Nghiên cứu chế tạo thử nghiệm vacxin đậu gà nhược độc đông khô chủng c trên tế bào xơ phôi gà một lớp

DANH MỤC BẢNG 4.1: Kết quả khảo sát ñặc tính gây phá hủy tế bào của virus giống ñậu gà nhược ñộc chủng C trên môi trường tế bào xơ phôi gà một 4.3: Kết quả kiểm tra vô trùng lô giống gốc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS CÙ HỮU PHÚ

PGS.TS NGUYỄN HỮU NAM

HÀ NỘI – 2012

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là ñề tài nghiên cứu của tôi và các ñồng nghiệp Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực, do tôi khảo sát nghiên cứu, có sự giúp ñỡ của các ñồng nghiệp trong cơ quan

Tôi xin cam ñoan, các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñược chỉ

rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

Nguyễn Trần ðặng Dũng

LỜI CẢM ƠN

để hoàn thành bản luận văn này, ngoài sự cố gắng, nỗ lực hết mình của bản thân còn có sự hướng dẫn tận tình của thầy hướng dẫn khoa học PGS TS

Cù Hữu Phú, PGS TS Nguyễn Hữu Nam

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ựến thầy hướng dẫn, người ựã giành nhiều thời gian quý báu tận tình giúp ựỡ, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn:

- Ban giám ựốc Xắ nghiệp thuốc thú y Trung Ương

- Tập thể cán bộ công nhân viên trong phân xưởng vacxin virus ựông khô Ờ Xắ nghiệp thuốc thú y Trung Ương

- Ban ựào tạo sau ựại học Ờ Trường ựại học Nông Nghiệp Hà Nội

đã tận tình giúp ựỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Nhân dịp này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia ựình, người thân, bạn bè, ựồng nghiệp - Những người luôn tạo ựiều kiện, ựộng viên, giúp

ựỡ tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Hà Nội, ngày Ầ tháng Ầ năm 2012

Tác giả luận văn

Nguyễn Trần đặng Dũng

2.1 VIRUS ðẬU GÀ VÀ BỆNH ðẬU GÀ 4

2.2 MIỄN DỊCH HỌC CỦA BỆNH ðẬU GÀ 17

2.3 NHỮNG YÊU CẦU CƠ BẢN TRONG SẢN XUẤT VACXIN ðẬU

3.3 NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU 32

3.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 38

4.1 KẾT QUẢ NUÔI CẤY VIRUS ðẬU GÀ NHƯỢC ðỘC CHỦNG C TRÊN MÔI TRƯỜNG TẾ BÀO XƠ PHÔI GÀ MỘT LỚP 38

4.1.1 Khảo sát ñặc tính gây phá hủy tế bào của virus giống ñậu gà nhược ñộc chủng C trên môi trường tế bào xơ phôi gà một lớp 38

4.1.2 Kết quả xác ñịnh hiệu giá virus giống trên môi trường tế bào xơ phôi gà một lớp qua các lần cấy chuyển (TCID50) 41

4.1.3 Kiểm tra các chỉ tiêu thuần khiết, an toàn và tính sinh miễn dịch của lô giống gốc thích ứng trên môi trường nuôi cấy tế bào 43

4.2 XÂY DỰNG QUY TRÌNH SẢN XUẤT VACXIN 48

4.2.1 Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất vacxin ñậu gà nhược ñộc ñông khô nuôi cấy trên môi trường tế bào 48

4.2.2 Xác ñịnh liều gây nhiễm thích hợp của virus ñậu gà chủng C trên môi

4.2.3 Xác ñịnh thời ñiểm thích hợp ñể thu hoạch huyễn dịch sau khi gây

4.2.4 Xác ñịnh tỷ lệ phối trộn chất bổ trợ và huyễn dịch virus 54

4.3 ðÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG VACXIN ðẬU GÀ ðƯỢC SẢN XUẤT TRÊN MÔI TRƯỜNG TẾ BÀO XƠ PHÔI GÀ MỘT LỚP 56

4.3.1 Kết quả kiểm tra ñộ ẩm và chân không của vacxin ñông khô 56

4.3.2 Kết quả kiểm tra vô trùng 58

4.3.3 Kết quả kiểm tra an toàn 59

4.3.4 Kết quả kiểm tra tính sinh miễn dịch 61

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ADN Acid deoxyribonucleic

CAM

CEF

Chorioallantoic membrane (Màng rung niệu)

Chick embryo fibroblast (Tế bào xơ phôi gà)

CEK Chick embryo kidney (Tế bào thận phôi gà)

CEL Chick embryo liver (Tế bào gan phôi gà)

CK Chick kidney (Tế bào thận gà)

CPE

REV

Cytopathic effect (Bệnh lý tế bào)

Reticuls endotheliosis virus

ARN Acid ribonucleic

EID50 50% Egg-infective dose (Liều gây nhiễm trứng 50%)

LD50 50 percent Lethal Dose

M Membrain (Protein màng)

MEM Minimal essential medium (Môi trường cần thiết tối thiểu)

OIE Office International des Epizooties (Tổ chức Dịch tế Thế giới) PBS Phosphate buffered saline (Dung dịch muối ñệm)

Polymerase chain reaction

Specific pathogen free (Sạch bệnh)

Median tissue culture infective dose (Liều gây nhiễm tế bào 50%)

Tiêu chuẩn ngành

Thí nghiệm

TK Thymidine kinase

DANH MỤC BẢNG

4.1: Kết quả khảo sát ñặc tính gây phá hủy tế bào của virus giống

ñậu gà nhược ñộc chủng C trên môi trường tế bào xơ phôi gà một

4.3: Kết quả kiểm tra vô trùng lô giống gốc ñậu gà nhược ñộc chủng C

trên môi trường nuôi cấy tế bào 44

4.4: Kết quả kiểm tra an toàn lô giống gốc ñậu gà nhược ñộc chủng C

trên môi trường nuôi cấy tế bào 46

4.5: Kết quả kiểm tra tính sinh miễn dịch của lô giống gốc ñậu gà

nhược ñộc chủng C trên môi trường nuôi cấy tế bào 47

4.6: Kết quả xác ñịnh liều gây nhiễm thích hợp của virus ñậu gà nhược

ñộc chủng C trên môi trường nuôi cấy tế bào 50

4.7: Kết quả xác ñịnh thời ñiểm thích hợp ñể thu hoạch huyễn dịch

4.8: Kết quả thí nghiệm về tỷ lệ chất bổ trợ trong vacxin ñậu gà tế bào

4.9: Kết quả kiểm tra ñộ ẩm và chân không của vacxin ñông khô 57

4.10 Kết quả kiểm tra vô trùng các lô vacxin ñậu gà trên môi trường

4.11: Kết quả kiểm tra an toàn vacxin ñậu gà nhược ñộc chủng C trên

môi trường nuôi cấy tế bào 60

4.12: Kết quả kiểm tra tính sinh miễn dịch các lô vacxin ñậu gà C trên

môi trường nuôi cấy tế bào 62

4.14: Kết quả ñánh giá ñộ dài miễn dịch ñậu gà sau khi tiêm vacxin

bằng phương pháp công cường ñộc 66

4.15: Kết quả nghiên cứu thời gian bảo quản vacxin ñậu gà 68

chủng C trên môi trường nuôi cấy tế bào 68

DANH MỤC HÌNH

4.1: Bệnh tích tế bào do virus ñậu gà nhược ñộc chủng C gây ra 40

4.2: Tế bào xơ phôi gà một lớp không gây nhiễm virus 40

4.3: Hiệu giá virus ñậu gà sau các lần cấy chuyển 43

4.4: Sơ ñồ quy trình sản xuất vacxin nhược ñông khô ðậu gà bằng

công nghệ nuôi cấy tế bào 48

4.5: Hiệu giá virus ñậu gà của các liều gây nhiễm 52

4.6: Hiệu giá virus tại các thời ñiểm sau khi gây nhiễm virus ñậu gà

chủng C trên môi trường nuôi cấy tế bào 53

4.7: Kết quả kiểm tra ñộ ẩm và ñộ chân không của vacxin ñậu gà tế

1 MỞ ðẦU

1.1 ðẶT VẤN ðỀ

ðậu gà là một bệnh truyền nhiễm lây lan nhanh với các biểu hiện ñặc trưng là hình thành và xuất hiện các nốt ñậu ở mào, tích, mép mỏ, mí mắt, da chân và màng giả ở niêm mạc vòm họng, hầu của gà

Bệnh ñậu gà là bệnh virus chung của gia cầm (gà, gà tây) và các loài chim (cả chim nuôi và chim hoang dã) Theo các tác giả Bolte, A L J Meurer, E F và Kaleta [17] thì có khoảng 9.000 loài chim ñã bị nhiễm bệnh

tự nhiên với virus ðậu Bệnh gây ra bởi virus ADN thuộc nhóm Avipoxvirus,

họ Poxviridae Bệnh phân bố rộng khắp trên toàn thế giới Bệnh gây ảnh hưởng nghiêm trọng ñến kinh tế ñối với các ñàn gia cầm vì nó gây giảm sản lượng trứng ñối với các ñàn gà ñẻ, gây giảm sự tăng trưởng ñối với các ñàn gia cầm non và gây tỷ lệ chết ñáng kể ñối với tổng ñàn

Bệnh ñậu gà là một bệnh lây lan với những ñặc trưng của bệnh là hình thành những nốt ñậu hoặc vẩy ở những vùng da không có lông (gọi là thể ngoài da) hoặc hoại tử fibrin và các bệnh tích tăng sinh ở lớp màng nhầy của ñường hô hấp trên, miệng, thực quản (gọi là thể thực quản) Gia cầm bị bệnh ñậu có thể bị ở thể ngoài da hoặc thể bạch hầu hoặc có thể bị cả hai thể cùng lúc

ðối với thể ngoài da, tỷ lệ chết trong tổng ñàn thường thấp Tuy nhiên, nó lại là nguyên nhân gây ra thể bạch hầu và kế phát các bệnh truyền nhiễm khác

và gây ra tỷ lệ chết cao trong tổng ñàn

Gà con 1- 3 tuần tuổi rất mẫn cảm với bệnh Ở gà bệnh, virus ñậu có trong nốt ñậu, màng giả trong niêm mạc, virus còn có ở trong máu khi gà ñang có bệnh hoặc khi ñã khỏi bệnh Virus ñậu tồn tại lâu trong các vẩy ñậu, trong môi trường và là nguyên nhân gây bệnh cho những ñàn gà mẫn cảm khác Tỷ

lệ bệnh tăng lên ở những nơi có nhiều ñàn gà nhốt gần nhau hoặc ở những

chuồng nuôi có nhiều lứa tuổi gà khác nhau Trong ñiều kiện như vậy, nó là nguyên nhân lây nhiễm giữa các ñàn gà với nhau thông qua khí dung Chuồng trại chật trội, ñiều kiện vệ sinh không sạch sẽ là nguyên nhân cho sự lây lan của dịch bệnh

