tìm hiểu mối liên quan giữa nồng độ 25(oh)d3, peptide kháng khuẩn ll-37 trong huyết thanh ở phụ nữ có thai bị nhiễm khuẩn tiết niệu

Theo nhiều nghiên cứu trong nước và trên thế giới nhiễm khuẩn tiếtniệu ở phụ nữ có thai chiếm một tỷ lệ cao khoảng gần 10% 2], [5] và ảnhhưởng tới thai kỳ gây ra nhiều nguy cơ và có thể

Theo nhiều nghiên cứu trong nước và trên thế giới nhiễm khuẩn tiếtniệu ở phụ nữ có thai chiếm một tỷ lệ cao khoảng gần 10% 2], [5] và ảnhhưởng tới thai kỳ gây ra nhiều nguy cơ và có thể đe dọa đến tính mạng của

mẹ và thai Đối với mẹ, nhiễm khuẩn tiết niệu có thể gây hoại tử ống thậncấp, sốc nhiễm khuẩn, tăng huyết áp Đối với thai, nhiễm khuẩn tiết niệu cóthể gây thai chết lưu hay chết ở thời kỳ sơ sinh, thai non tháng, nhiễm khuẩn

sơ sinh, suy dinh dưỡng [20], [33]

Việc phát hiện sớm, nhất là thể NKTN không triệu chứng để điều trịkịp thời là việc hết sức cần thiết để tránh tai biến cho mẹ và con Ward vàJones đã đưa ra lời khuyên là tất cả phụ nữ có thai phải được xét nghiệm nướctiểu để phát hiện nhiễm khuẩn tiết niệu tiềm tàng trong lần đến khám thai đầutiên và xét nghiệm lại ở tuần thứ 28 đối với những phụ nữ có tiền sử nhiễmkhuẩn tiết niệu

Điều trị nhiễm khuẩn tiết niệu dùng kháng sinh là chủ yếu, việc lạmdụng kháng sinh, dùng không đúng liều lượng khiến vấn đề đề kháng với cỏckháng sinh thông dụng ngày càng cao, dẫn tới việc điều trị trở nên phức tạphơn rất nhiều, đối với phụ nữ có thai việc dùng kháng sinh là rất cân nhắc [6],[7] Vì vậy việc nghiên cứu phương pháp để hạn chế việc dựng cỏc thuốc ảnhhưởng đến thai nhi là rất cần thiết để tránh tai biến cho mẹ và con

Gần đây nhiều nghiên cứu trên thế giới đã tìm thấy một số loại peptidekháng khuẩn nội sinh ở người Một loại peptid kháng khuẩn có tên là cationicantimicrobial peptid-18(hPCA-18) hay pro-LL-37, propeptid này bị phân hủythành cathelin và peptide có C- tận cùng là LL-37 Nhiều nghiên cứu cho thấypeptide kháng khuẩn LL-37 có mặt ở tế bào nội mô của niệu quản, khi có vikhuẩn xâm nhập tế bào nội mô nhanh chóng sản xuất và bài tiết LL-37 ranước tiểu LL-37 có tác dụng bảo vệ đường niệu chống lại vi khuẩn bằng cáchphá vỡ màng tế bào vi khuẩn 61 Về mặt phân tử, gen mã hóa tổng hợp LL-37bao gồm vị trí mã hóa cho cả vitamin D receptor (VDR) và dạng hoạt hóa củavitamin D là 1,25(OH)2D3 làm tăng tổng hợp LL-37 ở tế bào bạch cầu trungtính ở người 42

Vitamin D rất quan trọng với xương của bà mẹ và trẻ sơ sinh việc thiếuhụt vitamin D được xem là có liên quan đến việc gia tăng các bệnh nhiễmtrùng []…Đặc biệt khi mang thai lượng vitamin D cần thiết để hình thành hệxương cho trẻ là rất cao, nếu như không có biện pháp bổ xung hợp lý thìnhững thiếu hụt này sẽ để lại những hậu quả xấu

Vì vậy việc nghiên cứu nồng độ của 25(0H)D3, peptide kháng khuẩnnội sinh LL-37 và tìm hiểu mối liên quan trong cơ chế tự bảo vệ của cơ thểchống lại nhiễm khuẩn mở ra một hướng mới góp phần cho chẩn đoán, theodõi, điều trị và phòng bệnh giúp tránh được biến chứng nguy hiểm xảy ra mà

ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về vấn đề này Đặc biệt là đối với bà mẹmang thai nhằm tránh biến chứng cho mẹ và thai nhi, mà ở đõy chúng tôinghiờn cứu trên những bà mẹ mang thai bị nhiễm khuẩn tết niệu Với các lý

do trên, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu với mục tiêu sau:

1 Xác định nồng độ 25(OH)D3 và peptide kháng khuẩn LL-37 trong huyết thanh ở phụ nữ có thai ở nhóm bệnh và nhiễm khuẩn tiết niệu.

2 Tìm hiểu mối liên quan giữa nồng độ 25(OH)D3, peptide kháng khuẩn LL-37 trong huyết thanh ở phụ nữ có thai bị nhiễm khuẩn tiết niệu

Chương 1

TỔNG QUAN

1.1 Tỡnh hình mắc NKTN ở phụ nữ có thai

Theo nhiều thống kê trên thế giới và đa số tác giả tỷ lệ NKTN ở phụ nữ

có thai chiếm khoảng 5-10%, trong đó NKTN không triệu chứng chiếm tỷ lệcao hơn chủ yếu được phát hiện do xét nghiệm tìm vi khuẩn trong nước tiểumột cách có hệ thống [14], [16] ,[57] Theo bác sĩ, thạc sĩ Nguyễn Vũ Thủy,bệnh viện Phụ sản Trung ương tỷ lệ thai phụ đến khám tại viện bị NKTNchiếm tới gần 10% trong đó phần lớn là NKTN không triệu chứng chiếm tớigần 7% Theo bác sĩ Ngô Thị Thùy Dương tiến hành sàng lọc trên 1880 thaiphụ thấy tỷ lệ nhiễm khuẩn tiết niệu không triệu chứng là 6,54% 9 

Bảng 1.1 Tỷ lệ NKTN không triệu chứng ở PNCT của một số tác giả.

1.2 Tác nhân gây NKTN và sự nhạy cảm của VK với kháng sinh

hơn [3], [4], [8], [11], [13], [36]… Các vi khuẩn này từ vùng hậu môn, âmđạo xâm nhập vào bàng quang qua niệu đạo, nhiễm trùng khu trú ở đó Tiếptheo, vi khuẩn di chuyển đến bàng quang gây viêm bàng quang và cuối cùnglan đến thận qua đường niệu quản gây viêm thận, bể thận

Theo Mohammad và cộng sự thấy E.coli là vi khuẩn chủ yếu gây NKTN ở phụ nữ có thai (40%), sau đó là Kleibsiella và streptococcus nhóm B

Theo Blomberg vi khuẩn Gram âm là nguyên nhân gõy NKTN nhiều

nhất, trong đó E.coli là nguyên nhân chính 20.

Theo Mtimavalye LA và cộng sự thấy nguyên nhân gây nhiễm khuẩn

tiết niệu ở thai phụ nhiều nhất là E.coli 62.

1.2.2 Sự nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh.

Theo nghiên cứu của các tác giả trong và ngoài nước về tính nhạy cảmvới kháng sinh của các vi khuẩn gây nhiễm khuẩn tiết niệu cho thấy hầu hết

các vi khuẩn đó kháng lại kháng sinh thông thường được chỉ định dùng chođường tiết niệu.

