đánh giá hiệu quả của kỹ thuật pcr phát hiện trực tiếp mycobacterium tuberculosis trong mẫu bệnh phẩm

NGUYỄN DUY HÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA KỸ THUẬT PCR PHÁT HIỆN TRỰC TIẾP MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS TRONG MẪU BỆNH PHẨM LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên – Năm 2011... Hiện nay có một

NGUYỄN DUY HÀ

ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA KỸ THUẬT PCR PHÁT HIỆN TRỰC TIẾP MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS

TRONG MẪU BỆNH PHẨM

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên – Năm 2011

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN ĐẮC TRUNG

Thái Nguyên – Năm 2011

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Đắc Trung – Phòng Xét

nghiệm Vi sinh vật và Sinh học phân tử - Bộ môn Vi sinh – Trường Đại học Y Dược Thái Nguyên, đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo tôi trong quá trình thực hiện đề tài này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô, kĩ thuật viên và nhân viên của Bộ môn Vi sinh – Trường Đại học Y Dược Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện về máy móc và cơ sở vật chất giúp tôi hoàn thành đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn các Ban Giám đốc, Phòng Kế hoạch Tổng hợp, các bác sỹ, kĩ thuật viên của Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Thái Nguyên đã cung cấp mẫu bệnh phẩm, hỗ trợ và giúp đỡ tôi hoàn thành một số thí nghiệm trong quá trình nghiên cứu

Cùng với lòng biết ơn sâu sắc tôi xin gửi tới toàn thể các thầy cô giáo trong Khoa Sinh – KTNN, Khoa Sau Đại học – Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên đã giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành đề tài nghiên cứu

Cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp, người thân và gia đình đã động viên và giúp

đỡ tôi rất nhiều

Tôi xin chân thành cảm ơn !

Thái Nguyên, tháng 8 năm 2011

Học Viên

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chưa có ai công bố trong một công trình nào khác

Học Viên

Nguyễn Duy Hà

1.2 Tình hình bệnh lao trên thế giới và ở Việt Nam 3 1.3 Đặc điểm của bệnh lao và đặc điểm của vi khuẩn lao 8 1.4 Các phương pháp chẩn đoán vi khuẩn lao và bệnh lao 16

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

3.1 Kết quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis trong các

3.2.1 Hiệu quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis trong đờm 38

3.2.2 Hiệu quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis trong

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Viết đầy đủ

AFB Acid Fast Bacilli

AIDS Acquired Immuno Deficiency Syndrome

CTCLQG Chương trình chống lao quốc gia

DRPQ Dịch rửa phế quản

EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid

ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay

GTDBDT Giá trị dự báo dương tính

GTDBAT Giá trị dự báo âm tính

HIV Human Immunodeficiency Virus

IgG Immuno globin G

IS6110 Insert Sequence 6110

PCR Polymerase Chain Reaction

DANH MỤC BẢNG SỐ LIỆU Trang

Bảng 1.1 Ước tính bệnh nhân lao mới mắc năm 2002 theo khu vực 5 Bảng 1.2 Số liệu ước tính bệnh lao của nước ta hàng năm 7

Bảng 3.1 Kết quả nhuộm soi phát hiện vi khuẩn AFB trong đờm 33

Bảng 3.2 Kết quả nuôi cấy phát hiện vi khuẩn Mycobacterium tubercuolosis

Bảng 3.4 Kết quả nhuộm soi phát hiện vi khuẩn AFB trong dịch màng phổi 35

Bảng 3.5 Kết quả nuôi cấy phát hiện vi khuẩn Mycobacterium tubercuolosis

Bảng 3.7 Hiệu quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium tubercuolosis

trong đờm bằng nhuộm soi so với nuôi cấy

38

Bảng 3.8 Hiệu quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium tubercuolosis

trong đờm bằng PCR so với nuôi cấy

39

Bảng 3.9 Hiệu quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium tubercuolosis

trong dịch màng phổi bằng nhuộm soi so với nuôi cấy

40

Bảng 3.10 Hiệu quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium tubercuolosis

trong dịch màng phổi bằng PCR so với nuôi cấy

41

Bảng 3.11 So sánh hiệu quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium

tubercuolosis trong đờm giữa phương pháp nhuộm soi và PCR

42

Bảng 3.12 So sánh hiệu quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium

tubercuolosis trong dịch màng phổi giữa phương pháp nhuộm soi và PCR

43

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Trang

Hình 1.1 Vi khuẩn lao Mycobacterium tubercuolosis soi dưới kính hiển vi 14 Hình 1.2 Khuẩn lạc vi khuẩn lao trên môi trường nuôi cấy 15