ðể phòng bệnh ñậu cho gà, biện pháp duy nhất và hiệu quả nhất là sử dụng vacxin phòng bệnh Trên thế giới cũng như ở Việt Nam ñang sử dụng hai chủng virus là chủng virus ñậu gà và chủng virus ñậu bồ câu dùng ñể chế vacxin phòng bệnh ñậu cho gia cầm Những vacxin này ñược sản xuất bằng cách gây nhiễm virus ñậu gà hoặc virus ñậu bồ câu vào màng CAM của phôi gà 9 – 11 ngày tuổi hoặc gây nhiễm vào môi trường nuôi cấy tế bào xơ phôi gà

Những khu vực có tình hình dịch tễ phức tạp và ñã có thông báo bị bệnh ñậu ñược khuyến cáo sử dụng vacxin nhược ñộc ðậu gà từ chủng virus ñậu

gà hoặc ñậu bồ câu gây nhiễm trên màng CAM của phôi gà Những vacxin này có chứa tối thiểu 105EID50/ ml ñược xác ñịnh là tạo miễn dịch tốt cho ñàn gà Tuy nhiên, những vacxin sống ñược sản xuất trên phôi sẽ gây những phản ứng nghiêm trọng nếu sử dụng không ñúng cách Vacxin ðậu

gà ñược sản xuất trên màng CAM ñược sử dụng theo phương pháp chủng cánh cho gà 4 tuần tuổi và gà mái 1 – 2 tháng tuổi trước khi bắt ñầu ñẻ Tái chủng cho gà mái trước lứa ñẻ thứ 2 nhưng không ñược sử dụng vacxin trong khi gà ñang ñẻ

Vacxin virus ñậu gà nhược ñộc sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy tế bào sử dụng hiệu quả ở gà con một ngày tuổi và có thể sử dụng cùng lúc với vacxin phòng bệnh Marek Theo các tác giả Mayr and Danner [22] vacxin ñậu

gà sản xuất bằng phương pháp nuôi cây tế bào có thể sử dụng tốt theo ñường cho uống nếu hiệu giá virus trong vacxin chứa tối thiểu 106 – 108 TCID50/ ml Nagy và cộng sự [23] cũng ñã chứng minh rằng gà một ngày tuổi ñược sử dụng vacxin theo ñường cho uống cũng ñạt hiệu quả miễn dịch khi nồng ñộ virus ñạt 106 TCID50/ ml Như vậy, công nghệ sản xuất vacxin ðậu bằng

phương pháp nuôi cấy tế bào ñã khắc phục ñược những nhược ñiểm của công nghệ sản xuất vacxin bằng phương pháp nuôi cấy trên màng CAM

Hiện tại, các vacxin phòng bệnh ñậu gà ở Việt nam chủ yếu ñược sản xuất

từ trứng gà có phôi như vacxin ðậu gà chủng C của Xí nghiệp thuốc thú y Trung Ương, vacxin ðậu gà chủng Woybridge của Công ty Navetco hoặc vacxin ñậu gà chế từ chủng C Trường ðại học nông nghiệp I Hà Nội (Nguyễn Như Thanh)[13]

Xuất phát từ những luận cứ về khoa học trên, chúng tôi ñề xuất tiến hành

nghiên cứu ñề tài: “Nghiên cứu chế tạo thử nghiệm vacxin ñậu gà nhược

ñộc ñông khô chủng C trên môi trường tế bào xơ phôi gà một lớp”

1.2 MỤC TIÊU CỦA ðỀ TÀI

- Nuôi cấy thích nghi virus ñậu gà chủng C trên môi trường nuôi cấy tế

bào xơ phôi gà một lớp

- Xây dựng quy trình sản xuất vacxin ðậu gà bằng công nghệ nuôi cấy

tế bào

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 VIRUS ðẬU GÀ VÀ BỆNH ðẬU GÀ

2.1.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh ñậu

ðậu gà ñã ñược phát hiện từ lâu trên nhiều loại gia cầm Ban ñầu thuật ngữ ñậu gà bao gồm tất cả các bệnh ñậu virus của chim, nhưng ngày nay nó chỉ ñược sử dụng cho các bệnh ở ñàn gia cầm thương phẩm Lúc ñầu, Woodruff và Goadpasture [29] chứng minh rằng các tiểu phần virus trong thể

ẩn là tác nhân gây bệnh ñậu gà Sau này, người ta chứng minh rằng kháng huyết thanh kháng virus ñậu gà hình thành sau miễn dịch hoặc sau khi khỏi bệnh ñã ngưng kết một huyễn dịch các thể cơ bản của virus ñậu gà

Mô tả về thể vùi tế bào trong bệnh ñậu gia cầm Năm 1873 ñã phát hiện những tiểu thể nội bào trong tế bào biểu bì của nốt ñậu người mà Michaelis coi ñó là những thể vùi ñặc hiệu của bệnh ñậu và mô tả kỹ tiểu thể nội bào trong bệnh ñậu gà mà ngày nay ñược gọi là thể bao hàm Bollinger ñể ghi nhớ công người phát hiện

Năm 1887 lần ñầu tiên người ta thấy virus ñậu gà bằng kính hiển vi quang học Năm 1904 khám phá ra các tiểu thể nhỏ (0,25 µm) nằm rải rác trong nguyên sinh chất tế bào bong kết lại thành ñám gọi là tiểu thể bao hàm Bollinger, sự phát hiện này dẫn ñến hàng loạt những nghiên cứu về bản chất của chúng và rất nhiều công trình nghiên cứu gần ñây bằng phương pháp hóa

tổ chức học, nghiên cứu trên kính hiển vi quang học … và ngày nay người ta

ñã xác ñịnh rõ bản chất sinh học của thể vùi tế bào này

Năm 1906 mô tả tiểu thể nội bào của bệnh ñậu mùa trên tiểu bản phết Năm 1923 ñã tiến hành tiêm chủng vacxin phòng bệnh ñậu gà từ chủng giảm ñộc lực (chủng virus II ở ðức) Năm 1925 ñã nhân giống virus vacxin trên tế bào nuôi Theo Woodruff và Goodpasture [29] ñã sử dụng phôi gà ñể nuôi

cấy virus đậu và phát triển kỹ thuật nuơi cấy virus vào màng niệu đạo của phơi trứng Năm 1932 đã xác định khả năng gây nhiễm của chất qua lọc và ly tâm tiểu thể nội bào của virus đậu Năm 1954 mơ tả bệnh giống như bệnh đậu

ở muỗi Năm 1962 Bigelli mơ tả bệnh đậu ở cá Năm 1963 nghiên cứu về siêu cấu trúc của virus đậu bằng phương pháp nhuộm âm bản và soi kính hiển vi điện tử

Các nghiên cứu về đặc tính sinh học của virus đậu nĩi chung và đậu gà nĩi riêng, về cơ chế sinh bệnh, về chẩn đốn bệnh và về vacxin phịng bệnh của nhiều tác giả đã làm sáng tỏ về bệnh đậu

2.1.2 Virus ðậu gà

2.1.2.1 Phân loại

Bệnh đậu là bệnh truyền nhiễm chung cho người và nhiều lồi động vật

khác như gia súc, gia cầm, chim hoang dại, cá, do poxvirus gây ra đã được xếp trong bảng phân loại virus thuộc họ Poxviridae

Virus đậu gia cầm (gà, gà tây, chim bồ câu, chim yến, vẹt, chim cút, chim sẻ, quạ, cơng, chim cánh cụt, kền kền, sáo) là các thành viên thuộc giống Avipox virus, họ Poxviridae Virus đậu gà là lồi đặc trưng của Giống Vì tầm quan trọng của virus đậu gà đối với nền kinh tế cho nên rất nhiều nghiên cứu

cơ bản và ứng dụng về virus đậu gà đã được tiến hành, nhiều hơn bất cứ lồi nào của giống này

Theo phân loại Poxvirus chia thành 6 nhĩm

Nhĩm 1: Vaccinia và những virus tương tự

- Virus đậu người: Poxvirus variola, Variola major

- Virus đậu bị: Variola vaccinin

- Virus đậu chuột nhắt: Poxvirus muscin, Botonelivirus

- Virus đậu khỉ: Cinia virus

- Virus đậu thỏ: Poxvirus cuniculi

Nhĩm này cĩ hình thái, huyết thanh tương tự và khơng nhạy cảm với ete

Nhóm 2: Orivirus và những virus tương tự

- Virus viêm miệng mụn nước ở bò: Storatitis popriloon virus

- Virus giả ñậu bò: Pozovaccinin virus

- Virus mụn mủ truyền nhiễm dê rừng

Nhóm này có hình thái và huyết thanh giống nhau nhạy cảm với ete

Nhóm 3: Những virus xâm nhập vào móng vuốt của ñộng vật

- Virus ñậu cừu: variola ovina

- Virus ñậu dê: Variola coprina

- Virus của bò

- Virus ñậu ngựa: Variola equina

- Virus ñậu lạc ñà: Variola

Khả năng của nhóm này có thể là ñồng loại của phân nhóm 1, 2 Một số virus trong ñó nhạy cảm với ete

Nhóm 4: Virus ñậu gia cầm

- Virus ñậu gà: Poxvirus gallinae

- Virus ñậu hoàng yến: Poxvirus canavae

- Virus ñậu bồ cầu: Poxvirus coliniae

- Virus ñậu cun cút

- Virus ñậu gà tây

Nhóm này có tiểu thể nội bào lớn, trong ñó chứa chủ yếu là lipoprotein, kháng ete thường do côn trùng truyền