Theo Trần Thị Thanh Nga (1999) các tác nhân hầu hết đề kháng vớiAmoxicllin, Trimethoprim-Sulfamethoxazol và cloramphenicol Gentamycin

cũng bị đề kháng cao, trừ Citrobacter sp còn nhạy cảm khá tốt (3/4 dòng nhạy

cảm) Đặc biệt E.coli có tỷ lệ nhỏ kháng với các thuốc nhóm quinolones từ

Nalidixic acid đến kháng sinh mới như Norfloxacin và ciprofloxacin

1.3 Thay đổi hệ tiết niệu trong khi có thai

Những thay đổi về cơ thể và sinh lý trong lúc mang thai có thể giúp chonhiễm khuẩn tiết niệu dễ dàng xảy ra

1.3.2 Đài bể thận và niệu quản 1 [83].

Trong thời kỳ thai nghén đài thận và bể thận giãn, hai quả thận giatăng về thể tích (Dài thêm khoảng 1 cm và nặng thêm khoảng 4,5g), niệuquản to, giảm nhu động Niệu quản dài ra, cong queo, giảm trương lực, thận ứnước sinh lý Hiện tượng này gặp ở 90% phụ nữ có thai, rõ hơn ở thận phải

và ít liên quan đến số lần đẻ

1.3.3 Bàng quang và niệu đạo 1 [83].

Trong những tháng đầu của thai kỳ, bàng quang của thai phụ có thể bịkích thích gõy đỏi dắt Khi có thai, tử cung nghiêng về bên phảiđè vào niệu

quản vùng chậu làm giãn nở phần trên và khi tử cung lớn lên có thể chèn épniệu quản, bàng quang bị đè đẩy lên trên ra trước, niệu quản bị kéo dài làmcho dòng nước tiểu không lưu thông dễ dàng, tiểu không hết Đến cuối thai

kỳ, đầu thai nhi lại đè vào bàng quang nên không thể làm rỗng bàng quanghoàn toàn mỗi khi tiểu, càng làm cho dòng nước tiểu khó lưu thông, ứ đọngtạo thuận lợi cho vi khuẩn phát triển trước khi bị thải ra ngoài Trong trườnghợp tử cung ngả sau hoặc tử cung chèn vào cổ bàng quang, thai phụ có thể bớ

1.4 Các yếu tố thuận lợi khỏc gõy NKTN ở phụ nữ có thai

1.4.1 Yếu tố nội tiết 1 [83].

Nồng độ progesteron tăng làm giảm nhu động niệu quản và ruột, gâydẫn lưu nước tiểu kém và táo bón Vi khuẩn gây bệnh thường là trực khuẩnđường ruột nhất là E.coli, do táo bón xâm nhập qua máu tới thận rồi vì ứ đọng

và dẫn lưu nước tiểu kém trở nên dễ gây nhiễm khuẩn tại chỗ

Khi có thai, tử cung nghiêng về bên phải đè vào niệu quản vùng chậulàm giãn nở phần trên và khi tử cung lớn lên có thể chèn ép niệu quản, bàngquang bị đè đẩy lên trên ra trước, niệu quản bị kéo dài làm cho dòng nước tiểukhông lưu thông dễ dàng, tiểu không hết Đến cuối thai kỳ, đầu thai nhi lại đèvào bàng quang nên không thể làm rỗng bàng quang hoàn toàn mỗi khi tiểu,càng làm cho dòng nước tiểu khó lưu thông, ứ đọng tạo thuận lợi cho vikhuẩn phát triển trước khi bị thải ra ngoài Trong trường hợp tử cung ngả sauhoặc tử cung chèn vào cổ bàng quang, thai phụ có thể bớ bớ đỏi

1.4.3.Thay đổi sinh lý hóa học của nước tiểu 1 [83]

Kiềm hóa nước tiểu do tăng thải bicarbonate, giảm kali máu (do nôn)làm thay đổi môi nước tiểu Đường niệu và đạm niệu là các yếu tố tạo thuậnlợi thêm cho vi khuẩn phát triển

1.4.4 Yếu tố cơ địa

Các tác giả cho rằng tiền sử bị NKTN trong lần thai nghén trước hoặcngẫu nhiên ngoài đợt thai nghén có liên quan đến NKTN

Cambell và cộng sự nhận thấy tỷ lệ NKTN ở nhóm có tiền sử là 42%,trong khi đó tỷ lệ này ở nhóm không có tiền sử 18% 25

1.5 Các thể lâm sàng của NKTN trong thời kỳ thai nghén

Nhiễm khuẩn tiết niệu xuất hiện dưới nhiều dạng, từ một nhiễm khuẩnkhông triệu chứng đến một nhiễm khuẩn có triệu chứng liên quan tới từngphần của hệ tiết niệu như viêm bàng quang, viêm đài bể thận, viêm thận Mỗidạng đều có thể là ổ nhiễm khuẩn nguyờn phỏt có sẵn trước khi mang thaihoặc xảy ra do thai kỳ

1.5.1 NKTN không triệu chứng.

Thường không có triệu chứng lâm sàng phát hiện được nhờ xét nghiệmtổng phân tích nước tiểu cho thai phụ, cấy nước tiểu giữa dòng tìm vi khuẩntrong nước tiểu một cách có hệ thống

Theo Bachman NKTN tiềm tàng ở phụ nữ có thai được chẩn đoán xácđịnh với các tiêu chuẩn sau:

- Nuôi cấy nước tiểu giữa dòng 2 lần có từ 100.000 vi khuẩn/1ml nướctiểu trong 2 mẫu liên tiếp nước tiểu được lấy sạch giữa dòng

- Không có các triệu chứng lâm sàng của NKTN

Theo Andrew, Stenqvist, Sweet thể này ở phụ nữ có thai chiếm khoảng

2 - 11% Theo Harry 4,3 - 5,6% Hầu hết các nghiên cứu khoảng 4 - 7% Tỷ

lệ này thay đổi theo số lần sinh và điều kiện kinh tế xã hội: Sinh nhiều lần,nghèo hay gặp nhất 43 Nếu không được điều trị các trường hợp có thể tiếntriển thành nhiễm khuẩn có triệu chứng cấp tính, viêm đài bể thận, đối vớithai gây đẻ non, xảy thai, suy dinh dưỡng Vì vậy nên kiểm soát nhiễm khuẩntiết niệu không triệu chứng bằng cách lấy nước tiểu xét nghiệm ít nhất 2 lầntrong thai kỳ: Một lần ngay khi khám thai phụ lần đầu và một lần trong 3tháng cuối của thai kỳ

1.5.2 NKTN thấp (viờm bàng quang cấp)

Tỷ lệ viêm bàng quang ở phụ nữ có thai là 1,2 -1,5% Triệu chứng củaviêm bàng quang thường là đái buốt, đái dắt, nước tiểu sẫm màu, có khi đái ramáu ở cuối bãi, cảm giác nóng bỏng và rát khi đỏi, khụng sốt, người mệt mỏi.Nếu không điều trị khịp thời có thể dẫn đến viêm thận –bể thận cấp 83

1.5.3 NKTN cao (viờm thận - bể thận cấp)

Người bệnh sốt cao 39 - 40˚C, mạch đập nhanh, rét run, thể trạng suysụp nhanh, mệt mỏi li bì, đau vùng thắt lưng (đặc biệt là bên phải), buồn nôn

và nôn, nhức đầu, đái buốt, đái rắt,đỏi máu hoặc đái mủ, phù toàn thân nhanh,

có khi choáng do urờ huyết tăng, rối loạn chức năng thận dẫn đến suy thậncấp Ngoài ra, có thể bị suy tuần hoàn, suy hô hấp cấp Đây là thể bệnh nặngnhất, nếu không điều trị kịp thời có thể gây nguy hiểm cho mẹ và thai nhi

1.6 Đường xâm nhập của vi khuẩn

cầu khuẩn ruột, tụ cầu vàng và Proteus thường gõy viờm bể thận qua đường

máu 8 [13]

- Đường bạch huyết:

Vi khuẩn từ âm đạo hoặc cổ tử cung bị viêm có thể qua đường bạchhuyết gây viêm bàng quang, vì hai cơ quan này có liên hệ với nhau qua đườngbạch huyết Theo Franke, vi khuẩn từ đại tràng bị viêm có thể xâm nhập thậnphải Theo Heitz Boyer hiện tượng trên gọi là chu trình ruột thận 8, 13

- Đường bạch huyết - máu:

Vi khuẩn theo đường bạch huyết của đường tiết niệu dưới hay cơ quansinh dục ngoài, qua ống ngực vào đại tuần hoàn, cuối cùng vào thận8, 13

1.6.2 Đường tiết niệu từ dưới lên.