Hình 2.2 Sơ đồ chu trình nhiệt phản ứng PCR 30

Hình 3.1 So sánh kết quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium

tubercuolosis trong đờm bằng 3 phương pháp

34

Hình 3.2 So sánh kết quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium

tubercuolosis trong dịch màng phổi bằng 3 phương pháp

36

Hình 3.3 So sánh hiệu quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium

tubercuolosis trong đờm giữa phương pháp nhuộm soi và PCR

42

Hình 3.4 So sánh hiệu quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium

tubercuolosis trong dịch màng phổi giữa phương pháp nhuộm soi và PCR

43

Hình 3.5 Hình ảnh soi trên kính hiển vi quang học trực khuẩn lao AFB

nhuộm bằng phương pháp Ziehl-Neelsen

44

Hình 3.6 Đặc điểm phát triển của vi khuẩn lao trên môi trường nuôi cấy

Ogawa

45 Hình 3.7 Điện di đồ DNA trên gel agarose 1,0% 45

MỞ ĐẦU

Lao là một bệnh nhiễm khuẩn phổ biến ở người, số người mắc lao trong cộng đồng ngày càng tăng Theo Tổ chức Y tế thế giới, năm 1994 có khoảng 1/3 dân số thế giới bị nhiễm lao Mỗi năm có 30 triệu người nhiễm lao, mỗi giây có thêm 1 người nhiễm lao Bệnh lao là bệnh gây tử vong hàng đầu ở người lớn, mỗi năm có 3 triệu người chết vì lao, đến năm 2020 có thêm 1 tỷ người nhiễm lao trong đó có khoảng 70 triệu người chết vì lao mà chủ yếu là lao phổi Bệnh lao chủ yếu phát triển ở những nước nghèo, các nước đang phát triển, khoảng 95% số bệnh nhân lao

và 98% số người chết do lao ở những nước có thu nhập vừa và thấp [8, 9, 10, 43]

Ở các nước đang phát triển, bệnh lao vẫn còn tồn tại trong cộng đồng do rất nhiều yếu tố: sự bùng nổ của đại dịch HIV/AIDS, tăng dân số không kìm hãm được,

do sự phân cực, phân hóa giàu nghèo, hoạt động chưa hiệu quả của các chương trình phòng chống lao quốc gia Việt Nam đứng thứ 12 trong số 22 nước có số bệnh nhân lao cao trên toàn cầu (WHO, 2008) Trong khu vưc Tây-Thái Bình Dương, Việt Nam đứng thứ 3 sau Trung Quốc và Philippinnes về số lượng bệnh nhân lao lưu hành cũng như bệnh nhân lao xuất hiện thêm hàng năm

Để làm giảm tỷ lệ mắc bệnh cũng như tỷ lệ tử vong do bệnh lao, một trong những biện pháp mà Tổ chức Y tế thế giới ưu tiên hàng đầu là đẩy mạnh việc phát hiện sớm các trường hợp mắc lao, điều trị kịp thời để loại bỏ nguồn lây, hạn chế tối

đa sự lây nhiễm trong cộng đồng

Bệnh lao là bệnh nhiễm khuẩn, tác nhân gây bệnh là trực khuẩn

Mycobacterium tuberculosis Phát hiện và chẩn đoán lao quan trọng nhất chủ yếu

dựa vào việc phát hiện trực khuẩn lao trong cơ thể hoặc trong chất xuất tiết của

người bị bệnh lao Tìm thấy trực khuẩn lao được coi là “tiêu chuẩn vàng” trong

việc chẩn đoán bệnh lao Hiện nay có một số phương pháp giúp chẩn đoán xác định

hoặc hỗ trợ chẩn đoán xác định vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis gây bệnh lao

như: nhuộm soi trực tiếp, nuôi cấy phân lập, tiêm truyền động vật cảm nhiễm, test tuberculin, ELISA,… [13, 23]

Ở Việt Nam, hiện nay tại hầu hết các bệnh viện, việc chẩn đoán bệnh lao vẫn chủ yếu dựa vào phương pháp nhuộm soi bệnh phẩm tìm vi khuẩn lao AFB Một số bệnh viện chuyên khoa lao và bệnh phổi, thường là ở tuyến trung ương có điều kiện

có thể thực hiện thêm phương pháp nuôi cấy phân lập Tuy nhiên những phương pháp này ngoài ưu điểm vẫn còn một số hạn chế: Phương pháp nhuộm soi trực tiếp, tuy đơn giản, dễ thực hiện, nhưng hiệu quả thấp, độ nhạy không cao, ngưỡng phát hiện yêu cầu ≥103 vi khuẩn/ml Còn phương pháp nuôi cấy, phân lập tuy có độ đặc hiệu cao nhưng lại cho kết quả chậm sau 4-8 tuần Do đó, việc có thêm một phương pháp phát hiện nhanh vi khuẩn lao, với độ nhạy và độ đặc hiệu cao sẽ đáp ứng được yêu cầu của thực tế, khắc phục được một số hạn chế còn tồn tại của những phương pháp chẩn đoán vi khuẩn lao thường dùng hiện nay