Nhóm 5: Myxocotoso virus

- Virus myxocotoso của thỏ

- Virus gây u xơ của thỏ Fibroxivirus

- Virus gây u xơ của sóc Bichruchen

Nhóm này nhạy cảm với ete, có thể truyền bệnh do côn trùng

Nhóm 6: Virus ñậu chưa xếp loại

- Virus ñậu lợn Variola saills

2.1.2.2 Hình thái học, cấu trúc virus ñậu gà

Cũng giống như các giống khác thuộc họ Poxviridae, tất cả các virus ñậu gà ñều có hình thái giống nhau Virus hoàn thiện (thể cơ bản) có hình viên gạch và có kích thước khoảng 230 - 280 - 200 nm Lớp ngoài ñược cấu tạo bởi một tập hợp ngẫu nhiên của các lớp ống nhỏ Virus ñậu gà bao gồm một lõi 2 mặt lõm nằm ở giữa hoặc 1 nucleoid và hai thể phụ nằm ở hai mặt lõm và ñược bao bọc bởi một vỏ

Thành phần chính của virus ñậu gà là protein, ADN và lipid Virus có trọng lượng phân tử là 2,04 – 10-14 gram và có 7,51 – 10-15 gram protein, 4,03 – 10-16 gram ADN và 5,54 -10-15 gram lipid Gần 1/3 của virus ñậu gà là lipid Thành phần lipid và choletrolester ñược phát hiện trong chế phẩm virus lấy từ

da ñầu của một con gà mắc bệnh Trọng lượng trung bình của thể bao hàm khoảng 6,1 – 10-7 mg trong ñó 50% là lipid

Virus ñậu gà không bắt màu cho thấy sự phân bố các ống nhỏ bề mặt một cách ngẫu nhiên Lớp cắt siêu mỏng của bệnh tích ñậu từ một con chim

bồ câu nhiễm bệnh tự nhiên cho thấy các tiểu phần virus có hình thái ñặc trưng của virus ñậu Lớp cắt siêu mỏng của bệnh tích ñậu gà thể bạch cầu từ một gà nhiễm bệnh cho thấy một thể bao hàm type A, trong ñó các tiểu phần virus của hình thái ñặc trưng virus ñậu ñược phân bố quanh ngoại biên của thể bao hàm (inclusion body) Sự biến ñổi các chủng về thành phần kháng nguyên

do thẩm miễn dịch của các kháng nguyên hòa tan của virus ñậu gia cầm ñã ñược ñiều chế từ các tế bào ñã gây nhiễm và các chủng virus ñậu gà 101; Ceva; Minnesita và chủng Nebreska Protein ñã ñược tách bằng phương pháp

SDS - PAGE và ựược chuyển vào nitrocellutose Các kháng nguyên virus ựược phát hiện bằng phản ứng với kháng huyết thanh kháng virus ựậu gà đã tiến hành phân tắch ựiện di trên thạch ựối với các gien của một virus vacxin, một virus ựậu gà phân lập tự nhiên, một virus tự nhiên phân lập từ ựàn chim yến và một virus vacxin phân lập từ ựàn chim cút Sau khi ựã cắt bỏ ựoạn Hind III Thể bao hàm có trọng lượng 7,69 Ờ 10-8 mg và trọng lượng trung bình của ADN của mỗi inclusion là 6.64 Ờ 10-9 mg

2.1.2.3 đặc tắnh nuôi cấy của virus ựậu gà

+ Sự nhân lên của virus

Vị trắ tế bào chất của ADN tổng hợp trong các tiểu phần virus gây bệnh rất ựặc trưng ựối với virus ựậu

Virus ựậu gà có chứa các gien chịu trách nhiệm mã hóa 1 ADN Ligase ATPGTP liên kết protein, ADN Glycosylase, ADN polymerese, ADN Topoisomerase, yếu tố sử lý DNA và Kinase nhân ựôi protein

Ngoài ra virus ựậu gà còn chứa 1 gien chịu trách nhiệm mã hóa enzyme sửa chữa ADN; CPO photolyase sửa chữa ADN do bị tia cực tắm phá hủy bằng cách sử dụng nguồn sáng như 1 nguồn năng lượng Có thể kết luận rằng enzyme này ựã giúp virus tồn tại ở các nốt bệnh tắch ở gia cầm và trong môi trường Sự nhân lên của virus ựậu gia cầm xuất hiện tương tự như trong biểu

mô của gà, trong tế bào biểu mô của màng niệu nang của phôi gà ựang phát triển và ở tế bào da của phôi Tuy nhiên sự khác nhau trên các tế bào vật chủ

và các chủng virus có thể tác ựộng ựến thời gian nhân lên của virus Sự tổng hợp sinh học của virus ựậu gà trong biểu mô bao gồm 2 pha khác nhau: sự ựáp ứng của vật chủ ựặc trưng bởi tăng sinh tế bào trong suốt 72h ựầu tiên và

sự tổng hợp của virus gây bệnh từ 72 - 96h sau khi nhiễm bệnh

Sự nhân lên của ADN virus trong biểu bì bắt ựầu giữa 12 và 24h sau khi nhiễm bệnh và tiếp theo là sự xuất hiện của virus gây bệnh sau ựó Sự tăng sinh của biểu mô kéo dài từ 36 - 48h sau nhiễm bệnh và kết thúc với một

sự tăng số lượng tế bào lên 2,5 lần trong 72h sau nhiễm bệnh Tỷ lệ tổng hợp ADN virus trong 60h ñầu là thấp Sự tăng tỷ lệ tổng hợp ADN virus xuất hiện

từ 60 - 72h sau nhiễm bệnh ñi kèm với một sự suy giảm rõ nét vì sự tổng hợp ADN tế bào Từ 72 - 96h sau nhiễm bệnh, sự tổng hợp của ADN virus trở nên mãnh liệt hơn, và không còn thấy sự tăng sinh của tế bào nữa Theo Swallen [28] ñã thực hiện ñiều này bằng cách sử dụng phương pháp chạy tia phóng xạ biểu mô nhiễm bệnh của gà với virus ñàn gà trong 48h cho thấy tăng gấp 3 lần

về nucleic so với ñối chứng, chứng tỏ rằng bệnh ñậu gà có liên quan việc tác ñộng ñến tổng hợp ADN trong nhân Cả 2 loại ADN và ARN virus ñều ñược phát hiện trong nhân của các tế bào nhiễm bệnh sau 24 - 72h Sự gây nhiễm tế bào da phôi gà cho kết quả tăng hiệu giá virus tại thời ñiểm 16h sau khi gây nhiễm với bệnh tích tế bào rõ ràng (CPE) Mặc dù hiệu giá virus tế bào tăng suốt 20h tiếp theo, nhưng sau ñó sẽ giảm ở thời ñiểm 36 - 48h sau gây nhiễm Hiệu giá của virus tăng tổng cộng lên 100 lần trong suốt quá trình phát triển

Sự nhân lên của ADN virus ñậu gà trong tế bào vật chủ xuất hiện từ 12 - 16h sau nhiễm bệnh và tiếp tục kéo dài ñến 48h Bộ gien của virus ñậu gà bao gồm 6 gien với chức năng tăng cường protein giả ñịnh: những gien này bao gồm 3 protein Kinase (PK), 1 tyrosine PK, 1 metalls protease và 1 protein phophatse Những gien này có trong protein virus trong quá trình tập hợp virus xử lý protein virus và tạo hình thái virus Dựa trên những phân tích trình

tự gien gần ñúng thì virus ñậu gà mã hóa ít nhất 31 protein cấu trúc virus vacxin một cách tương ñồng và ñều liên quan ñến các tiểu phần virus hoàn thiện nội bào Trong số những protein này, 12 protein nằm ở vị trí trong lõi và

7 protein liên quan ñến màng 3 protein liên quan ñến các virion ñược bao bọc bởi tế bào Ngoài ra còn có sự tương ñồng của 5 protein ñại diện cho 2 họ gien virus ñược duy trì và có các chức năng cấu trúc trong virus ñậu Ngoài ra virus ñậu còn chứa ñồng ñẳng của các protein bao hàm type A Những inclusion này sẽ bảo vệ các virion hoàn thiện khỏi tác ñộng của môi trường và

hỗ trợ cho virus sống lâu trong môi trường tự nhiên Sự bền vững của virus trong môi trường tự nhiên có thể còn ñược hỗ trợ bởi sự có mặt của Photolyase và Glutashion peroxidase Các nghiên cứu về siêu cấu trúc ñã tập trung vào hình thái của virus trong các giai ñoạn phát triển khác nhau ñể tạo nên các virus hoàn thiện Sau khi virus ñậu gà hấp phụ và xâm nhập vào màng

tế bào có trong vòng một giờ sau khi gây nhiễm cho biểu mô và một tiếng sau khi gây nhiễm màng niệu nang, virus tách khỏi lớp vỏ và tổng hợp nên môt virus mới từ vật chất tiền nhiệm Một số virus nhỏ và một số virus không hoàn thiện ñã ñược quan sát ở thời ñiểm 12h sau gây nhiễm Số lượng virus tăng lên và có nhiều virus chưa hoàn thiện sau 16h sau gây nhiễm Mặc dù từ

16 - 66h sau gây nhiễm phần lớn các tiểu phần virus xuất hiện ñều là virus chưa hoàn thiện, nhưng vẫn có thể quan sát ñược tất cả các bước tiếp theo của quá trình tạo hình thái virus Chỉ có một số ít virus không hoàn thiện nội bào ñược phát hiện sau 41h gây nhiễm, trong ñó một số ñã hoàn tất hoặc ñược bao bọc từng phần và trong quá trình trở thành virus nội bào có vỏ bọc Các virus không hoàn thiện cũng ñược tìm thấy trong các tập hợp tế bào màng Sự tăng lên của các tiểu phần virus gắn màng plasma ñưa ra giả thiết là virus ñậu gà thoát ra khỏi tế bào chủ yếu là do sự nẩy chồi Các thể bao hàm xuất hiện 72h sau gây nhiễm biểu mô và 96h sau gây nhiễm màng niệu nang Những inclusion type A có thể chứa các virus ñậu gà, ñậu yến, ñậu bồ câu và có thể bởi tất cả các virus ñậu gia cầm Mặc dù virus ñậu chủ yếu ñược tập hợp trong cytoplasma của các tế bào nhiễm bệnh, nhưng Gafford và Ramdall [19] ñã phát hiện thấy các lõi ñều tham dự vào các quá trình nhân lên của virus ñậu,

vì ñã phát hiện thấy ARN và ADN virus trong lõi của các tế bào nhiễm bệnh

24 - 72h sau gây nhiễm Một ñiều thú vị là một virus ñậu gia cầm ñược phân lập từ sẻ Nam Mỹ ñã tạo các inclusion lõi ngoài các inclusion cytoplasma Tuy nhiên trong các inclusion nội nhân không có các tiểu phần virus

