình bao gói virus xảy ra

2.6.4 Thành phần hóa học

ARN của virus chiếm 0,8 - 1,1%; protein chiếm 70 - 75%; lipid chiếm 20

- 24%; hydratcacbon chiếm 5 - 8% khối lượng hạt virus

Lipid tập trung ở màng virus và chủ yếu là lipid có gốc phospho, số còn lại là cholesterol, glucolipid và một ít hydrocacbon gồm các loại men galactose, ribose, fructose, glucosamin Thành phần chính protein của virus chủ yếu là glycoprotein

2.6.5 Quá trình nhân lên của virus

Theo Kingrbury 1985, Fenner và cộng sự mô tả quá trình nhân lên (sinh sản) của virus ñược tóm tắt như sau:

Virus xâm nhập vào tế bào nhờ chức năng của protein HA thông qua hiện tượng ẩm bào (endocytosis) qua cơ chế trung gian tiếp hợp thụ thể Thụ thể liên kết tế bào của virus cúm có bản chất là acid sialic cắm sâu vào glycoprotein hay

glycolipid của vỏ virus Trong khoang ẩm bào, khi nồng ñộ pH ñược ñiều hòa

ñể giảm xuống mức thấp sẽ xảy ra quá trình hợp nhất màng tế bào và virus, sự hợp nhất này phụ thuộc vào sự cắt rời protein HA nhờ enzyme peptidase và enzyme protease của tế bào Lúc này nucleocapsid của virus ñi vào trong nguyên sinh chất rồi vào trong nhân tế bào, chuẩn bị thực hiện quá trình tổng hợp ARN nguyên liệu hệ gen cho các virion mới

Hệ thống enzyme sao chép của virus ngay lập tức tạo nên các ARN thông tin Các phân ñoạn ARN hệ gen ñược mã hóa ở 10 - 13 nucleotid ñầu 5’ với nguyên liệu mã hóa lấy từ ARN tế bào, nhờ vào hoạt tính enzyme PB2 của virus ARN thông tin của virus sao chép trong nhân ñược chuyển vận ra nguyên sinh chất, ñược riboxom trợ giúp tổng hợp nên protein cấu trúc và protein nguyên liệu Protein H, N, M2, ở lại trong nguyên sinh chất, ñược vận chuyển xuyên qua

hệ thống võng mạc nội mô và hệ Golgi sau ñó ñược cắm lên màng tế bào nhiễm Protein NS1, NP, M1 ñược chuyển vận vào nhân ñể bao bọc ñệm lấy nguyên liệu ARN hệ gen mới ñược tổng hợp Song song với quá trình sao chép ARN thông tin và tổng hợp protein cấu trúc, protein nguyên liệu, virus tiến hành tổng hợp nguyên liệu di truyền là các sợi ARN mới Từ sợi ARN âm ñơn của virus ban ñầu, một sợi dương ARN toàn vẹn ñược tạo ra theo cơ chế bổ sung, sợi dương mới này lại làm khuôn ñể tổng hợp nên sợi âm ARN mới làm nguyên liệu Các sợi âm ARN mới, một số vừa làm nguyên liệu ñể lắp ráp virion mới, số khác lại làm khuôn ñể tổng hợp ARN theo cơ chế như với sợi ARN của virus ñầu tiên Các sợi ARN hệ gen ñược tạo ra là một sợi hoàn chỉnh về ñộ dài và ñược các protein ñệm (NS1, M1, NP) bao gói tạo nên ribonucleocapsid (nucleoriboprotein) ngay trong nhân tế bào nhiễm, sau ñó ñược chuyển vận ra nguyên sinh chất rồi ñược chuyển vận ñến vị trí màng tế bào có sự biến ñổi ñặc hiệu với virus

Sự kết hợp cuối cùng của tổ hợp nucleoriboprotein với các protein cấu trúc (HA, NA, M2) tạo nên các hạt virus hoàn chỉnh mới và ñược giải phóng ra

khỏi tế bào nhiễm theo hình thức nảy chồi

2.6.6 ðộc lực của virus

ðộc lực của virus cúm gia cầm có sự dao ñộng lớn, phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trước hết là protein HA Các nghiên cứu ở mức ñộ phân tử cho thấy khả năng lây nhiễm của virus phụ thuộc vào tác ñộng của men protease vật chủ ñến

sự phá vỡ của liên kết hóa học sau khi dịch mã của phân tử ngưng kết, thực chất

là sự cắt rời protein HA thành 2 tiểu phần HA1 và HA2 Tính thụ cảm của ngưng kết tố và sự phá vỡ liên kết của men protease lại phụ thuộc vào số lượng các amino axit cơ bản tại ñiểm bắt ñầu phá vỡ các liên kết Các enzym giống trypsin

có khả năng phá vỡ liên kết khi chỉ có một phân tử Arginin, trong khi ñó các enzym protease khác lại cần nhiều amino acid cơ bản