PCR là phản ứng tổng hợp DNA trong ống nghiệm, cho phép khuếch đại một đoạn DNA đích lên hàng triệu bản sao trong thời gian ngắn PCR đã được ứng dụng rộng rãi trong y sinh học, đặc biệt trong chẩn đoán nguyên nhân một số bệnh nhiễm trùng truyền nhiễm, nhiều nghiên cứu cho thấy đây là kỹ thuật có độ nhạy và độ đặc hiệu cao trong chẩn đoán

Ứng dụng và phát triển kỹ thuật PCR giúp chẩn đoán nhanh và chính xác vi khuẩn gây bệnh lao sẽ giải quyết được yêu cầu cấp bách trong công tác phát hiện và điều trị bệnh lao, góp phần khống chế và đẩy lùi dần bệnh lao trong cộng đồng Từ

yêu cầu thực tế đó chúng tôi tiến hành đề tài: “Đánh giá hiệu quả của kỹ thuật

PCR phát hiện trực tiếp Mycobacterium tuberculosis trong mẫu bệnh phẩm”

Mục tiêu nghiên cứu:

1 Phát hiện nhanh vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis trong các mẫu bệnh

phẩm thu nhận từ những bệnh nhân nghi mắc lao phổi và tràn dịch màng phổi do lao bằng kỹ thuật PCR

2 Đánh giá hiệu quả của kỹ thuật PCR trong việc phát hiện nhanh vi khuẩn lao

Mycobacterium tuberculosis

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh lao

Lao là một trong những bệnh được ghi nhận sớm nhất trong lịch sử y học Bệnh lao được phát hiên trước Công nguyên ở Ấn Độ, Ai Cập, Hy Lạp và các nước vùng Trung Á Thời kỳ này bệnh lao được xếp lẫn với một số bệnh khác, đặc biệt là các bệnh ở phổi Trong một thời gian dài, người ta quan niệm đây là bệnh không chữa được và là bệnh di truyền [2, 3, 4]

Năm 1882, Robert Kock tìm ra nguyên nhân gây bệnh lao là trực khuẩn lao, ông được giải thưởng Nobel y học năm 1905 và sau đó trực khuẩn lao được mang tên nhà bác học R.Koch (trực khuẩn BK-Bacille de Koch) [16, 27, 28]

Từ đầu thế kỷ XX, xuất hiện nhiều công trình về dị ứng và phòng bệnh lao Năm 1907, Von Pirquet áp dụng phản ứng da để xác định tình trạng nhiễm lao Năm 1908, Mantoux dùng tuberculin tiêm trong da để phát hiện dị ứng lao (nay gọi

là phản ứng Mantoux) Cũng năm 1908, Calmette và Guérin bắt đầu nghiên cứu tìm vacxin BCG (Bacille Calmette Guérin) được sử dụng phòng bệnh lao trên người [14]

Thời kỳ đầu, điều trị lao gặp nhiều khó khăn, một số phương pháp được áp dụng điều trị như dinh dưỡng, bơm hơi màng phổi, màng bụng, phẫu thuật thành ngực hay cắt bỏ tổn thương Tiếp sau đó, các thuốc điều trị lao như Rimifon, Streptomycine, Rifampicin, Pyrazinamid, đã lần lượt được tìm ra Hội nghị chống lao quốc tế lần thứ 23 ở Mexico (1975) nêu 12 loại thuốc đặc hiệu điều trị bệnh lao Những thành tựu y học đã đạt được mở ra thời kỳ phòng chống và tiêu diệt bệnh lao trên quy mô toàn cầu

1.2 Tình hình bệnh lao trên thế giới và ở Việt Nam

1.2.1 Tình hình bệnh lao trên thế giới

Hiện nay, trên thế giới có khoảng 2,2 tỷ người đã nhiễm lao (chiếm 1/3 dân

số thế giới) Theo số liệu công bố của Tổ chức Y tế thế giới (WHO, 2004), ước tính trong năm 2003 có thêm khoảng 9 triệu người mắc lao mới và 2 triệu người

chết do lao Khoảng 95% số bệnh nhân lao và 98% số người chết do lao ở các nước có thu nhập vừa và thấp, 75% số bệnh nhân lao cả nam và nữ ở độ tuổi lao động Trong đó, có khoảng 80% số bệnh nhân lao toàn cầu thuộc 22 nước có gánh nặng bệnh lao cao