+ Nuôi cấy trên phôi trứng

Cấy vào màng nhung niệu của phôi thai gà ấp 10-12 ngày, dùi một lỗ ở buồng hơi và một lỗ tiêm cách xa thai và mạch máu, lỗ thứ hai này rất nông, không xuyên qua niệu mô, nhỏ một giọt nước sinh lý vào lỗ tiêm, dùng một quả bóng cao su hình lê hút hơi ở túi hơi ra hết làm tách niệu mô với vỏ mềm Sau ựó dùng ống tiêm và kim tiêm ngắn, nhỏ, hút huyễn dịch virus ựậu (màng nhung niệu chứa virus ựậu gà hòa với nước muối sinh lý thành huyễn dịch 1/10) ựâm kim vào rất nông, vừa bơm huyễn dịch vừa xoay Sau ựó ựể vào tủ

ấm 370C trong 4 - 5 ngày, hàng ngày soi trứng, thai nào chết thì loại ra, giữ thai sống ựến ngày thứ 5 Mổ phôi thai, xem bệnh tắch thấy màng nhung niệu dày ra, giống gelatin và có nhiều ựốt ựậu trắng

+ Nuôi cấy trên môi trường tế bào

Plaque: đã quan sát ựược sự khác nhau trong khả năng tạo màng của

virus ựậu gà Việc cấy chuyển virus trên môi trường tế bào là cần thiết, bởi vì không phải tất cả các chủng virus ựều tạo màng Việc hình thành Plaque trên

tế bào sơ phôi gà ựơn lớp ở một số virus ựậu gia cầm ựược biểu hiện ựiển hình và ựược xem là một phương tiện ựể phân loại virus Các Plaque hình thành 3 - 4 ngày sau gây nhiễm tế bào chim cút với một số chủng nhất ựịnh virus ựậu gà sau khi ựã cấy chuyển

Sau khi gây nhiễm virus cho tế bào từ 24 - 72 giờ rồi quan sát trên kắnh hiển vi quang học thấy xuất hiện bệnh tắch tế bào Ở giai ựoạn ựầu trong nguyên sinh chất tế bào xuất hiện những không bào và những tiểu thể bao hàm với kắch thước to nhỏ khác nhau, sau ựó sự thoái hóa của các tế bào, tế bào co ngắn lại nguyên sinh chất thu hẹp và cuối cùng màng tế bào bị tan vỡ

ra không còn ranh giới giữa các tế bào

2.1.2.4 Sức ựề kháng

Sức ựề kháng với ether ựược liệt vào một trong các tiêu chuẩn phân loại ựối với virus ựậu Trong khi một số tác giả cho rằng virus ựậu mẫn cảm với cả

ether và chloroform, thì một số khác lại cho rằng một virus ựậu bồ câu và 2 biến thể của nó có sức ựề kháng với cả ether và chloroform Virus ựậu gà ựược biết là chịu ựược dung dịch pheno 11% và dung dịch formelin 1% trong

9 ngày nhưng sẽ bị vô hoạt bằng dung dịch KON 1% nếu nó ựược giải phóng khỏi tế bào Virus cũng bị vô hoạt ở nhiệt ựộ 500C trong 30 phút hoặc 600C trong 8 phút Trypsin không có tác dụng với ADN của virus hoặc cả virus Ở môi trường khắ virus có sức ựề kháng ựáng kể Nó có thể tồn tại ở da khô hàng tháng, thậm chắ hàng năm

2.1.3 Bệnh ựậu gà

2.1.3.1 Loài mắc bệnh

Bệnh ựậu gà do virus ADN thuộc chi Avipoxvirus, họ Poxviridae gây

ra trên phạm vi toàn cầu Có rất nhiều dòng virus ựậu gia cầm (avian pox) khác nhau và dòng tấn công gà và gà tây ở mọi lứa tuổi thường ựược gọi là ựậu gà (fowlpox) Bồ câu bị tấn công bởi một dòng virus ựậu khác và hai dòng ựậu này nhìn chung không lây nhiễm lẫn nhau Trong khoảng 9000 loài chim có khoảng 232 loại trong 23 dòng ựược biết bị nhiễm virus ựậu gà tự nhiên như gà, gà tây, chim bồ câu, chim yến, vẹt, chim cút, chim sẻ, quạ, công, chim cánh cụt, kền kền, sáoẦ

2.1.3.2 Lứa tuổi mắc bệnh

Bệnh ựậu gà xảy ra ở mọi lứa tuổi ở gà, tuy nhiên gà con 1 - 3 tháng rất cảm nhiễm với bệnh

2.1.3.3 đường xâm nhập và cách lây truyền

Sự truyền bệnh là do tiếp xúc trực tiếp giữa gà bệnh với gà khỏe, hoặc

do dụng cụ chăn nuôi bị ô nhiễm Căn bệnh thường xâm nhập qua da ở những chỗ xây sát dù nhỏ cũng tạo thuận lợi cho virus gây bệnh Phương thức này ựã ựược nhiều tác giả chứng minh và mô tả, không cần phải tranh luận đã từ lâu

có ý kiến cho rằng các côn trùng hút máu cũng có thể là một phương thức truyền bệnh, bằng thực nghiệm các tác giả và nhận thấy ruồi và muỗi các

giống khác nhau sau khi ñược nuôi bằng chất liệu chứa virus có khả năng truyền bệnh cho những vật khỏe sau nhiều tuần lễ

Bệnh xảy ra ở các nước trên thế giới, thường vào mùa khô (thu ñông) những năm bệnh phát mạnh có thể xảy ra vào mùa hè thu ở Úc (Lee và cộng sự)[21] chủ yếu là dịch ñịa phương, nhưng cũng có thể thành dịch lớn như ở Bắc Phi Thể bệnh ngoài da thường thấy ở xứ nóng, thể yết hầu thấy ở xứ lạnh

Sau khi xâm nhập vào da và niêm mạc, virus gây nhiễm tế bào cảm thụ

và gây bệnh biến cục bộ, với các chủng có ñộc lực cao thì sau khi sinh sản tại chỗ virus xâm lấn sang các tổ chức xung quanh rồi vào máu gây nhiễm trùng huyết và lan sang các phủ tạng, nhưng trong các cơ quan thực thể virus không sinh sản mạnh và không gây nên các biến ñổi bệnh lý

Trong trường hợp bệnh xảy ra ở thể ñiển hình thì sau khi sinh sản tại nơi xâm nhập, virus sẽ vào máu gây nhiễm trùng huyết sơ phát rồi vào các cơ quan thực thể tăng cường sinh sản và gây thoái hóa các tế bào tổ chức, nếu quá trình bệnh lý nặng thì gia cầm có thể chết trong giai ñoạn này Nếu cơ thể chịu ñựng ñược thì từ phủ tạng, virus lại trở vào máu gây nhiễm trùng huyết thứ phát, sau ñó theo máu ñến toàn thân xuất hiện bệnh tích ñiển hình của bệnh ñậu (biểu hiện ở da và niêm mạc), tại các cơ quan khác virus không nhân lên mạnh mẽ, nhưng khả năng tồn tại của virus lâu

Tổn thương thuần túy do virus ñậu gây ra thường nhẹ và dễ lành, nhưng

do tiếp xúc và tái nhiễm thì bệnh nặng “những tổn thương lớn và dai dẳng là hậu quả của nhiễm trùng thứ phát”

2.1.3.4 Triệu chứng lâm sàng

Bệnh ñậu gà thường có 3 thể : thể ngoài da (mụn ñậu), thể niêm mạc (yết hầu, màng giả) và thể hỗn hợp, thời gian nung bệnh trung bình từ 4-8 ngày, thời gian này có thể thay ñổi tùy theo hoạt lực của virus

- Thể mụn ñậu ngoài da : Mụn ñậu thường mọc ở da vùng ñầu như mào, yếm, khóe mắt, khóe miệng và một số nơi ít lông như mặt trong cánh, da chân,

Mụn ñậu bắt ñầu bằng những nốt sần nhỏ, màu nâu xám hay ñỏ xám, nốt sần to dần bằng hạt thóc, hạt ñậu, nếu mọc gần nhau nốt ñậu sẽ làm da sần sùi, nốt ñậu mọc ở khóe mắt làm gà khó nhìn, gây viêm kết mạc, chảy nước mắt, nốt ñậu có thể bịt kín lỗ mũi làm con vật khó thở, nếu mọc ở khóe mồm, con vật sẽ ñau ñớn khi mổ thức ăn

Màu sắc nốt ñậu cũng biến ñổi dần, từ màu nâu sẫm ban ñầu biến thành màu vàng xám, do các tế bào bên trong bị dung giải nên mụn ñậu mềm dần rồi vỡ ra và chảy một chút mủ sánh như kem mụn ñậu khô, ñóng vẩy, vẩy màu nâu sẫm, ñầu sần bị bóc ñi ñể lại những nốt sẹo nhỏ màu vàng xám

Trường hợp mụn ñậu bị nhiễm trùng thì quá trình viêm và hoại tử ở da

sẽ trở nên trầm trọng

- Thể niêm mạc (yết hầu, màng giả) thể này thường mắc ở gà con, những triệu chứng ñầu tiên là hiện tượng cảm mạo khó thở, ủ rũ, biếng ăn do niêm mạc miệng – hầu họng bị ñau, con vật sốt, từ miệng chảy ra một chất nước nhớt có mủ lẫn màng giả, nếu vạch mồm con vật thấy trên niêm mạc gốc lưỡi, khóe mồm, vòm miệng, niêm mạc hầu họng và thanh quản phủ một lớp màng giả màu vàng xám Khi màng giả bóc ra sẽ ñể lại niêm mạc màu ñỏ tươi, bên cạnh các ñám màng giả thường là những vùng niêm mạc mới bị bệnh tế bào thượng bì tăng sinh, sưng lên tạo thành những chấm ñỏ xám, dần dần những ñám viêm này lan ra và dầy lên hình thành màng giả

Quá trình viêm thường bắt ñầu ở niêm mạc hầu họng, sau lan ra niêm mạc mũi mắt Viêm mũi làm gà chảy nước mũi, nếu màng giả bịt kín cả xoang mũi sẽ làm con vật ngạt thở Nếu viêm vùng tiếp hợp con vật chảy nước mắt ñặc có fibrin rồi dần dần biến thành một chất mủ màu vàng xám che kín cả mắt, trường hợp nặng gà có thể bị mù mắt