Tại Hội thảo thế giới lần ñầu tiên về bệnh cúm gà 1981, Bankowski và cộng sự thông báo virus cúm gà có kháng nguyên bề mặt H7 thuộc loại có ñộc lực cao Nhưng Pensyvania (Mỹ) ñã chứng kiến trận dịch cúm gà gây chết 75%

số gà, khi phân lập virus có kháng nguyên bề mặt H5 mà không phải là H7 ðể ñánh giá ñộc lực của virus cúm một cách khoa học, các nhà khoa học sử dụng phương pháp gây bệnh cho gà 3 - 6 tuần tuổi bằng cách tiêm tĩnh mạch 0,2 ml nước trứng ñã ñược gây nhiễm virus (pha loãng ở nồng ñộ 1/10) Sau ñó ñánh giá mức ñộ nhiễm bệnh của gà ñể cho ñiểm (chỉ số IVPI) ðiểm tối ña là 3 ñiểm

và ñó là virus có ñộc lực cao nhất Theo quy ñịnh của Tổ chức Thú y Thế giới (OIE), virus nào có chỉ số IVPI từ 1, 2 trở lên thuộc loại có ñộc lực cao Và các nhà khoa học ñã thống nhất chia ñộc lực của virus ra 3 loại:

- Virus có ñộc lực cao: Nếu sau khi tiêm tĩnh mạch 10 ngày phải làm chết

75 - 100% số gà thực nghiệm Virus gây bệnh cúm gà (có thể là typ phụ) phải làm chết 20% số gà mẫn cảm thực nghiệm và phát triển tốt trên tế bào xơ phôi trong môi trường nuôi cấy không có Trypsin

- Virus có ñộc lực trung bình: Là những chủng virus gây dịch cúm gà với triệu chứng lâm sàng rõ rệt nhưng gây chết gà không quá 15% số gà bị nhiễm bệnh

tự nhiên hoặc không gây quá 20% số gà mẫn cảm thực nghiệm

- Virus có ñộc lực thấp (nhược ñộc): Là những virus phát triển tốt trong

cơ thể gà, có thể gây ra dịch nhưng không có triệu chứng lâm sàng rõ rệt, không tạo ra bệnh tích ñại thể và không làm chết gà

Trong thực tế người ta chia virus cúm gà ra làm 2 loại: Loại virus có ñộc lực thấp - LPAI (Low Pathogenic Avian Influenza) và loại virus có ñộc lực cao - HPAI (Highly Pathgennic Avian Influenza)

Cho ñến nay người ta thừa nhận chỉ có 2 biến chủng virus có cấu trúc kháng nguyên H5, H7 ñược coi là loại có ñộc lực cao gây bệnh ở gia cầm, nhưng không phải tất cả các chủng mang gen H5, H7 ñều gây bệnh

Thực tế chứng minh rằng các chủng có ñộc lực thấp trong quá trình lưu hành trong thiên nhiên và trong ñàn thủy cầm có thể ñột biến nội gen hoặc ñột biến tái tổ hợp ñể trở thành các chủng có ñộc lực cao - HPAI

2.6.7 Danh pháp

ðể ký hiệu và lưu trữ một cách khoa học và ñầy ñủ các chủng virus cúm phân lập ñược, năm 1980 Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) ñã ñưa ra một hệ thống phân loại mới, ñược quy ñịnh ký hiệu theo trình tự: Serotyp/loài nhiễm /nơi phân lập /số hiệu chủng /thời gian phân lập /loại hình Subtyp HA (H) và NA (N) Ví dụ: Virus cúm có kí hiệu A/GS/HK/437/4/99/H5N1, có nguồn thông tin là: Cúm nhóm A; loài nhiễm là ngỗng (GS = goose); nơi phân lập là Hồng Kông (HK); số hiệu 437; thời gian phân lập tháng 4/1999; Subtyp H5N1