Đây là đường thường gặp nhất của NKTN

Vi khuẩn đường ruột thường có ở âm đạo, miệng lỗ niệu đạo vùng quanh

âm hộ, sau đó di chuyển vào bàng quang Cơ chế của sự di chuyển này được giảithích là do vi khuẩn sinh sản, phát triển rồi tụ lại thành từng khối và tự động tiếnsâu vào bàng quang hoặc nhờ cơ chế ngược dòng niệu đạo - bàng quang Sự cothắt sinh lý của cơ vòng niệu đạo xảy ra trước khi đóng cổ bàng quang, có thể giảithích một phần cơ chế ngược dòng niệu đạo - bàng quang 8, 13

Từ niệu đạo vi khuẩn gây thương tổn trước hết ở bàng quang và thườnggõy viờm tại chỗ, nhưng nhiễm khuẩn có thể lan lên thận Trên thực nghiệmkhi bơm vi khuẩn vào bàng quang có thể gõy viờm bể thận cấp do vi khuẩnqua niệu quản lên thận Khi cắt một bên niệu quản, người ta thấy thận bờn đúkhông bị viêm Theo Kass, khi lưu lượng nước tiểu < 25ml/phút vi khuẩn cóthể đi ngược dòng nước tiểu lên niệu quản Nhiễm khuẩn ở thận theo đường

niệu quản sẽ xảy ra nếu có hiện tượng ngược dòng bàng quang do tắc đườngtiết niệu dưới hoặc rối loạn thần kinh bàng quang 8, 13.

1.6.3 Nhiễm khuẩn do thủ thuật.

NKTN có thể do thủ thuật ở đường tiết niệu như thông niệu đạo, thôngbàng quang không vô khuẩn 8, 13

1.7 Cơ chế chống nhiễm khuẩn của cơ thể

Theo Pasteur, nước tiểu là môi trường thích hợp cho vi khuẩn, đặc biệt

vi khuẩn gram âm, do pH nước tiểu, nồng độ phân tử, nồng độ ure, sự có mặtcủa một lượng đường rất nhỏ trong nước tiểu.Khả năng chống nhiễm khuẩncủa nước tiểu kém hơn các dịch sinh vật khác như nước bọt vì nước bọt chứanhiều lysozym và immunoglobulin hơn nước tiểu Tuy nhiên cơ thể có những

cơ chế để chống nhiễm khuẩn 8, 12

1.7.1 Ở niệu đạo.

Niệu đạo nữ ngắn (3,5cm) nhưng áp lực tĩnh cao, áp lực này ở giữaniệu đạo là 100 ± 20 cm nước, nên có khả năng kìm giữ nước tiểu và ngăn vikhuẩn tiến sâu vào bàng quang mặc dù có hiện tượng ngược dòng lúc đi tiểuhoặc hiện tượng kích thích khi giao hợp 8, 13

1.7.2 Ở bàng quang.

1.7.2.1 Yếu tố cơ học.

Đi tiểu nhiều lần trong ngày, đi tiểu hết để không đọng nước tiểu ởbàng quang là yếu tố chống nhiễm khuẩn, do đó cần tăng số lần đi tiểu vàtăng bài niệu nếu có khuẩn niệu Tăng bài niệu làm loãng nước tiểu, rửa sạchbàng quang và giảm số lượng vi khuẩn trong nước tiểu 8, 13

1.7.2.2 Yếu tố diệt khuẩn.

Thực nghiệm đưa vi khuẩn Proteus hay E.coli vào bàng quang chuột

bạch cái, sau 4 giờ chỉ còn 10% tổng số vi khuẩn sống sót Sau mỗi lần đi tiểuvẫn còn một lớp nước tiểu đọng lại trên niêm mạc bàng quang, tuy vậy vikhuẩn vẫn khụng phỏt triển được chứng tỏ vi khuẩn có thể bị diệt Bàngquang có thể diệt khuẩn nhờ bạch cầu hoặc do bàng quang bài tiết acid hữu cơhay chất ức chế vi khuẩn phát triển 8, 13

1.7.2.3 Yếu tố khỏng dớnh.

Yếu tố khỏng dớnh của niêm mạc bàng quang thuộc về lớp mucin, làmột muco polysaccharid - glucosaminoglucan được tiết bởi tế bào bề mặt.Mucin phong bế các thụ thể của niêm mạc, không cho gắn vào các cấu trúcngoại tế bào của vi khuẩn nên vi khuẩn không dính vào được niêm mạc Khitiêu hủy lớp mucin bằng HCL 0,3 N, người ta thấy hiện tượng dính xuất hiện.Tớnh khỏng dớnh của mucin giải thích tại sao tăng nhịp độ đi tiểu đều trongngày có khả năng tống vi khuẩn ra khỏi bàng quang Mucin có khả năng ngăncản ion canxi, oxalat canxi, protein dính vào niêm mạc nờn phũng được sỏibàn quang 8, 13

1.7.2.4 Yếu tố miễn dịch

Miễn dịch dịch thể: Thuyết về sự hiện diện hoặc gia tăng của kháng thểtrong huyết thanh ở thai phụ bị nhiễm khuẩn đường tiết niệu dưới khôngđược các tác giả chấp nhận chấp nhận, mặc dù người ta thấy có kháng thểtrong huyết thanh ở một số trường hợp viêm bàng quang

Miễn dịch mô học tại bàng quang: Xét nghiệm chất bài tiết từ bàngquang thấy IgG và IgA tăng cao nhất ở bàng quang bị viêm IgM cũng tăngtrong viêm bàng quang nhưng tỷ lệ ít hơn IgG và IgA Nguồn gốc của Ig này

có thể từ bàng quang, thận, niệu đạo Theo Pazin, immunoglobulin tác động

vào vi khuẩn theo nhiều cơ chế, IgG làm bất động vi khuẩn trên chuột, IgAlàm vô hiệu hóa hoạt tính vi khuẩn, IgM diệt khuẩn8, 13.