Đến năm 2008, theo ước tính của WHO thì tỷ lệ bệnh nhân lao lưu hành là 11,1 triệu ca (tương ứng với tỷ lệ lưu hành là 164 ca/100.000 dân); tỷ lệ các trường hợp mới nhiễm ước tính là 9,4 triệu ca (tương ứng với tỷ lệ mắc mới 139 ca/100.000 dân) cao hơn so với năm 2007 (9,3 triệu ca); trong số đó có 12 trong

15 nước có gánh nặng cao về lao nằm ở châu Phi (nơi mà tỷ lệ mắc lao ước tính khoảng 363 ca/100.000 dân) Cũng trong năm này số liệu cho thấy có 1,3 triệu ca

tử vong do lao (tương đương 20 ca tử vong/100.000 dân) bao gồm cả lao đồng

nhiễm HIV, trong đó nữ chiếm 0,5 triệu [2, 8, 9, 10, 12]

Hiện tại, tỷ lệ điều trị thành công trên toàn cầu đạt 82%, nhưng tỷ lệ phát hiện chỉ đạt 37% số bệnh nhân ước tính Như vậy, còn rất nhiều bệnh nhân lao không được chữa trị đang tiếp tục lây bệnh cho cộng đồng, và theo ước tính của WHO, mỗi năm có thêm 1% dân số thế giới bị nhiễm lao (65 triệu người)

Theo WHO, phân bố của bệnh lao theo khu vực như sau: Châu Á 55%, châu Phi 30%, Trung Đông 7%, châu Âu 5%, châu Mĩ 3%

Mức độ nặng nề của bệnh lao đã ảnh hưởng tới thu nhập quốc dân và chỉ số phát triển con người của các quốc gia Các nghiên cứu về kinh tế y tế cho thấy, mỗi bệnh nhân lao sẽ mất trung bình 3-4 tháng lao động, làm giảm 20-30% thu nhập bình quân của gia đình Những gia đình có người chết sớm vì bệnh lao có thể

sẽ mất tới 15 năm thu nhập.[43, 44, 45]

Bảng 1.1 Ước tính bệnh nhân lao mới mắc năm 2002 theo khu vực (WHO) [43, 46]

Khu vực Số BN (nghìn) Tỷ lệ/100 000 Tử vong do lao (bao

WHO và nhiều đối tác đang kêu gọi tăng cường sự hợp tác và liên kết giữa Chương trình chống lao quốc gia và Chương trình HIV/AIDS, đặc biệt là ở Cam-pu-chia, Trung Quốc, Pa-pua-Niu-Ghi-nê và Việt Nam, là những nơi có số người đồng nhiễm Lao/HIV đang gia tăng Nghiên cứu về tỷ lệ HIV trong số bệnh nhân lao tại Cam-pu-chia năm 2003 cho thấy tại thủ đô Phnom Penh, tỷ lệ bệnh nhân lao

có HIV (+) tăng gần gấp 3 lần so với năm 1995 (từ 11% năm 1995 lên 31% năm

2003) [15]

1.2.3 Tình hình bệnh lao ở Việt Nam

Ở Việt Nam, bệnh lao còn phổ biến và có tỷ lệ mắc cao Việt Nam đứng thứ

12 trong 22 nước có số bệnh nhân lao cao trên loàn cầu (WHO, 2008) Trong khu vực Tây - Thái Bình Dương, Việt Nam đứng thứ ba sau Trung quốc và Philipinnes

về số lượng bệnh nhân lao lưu hành cũng như bệnh nhân lao mới xuất hiện hàng năm

Năm 1995, trước những biến động xấu đi của tình hình dịch tễ bệnh lao toàn cầu, công tác chống lao thực sự bắt đầu phải đối mặt với những thách thức mới là bệnh lao kháng thuốc và Lao/HIV, Nhà nước và Bộ Y tế Việt Nam đã quyết định

đưa “Chương trình chống lao” thành một trong những Chương trình y tế quốc gia

trọng điểm Cùng với sự đầu tư phát triển các Chương trình y tế quốc gia nói chung, Bộ Y tế và Chính phủ đã ưu tiên đầu tư đồng bộ lượng rất lớn cán bộ, kinh phí và trang thiết bị cho Chương trình chống lao

Trong giai đoạn 1997-2002, Chương trình chống lao quốc gia (CTCLQG)

đã phát hiện được 532.703 bệnh nhân lao các thể, tỷ lệ phát hiện đạt 82% số bệnh nhân ước tính (so với mục tiêu của WHO là 70%), CTCLQG đã điều trị 260.698 bệnh nhân lao phổi AFB(+) với tỷ lệ khỏi là 92%