2.6.8 Nuôi cấy và lưu giữ virus cúm gà

Virus cúm gà phát triển tốt trên phôi gà 9 - 11 ngày tuổi, trong nước phôi

gà tập trung khá nhiều virus và có thể lưu giữ virus ñược vài tuần ở ñiều kiện

40C Khả năng tồn tại và gây bệnh của virus rất cao nếu ta bảo quản nước phôi

ñó ở -700C hoặc cho ñông khô

Virus cúm gà cũng phát triển tốt trong tế bào xơ phôi gà (CEF) và tế bào thận chó MDCK (Madin- Darby Canine Kidney cell) với ñiều kiện môi trường

nuôi cấy tế bào không chứa Trypsin

Bệnh Cúm gia cầm do vi rút cúm type A gây ra cho các loài lông vũ thuần hóa hoặc hoang dã và người Bệnh xảy ra lần ñầu tiên ở Ý năm 1878 do Edoardo Perroncito phát hiện và mô tả Năm 1900 Centanni và Savunozzi mới xác ñịnh ñược căn nguyên gây bệnh là siêu nhỏ qua màng lọc Năm 1955 Schafer mới phân lập và xác ñịnh ñược vi rút gây bệnh thuộc type A Vi rút Cúm A có cấu trúc gien ARN xoắn ñơn, có 8 ñoạn gien ñược mã hóa 7 protein cấu trúc (PB1, PB2, PA, HA, NA, NP và M1) và 3 protein không cấu trúc (NS1, NS2 và M2)

Do tính chất nguy hiểm của bệnh, lây lan nhanh, truyền sang người nên thiệt hại về kinh tế là rất lớn, bệnh có xu hướng ngày càng phức tạp, nếu từ năm 1959- 1998 trong vòng 40 năm có 23 triệu gia cầm bị nhiễm bệnh, thì từ năm 1999-2004 trong vòng 5 năm ñã có trên 200 triệu gia cầm bị bệnh.Theo thông báo của tổ chức y tế thế giới WHO từ năm 2003 tới 2011 ñã có 539 người nhiễm Cúm gia cầm và 318 người tử vong, trong ñó số người mắc bệnh và tử vong vì cúm gia cầm H5N1 ở Việt Nam là 119 và 59

Vi rút cúm týp A ñược xác ñịnh phân typ dựa trên cơ sở kháng nguyên bề mặt, yếu tố gây ngưng kết hồng cầu (Hemagglutinin, viết tắt là H hoặc HA) và enzym trung hoà (Neuraminidase, viết tắt là N hoặc NA) có vai trò quan trọng trong miễn dịch bảo hộ Có tất cả 16 biến thể HA (kí hiệu từ H1 ñến H16) và có

9 biến thể NA (kí hiệu từ N1 ñến N9) Hemagglutinin ñược coi là yếu tố vừa quyết ñịnh tính kháng nguyên, vừa quyết ñịnh ñộc lực của vi rút cúm A

Mỗi hợp thể kháng nguyên HA và NA tạo nên 1 subtype Về mặt huyết thanh học, giữa các subtyp không hoặc có rất ít phản ứng chéo ðây là trở ngại cho việc nghiên cứu vacxin

Các chủng vi rút cúm ñược kí hiệu theo danh pháp quốc tế với trật tự: Tên Type/loài nhiễm/nơi phân lập/số hiệu chủng/thời gian phân lập/loại hình subtype

HA (H) và NA (N) Ví dụ: Vi rút cúm có kí hiệu A/Chicken/Scotland/59/H5N1,

có nguồn thông tin là vi rút cúm A, loài nhiễm là gà, nơi phân lập tại Scotland,

phân lập năm 1959, subtype H5N1 Kháng nguyên cúm gia cầm để thực hiện các phản ứng HI cũng mang tên của chủng, ví dụ kháng nguyên chế từ chủng nêu tên ở trên cũng cĩ tên là A/Chicken/Scotland/59/H5N1

Các loại kháng nguyên của vi rút cĩ thể kích thích cơ thể sinh ra nhiều loại kháng thể nhưng chỉ cĩ loại kháng thể kháng HA mới cĩ vai trị trung hồ vi rút cho bảo hộ miễn dịch Một số kháng thể khác cĩ tác dụng kìm hãm sự nhân lên của vi rút Ví dụ: kháng thể kháng NA ngăn cản vi rút giải phĩng, kháng thể kháng M2 ngăn cản chức năng M2 khơng cho quá trình bao gĩi xảy ra Nhưng thơng thường người và động vật chết rất nhanh trước khi cĩ sự hình thành kháng thể Vì vậy người ta thường dùng phản ứng HI để đánh giá hiệu quả của việc tiêm phịng vắc xin cúm gia cầm Nếu tiêm vắc xin subtype HA nào thì thường phải sử dụng kháng nguyên HA cùng subtype HA đĩ