1.7.3 Tại đường tiết niệu trên.

Nhu động của đường niệu đẩy nước tiểu liên tục là yếu tố chốngnhiễm khuẩn

Áp lực niệu quản nơi gần bàng quang là 40 - 50 cm nước, áp lực bàngquang trong lúc nghỉ thấp, khoảng 10 cm nước cũng là yếu tố chống ngượcdòng và chống nhiễm khuẩn 8, 13

1.7.4 Vitamin D và vai trò trong chống nhiễm khuẩn

Vitamin D từ lâu đã được công nhận cho tác động có lợi đối với sứckhỏe của xương trong vai trò là điều phối chuyển hóa calcium Nhưng nhữngnăm gần đây có sự hiểu biết hơn vai trò của vitamin D trong sự tăng trưởngcủa tế bào, miễn dịch và sự chao đổi chất của tế bào Bởi vì vitamin D có thụthể vitamin D (tức vitamin D receptor) hiện diện khắp mô và tế bào trong cơthể [27],[53] Vitamin D đóng vai trò kiểm soát và điều phối gần 1000 gientrong cơ thể chúng ta, đây là một loại hormon bận rộn [12], [22] Nhất làvitamin D đóng vai trò quan trọng trong hệ miễn dịch, nhất là có mối liên hệgiữa vitamin D receptor và peptide kháng khuẩn cathelicidin [42]

Tác động của tình trạng thiếu vitamin D ở sự phát triển của thai nhi vàsức khỏe bà mẹ là một mối quan tâm đáng kể Một tỷ lệ cao thiếu hụt vitamin

D được công nhận ở phụ nữ mang thai [65]

Đặc biệt phổ biến ở những phụ nữ Mỹ gốc Phi, người có khả năng tổng hợpvitamin D từ ánh sáng cực tím cần tiếp xúc nhiều hơn hơn là ở phụ nữ da trắng Vớimức tăng vitamin D, nguy cơ tiền sản giật được cho làm giảm đáng kể [21]

Vi vậy vitamin D rất quan trọng đối với bà mẹ và trẻ sơ sinh, thiếu hụtvitamin D có liên quan đến việc gia tăng các bệnh nhiễm trùng, ung thư, tim mạch

Vì vậy việc bổ xung vitamin D cho đối tượng có nguy cơ là hết sức cần thiết

1.7.4.1 Nguồn gốc của vitaminD trong cơ thể.

Vitamin D là một nhóm của các tiền hormon tan trong dầu, một số dạngcủa vitaminD đã được phát hiện:

Bảng 1.2 Một số dạng của vitaminD [38].

Vitamin D 1 Phức hợp phân tử của ergocalciferol với

lumisterol 01:01

Vitamin D 2 ergocalciferol (làm từ ergosterol )

Vitamin D 3 Cholecalciferol (Vitamin D làm từ

7-dehydrocholesterol ở da)

Vitamin D 4 22-dihydroergocalciferol

Vitamin D 5 sitocalciferol (làm từdehydrositosterol-7 )

Vitamin D có 2 dạng hoạt tính: Loại tổng hợp (D2), loại tự nhiên:Cholecalcifero (D3) chiết từ dầu gan cá được gọi chung là calciferol Trongthức ăn và các chất bổ sung dưới dạng vitamin D hoặc các tiền chất vitamin

D Dưới tác dụng của tia cực tím, 7-dehydrocholesterol dưới da sẽ chuyểnthành vitamin D3

Cả hai dạng Vitamin D2 và Vitamin D3 ở người hoạt tính hormon hiệu

quả như nhau, tuy nhiên trong một số trường hợp thì Vitamin D3 hiệu quả

hơn Vitamin D2 Ở một số loài chuột thì Vitamin D2 lại hiệu quả hơn

Vitamin D3

Nhu cầu vitamin D cho trẻ vào khoảng 100-400 UI/ ngày Tuổi càngtăng thì nhu cầu vitamin D càng thấp nhưng ở phụ nữ mang thai và cho con

bú có thể tăng lên 200UI/ngày

1.7.4.2.Chuyển hóa của vitamin D trong cơ thể.

Vitamin D là một tiền hormon, sau hai phản ứng hydroxy hóa đượcchuyển thành 1,25 dehydroxycalxyferol là dạng có hoạt tính hormon

Ở trong da vitamin D3 dược sản xuất bằng cách quang hóa trong da từ7- dehydrocholesterol Sự tạo thành các sản phẩm của vitamin D trong tựnhiên luôn cần đến ánh sáng tím

Sơ đồ chuyển hóa vitamin Dtrong cơ thể [26].

Vitamin D3 được sản xuất ở trong da và được hấp thụ qua thức ăn vào cơthể sẽ gắn vào -globulin để vận chuyển, tích luỹ ở gan và mỡ Chuyển hoáqua 2 giai đoạn: Ở gan vitamin D3 được hydroxylatd tại vị trí C25 tạo thành25-hydroxycalciferol 25(OH)D3 hoặc calcidol) nhờ enzym 25-hydroxylase(CYP27A1) sản xuất bởi tế bào gan và được lưu giữ tới khi cần thiờt 25 (OH)D3 liên kết với protein (VDBP) luân chuyển trong máu, là chất chuyển hóalưu hành chính của vitamin D có thời gian bán huỷ là 21 ngày, nồng độ25(OH)D huyết thanh 15-80 ng/ml 12, chất này qua thận lại đượchydroxyled bởi enzym 1α-hydroxylase (CYP27B1) chuyển hoá tiếp thành1,25 dihydroxycalciferol (1,25(OH)2D3) là chất có hoạt tính hoặc24,25(OH)2D 1,25(OH)2D3 được giải phóng vào hệ tuần hoàn bằng cách gắnvào VDBP, nó được chuyển tới cơ quan đích 12 Sự hydroxyl hóa vị trí C25cũng xảy ra ở cỏc mụ khỏc trong cơ thể như ruột, thận Tốc độ hydroxyl hóa ở

vị trí 25 và sự tổng hợp 1,25(OH)2D3 được điều hòa theo cơ chế ngược, tuynhiên sự điều hòa này không chặt chẽ

1,25(OH)2D có tính chất của hormon steroid cổ điển được bài tiết ở cơquan nội tiết (thận) và được vận chuyển đến mụ đớch ruột, xương Tại đây

nó gắn vào các receptor của vitamin D (VDR) chủ yếu nằm ở các hạt nhâncủa các tế bào đích và điền khiển tổng hợp RNAm, dịch mã mà điều biến cácgen biểu hiện của protein để tiến hành hoạt động sinh học của hormon

Vitamin D và các chất chuyển hóa cỳa nú được bài xuất chủ yếu quamật và phân, chỉ có một lượng nhỏ xuất hiện trong nước tiểu va dược tái hấpthu tại ruột

Receptor vitamin D thường ở trong nhân tế bào đích Ở người VDR làmột protein 50KD gồm 427 acid amin và chứa một vùng gắn DNA và mộtvùng gắn hormon Vùng gắn hormon là vùng giàu cystine, vùng gắn hormon

chịu trách nhiệm cho sự gắn đặc hiệu 1,25(OH)2D Gen mó hoỏ receptor này

là một thành viên của liên họ các gen tiếp nhận steroid Receptor của1,25(OH)2D3 được tổng hợp bởi các tế bào trong hầu hết các tổ chức như các

tế bào ở não, da, tuyến yên, tuyến sinh dục Vai trò chính của vitamin D đãđược biết đến nhiều thập kỷ qua là kích thích vận chuyển canxi qua ruột vàmáu cũng như tham gia tái tạo, phát triển, tiêu huỷ xương với sự kích thíchcủa PTH [60] Gần đây người ta thấy rằng 1,25(OH)2D3 có vai trò điều hoàđáp ứng miễn dịch ức chế sự tăng sinh biệt hoá tế bào u, tăng bài tiết insulin

và TSH 24], [75]

Những nghiên cứu gần đây ở các bệnh rối loạn đáp ứng miễn dịch dothiếu vitamin D đều liên quan sự thiếu 25(OH)D2 tuần hoàn chứ không phảithiếu 1,25(OH)2D3

1.7.4.3.Vai trò của vitamin D trong điều hòa đáp ứng miễn dịch.