- Thể yết hầu hay kéo dài, do các loại vi khuẩn ký sinh trên các niêm mạc gây quá trình viêm kết phát Bệnh ở thể này thường nặng, tỷ lệ chết khá cao

Thể hỗn hợp thường thấy ở gà con thể hiện cả hai thể bệnh trên cùng con vật làm cho bệnh nặng thêm thường dẫn tới những biến chứng,

tỷ lệ chết cao

Về giải phẫu bệnh chủ yếu là do tăng sinh các tế bào biểu mô của lớp Malpighi và sau ñó là biến chứng của những tổn thương này do sự nhiễm trùng thứ phát

Bệnh tích bên trong quan sát kỹ thấy các phủ tạng thoái hóa nhẹ, thận lách hơi sưng, gan thoái hóa, niêm mạc khí quản, phế quả phổi bị xung huyết, viêm xuất huyết và bị phủ một lớp màng giả

2.1.2.5 Bệnh tích

Gà ốm gầy, nổi mụn ñậu trên da, viêm cata ở niêm mạc miệng , thanh quản Các vết viêm này loang dần thành các nốt phồng, dày dần lên cuối cùng tạo thành lớp màng giả dính chặt vào niêm mạc Niêm mạc ruột có thể tụ máu

ñỏ từng ñám Phổi tụ máu và tích nước Khí quản chứa nhiều dịch xuất lẫn bọt

Bệnh tích ñặc trưng của bệnh ñậu gà thể da là sự tăng sinh ở biểu mô

và ở nang lông với sự hình thành các nốt lúc ñầu là các nốt trắng sau ñó nhanh chóng to lên và biến màu vàng Ở các gà mắc bệnh trong da, ngày thứ 4 xuất hiện một số bệnh tích nguyên phát Vào ngày thứ 5 và thứ 6 hình thành các nốt mủ Tiếp theo là giai ñoạn mụn nước, kèm theo sự hình thành các bệnh tích dày, các nốt bệnh tích liền nhau có thể hợp lại và trở nên thô ráp và có màu xám hoặc nâu thẫm Sau 2 tuần hoặc thỉnh thoảng sớm hơn bệnh tích có các vùng viêm sưng và xuất huyết Hình thành vảy trong vòng 1- 2 tuần kế tiếp, kết thúc bằng việc bong vảy Nếu vảy bong sớm có dịch chảy ra khắp vùng lấm tấm xuất huyết Khi vảy bong tự nhiên, một sẹo tròn có thể xuất

hiện, ở trường hợp nhẹ sẹo cĩ thể khơng nhìn rõ Các virus vacxin nhược độc tạo ra các bệnh tích cục bộ, các bệnh tích này nhẹ hơn so với các bệnh tích do các chủng độc lực gây nên

Ở thể bạch hầu sẽ hình thành các nốt đục hoặc các đốm vàng trên niêm mạc miệng, thực quản, lưỡi và khí quản Các nốt nhanh chĩng to lên và thường hợp lại trở thành các màng màu vàng, hoại tử bạch hầu hoặc giả bạch hầu Nếu màng bị bơng, sẽ cĩ máu chảy

Ở gà lớn (mái hoặc trống) thường mắc thể màng giả yết hầu Chỗ cĩ màng giả lúc đầu sưng đỏ, cĩ nhiều nước nhờn, bệnh nặng, màng giả dày đặc làm gà khĩ thở và chết

2.1.3.6 Chẩn đốn

Vì các bệnh tích ở khí quản của gà đều cĩ thể xuất hiện ở đậu gà và virus viêm thanh khí quản truyền nhiễm nên thể bạch hầu của đậu gà với các triệu chứng hơ hấp phải được phân biệt với bệnh viêm thanh khí quản truyền nhiễm Ở trường hợp viêm thanh khí quản truyền nhiễm các inclusion nhân sẽ được phát hiện trong biểu mơ của khí quản Các bệnh tích ở gà do panhthenie acid hoặc độc tố T2 cĩ thể bị nhầm với các bệnh tích ở đậu gà Trường hợp bệnh tích đậu bạch hầu ở bồ câu cĩ thể nhầm với bệnh tích do Trichomonas galline gây ra, loại này cĩ thể phát hiện bằng chẩn đốn trên tiêu bản kính hoặc bằng nuơi cấy

+ Chẩn đốn bằng phản ứng trung hịa

Phản ứng trung hịa virus trên tế bào hoặc trên phơi gà cĩ thể được sử dụng, tuy nhiên quy trình này khơng thuận tiện như các phản ứng thường quy

+ Chẩn đốn bằng kháng thể huỳnh quanh, Immunoperodidase và ELISA

Các phản ứng miễn dịch huỳnh quang và immunoperodidase sẽ phát hiện các thể bao hàm trong tế bào chất trong các tế bào nhiễm virus bắt màu

ựặc hiệu Trong phản ứng trực tiếp, ựầu tiên kháng thể kháng virus ựậu gà ựược ủ với kháng nguyên có trong các tế bào phơi nhiễm và sau ựó kháng thể gắn kết sẽ phản ứng với kháng thể gắn với perozidase hoặc isothiocynate lần thứ 2 kháng lại gamma globulin của gà Gần ựây ELISA là phản ứng ựược chọn ựể xác ựịnh sự ựáp ứng kháng thể dịch thể, 1 sự ựáp ứng kháng thể sẽ ựược phát hiện từ 7-10 ngày sau gây nhiễm

+ Chẩn ựoán bằng phản ứng PCR

Trình tự ADN gien virus ựậu gà với các kắch thước khác nhau có thể ựược khuyếch ựại bằng phản ứng PCR có dòng mồi ựặc hiệu Phản ứng này rất công dụng khi chỉ có 1 lượng virus cực nhỏ hiện diện trong mẫu Trong trường hợp có nhiều bệnh hỗn hợp, các ựoạn với kắch thước khác nhau có thể ựược khuyếch ựại trong phản ứng PCR ựơn có sử dụng các ựoạn mồi ựặc hiệu Thắ dụ thể bạch hầu của bệnh ựậu gà và bệnh viêm thanh quản truyền nhiễm cùng có các triệu chứng lâm sàng giống nhau và ựều gây bệnh tắch ở khắ quản Dùng các ựoạn mồi ựặc hiệu virus có thể phát hiện ựược các bệnh này Gồm dùng PCR còn ựược dùng ựể phân biệt các chủng virus ựậu gà vacxin và virus ựậu tự nhiên vì virus tự nhiên có chứa tiền virus nguyên vẹn

còn các chủng vacxin chỉ chứa các trình tự LTR (Long Terminal Repeat)

2.2 MIỄN DỊCH HỌC CỦA BỆNH đẬU GÀ

2.2.1 Các loại miễn dịch chống bệnh ựậu gà

2.2.1.1 đáp ứng miễn dịch không ựặc hiệu

Khả năng ựáp ứng miễn dịch không ựặc hiệu của gà ựối với virus ựậu

gà thể hiện bằng sự sản sinh các chất miễn dịch không ựặc hiệu, bao gồm:

* Interferon: Là một chất do tế bào sinh ra có tác dụng ức chế sự nhân

lên của virus bằng cách giải thoát sự khống chế việc tổng hợp protein kháng virus Protein này có khả năng khống chế sự phiên dịch các thông ựiệp của virus ở Ribosome của tế bào

* Tế bào NK: Tăng cường hoạt ựộng diệt những tế bào ựã bị nhiễm

virus do chúng có một phần tử KIR (Killer cell Inhibitory Receptor) có tác dụng giúp chúng tiếp xúc với tế bào ựắch (tế bào bị nhiễm virus) làm ức chế tắn hiệu hoạt hóa và dung giải tế bào ựắch Vũ Triệu An [1]

* Các loại bổ thể có vai trò khởi phát viêm và opsonin hóa các yếu tố

gây bệnh Từ ựó tạo ựiều kiện cho các tế bào thực bào bắt nuốt, tiêu diệt và

trình diện kháng nguyên

2.2.1.2 đáp ứng miễn dịch ựặc hiệu

Khoảng 7 - 10 ngày sau chủng vacxin ựàn gà ựã ựược kiểm tra sự Ộtiếp nhậnỢ vacxin Sự tiếp nhận vacxin bao gồm nốt sưng của da hoặc có vảy ở vị trắ chủng vacxin và là bằng chứng chứng tỏ ựã tiêm chủng thành công Bình thường miễn dịch sẽ hình thành từ 10 - 14 ngày sau tiêm chủng Nếu vacxin ựược tiêm chủng ựúng cách cho các gà mẫn cảm thì phần lớn gà sẽ tiếp nhận vacxin Ở những ựàn gà lớn ắt nhất 10% số gà phải ựược kiểm tra ựộ tiếp nhận vacxin cho 1 gà ựã có miễn dịch, việc sử dụng vacxin kém hiệu lực hoặc tiêm chủng không ựúng cách

Có thể phân biệt ựặc tắnh gây bệnh và tắnh sinh miễn dịch :

- Virus ựậu gà : gây bệnh cho gà và gà sao, gây bệnh nhẹ cho gà tây, còn với bồ câu chỉ gây phản ứng nhẹ tại chỗ, sau khi gây nhiễm virus ựậu gà cho bồ câu, trở thành virus ựậu bồ câu, nhưng vẫn giữ ựược ựặc tắnh sinh miễn dịch ựối với gà, nên có thể dùng chủng này ựể chế vacxin phòng bệnh

- Virus ựậu bồ câu : chỉ gây bệnh cho bồ câu, còn trên gà và gà tây, thậm chắ cả vịt nếu tiêm truyền virus liên tiếp nhiều ựời qua phôi gà sẽ làm tăng tắnh miễn dịch của virus ựậu bồ câu nhưng không làm tăng tắnh miễn dịch cho gà

- Virus ựậu gà tây : gây bệnh nặng cho gà tây, gây bệnh cho gà, bồ câu

và vịt, về ựặc tắnh miễn dịch có liên hệ họ hàng chặt chẽ với virus ựậu bồ câu,

virus ñậu gà tây gần với virus ñậu gà, ñộc với gà nhưng không ñộc với bồ câu,

nó gây tổn thương ở cục bộ Virus ñậu gà và ñậu bồ câu có khả năng gây miễn dịch chống virus ñậu gà tây, về khả năng giết phôi gà của virus này kém hơn so với 2 virus ñậu gà và ñậu bồ câu

- Virus ñậu chim kim tước: chủ yếu gây bệnh cho loài chim này, gây bệnh nhẹ cho bồ câu, và gây phản ứng nhẹ tại chỗ cho gà, gà tây nhưng chỉ gây miễn dịch cho chính nó mà thôi