Rất nhiều những nỗ lực đã được thực hiện nhằm khống chế hoặc thanh tốn H5N1 ở gia cầm và phịng ngừa sự phơi nhiễm cho con người, cả 2 cách này đều cĩ thể giảm được nguy cơ xảy ra đại dịch Ở Châu Âu, các ổ dịch được khống chế bằng cách nhanh chĩng cắt giảm số lượng gia cầm ở những khu vực nuơi bị nhiễm bệnh, để trống những trang trại kế cận, hạn chế vận chuyển và các biện pháp vệ sinh động vật Tuy nhiên, ở Châu Á, bệnh đã trở thành dịch địa phương và việc khống chế bằng cách tiêu hủy kết hợp với hạn chế vận chuyển

và các biện pháp vệ sinh là khơng thực tế về mặt kinh tế xã hội và khơng thể hồn tồn tiêu diệt được mầm bệnh Do vậy, tiêm phịng vẫn là chiến lược khống chế dịch bệnh được sử dụng rộng rãi nhất Ví dụ riêng Indonesia đã sử dụng hơn 400 triệu liều vaccine trong năm 2004, Việt Nam nhập khẩu 500 triệu liều để sử dụng trong năm 2008

Hiện tại tồn nhân loại đang tập trung vào nghiên cứu hầu hết các khía cạnh của bệnh Cúm gia cầm như: phương pháp chẩn đốn, phịng bệnh, vacxin, đường lây truyền, nguồn gây bệnh, đặc biệt tập trung nghiên cứu sản xuất các chế phẩm phục vụ chẩn đốn Hiện tại cĩ nhiều nước (Anh, Trung quốc) đã sản

xuất và thương mại hĩa loại kháng nguyên, tuy nhiên giá thành cịn rất đắt đối với những nước đang phát triển đặc biệt là kháng nguyên H5N1 của VLA (nước Anh) sản xuất và được sử dụng phổ biến ở Việt Nam Vì vậy, việc nghiên cứu sản xuất để tự chủ loại nguyên liệu này là cần thiết đối với những nước đang phát triển, do vậy chúng tơi lựa chọn giống vi rút A/Anhui05-H5N1 cho việc nghiên cứu sản xuất kháng nguyên cho chẩn đốn bệnh cúm A/H5N1

2.6.9 Nguồn gốc của vi rút A/Anhui05-H5N1

Trong chương trình hợp tác giữa Trung tâm chẩn đốn Thú Y trung ương và CDC từ năm 2003 – 2008, CDC đã chuyển giao cho chủng vi rút A/Anhui05-H5N1

Vi rút A/Anhui/05-H5N1 là chủng vi rút cúm gia cầm cĩ độc lực cao được phân lập năm 2005 Vi rút đã được xĩa gen độc bằng cơng nghệ gen và lắp giáp nhân tạo bằng kỹ thuật di truyền Tuy vi rút đã mất tính độc nhưng vẫn giữ nguyên bản chất đặc tính kháng nguyên

Vi rút cĩ khả năng thích ứng nhân lên khi nuơi cấy trên phơi gà

Giống vi rút cúm gia cầm A/Anhui/05-H5N1 được sử dụng làm giống gốc trong nghiên cứu chế kháng nguyên H5N1 sử dụng trong phản ứng xét nghiệm phát hiện kháng thể kháng kháng nguyên H5

PHẦN III NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Nội dung

3.1.1 Tiêm truyền xác ựịnh nồng ựộ pha loãng tốt nhất cho nhân giống vi rút cúm A/H5N1

3.1.2 đánh giá ựộ an toàn (tắnh không ựộc) của vi rút

3.1.3 Vô hoạt vi rút bằng formaldehyde

3.1.4 đánh giá ựộ thuần khiết của sản phẩm kháng nguyên

3.1.5 Kiểm tra tắnh sinh miễn dịch của sản phẩm kháng nguyên

3.1.6 Kiểm tra ựộ nhạy và ựộ ựặc hiệu của chế phẩm kháng nguyên tự chế bằng phản ứng HI

3.1.7 So sánh ựánh giá ựộ nhạy của kháng nguyên tự chế với kháng nguyên của Anh bằng mẫu giám sát sau tiêm phòng lấy từ Hà Nội, Nam định và Vĩnh Phúc

3.1.8 Xác ựịnh thời gian bảo quản kháng nguyên tự chế

- Trứng gà có phôi 9-10 ngày tuổi

- Kháng huyết thanh chuẩn H5N1 nhận từ phòng thắ nghiệm tham chiếu cúm gia cầm của Weibridge (Anh Quốc)

- Huyết thanh của gia cầm ựã ựược tiêm phòng vắc xin H5N1-Re1 và H5N1-Re5 ựược thu thập từ 3 tỉnh Hà Nội, Nam định và Vĩnh Phúc

- Phầm mềm phân tắch các thông số dịch tễ - thống kê R, phiên bản 2.14.2

R Development Core Team (2012) và Bộ công thức tắnh toán các thông số dịch

tễ - thống kê epiR, phiên bản 09.34 (Stevenson., 2012)