Vai trò của vitamin D trong điều hoà đáp ứng miễn dịch được đưa racách đây hơn 25 năm với 3 phát hiện quan trọng :

- Sự hiện diện của receptor vitamin D trờn cỏc tế bào viêm

- Khả năng của 1,25(OH)2D3 trong điều chỉnh tế bào limpho T tăng sinh

- Đại thực bào có khả năng sinh vitamin D

Dạng có hoạt tính hormon của vitamin D điều hòa tác dụng miễn dịchbằng cách gắn với các receptor vitamin D nhõn cú trong hầu hết các loại tếbào miễn dịch bao gồm cả miễn dịch bẩm sinh và miễn dịch thích ứng VDRđược sản xuất chủ yếu trong các tế bào bạch cầu đơn nhân (monocyte), tế bàođại thực bào (macrophage), tế bào đuôi gai (dendritic cell), tế bào T và tế bào

B hoạt động [53] Vitamin D đóng vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn dịchbẩm sinh và miễn dịch thu được Những nghiên cứu ở Mỹ cho thấy có sự liên

quan giữa nồng độ 1,25(OH)2D3 và bệnh lao phổi tiến triển, nồng độ1,25OHD3 thấp gắn liền với các bệnh nhiễm trùng như NKTN, nhiễm trùng

da, lao phổi 31 Trong invitro người ta đã quan sát thấy sự kích thích TLR2

(Toll-like recptor) 24 [56] làm tăng sản xuất 1,25(OH)2D3, ở tế bào đơn nhânnhững chất này sẽ làm tăng sự sản xuất peptid kháng khuẩn Ở chuột do thiếuCYP27B1 mặc dù có gen tổng hợp Cathelecidin như ở người nên sự tổng hợppeptid kháng khuẩn này cũng không diễn ra được 42] Đối với miễn dịch thứphát vitamin D ức chế sự tăng sinh limpho T, các globulin miễn dịch ngănchặn sự trưởng thành của các tương bào thành limpho B Đặc biệt với tế bàoTh1 làm giảm khả năng sản xuất IFN-, IL2 và hoạt hoá đại thực bào.1,25(OH)2D3 làm giảm sự thể hiện của các CD4, CD86 trong các tế bào đuôigai 46]

Với miễn dịch bẩm sinh, nghiên cứu của Schauber và cộng sự nhậnthấy rằng những tế bào keratinocytes được điều chỉnh bởi 1,25(OH)2D3 tăngtổng hợp Cathelecidin LL37 sẽ tiêu diệt Staphyococcus, E.coli, Pseudomonas

aeruginosa hơn những tế bào keratonocyte không được điều chỉnh [71] Các

tác giả cho rằng 1,25(OH)2D3 làm cho các đại thực bào, tế bào đơn nhõn, cỏc

tế bào biểu mô nhận ra các thành phần vi khuẩn nhờ TLR2 gây ra sự điềuchỉnh CYP27B1 và VDR, CYP27B1 hoạt hoá vitamin D dạng không hoạtđộng thành hoạt động 1,25(OH)D3, gắn vào VDR và làm hoạt hoá VDR sinh

ra các yếu tố chống nhiễm khuẩn như các cathelicidin và các AMPs đặc biệt

là LL-37 Người ta cũng nhận thấy rằng có sự liên hệ chặt chẽ giữa LL-37 và1,25(OH)2D3 về mặt phân tử gen mó hoỏ tổng hợp LL-37 gồm vị trí mó hoỏcho vitamin D receptor Dạng hoạt hoá của vitamin D là 1,25(OH)2D3 làmtăng tổng hợp LL-37 ở bạch cầu trung tính người 15], [ Như vậy vai trò củavitamin D đối với nhiễm khuẩn nói chung và nhiễm khuẩn tiết niệu nói riêng

tác động gián tiếp thông qua peptid kháng khuẩn LL-37 yếu tố gần đây đượccho là có vai trò then chốt trong bảo vệ đường niệu khỏi bị vi khuẩn [82].

1.7.4.4 Đánh giá tình trạng vitamin D trong huyết thanh

Nồng độ huyết thanh của 25-hydroxy-vitamin D thường được sử dụng

để xác định tình trạng vitamin D Nó phản ánh việc sản xuất vitamin D trong

da cũng như được cung cấp vitamin D từ chế độ ăn Vitamin D có thời gianbán hủy khá dài 15 ngày, tuy nhiên lượng vitamin D được lưu trữ trong cỏc

mụ cơ thể khác nhau Mức độ 1,25-dihydroxy-vitamin D huyết thanh thườngkhông được sử dụng để xác định tình trạng vitamin D bởi vì thời gian bán hủyngắn 15 giờ và được điều hòa chặt chẽ bởi hormone tuyến cận giáp, nồng độcanxi và phốt phát, vì vậy mà nó không giảm đáng kể cho đến khi sự thiếu hụtvitamin D trở nên trầm trọng [35]

Mức độ chính xác cần thiết của 25-hydroxy-vitamin D cần thiết cho sứckhỏe là vấn đề còn tranh cãi Một mức thấp hơn 10 ng / mL (25 nmol / L) làliên quan với các bệnh thiếu hụt vitamin D nghiêm trọng như: còi xương ở trẻ

sơ sinh và trẻ em, và nhuyễn xương ở người lớn Một nồng độ trên 15 ng / ml(37,5 nmol/L) thường được coi là đủ đối với những người có sức khỏetốt Mức trên 30 ng/ml (75 nmol/L) được đề xuất bởi một số như mong muốn

để đạt được sức khỏe tối ưu [35], [67]

Mức độ 25-hydroxy-vitamin D được thống nhất trên 200 ng / ml (500nmol/L) được cho là gây độc hại, mặc dù số liệu nghiên cứu trờn cũn ít Ởđộng vật nghiên cứu lên đến 400 ng/mL (1.000 nmol/L) không thấy liên quanđến độc tính [35] Chứng tăng calci máu (hypercalcenia) thường là kết quả từviệc bổ sung quá liều Vitamin D và mức 25-hydroxy -vitamin D trên 150 ng/

ml (375 nmol/L) Vỡ vậy các nhà khoa học khuyến cáo định lượng định kỳcanxi trong huyết thanh ở bệnh nhân nhận điều trị liều vitamin D cao [79]

1.7.5 Peptid kháng khuẩn LL-37 và vai trò trong chống nhiễm khuẩn.

1.7.5.1 Nguồn gốc LL-37.

Hệ thống miễn dịch bẩm sinh là một hệ thống phức tạp, không đặchiệu, hệ thống dự phòng đa chức năng có hiệu quả cao trong việc bảo vệ cơthể Trong hai thập kỷ qua đã chỉ ra rằng cation peptide nhỏ có hoạt tính khángkhuẩn mạnh chống lại vi khuẩn Gram dương, Gram âm, nấm, và một số virus

vì vậy là thành phần quan trọng của hệ miễn dịch bẩm sinh [23] [47]. Ngoàihoạt động kháng khuẩn của mình, peptide kháng khuẩn cũn cú vai trò quantrọng trong viêm, kích hoạt hệ miễn dịch và chữa lành vết thương [72]

Ở động vật có vú, các peptide kháng khuẩn có hiệu quả quan trọngtrong hệ miễn dịch bẩm sinh là cathelicidins và defensins Một số Defensinsđặc trưng ở con người, trong khi chỉ có một cathelicidin được mô tả trong conngười là peptide kháng khuẩn cation 18 kDa (hCAP18) Peptide này được tiết

ra bởi bạch cầu trung tính và các mô biểu mụ lút khoang miệng, niệu sinh

dục, hô hấp và tiêu hóa [64] Nghiờn cứu trước đây đã chỉ ra rằng hCAP18

điều hòa bởi viêm và tổn thương có tên gọi LL-37 [18] Peptide này được lưutrữ trong hạt của neutrophils trong một proform không hoạt động, được rangoài tế bào thành LL-37 peptide trưởng thành tích cực và các cathelinpropart sau khi mất hạt neutrophil Cathelicidin hay pro- LL-37, propeptidnày phân hủy thành cathelin và peptid có C- tận cùng là LL-37, cả hai đều cótác dụng chống nhiễm khuẩn [74]