Nhân ngày Thế giới Chống lao 24/3/2004, tại Diễn đàn các Đối tác chống lao lần thứ 2 do WHO tổ chức tại New Dehli, CTCLQG Việt Nam là một trong 6 nước trên thế giới (bao gồm: Việt Nam, Pêru, Madives, Cuba, Tunisia và Morocco) và là nước duy nhất trong 22 nước có gánh nặng bệnh lao cao được

nhận giải thưởng của WHO về thành tích đã đạt được mục tiêu của WHO và kết quả có tính bền vững trên 4 năm [1, 8, 9, 10]

Năm 2006, Dự án phòng, chống lao quốc gia phối hợp với Tổ chức Y tế thế giới ước tính chỉ số dịch tễ bệnh lao ở Việt Nam như sau [5]

- Tỷ lệ người bệnh lao mới các thể: 173/100.000 dân

- Tỷ lệ người bệnh lao phổi AFB (+) mới: 77/100.000 dân

- Tỷ lệ hiện mắc các thể: 225/100.000 dân

- Tỷ lệ người bệnh lao mới nhiễm HIV: 5,0 %

- Tỷ lệ kháng đa thuốc ở người bệnh lao mới: 2,7%

- Tỷ lệ kháng đa thuốc ở người bệnh lao đã điều trị: 19%

Hiện giờ nguy cơ nhiễm lao hàng năm ở nước ta ước tính là 1,5% (ở các tỉnh phía Nam là 2%, ở các tỉnh phía Bắc là 1%)

Bảng 1.2 Số liệu ước tính bệnh lao của nước ta hàng năm (với dân số 70-80 triệu)

Số mới mắc lao (mọi thể): 130.000

Số lao phổi AFB (+) mới: 60.000 Tổng số trường hợp lao: 260.000 Tổng số lao phổi AFB (+): 120.000 Qua theo dõi một số địa phương cho thấy xu hướng tăng số lượng bệnh nhân Lao/HIV hàng năm Số lượng bệnh nhân Lao/HIV tăng sẽ làm tăng gánh nặng và giảm hiệu quả của CTCLQG vì việc chẩn đoán bệnh lao ở người HIV(+) khó khăn hơn, tỷ lệ tử vong trong số bệnh nhân Lao/HIV cao hơn sẽ làm giảm kết quả điều trị khỏi bệnh của Chương trình

Theo số liệu giám sát trọng điểm của Chương trình HIV/AIDS cho thấy tỷ lệ HIV(+) trong số bệnh nhân lao năm 2002 trên cả nước khoảng 3,2%, trong đó có

10 tỉnh tỷ lệ này là trên 3% (Hồ Chí Minh 9,4% và An Giang 4,8%) Năm 2007 tỷ

lệ này là 8,1% Như vậy, lượng bệnh nhân đồng nhiễm Lao/HIV không ngừng tăng lên, gây nhiều khó khăn cho Chương trình chống lao quốc gia, cũng như làm tổn hại đến nền kinh tế [7, 8, 9, 10]

1.3 Đặc điểm của bệnh lao và đặc điểm của vi khuẩn lao

1.3.1 Đặc điểm của bệnh lao

1.3.1.1 Bệnh lao là một bệnh nhiễm trùng

Nguyên nhân gây ra bệnh lao được Robert Koch tìm ra năm 1882 do trực khuẩn lao Bacille de Kock gọi tắt là BK (Hiện nay trực khuẩn lao được gọi tắt là

AFB-Axit Fast Bacilli) Chủ yếu là loại trực khuẩn lao người Mycobacterium

tuberculosis homonis Ngoài ra còn cả trực khuẩn lao bò M bovis, trực khuẩn lao

không điển hình M atypic

Bệnh lao là bệnh lây theo con đường hô hấp, khi người lao phổi có AFB dương tính ho, các hạt đờm có trực khuẩn lao nhiễm vào không khí Những người xung quanh hít phải các hạt này vào phổi, trực khuẩn lao qua đó xâm nhập vào cơ thể Bệnh lao cũng có thể lây qua đường ăn uống, đường tiếp xúc là khi trực khuẩn lao qua những con đường này lọt vào cơ thể Nhưng đờm của người bệnh lao AFB dương tính vẫn là quan trọng nhất (nhất là loại trực khuẩn lao kháng thuốc)