2.2.1.3 ðộ dài miễn dịch

Khi ñưa vacxin vào cơ thể, kháng thể chưa sinh ra ngay lập tức mà phải sau một thời gian tiềm tàng, dài hay ngắn phụ thuộc vào kháng nguyên chứa trong vacxin và sự xâm nhập của kháng nguyên vacxin lần ñầu hay lần thứ hai, thứ ba, Sau ñó kháng thể mới ñược sinh ra, lượng kháng thể tăng dần, ñạt mức cao nhất sau 2 - 3 tuần rồi giảm dần và mất ñi sau vài tháng hoặc vài năm

Sử dụng vacxin lần ñầu ñáp ứng miễn dịch ñược gọi là sơ cấp hay tiên phát Sử dụng vacxin lần hai ñáp ứng miễn dịch gọi là thứ cấp hay thứ phát Trong ñáp ứng miễn dịch thứ phát, thời gian tiềm tàng ngắn hơn, lượng kháng thể sinh ra nhiều hơn và thời gian xuất hiện kháng thể sớm hơn

Sự khác biệt của ñáp ứng miễn dịch sơ cấp và thứ cấp là do vai trò của các tế bào nhớ miễn dịch Trong ñáp ứng miễn dịch thứ cấp, các tế bào này phát triển nhanh và mạnh, tạo ra một lớp tế bào sản xuất kháng thể nhanh và nhiều hơn nên kháng thể xuất hiện sớm, hàm lượng nhiều hơn rõ rệt Nếu cách lần dùng vacxin ñầu 3 - 4 tuần, sử dụng tiếp lần thứ hai thì ñáp ứng miễn dịch sẽ nhanh hơn, mạnh hơn, có thể gấp hàng trăm lần và thời gian miễn dịch dài hơn ðây là cơ sở khoa học cho việc tiêm phòng vacxin nhắc lại tạo mức

ñộ miễn dịch cao cho cơ thể

Khi kiểm tra hàm lượng kháng thể trong cơ thể ñã sử dụng vacxin kết hợp với phương pháp công cường ñộc, người ta nhận thấy rằng không phải

kháng thể cứ xuất hiện trong máu là con vật ñược bảo vệ khỏi sự tấn công của mầm bệnh cường ñộc mà lượng kháng thể phải ñạt ñến một trị số nhất ñịnh thì cơ thể mới có mức ñộ miễn dịch bảo vệ Trị số kháng thể này ñược gọi là ngưỡng bảo hộ Hàm lượng kháng thể càng cao hơn ngưỡng bảo hộ thì mức

ñộ miễn dịch của cơ thể càng cao và ngược lại

Mỗi loại vacxin khi ñưa vào cơ thể sẽ gây ra ñáp ứng miễn dịch và trạng thái miễn dịch ở ñộng vật ñược duy trì một thời gian nhất ñịnh gọi là ñộ dài miễn dịch Tùy từng loại vacxin mà thời gian này dài ngắn khác nhau, khi hết thời gian ñó cơ thể không còn khả năng chống lại mầm bệnh nữa, vì vậy người ta phải tiến hành tái chủng

Như vậy, ñể duy trì ñáp ứng miễn dịch và nâng cao khả năng miễn dịch, cứ khoảng một thời gian nhất ñịnh nên tái chủng vacxin một lần cho ñộng vật tùy theo loại vacxin, tùy theo loài ñộng vật và tình hình dịch tễ

2.3 NHỮNG YÊU CẦU CƠ BẢN TRONG SẢN XUẤT VACXIN ðẬU

GÀ

Vacxin ñậu gà tế bào ñược sản xuất ñều phải áp dụng ñầy ñủ các tiêu chuẩn chung áp dụng cho các loại vacxin, ñồng thời cũng phải có những yêu cầu riêng áp dụng cho vacxin nhược ñộc

ðối với việc sản xuất vacxin nói chung và vacxin ñậu gà tế bào nói riêng, việc xác ñịnh chủng cường ñộc ñể kiểm tra hiệu lực là rất quan trọng Chủng cường ñộc phải ñược thiết lập từ những virus có tính tương ñồng kháng nguyên với virus có mặt trong vacxin ðối với virus cường ñộc ñậu gà, hiện nay ñược biết ñến ñể sử dụng kiểm tra hiệu lực cho vacxin nhược ñộc

2.3.1 Virus giống và các ñặc ñiểm của virus giống

Hệ thống lô giống (Seed lot System) ñược sử dụng cho mọi loại giống

ñể sản xuất vacxin, kể cả các chủng cường ñộc ñể tạo ra những lô giống có nguồn gốc rõ ràng và không tạp nhiễm với các chủng khác Bảo quản riêng rẽ

giữa các chủng, ñặc biệt với chủng cường ñộc Trước khi tiến hành sản xuất vacxin, giống phải ñược kiểm tra các chỉ tiêu thuần khiết, vô trùng, an toàn và hiệu lực Giống ñậu gà chủng C ñược giữ dưới dạng ñông khô và bảo quản ở nhiệt ñộ - 85oC

2.3.1.1 Phương pháp nuôi cấy

Tất cả những virus giống ñược gây nhiễm và phát triển trên màng nhung niệu của phôi gà ñang phát triển hoặc trong môi trường tế bào thích hợp

Trứng gà sử dụng ñể gây nhiễm virus giống phải lấy từ những ñàn gà sạch bệnh, có nguồn gốc rõ ràng

Nguyễn Như Thanh, Trần Khâm [7] ñã dùng giống ñậu gà nhược ñộc

tự nhiên (chủng C) của Hungary ñể chế tạo vacxin qua màng nhung niệu phôi

gà ấp 13 ngày và ñã thông báo về các chỉ tiêu an toàn ñối với các lứa tuổi gà

và hiệu lực ñạt từ 80 – 95,3% (Khoa học kỹ thuật nông nghiệp số 7/1975)

Nguyễn Như Thanh, Trần Khâm [9] ñã nghiên cứu chuẩn ñộ giống gốc (virus ñậu gà chủng C) ñể xác ñịnh liều phân giống thích hợp trên màng nhung niệu của phôi gà ấp 11 - 13 ngày, ñể có tỷ lệ phôi sống sau 3 và 6 ngày

là cao nhất, ñồng thời có bệnh tích ñiển hình nhất, các tác giả cho biết với ñộ pha loãng giống là 10-2 thì tỷ lệ phôi sống sau 3 ngày là 78,65 ± 1,29, sau 6 ngày là 51,0 ± 1,2 (Kỷ yếu nghiên cứu khoa học Trường ðại học Nông nghiệp I, 1977-1978) với liều nhân giống này các tác giả ñã xây dựng quy trình sản xuất nhiều lô vacxin ñông khô và ñem thực nghiệm ở nhiều xí nghiệp gà công nghiệp thuộc các tỉnh phía bắc và phía nam ñều thấy an toàn ñối với các lứa tuổi gà, các giống gà và ở các vùng có khí hậu khác nhau hiệu lực trong sản xuất ñạt tương ñương như hiệu lực trong phòng thí nghiệm, và các tác giả cũng cho thấy có sự tương quan giữa tỷ lệ mọc ñậu khi chủng vacxin và tỷ lệ hiệu lực thông qua thử thách bằng giống cường ñộc, tiêu chuẩn

102, qua ựó có thể ựánh giá sơ bộ hiệu lực của vacxin thông qua tỷ lệ mọc ựậu (Khoa học kỹ thuật nông nghiệp số 11/1978)

2.3.1.2 Kiểm tra các tiêu chuẩn giống

a Kiểm tra thuần khiết

Mỗi lô giống ựều phải không có sự tạp nhiễm vi khuẩn, nấm, mycoplasma và những virus ngoại lai

b Kiểm tra an toàn

Giống virus nên ựược kiểm tra ựể phát hiện bất kỳ một khả năng nào làm tăng cường ựộc lực trở lại của virus Giống virus vacxin ựược kiểm tra an toàn giống như mục sản xuất vacxin

c Kiểm tra hiệu lực

Với mỗi liều vacxin sử dụng, con vật phải bảo hộ ựược với chủng virus cường ựộc sau khi tiêm

2.3.1.3 Phương pháp sản xuất giống

Giống ựậu gà ựược sản xuất bằng cách gây nhiễm trên môi trường tế bào

và nuôi cấy ở nhiệt ựộ 37oC Phần lớn trứng chết phôi sau 48 Ờ 96 giờ gây nhiễm Huyễn dịch thu hoạch ựược phối trộn với chất bổ trợ đông khô sản phẩm và bảo quản ở nhiệt ựộ -70oC hoặc thấp hơn OIE [25]

2.3.2 Các tiêu chuẩn kiểm nghiệm ựối với vacxin ựậu gà

Các thành phần kháng nguyên của các lô vacxin ựược kiểm nghiệm trong phòng thắ nghiệm và thử nghiệm ngoài thực ựịa ựể chứng minh hiệu quả Chuẩn ựộ hiệu giá virus ựược tiến hành trên phôi trứng gà và môi trường

nuôi cấy tế bào

a Kiểm tra vô trùng

Mỗi lô vacxin nhược ựộc phải ựược kiểm tra xem có vi khuẩn, nấm hay virus ngoại lai hay không

b Kiểm tra an toàn

Tiến hành kiểm tra an toàn của vacxin ñậu gà trên môi trường nuôi cấy

tế bào theo TCN 196 – 94 “Vacxin thú y – Quy trình kiểm nghiệm vacxin ðậu gà nhược ñộc” [2] Chủng vacxin vào da cho 10 gà (1- 2tuần tuổi), mỗi con 10 liều quy ñịnh Theo dõi trong 14 ngày, tất cả gà phải sống khoẻ

c Kiểm tra hiệu lực

Vacxin ñược kiểm tra hiệu lực bằng hai cách: thử thách với chủng virus cường ñộc hoặc chuẩn ñộ hiệu giá virus trong mỗi liều vacxin