1.7.5.2 Cấu trúc LL-37.

Cathelicidins bao gồm một khu vực N-đầu cuối bảo tồn cao (các miềncathelin) với tương đồng với cathelin chất ức chế protease cysteine và mộtantimicrobialregion C-ga ít bảo rằng thay đổi giữa các loài, năng suất peptidenhiều với nhiều loại kích thước đáng kể, trình tự, và các cấu trúc [23], [40] [47]

Trình tự xắp xếp các a.a của peptide LL-37 [16]:

Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile - Gly - Lys - Glu - Phe - Lys - Arg - Ile - Val - Gln - Arg - Ile - Lys asp -Phe - Leu - Arg - ASN - Leu - Val - Pro - Arg - Thr - Glu - Ser

-LL-37 gồm 37a.a được xắp xếp như trên, tương ứng với a.a 134-170của protein ở người hCAP18(cationic antimicrobial peptid 18), được phân cắt

từ hCAP18 bởi protease tạo ra amino-acid 37 peptid kháng khuẩn LL-37 và

103 amino-acid cathelin [74]

1.7.5.3 Chức Năng kháng khuẩn của LL-37

LL-37 có hoạt tính kháng khuẩn mạnh chống lại nhiều loại vi khuẩn:

Tụ cầu, Escherichia E.coli, nấm candida albical ,vi rut herpes…[18], [49].[76], [77], [80] Chức năng kháng khuẩn bằng cách phá vỡ màng vi khuẩn[73], [78] của nó, LL-37 cũn cú vai trò quan trọng trong viờm, húa ứng độngbạch cầu đơn nhân, tế bào T, bạch cầu trung tính, và các tế bào mast, kíchthích tế bào mast giải phóng histamine, điều biến sự khác biệt tế bào đuôi gai,

và kích thích IL-8 tiết [30], [66]LL-37 kích thích sự hình thành mạch [55],LL-37 hoạt động đã được kết hợp với chữa bệnh suy biểu mô ở vết thương da[45], chữa lành vết thương, kích hoạt hệ miễn dịch

Sơ đồ vai trò của LL-37 với tế bào

LL-37/hCAP18 được bài tiết bởi bạch cầu đơn nhân, bạch cầu trungtính và từ các tế bào biểu mô của các hệ bài tiết như da, hệ tiết niệu sinh dục,

hệ tiêu hóa, hệ hô hấp [64] Gen mã hóa cho hCAP18 là CAMP (cathelicidinantimicrobial peptide), hoạt động gen điều hoà quá trình tổng hợp peptidekháng khuẩn bị tác động trực tiếp của vitamin D thông qua vitamin Dreceptor Ở chuột có loại peptid tương tự là cathelicidin Các peptide khángkhuẩn tham gia điều hoà hệ miễn dịch miễn dịch dịch thể Như vậy chúng làmột yếu tố kết nối miễn dịch tự nhiên và miễn dịch thu được Một nghiên cứu

gần đây của giáo sư Annelie Brauner đã đăng một báo cáo mới nhất trên tạpchí Nature Medicine, 2007 cho thấy peptide kháng khuẩn LL-37 có vai tròquan trọng đối với niêm mạc niệu quản và khả năng nhiễm khuẩn ở niệuquản LL-37 có mặt ở tế bào nội mô của niệu quản Nghiên cứu cho thấy, khi

vi khuẩn tiếp xúc với tế bào nội mô này thì tế bào nhanh chóng sản xuất vàbài tiết LL-37 trong khoảng vài phút và LL-37 sẽ được bài tiết ra nước tiểu

Tế bào nội mô bài tiết LL-37 có tác dụng bảo vệ đường tiết niệu chống lại vikhuẩn gây bệnh, các peptide kháng khuẩn nội sinh sẽ tiêu diệt vi khuẩn bằngcách phá vỡ màng vi khuẩn 50], [61 Điều này được chứng minh trên môhình thực nghiệm trên chuột bị loại bỏ gen CRAMP (cathelin-relatedantimicrobial peptid) và không có bạch cầu hạt Tế bào nội mô bàng quang tổnghợp phân tử Toll-like recptor (TLR-4) cùng với tế bào CD14 phá hoại hàng ràobảo vệ miễn dịch bằng cách điều hoà kích thích tổng hợp các Cytokin, chimokinđặc biệt là IL-8 có tác dụng như những chất hoá hướng động Các chất này thu hútcác bạch cầu có hạt di chuyển vào vị trí nhiễm khuẩn loại bỏ vi khuẩn khỏi hệ tiếtniệu theo các cơ chế khác nhau như thực bào hoặc bằng các độc tố diệt vi khuẩn

Nhiều nghiên cứu nhiềm khuẩn tiết niệu cho thấy, vi khuẩn e.Coli lànguyên nhân chủ yếu gây nhiễm khuẩn tiết niệu, viêm đài bể thận cấp E.Colixâm nhập vào đường tiết niệu, tăng sinh và gây tổn thương đường tiết niệucho bệnh nhân E.coli có khả năng tạo vỏ bọc xung quanh (biofilm) trỏnh cỏcđại thực bào của vật chủ rồi tăng sinh trong tổ chức Sự hình thành cácbiofilm gây trở ngại cho điều trị: giảm cho tác dụng của kháng sinh Trongbiofilm có thể tồn tại nhiều chủng vi khuẩn gây bệnh khác nhau Về mặt phân

tử, gen mó hoỏ tổng hợp LL-37 bao gồm vị trí mó hoỏ cho cả vitamin Dreceptor Dạng hoạt hoá của vitamin D là vitamin D 1,25(OH)2 D2 làm tăngtổng hợp LL-37 ở tế bào bạch cầu trung tính người

Thông thường cỏc phỏc đồ điều trị cho nhiễm khuẩn tiết niệu là dùngkháng sinh Tuy nhiên đối với các trường hợp nhiễm khuẩn nặng, tái đi tái lạinhiều lần và khỏng cỏc loại thuốc kháng sinh gây đau đầu cho các bác sĩ lâmsàng Vì vậy, nghiên cứu các peptide kháng khuẩn như peptide kháng khuẩnnội sinh, ít khả năng bị vi khuẩn kháng là một hướng nghiên cứu mới thu hútnhiều nhà khoa học trên thế giới Những peptide kháng khuẩn này có thể dùng

để điều trị hoặc thay thế bổ sung cho kháng sinh thường dùng Vì vậy, nghiêncứu nồng độ, cao hơn nữa là vai trò peptide kháng khuẩn (LL-37) đường tiếtniệu, tìm hiểu mối tương quan của nó với vitamin D và vitamin D receptor làmột nghiên cứu quan trọng Từ đó tiếp tục có những nghiên cứu sâu hơn làtìm ra giải pháp kích thích tăng quá trình tự sản xuất peptide kháng khuẩnhoặc phát hiện ra các chất có khả năng kháng khuẩn, đặc biệt là chất khángkhuẩn nội sinh là một hướng nghiên cứu mới và cấp thiết

1.7.5.4 Đánh giá tình trạng LL-37 trong huyết thanh người

Bình thường nồng độ LL-37 huyết thanh ở người là ≥10 ng/ml nồng độnày tăng cao trong các bệnh nhiễm trùng

Xác định sự có mặt và nồng độ LL-37 bằng kỹ thuật ELISA

Chương 2ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Địa điểm nghiên cứu.