1.3.1.2 Bệnh lao là bệnh lây

Tất cả các bệnh nhân lao đều có thể là nguồn lây, nhưng mức độ lây rất khác nhau Đối với các thể lao ngoài phổi (lao màng não, màng bụng, hạch, xương khớp ) được gọi là các thể lao “kín”, nghĩa là vi khuẩn ít khả năng nhiễm vào môi trường bên ngoài Lao phổi là thể bệnh dễ đưa vi khuẩn ra môi trường bên ngoài (lượng không khí lưu thông trong một chu kỳ hô hấp trung bình là 500ml), vì vậy bệnh nhân lao phổi là nguồn lây quan trọng nhất Nhưng ngay đối với lao phổi thì mức độ lây cũng khác nhau Những bệnh nhân lao phổi trong đờm có nhiều vi

khuẩn có thể phát hiện bằng phương pháp nhuộm soi trực tiếp thì khả năng lây cho người khác gấp 2 đến 10 lần các bệnh nhân lao phổi phải nuôi cấy mới phát hiện được vi khuẩn Bệnh nhân lao phổi có vi khuẩn trong đờm phát hiện được bằng phương pháp soi trực tiếp là nguồn lây nguy hiểm nhất (còn gọi là nguồn lây chính) Bệnh lao ở trẻ em không phải là nguồn lây quan trọng vì có tới 95% bệnh lao ở trẻ

em không tìm thấy vi khuẩn trong các bệnh phẩm

1.3.1.3 Bệnh lao diễn biến qua hai giai đoạn

Giai đoạn nhiễm lao

Vi khuẩn lao xâm nhập vào đến phế nang, các tế bào bảo vệ được huy động tới (chủ yếu là đại thực bào) để tiêu diệt chúng Sự tương tác giữa vi khuẩn và đại thực bào làm cho một số vi khuẩn bị chết Nhưng một số vi khuẩn không bị tiêu diệt, tiếp tục phát triển nhân lên trong đại thực bào Sự thay đổi về hình thể và chức năng của một số tế bào tại tổn thương dần dần hình thành nang lao Trong đa số trường hợp tổn thương có thể tự khỏi (có hiện tượng lắng đọng calci, hình thành nốt vôi) và không có biểu hiện lâm sàng Phản ứng da với Tuberculin bắt đầu dương tính từ tuần thứ 3, sau khi vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể, nhưng miễn dịch đầy đủ của cơ thể chống lại bệnh lao phải sau 2 - 3 tháng Như vậy, nhiễm lao là giai đoạn đầu tiên khi vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể gây tổn thương đặc hiệu (thường là ở phổi) Đa số trường hợp không có biểu hiện lâm sàng; cơ thể hình thành dị ứng và miễn dịch chống lao Khi chưa có đại dịch HIV/AIDS thì chỉ có khoảng 5 - 10% người bị nhiễm chuyển thành bệnh lao Nếu nhiễm lao đồng thời với có HIV thì ít nhất 30% nhiễm lao chuyển thành bệnh lao

Giai đoạn lao bệnh

Đa số người bị bệnh chỉ ở tình trạng nhiễm lao (80- 90%) không chuyển sang giai đoạn lao bệnh Gọi lao bệnh là lao thứ phát khi sức đề kháng của cơ thể giảm,

số lượng và độc tính của vi khuẩn lao tăng nhanh, đặc biệt ở các nhóm người mắc bệnh toàn thân như: loét dạ dày, đái tháo đường, nghiện rượu, nghiện ma túy, HIV,… sẽ hình thành lao thứ phát

1.3.1.4 Bệnh lao có thể phòng và điều trị có kết quả

Phòng bệnh

- Giải quyết nguồn lây:

Giải quyết nguồn lây bằng cách phát hiện sớm và điều trị khỏi bệnh là làm mất một mắt xích quan trọng trong vòng xoắn lan truyền bệnh Có thể nói giải quyết nguồn lây là biện pháp phòng bệnh hiệu quả nhất

- Tiêm phòng lao bằng vaccin BCG cho trẻ sơ sinh và dưới 1 tuổi có thể hạn chế mắc lao tới 80%

1.3.1.6 Một số yếu tố thuận lợi dễ mắc bệnh lao

Tiếp xúc với nguồn lây

Những người tiếp xúc với nguồn lây nhất là nguồn lây chính dễ có nguy cơ

bị bệnh Trẻ em càng nhỏ tiếp xúc với nguồn lây càng dễ bị bệnh hơn

Trẻ em chƣa tiêm phòng lao bằng vaccin BCG

Tuy còn có ý kiến khác nhau về khả năng bảo vệ của vaccin BCG, nhưng hầu như các công trình đều đánh giá là tiêm vaccin BCG giúp cho trẻ em tránh được

các thể lao nặng như lao kê, lao màng não, Cần chú ý đến kỹ thuật tiêm và chất lượng của BCG mới đạt được hiệu quả mong muốn