2.4 ðÔNG KHÔ VACXIN

2.4.1 Khái niệm

Kỹ thuật ñông khô bản thân nó tương tự như quá trình chưng cất trong ñiều kiện chân không, nhưng nó có một ñiểm khác rất quan trọng, ñó là: Vật chất cần ñông khô phải ñược ñóng băng hoàn toàn trước khi ñưa vào quá trình làm khô (quá trình cung cấp chân không và nâng nhiệt) Dưới những ñiều kiện như vậy, các phân tử nước sẽ chuyển trực tiếp từ thể rắn sang thể khí bỏ qua giai ñoạn chuyển thành dung dịch ðiểm quan trọng của quá trình này là vật chất sau khi ñược ñông khô giữ nguyên hoàn toàn các ñặc tính ban ñầu, không có sự tác ñộng hoá lý lẫn nhau Thông thường kỹ thuật này thường ñược sử dụng ñể bảo quản lâu dài các chế phẩm ñể ngăn chặn lại sự xâm nhập của hơi nước

2.4.2 Mục ñích của kỹ thuật ñông khô

ðạt ñược một sản phẩm có thể hoà tan dễ dàng bằng nước và sau khi hoà tan nó còn nguyên ñầy ñủ các ñặc tính của sản phẩm như trước khi ñông khô

Trong ñiều kiện lạnh ở nhiệt ñộ thấp, quá trình ñông khô sẽ làm khô cả những phân tử nước hoà tan trong các albumin Vì vậy, hầu hết các thành phần hoá học sẽ ñược giữ nguyên cả về chất lượng và số lượng

Thông qua quá trình ñông khô, các sản phẩm sinh học như: Mô, chiết xuất của mô, vi khuẩn, vacxin, huyết thanh sẽ chuyển thành sản phẩm ở dạng

khô Với quá trình này sẽ tránh ñược sự biến ñổi lớn của các phản ứng enzyme, các phản ứng hoá học và sự biến ñổi của vi sinh vật

Vì vậy, có thể nói ñông khô là quá trình bảo quản tiện lợi nhất các ñặc tính sinh học của các chế phẩm sinh học

2.4.3 Tính ưu việt của sản phẩm ñông khô

Một trong những tính ưu việt nổi bật của sản phẩm ñông khô là không

bị thay ñổi tính chất, các chế phẩm ñược ñưa vào ñông khô như protein, chế phẩm vitamin, thuốc dược phẩm, huyết thanh, các loại thực phẩm, các chế phẩm này sau ñông khô thường vẫn giữ nguyên tính chất nguyên thuỷ của chúng và các hoạt tính của enzym ðối với vacxin vi trùng và virus sẽ ñược hồi phục khi hoà tan trở lại, vacxin vẫn giữ ñược hiệu lực, bảo quản lâu dài, khối lượng nhỏ gọn nhẹ, vận chuyển dễ dàng, vacxin lại ñược vô trùng, không

có sự ñông vón, ngăn chặn ñược quá trình phân huỷ

2.4.4 Các giai ñoạn của quá trình ñông khô

Quá trình ñông khô ñược tiến hành trong một thiết bị bao gồm một buồng sấy có giá ñiều khiển nhiệt ñộ, một buồng ngưng tụ ñể thu nạp nước bốc hơi từ chế phẩm vacxin, một hệ thống lạnh ñể cung cấp ga lạnh cho giá

và buồng ngưng tụ, một hệ thống chân không nhằm hạ áp suất của buồng sấy

và buồng ngưng tụ ñể thúc ñẩy quá trình ñông khô

− Quá trình ñông khô:

Quá trình ñông khô cơ bản ñược chia thành các giai ñoạn sau:

+ Giai ñoạn chuẩn bị chế phẩm vacxin: Giai ñoạn này các chế phẩm vacxin ñược chuẩn bị theo yêu cầu riêng của từng loại với chất bổ trợ thích hợp

+ Giai ñoạn làm ñông: Nguyên lý cơ bản của quá trình này là làm cho các sản phẩm ñược kết dính thành một khối rắn chắc và ñược cố ñịnh trong một vị trí nhất ñịnh, vì vậy hơi nước ñược thăng hoa và không xảy ra các phản ứng lý hoá học trong quá trình khử nước Giai ñoạn này, các phần tử trong

chế phẩm phải ñựơc làm ñông hoàn toàn, tức là phải làm lạnh dưới ñiểm ñóng băng thấp nhất của các chất có trong chế phẩm làm khô Quá trình ñóng băng sản phẩm ñược tiến hành trong máy ñông khô bằng cách hạ nhiệt ñộ từ từ, liên tục trong buồng làm ñông

+ Giai ñoạn sấy khô lần 1 (còn gọi là giai ñoạn thăng hoa): Ở giai ñoạn này, có một hệ thống nhiệt ñể cung cấp nhiệt cho sản phẩm ñã ñược ñóng băng hoàn toàn Khi ñược cung cấp nhiệt, các phân tử nước ở trạng thái rắn chuyển thẳng thành hơi và chuyển lên trên bề mặt của sản phẩm ñược ñóng băng Các phân tử hơi nước này sẽ di chuyển về khu vực có áp lực thấp hơn

Do vậy, dưới tác dụng của bơm chân không các phân tử hơi nước sẽ di chuyển về phía bình ngưng tụ Khi tiếp xúc với bình ngưng tụ, do nhiệt ñộ bình ngưng tụ bao giờ cũng thấp hơn nhiệt ñộ giá, các phân tử hơi nước bị lấy mất năng lượng và chuyển trở lại thành dạng ñá (ñóng băng) và bám xung quanh bề mặt bình ngưng Khi cung cấp nhiệt ñể các phân tử nước từ dạng ñóng băng chuyển thành thành dạng hơi nước ñồng thời nó cũng làm tăng nhiệt ñộ của sản phẩm Nếu cung cấp một lượng nhiệt quá lớn, hơi nước bốc hơi nhiều nó sẽ bị các phân tử nước ñóng băng ở phía trên cản trở quá trình bay hơi Do vậy, nếu hơi nước quá nhiều không thoát ra ngoài ñược sẽ dẫn tới hiện tượng tan chảy của sản phẩm ðể tránh hiện tượng này xảy ra, hệ thống máy ñông khô sẽ bao gồm hai hệ thống là hệ thống máy lạnh và hệ thống cung cấp nhiệt, hai hệ thống này họat ñộng hiệp ñồng với nhau ñể cung cấp một lượng nhiệt vừa ñủ ñể ñông khô sản phẩm ñồng thời tránh ñược sự tan chảy của sản phẩm trong quá trình ñông khô

Ở giai ñoạn này, hệ thống máy hút chân không của máy ñông khô họat ñộng liên tục ñể tạo ñiều kiện thăng hoa cho các phân tử nước ñồng thời cũng tạo ñiều kiện chân không trong buồng làm khô sản phẩm tránh ñược các phản ứng oxy hóa khử trong quá trình ñông khô

+ Giai ñoạn sấy khô lần 2 (giai ñoạn hấp phụ): Ở giai ñoạn này lượng

nhiệt cung cấp cho sản phẩm được đặt ở mức cao để làm khơ nốt các phân tử hơi nước cịn sĩt lại Do lượng hơi nước cịn rất ít làm cho hệ thống bình ngưng giảm đến mức thấp nhất và tạo ra sự cân bằng nhiệt mới Hệ thống máy hút chân khơng làm việc tạo ra áp lực chân khơng thấp nhất và nhiệt độ chế phẩm đơng khơ tăng lên gần bằng nhiệt độ giá của máy

Khi kết thúc quá trình đơng khơ, nhiệt độ chế phẩm đạt gần bằng nhiệt

độ của giá, độ ẩm giảm đến mức yêu cầu và trong lọ chế phẩm cĩ chân khơng hồn tồn

2.5 PHỊNG BỆNH BẰNG VACXIN

2.5.1 Cơ sở của việc tiêm phịng bằng vacxin

Nguyên lý của việc tiêm phịng bằng vacxin là gây ra trong cơ thể sống một đáp ứng chủ động của hệ thống miễn dịch nhằm tạo ra kháng thể dịch thể hay tế bào chống lại những nhĩm quyết định kháng nguyên của yếu tố cĩ khả năng gây bệnh và nhờ đĩ làm mất khả năng này Biện pháp tiêm phịng bằng vacxin đã cho y học, thú y học những thành tựu lớn trong phịng một số bệnh

do virus và vi khuẩn gây ra

Gần đây, do sự hiểu biết về lý thuyết miễn dịch, sự khơng ngừng cải tiến trong kỹ thuật chẩn đốn, sự phát triển liên tục của những sản phẩm mới

và phương thức sử dụng vacxin mới đã làm cho việc phịng bệnh bằng vacxin được giải quyết một cách hồn thiện

Tiêm phịng bằng vacxin đĩng vai trị cĩ ích nhưng nĩ khơng phải

là thuốc trị bệnh và càng khơng thể thay thế cho việc chăm sĩc đúng đắn thường ngày

Cơ sở của sự tiêm phịng bằng vacxin là phải nhận thức được vacxin khơng loại trừ mối đe doạ nào của tất cả các bệnh truyền nhiễm do virus, vi khuẩn gây ra, vacxin chỉ cĩ ích trong việc giúp con vật tránh sự tấn cơng ồ ạt của những dịch bệnh nghiêm trọng Phịng bệnh bằng vacxin cĩ tác dụng duy

trì sức khoẻ ựối với cả một quần thể gia súc và ắt có ý nghĩa phòng trước mắt cho một cá thể

để tiêm phòng có hiệu quả, việc chọn thời ựiểm sử dụng vacxin là vô cùng quan trọng Những trường hợp sử dụng vacxin một cách vội vã trong khi thông tin về những vacxin này không ựầy ựủ gây nên sự bất lợi cho việc nghiên cứu lưu hành bệnh trong ựàn, bởi vì khi ựã dùng vacxin rồi thì việc phân biệt kháng thể do tiêm vacxin kắch thắch tạo ra hay kháng thể do bản thân gia súc ựã nhiễm bệnh mà có rất khó khăn, ựặc biệt là trong trường hợp

sử dụng vacxin virus nhược ựộc

Vì vậy, muốn sử dụng vacxin có hiệu quả, hạn chế ựược tổn thất do dịch bệnh gây ra, người sử dụng vacxin phải có sự hiểu biết về các bệnh truyền nhiễm cũng như dịch tễ học của bệnh

Việc thành công trong tiêm phòng bằng vacxin không chỉ phụ thuộc vào vacxin mà bên cạnh ựó các biện pháp vệ sinh và y học cần ựược tiến hành ựồng thời Cải thiện ựiều kiện sinh thái, vệ sinh chuồng trại, vệ sinh môi trường xung quanh sẽ góp phần ựáng kể vào việc làm giảm tỷ lệ nhiễm bệnh

và tăng tác dụng của việc dùng vacxin phòng bệnh

Việc miễn dịch kháng ựậu gà bao gồm việc tiêm chủng cho các gà mẫn cảm trước thời ựiểm thường xảy ra dịch Thường thường phải tiến hành tiêm phòng trong suốt mùa Xuân và mùa Hè ở những vùng bệnh xảy ra vào mùa Thu và mùa đông Tuy nhiên, ở những trang trại lớn nuôi gà nhiều lứa tuổi và