Mẫu nghiên cứu được lấy tại bệnh viện Phụ Sản Hà Nội, tiến hành thựchiện nghiên cứu tại bệnh viện Đại học Y Hà Nội và bộ môn Hóa Sinh TrườngĐại học Y Hà Nội

2.2 Thời gian Nghiên cứu.

Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 04/2010 đến tháng 10/2010

2.3 Đối tượng nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện trên những thai phụ được lấy đồng thờinước tiểu và máu Bao gồm những thai phụ đến khám thai và tình nguyệntham gia nghiên cứu Thỏa món các tiêu chuẩn chọn đối tượng nghiên cứu

2.3.1 Cỡ mẫu nghiên cứu.

Chúng tôi chọn cỡ mẫu thuận lợi, khụng xỏc xuất với 70 thai phụ chialàm hai nhóm:

Nhóm chứng: Gồm 35 thai phụ khỏe mạnh

Nhóm bệnh: Gồm 35 thai phụ được chẩn đoán NKTN

2.3.2 Tiêu chuẩn chọn đối tượng nghiên cứu.

* Nhóm bệnh:

- Gồm 35 phụ phụ nữ mang thai có tuổi thai ở 3 tháng cuối của thai kỳ

- Đồng ý tham gia nghiên cứu.

- Không sử dụng thuốc kháng sinh trong thời gian 2 tuần trước khi đến khám

- Không điều trị nhiễm khuẩn tiết niệu vào bất cứ thời gian nào trongquá trình mang thai lần này

- Có hoặc không có triệu chứng lâm sàng nhiễm khuẩn tiết niệu: (Sốt,đái buốt, đái dắt, đái đục, đỏi mỏu )

- Xét nghiệm cận lâm sàng:

Nước tiểu: Bạch cầu niệu cao (+++) Thể nitrit dương tính (có hoặc không)

Vi khuẩn niệu ≥ 105 VK/ml nước tiểu giữa dòng (tiêu chuẩn Kass) Nếu

vi khuẩn niệu ≥ 105 VK/ml nhưng không có triệu chứng lâm sàng thì phải cấynước tiểu 2 lần cho cùng một kết quả (theo Bachman) thì chẩn đoán nhiễmkhuẩn tiết niệu không triệu chứng

* Nhóm chứng:

Gồm 35 phụ nữ mang thai không có triệu chứng lâm sàng của nhiễmkhuẩn tiết niệu, xét nghiệm cận lâm sàng âm tính

2.3.3 Tiêu chuẩn loại trừ.

- Cú các bệnh: lupus ban đỏ hệ thống, bệnh van tim, bệnh đái tháođường, bệnh máu, nhiễm khuẩn đường hô hấp và một số nhiễm khuẩn khác

- Không phù hợp với tiêu chuẩn lựa chọn

2.3.4 Kỹ thuật chọn mẫu.

Chọn mẫu theo phương pháp ngẫu nhiên đơn, căn cứ vào tiêu chuẩn lựachọn và tiêu chuẩn loại trừ đó nờu ở trên

2.3.5 Các chỉ số và biến số nghiên cứu.

+ Kết quả cấy nước tiểu: Số lượng VK; loại VK; mức độ nhạy cảm vớikháng sinh

+ Chỉ số sinh hóa nước tiểu: số lượng bạch cầu

+ Chỉ số sinh húa mỏu: Nồng độ 25(OH)D3; LL-37 trong huyết thanh.+ Và một số xét nghiệm khác

2.4 Trang thiết bị và vật liệu dùng cho nghiên cứu

- Que thử nước tiểu 10 thông số của Roche

- Kit định danh VK Apo-20

2.4.3 Chất liệu nghiên cứu.

- Dùng huyết thanh không có chống đông của mẫu nghiên cứu

- Nước tiểu gữa dòng của mẫu nghiên cứu đảm bảo vô khuẩn làm testnhanh tìm bạch cầu và nitit Phần còn lại bảo quản lạnh từ 0-4˚C đem nuôicấy trong vòng 4h

2.5 Phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Thiết kế nghiên cứu.

Đây là nghiờn cứu mô tả cắt ngang tiến cứu

2.5.2 Qui trình tiến hành nghiên cứu.

Sau khi thai phụ được khám lâm sàng một cách toàn diện tại khoakhám bệnh viện Phụ sản Hà Nội, sẽ được lấy mẫu máu và hướng dẫn lấy mẫunước tiểu để xét nghiệm tại khoa Hóa sinh của bệnh viện Kết quả được ghitheo mẫu bệnh án nghiên cứu riêng

2.5.2.1 Thu thập vô khuẩn mẫu nước tiểu giữa dòng.

- Thai phụ được hướng dẫn vệ sinh bộ phận sinh dục ngoài bằng nướcsạch trước khi lấy nước tiểu và cách lấy nước tiểu giữa dòng

- Sau đó lấy nước tiểu giữa dòng đựng vào hai lọ vô khuẩn có nắp đậykín Một lọ được dùng làm để xét nghiệm tìm bạch cầu niệu ngay tại khoaHóa sinh bệnh viện Phụ Sản Hà Nội, lọ còn lại bảo quản mát 0-4˚C và đượcnuôi cấy trong vòng 4 giờ

2.5.2.2 Làm test nhanh nước tiểu.

Tỡm bạch cầu (+++) và thể nitrit trong nước tiểu bằng que thử dipstickmười thông số trên máy tổng phân tich nước tiểu tự động

2.5.2.3 Nuôi cấy nước tiểu tìm vi khuẩn gây bệnh.

Tiến hành nuôi cấy phần nước tiểu còn lại trong vòng 4 giờ theo kỹthuật cấy đếm bằng que cấy chuẩn 1μl trong môi trường thạch Chrom và môitrường thạch máu để tìm vi khuẩn gây bệnh

Ủ môi trường nuôi cấy trong tủ ấm 18-24 giờ Sau đó đếm số lượngkhuẩn lạc từ đó suy ra số lượng VK trong 1 ml nước tiểu

Mỗi một khuẩn lạc mọc sau 18-24 giờ sẽ tương đương với 105 VK/mlnước tiểu

Chẩn đoán xác định NKTN khi trong môi trường nuôi cấy có ≥ 100khuẩn lạc của một dòng vi khuẩn, tương đương với có 105 ≥ VK/ml nước tiểucủa một dòng vi khuẩn

Bội nhiễm nước tiểu là khi nuôi cấy cú trờn 2 dòng vi khuẩn đều có từ

105 VK/ml nước tiểu

2.5.2.4 Định danh vi khuẩn gây bệnh.

Dựa vào các tính chất sinh vật hóa học của từng chủng, bằng các thửnghiệm hóa sinh để định danh vi khuẩn: Lên men đường, thủy phân tinh bột,thử nghiệm catalasa, quá trình giỏng húa…

2.5.2.5 Làm kháng sinh đồ.

Bằng kỹ thuật kháng sinh đồ xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức

chế VK ( Minimum Inhibitory Concentration – MIC) trong môi trường đặc

Hinton arga Mueller, theo phương pháp khuếch tán đĩa của Kirby - Bauer đểkiểm tra tính nhạy cảm của VK với kháng sinh trong điều trị NKTN Phươngpháp này dựa trên sự ức chế VK phát triển đo trong điều kiện tiờu chuẩn Dựatrên cỏc tiờu trớ có thể được phân loại: Nhạy cảm (Susceptible - S), trunggian (Intermediate - I), kháng (Resistante - R)

Giá trị MIC của các chủng chuẩn Quốc tế theo: Clinical

Microbi-ology and infection, volume 2 Supplemen 1, Dec,1996

Sử dụng khoanh giấy kháng sinh của hãng AB-Biodisk Thụy Điển

2.5.2.6 Định lượng 25(OH)D 3

Máu của nhóm bệnh và nhóm chứng được ly tâm chắt huyết thanh bảoquản tránh ánh sáng bằng bọc giấy bạc, để đông lạnh -20˚C Định lượng25(OH)D3 trong vòng 6 tháng