Một số bệnh tạo điều kiện thuận lợi dễ mắc bệnh lao

Bệnh lao dễ phát sinh và phát triển trong 3 tháng đầu của thời kỳ thai nghén

và sau đẻ Điều này được giải thích do thay đổi nội tiết của cơ thể mẹ tạo điều kiện cho vi khuẩn phát triển

Yếu tố cơ địa

Sự khác nhau về khả năng mắc bệnh lao giữa các dân tộc đã được y học nhận xét từ lâu Sự khác nhau về kháng nguyên hoà hợp tổ chức HLA (Human Leucocyte Antigene), về di truyền haptoglobulin, về các gene cảm thụ giữa người bệnh và người không mắc bệnh đã được nêu lên Tuy nhiên cần phải tiếp tục nghiên cứu về vấn đề này [26, 27, 31, 32]

1.3.1.7 Các thể bệnh lao

Lao phổi: là thể lao chủ yếu thường gặp ở người lớn chiếm 80% tổng số

trường hợp lao mọi thể Nguyên nhân chính là do trực khuẩn lao M tuberculosis, ngoài ra còn do một số trực khuẩn lao bò (M bovis), M kansassii, M avium

Lao màng não: thể lao này chiếm 12% trong tổng số các thể lao ngoài phổi

thường gặp ở người lớn Còn ở trẻ em, đây là thể lao chiếm tỉ lệ cao thứ hai sau sơ nhiễm

Lao màng phổi: là thể lao ngoài phổi đứng thứ 2 sau lao hạch Tại Việt

Nam, lao màng phổi là bệnh phổ biến Lao màng phổi là căn nguyên hàng đầu trong các bệnh lý gây tràn dịch màng phổi Theo ước tính của Chương trình chống lao quốc gia, lao màng phổi chiếm khoảng 39% trong các thể lao ngoài phổi và 80,6%

các trường hợp tràn dịch màng phổi [9]

Lao xương khớp: thể lao này chiếm 13% trong tổng số các thể lao ngoài

phổi Bệnh do AFB theo đường máu lan đến các khớp (bắt đầu từ khớp đốt sống) gây ra

Lao tản mạn: là thể lao do AFB từ một ổ bã đậu ban đầu lan tràn bằng

đường máu, đường bạch huyết để gây tổn thương ở phổi và các cơ quan khác Lao tản mạn chiếm tỉ lệ khá thấp trong các thể lao, dao động từ 10% - 13% Ở bệnh nhân HIV/AIDS, tỉ lệ lao tản mạn cao hơn khoảng 40% - 44%, ngoài ra còn có một

số thể lao khác thường gặp như: lao màng phổi chiếm 27%, lao hạch chiếm 20%, lao màng bụng chiếm 6,5%, lao thận, lao ruột, lao thanh quản

1.3.2 Đặc điểm vi khuẩn lao

1.3.2.1 Một số đặc điểm sinh học và phân loại

Phân loại học: Vi khuẩn lao thuộc

Ngành (phylum): Actinobacteria

Bộ (ordo): Actinomycetales

Phân bộ (subordo): Corynebacterineae

Họ (familia): Mycobacteriaceae

Chi (geneus): Mycobacterium

Loài (species): M tuberculosis

Một số cách phân loại:

- Phân loại dựa vào khả năng gây bệnh cho người và các động vật: Vi khuẩn lao

người, vi khuẩn lao bò, vi khuẩn lao chim, vi khuẩn lao chuột

- Phân loại dựa trên cấu trúc DNA: Đoạn IS6110 với 1361 cặp base chỉ có ở 4 loài là: M tuberculosis, M bovis, M africanum và M microti mà không có ở các chi

khác Tại khoa Vi sinh - Bệnh viện lao phổi Trung ương nhận thấy với các chủng vi

khuẩn lao ở Châu Á thì có 71% vi khuẩn có từ 5 đoạn IS6110 trở xuống, trong khi

vi khuẩn cổ điển tỷ lệ này là 10%

- Vi khuẩn kháng cồn, kháng toan không điển hình: Đây là nhóm không phân biệt được với vi khuẩn lao bằng phương pháp nhuộm soi kính, trước thập kỉ 80 của thế

kỉ XX chúng ít gây bệnh ở người, thường chỉ gây bệnh lao ở bệnh nhân bị bụi phổi, ghép cơ quan và điều trị corticoid kéo dài [7, 27, 28, 31, 32, 33]

Một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn lao

- Vi khuẩn lao có khả năng tồn tại lâu ở môi trường bên ngoài Ở điều kiện tự

nhiên, vi khuẩn có thể tồn tại 3 – 4 tháng Trong phòng thí nghiệm người ta có thể bảo quản vi khuẩn trong nhiều năm