ở những vùng có khắ hâu nhiệt ựới, những vùng mà bệnh xuất hiện quanh năm nên tiêm chủng bất kỳ lúc nào cần mà không theo mùa nào cả

Việc tiêm chủng chống virus ựậu gà dưới 3 ựiều kiện sau:

1 Khi một ựàn gà nuôi trong nhà mà năm trước ựã xảy ra dịch thì tất cả các ựàn gà con ấp nở từ nhà ựó hoặc từ các nguồn khác ựưa ựến ựều phải tiêm phòng vacxin ựậu gà

2 Nếu ñậu gà xuất hiện trong năm trước và vacxin ñậu bồ câu ñã ñược sử dụng thì tất cả gà nên tiêm nhắc lại vacxin ñậu gà, vì ñộ miễn dịch cảu vacxin ñậu bồ câu không kéo dài

3 Ở những vùng mà ñậu gà ñang thịnh hành, nên sử dụng vacxin ñậu gà ñể ñược bảo hộ gà chống dịch bệnh từ các ñàn lân cận

2.5.2 Các loại vacxin ñậu gà

a Vacxin vô hoạt

Vacxin vô hoạt tạo ñược miễn dịch nhưng hiệu lực thấp hơn so với vacxin nhược ñộc Tuy nhiên, vacxin vô hoạt chế trên môi trường tế bào gây miễn dịch nhanh giúp con vật có thể bảo hộ với chủng virus cường ñộc Vacxin vô hoạt, nhất là vacxin vi khuẩn thường có thời gian miễn dịch ngắn, 3-9 tháng

b Vacxin nhược ñộc

Vacxin nhược ñộc, nhất là các vacxin virus thường cho ñáp ứng miễn dịch mạnh, ổn ñịnh và thời gian miễn dịch kéo dài, có thể ñược một năm, thậm chí suốt ñời

Dựa trên cơ sở trong cùng một nhóm, giữa các phân nhóm có khả năng gây miễn dịch chéo, các nhà khoa học ñã dùng 2 loại vacxin ñồng chủng (virus ñậu gà chủng cho gà, virus bồ câu chủng cho bồ câu) và vacxin dị chủng (virus ñậu bồ câu chủng cho gà hoặc ñậu gà tây chủng cho gà)

Ở nước ta cũng như trên thế giới từ trước ñến nay ñã dùng các loại vacxin ñể chủng cho gà là vacxin chế từ chủng gây bệnh tự nhiên, vacxin vô hoạt và vacxin nhược ñộc

Vacxin virus sống ñược dùng miễn dịch gà chống bệnh ñậu gia cầm Vacxin ñậu gà và ñậu bồ câu ñược dùng một cách thường quy ñể tiêm phòng cho gà và gà tây ở những vùng có dịch Những vacxin này phải chứa ít nhất

105 EID50/ ml ñể ñảm bảo cho có miễn dịch tốt Vacxin virus ñậu gà và ñậu

bồ câu có nhân “xuất xứ phôi gà” ñược sản xuất từ màng niệu nang ñã gây

nhiễm Vacxin ñậu gà có nhân “xuất xứ tế bào” ñược sản xuất từ tế bào sơ phôi gà ñã gây nhiễm virus Sự thành công của tiêm phòng phụ thuộc vào hiệu lực và thuần khiết của vacxin và các ñiều kiện sử dụng vacxin ñó Sự tiêm chủng cơ bản sẽ tạo ra một thể nhẹ của bệnh Hướng dẫn sử dụng vacxin theo khuyến cáo của nhà sản xuất phải ñược tuân thủ dứt khoát Không nên dùng vacxin ở ñậu gà bị nhiễm các bệnh khác hoặc trong ñiều kiện chăn nuôi kém Tất cả gà nuôi trong cùng một nhà nên ñược tiêm phòng cùng trong một ngày Những gà mẫn cảm khác phải ñược cách ly với những gà ñã tiêm phòng Nếu bệnh ñậu xuất hiện trong một ñàn với ổ dịch ban ñầu chỉ có một ít

gà bị nhiễm bệnh, thì những con không nhiễm bệnh phải ñược tiêm phòng ngay Lọ vacxin chỉ ñược mở ngay trước khi sử dụng Chỉ mở từng lọ vacxin một và lọ ñã mở chỉ ñược sử dụng trong 2 giờ Sau khi pha vacxin, người pha vacxin phải rửa tay sạch sẽ Vacxin chỉ ñược tiếp xúc với gà ở vị trí tiêm phòng Thật cẩn thận ñể vacxin không dính vào các phần khác của cơ thể gà, dây ra nhà hoặc các thiết bị khác Tất cả các thiết bị dính vacxin, các vacxin không sử dụng, lọ hết vacxin …phải ñược khử trùng, tốt nhất là ñốt Vacxin

ñã pha không ñược ñể dùng cho lần sau

c Vacxin ñậu gà

Vacxin có nhân “nguồn trứng có phôi” có chứa virus ñậu gà sống có khả năng tạo ra các ổ dịch nghiêm trọng nếu sử dụng không ñúng quy trình Vacxin ñậu gà thường ñược sử dụng cho gà 4 tuần tuổi và gà giống 1-2 tháng trước khi ñẻ trứng theo ñường chủng cánh Vacxin cần ñược tiêm nhắc lại cho ñàn gà ñẻ trứng vào năm sau không nên tiêm vacxin cho gà mái ñang ñẻ trứng Vacxin ñậu gà tế bào nhược ñộc có thể ñược sử dụng cho gà 1 ngày tuổi và ñược dùng kết hợp với vacxin Marek Vacxin nhược ñộc tế bào dùng theo ñường uống ñược (Mayr và Danner) [22] báo cáo là có hiệu quả ở ðức Miễn dịch có hiệu quả cần dùng 106 - 108 TCID50 tùy thuộc virus vacxin ñược

sử dụng (Sharma và Sharma) [27] ñã ñánh giá so sánh miễn dịch của vacxin

ñậu gà theo các ñường tiêm bắp, chủng nang lông, cho uống và nhỏ mũi Họ thông báo là vacxin theo ñường uống không bảo vệ ñược gà quá 50%, còn các phương pháp khác cho bảo hộ 80-100% (Nagy và các cộng sự) [23] chứng minh ñược gà một ngày tuổi có thể tiêm phòng hiệu quả chống bệnh ñậu gà bằng ñường uống khi vacxin chứa ñủ nồng ñộ cao của virus (106 TCID50/ml)

Gà tây có thể ñược dùng vacxin theo ñường chủng cánh, nhưng virus

có thể lây lan và gây nhiễm ở vùng ñầu gà Vị trí ñược chọn ñể tiêm chủng là giữa ñùi Gà tây nên tiêm chủng lúc 2 - 3 tháng tuổi, nhưng ñối với gà giống nên tiêm nhắc lại trước khi ñẻ trứng Tiêm nhắc lại 3 - 4 tháng 1 lần trong suốt thời kỳ ñẻ trứng có thể có lợi, ñiều ñó còn phụ thuộc vào mức ñộ dịch tễ Vacxin ñậu gà ñã xảy ra trên tất cả các vùng của Mỹ ở các ñàn gà trước ñó ñã tiêm chủng 2 loại vacxin ñậu gà và ñậu bồ câu, ñiều ñó chứng tỏ rằng khó có khả năng cho miễn dịch hoàn toàn Thường người ta sử dụng kết hợp 2 vacxin ñậu gà và ñậu bồ câu trong các ñàn gà

Nguyễn Như Thanh, Trần Khâm [8] ñã nghiên cứu phương pháp sử dụng và bảo quản vacxin ñậu gà ở dạng ñông khô, nhận thấy :

Nếu chủng cho gà vào lúc 10-12 ngày tuổi là thích hợp nhất, vừa phát huy ñược trạng thái miễn dịch của cơ thể, vừa giúp cơ thể gà con vượt qua ñược giai ñoạn cảm nhiễm nhất ñối với bệnh ñậu gà tự nhiên (Khoa học kỹ thuật nông nghiệp 11/1976)

Miễn dịch chắc chắn có từ ngày thứ 7 - 8 sau khi chủng và miễn dịch cao nhất sau 21-28 ngày miễn dịch có thể duy trì sau 9 tháng

Vacxin dưới dạng ñông khô, bảo quản ở 26-300C ñược 4 ngày và ở

2-30C ñược 9 tháng

3 đỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 đỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

− Giống virus ựậu gà chủng C

3.2 NỘI DUNG

3.2.1 Nuôi cấy virus đậu gà nhược ựộc chủng C trên môi trường tế bào

xơ phôi gà một lớp

3.2.1.1 Khảo sát ựặc tắnh gây phá hủy tế bào xơ phôi gà của virus giống

3.2.1.2 Xác ựịnh hiệu giá virus giống trên tế bào xơ phôi gà (TCID 50 )

3.2.1.3 Kiểm tra chỉ tiêu vô trùng, an toàn và tắnh sinh miễn dịch của virus giống gốc ựã thắch ứng trên môi trường nuôi cấy tế bào

3.2.2 Xây dựng quy trình sản xuất vacxin

3.2.2.1 Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất vacxin ựậu gà tế bào

3.2.2.2 Xác ựịnh tỷ lệ phối trộn chất bổ trợ và huyễn dịch virus

3.2.2.3 Xác ựịnh liều gây nhiễm thắch hợp

3.2.2.4 Xác ựịnh thời ựiểm thắch hợp ựể thu hoạch huyễn dịch sau khi gây

nhiễm virus ựậu gà

3.2.3 đánh giá chất lượng vacxin đậu gà ựược sản xuất trên môi trường

tế bào xơ phôi gà một lớp

3.2.3.1 Kiểm tra ựộ ẩm và chân không của vacxin ựông khô

3.2.3.2 Kiểm tra chỉ tiêu vô trùng

3.2.3.3 Kiểm tra chỉ tiêu an toàn

3.2.3.4 Kiểm tra tắnh sinh miễn dịch

a/ Kiểm tra bằng phương pháp trực tiếp: Công thử thách cường ựộc ựối với gà sử dụng vacxin