Xác định nồng độ 25(OH)D3 bằng kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch điện hóa phát quang Sử dụng kit Vitamin D3(25-OH), Cat.No 03314847 của

Roche Diagnostics Tại bệnh viện Karolinska, Thụy Điển

25(OH)D3 là chất chuyển hóa được đo trong huyết thanh để xác địnhtoàn bộ vitamin D vỡ nú là dạng tồn tại chính của vitamin D trong cơ thểngười Thời gian bán hủy 25-OH vitamin D tuần hoàn là 2 đến 3 tuần Hơn95% 25-OH vitamin D đo trong huyết thanh là 25(OH)D3, trong khi 25(OH)D2 đạt tới mức đo chỉ ở những bệnh nhân đang bổ xung vitamin D2 Phản ứngmiễn dịch hóa phát quang định lượng 25-OH vitamin D sử dụng kháng thểđơn dòng trưc tiếp đối với 25(OH)D3

Nguyên tắc phản ứng: Dựa trên nguyên tắc cạnh tranh, toàn bộ thời

gian là 18 phút

Ủ lần thứ nhất: 25(OH)D3 trong huyết thanh (35àl) cạnh tranh vớivitamin D gắn biotin có trong hỗn hợp của thuốc thử R2 (Biotin-vitaminD/polyclonal 25-OH vitamin D3 -specific ruthenium labeled antibody), lượngcòn lại của phức hợp dựa vào nồng độ chất phân tích có trong bệnh phẩm

Ủ lần thứ 2: Sau khi thờm cỏc hạt gắn với streptavidin giúp cho phứchợp vừa được tạo thành gắn với pha rắn thông qua sự tương tác gữa biotin vàstreptavidin.

Hỗn hợp phản ứng được hút vào buồng đo lường nơi mà các hạt có từtính bám vào bề mặt điện cực Các thành phần không gắn sẽ được lấy đi bằngdung dịch procell Khi có hiệu điện thế sẽ phát quang và được đo bằng bộnhân quang

Kết quả xác định dựa vào một đường cong chuẩn bằng cách chuẩn 2điểm và đường cong gốc được cung cấp dựa vào mã vạch của thuốc thử

Giá trị đánh giá:

Trạng thái tối ưu của 25(OH)D3 là: 70-80nmol/L (>30 ng/ml )[35], [67]

Ở trẻ em thì nhu cầu cao hơn

Mức thấp hơn 10 ng/mL (25 nmol/L) thiếu hụt nghiêm trọng[35], [67]

Mức độ 25(OH)D3 được thống nhất trên 200 ng/ml (500 nmol/L) đượccho là có tiềm năng độc hại [79]

Nguyên tắc:

Toàn bộ các giai đoạn: 3 giờ 30 phút

Mẫu và chuẩn được ủ trong giếng có kháng thể LL-37 người

Đưa kháng thể gắn biotin vào gắn với LL-37 người

Phức hợp Streptavidin- peroxidase gắn vào kháng thể có gắn biotintrong phức hợp

Phức hợp Streptavidin- peroxidase sẽ gây phản ứng trên bề mặt,tetramethylbenzidine (TMB)

Phản ứng enzyme sẽ dừng lại khi thêm acid oxalic

Kết quả đo sự hấp thụ quang của dung dịch ở bước sóng 450nm.Đường cong chuẩn được xác định bằng cách vẽ đường hấp thu tương ứngvới với nồng độ LL-37 tiêu chuẩn LL-37 của mẫu được xác định từ dườngcong tiêu chuẩn

2.5.3 Sử lý số liệu.

Các số liệu thu thập được xử lý bằng các chương trình thống kê y học

trên phần mềm EPI-INFO 6.0 Các thuật toán thống kê được áp dụng:

- Các tỷ lệ %

- Giá trị trung bình (X), độ lệch chuẩn (SD), hệ số tương quan (r),

- Các phép so sánh 2 và test t nếu p < 0,05 coi là có ý nghĩa thống kê

2.5.4 Khía cạnh đạo đức của đề tài.

Nghiên cứu chỉ nhằm mục đích bảo vệ và nâng cao sức khỏe cho phụ

nữ có thai và thai nhi, không nhằm mục đích nào khác

Lựa chọn đối tượng tham gia nghiên cứu là dựa trên sự chấp thuận củathai phụ tham gia nghiên cứu Các đối tượng được quyền từ chối không thamgia nghiên cứu hoặc ngừng ở bất cứ giai đoạn nào của nghiên cứu.

Thai phụ không phải mất chi phí khi thực hiện xét nghiệm

Số liệu liên quan đến đối tượng nghiên cứu được lưu giữ bảo mật Các sốliệu thu được đều được kiểm tra lại ở nhiều khâu để đảm bảo tính chính xác

Chương 3KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Kết quả nuôi cấy nước tiểu.

Tiến hành nuôi cấy mẫu nước tiểu của 251 thai phụ có bạch cầu niệu (+

++) trong môi trường thạch chrom và thạch máu có kết quả như sau:

Trong số 251 mẫu nước tiểu có bạch cầu niệu (+++) được nuôi cấy có:

35 mẫu có kết quả ≥105 VK/ml, chiếm tỷ l3,9%

6 mẫu bội nhiễm hai loại VK, chiếm tỷ lệ 2,4%

m tinh

Âm tinh

B ộ i nhi ễ m 83,7%

Có 2 thai phụ do: E.coli + Enterococus ssp

Có 1 thai phụ do: Klebsiella + Streptococcus B

Có 2 thai phụ do: E.coli + Staphylococcus- saprophyticus

Có 1 thai phụ do: E.coli + Proteus spp

3.2 Kết quả thử nghiệm kháng sinh đồ.

Bảng 3.3 Kết quả thử nghiệm KSĐ của E Coli.

E.coli nhạy cảm nhất với Ciprofloxacin (90,48%), sau đó là

Nitrofurantoin (80,95%), Ceftazidime (76,19%) và Augmentin (71,43%)

Tỷ lệ kháng của E.coli với Ciprofloxacin (4,76%), Nitrofurantoin

Klebsiella ssp nhậy cảm nhất với Cotrimoxazon (6/6) và Ciprofloxacin

(6/6), sau đó là Nitrofurantoin (4/6) và Ceftazidime (3/6)

Tỷ lệ kháng thuốc của Klebsiella ssp với Cotrimoxazon (0/6) và

Ciprofloxacin (0/6) là thấp nhất), sau đó là Nitrofurantoin (2/6)

Tỷ lệ Klebsiella ssp kháng mạnh nhất với Augmentin (6/6) sau đó là

Ampicillin (4/6) và Cephalotine (4/6)

Bảng 3.5 Kết quả thử nghiệm KSĐ của Staphylococcus-saprophyticus.

Staphylococcus-saprophyticus nhạy cảm nhất với Nitrofurantoin (6/6),

sau đó là Ceftazidime (5/6), Ceftriaxone (5/6) Ampicillin và Augmentin (5/6)

Tỷ lệ Staphylococcus-saprophyticus kháng thấp nhất là Ceftazidime

(0/6), Ceftriaxone (0/6), Nitrofurantoin (0/6)

Tỷ lệ Staphylococcus-saprophyticus kháng cao nhất là Cotrimoxazon (3/6).

3.3 Đặc điểm của đối tượng nghiên cứu.

Bảng 3.6 Tuổi của thai phụ trong các nhóm nghiên cứu.

Nhận xét: Các thai phụ có tuổi trung bình đều nằm trong lứa tuổi sinh

đẻ bình thường Không có sự khác biệt về tuổi mẹ gữa nhóm chứng và nhómNKTN (p > 0,05) Tuổi thấp nhất là 18và tuổi cao nhất là 37