- Vi khuẩn lao là loại vi khuẩn hiếu khí Khi phát triển vi khuẩn cần đủ oxy, vì vậy

giải thích tại sao lao phổi là thể bệnh gặp nhiều nhất và số lượng vi khuẩn nhiều nhất trong các hang lao có phế quản thông

- Vi khuẩn lao sinh sản chậm Trong điều kiện bình thường, trung bình 18- 24 giờ vi khuẩn lao phân bào 1 lần, nhưng có khi hàng tháng, thậm chí “nằm vùng” ở tổn

thương rất lâu (Persister), khi gặp điều kiện thuận lợi chúng có thể tái triển lại

- Vi khuẩn lao có nhiều quần thể chuyển hoá khác nhau ở tổn thương Có những quần thể vi khuẩn phát triển mạnh, nằm ngoài tế bào (Nhóm A); có những quần thể vi khuẩn phát triển chậm, từng đợt (Nhóm B); có những vi khuẩn nằm trong tế bào (Nhóm C) Những quần thể vi khuẩn này chịu tác dụng khác nhau tuỳ từng thuốc chống lao

- Vi khuẩn lao nhìn thấy trên vi trường bắt mầu đỏ trên nền hơi xanh của tiêu bản không có lông, hai đầu tròn, thân có hạt, hình que cong, nhỏ, đứng thành từng đám, hay từng đôi song song hay hình chữ V hay riêng rẽ Chúng có chiều dài từ 3 đến 5

m, rộng 0,3 – 0,5m [7, 24, 27, 28]

Hình 1.1 Vi khuẩn lao M t uberculosis soi dưới kính hiển vi

1.3.2.2 Một số đặc điểm về nuôi cấy

Tuỳ thuộc vào phương pháp khử nhiễm khuẩn và loại môi trường nuôi cấy, chỉ cần vài đến 10 vi khuẩn là có thể phát hiện được vi khuẩn lao Tuy nhiên không thể sử dụng các kỹ thuật nuôi cấy vi khuẩn thông thường để phân lập vi khuẩn lao

từ bệnh phẩm lâm sàng, vì vi khuẩn lao có thời gian sản sinh rất chậm (tạo ra thế hệ sau mất 18-24 giờ) Chúng không mọc ở bệnh phẩm cũng như môi trường hoá chất đơn giản Vi khuẩn lao chỉ nhân lên được ở trong môi trường nuôi cấy đặc biệt chứa đầy đủ đường, đạm, dưỡng khí, các loại muối, các vitamin, pH từ 6,8 đến 7,2 và nhiệt độ từ 370C- 380C Những vi khuẩn mới phân lập từ bệnh phẩm của bệnh nhân

có khả năng tự tổng hợp các chất kém hơn các vi khuẩn đã được nuôi cấy nhiều lần

ở phòng xét nghiệm vì những vi khuẩn này đã thích ứng với điều kiện đầy đủ các chất dinh dưỡng trong cơ thể

Khuẩn lạc có thể nhìn thấy rõ ít nhất sau 3 tuần nuôi cấy Kết quả dương

tính khi thấy vi khuẩn lao (bao gồm cả M tuberculosis) mọc thành khuẩn lạc nổi

trên bề mặt môi trường, khuẩn lạc có thể rộng, tròn, nhẵn sau đó sần sùi như hoa súp lơ, màu kem và rất khó tan trong nước Kết quả âm tính nếu sau 8 tuần nuôi cấy

không thấy có khuẩn lạc mọc [12, 24, 25].

Hình 1.2 Khuẩn lạc vi khuẩn lao trên môi trường nuôi cấy

1.3.2.3 Một số đặc điểm về thành phần hóa học và cấu trúc vi khuẩn

Thành phần hoá học: 85,9% nước, đạm, đường, mỡ và muối khoáng

- Đạm (tuberculo protein khác): 56% trọng lượng khô của vi khuẩn

- Đường (15%) ở dạng polysaccharide (không độc, ít có tính kháng nguyên, không

gây hiện tượng mẫn cảm, nhưng có hoạt tính trong các phản ứng huyết thanh, các vi

khuẩn độc lực cao thì giảm các đường như arabinose, galactose, và tăng glucose

- Lipit chiếm 10-14%: mycozit-c, cord-factor và các chất sáp, chúng liên quan đến

5 Lớp màng plasma

6 Lớp lipoarabinomannan (LAM)

7 Lớp phosphatidylinositol mannoside

8 Lớp khung vách tế bào

 Bào tương và nhân:

- Bào tương sát thành vi khuẩn gồm 3 lớp phức hợp lipoprotein

- Trong bào tương có nhiều hạt phosphate đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hoá của vi khuẩn, hạt lipit chưa rõ chức năng

- Nhân ở dạng hoà tan: các axit nhân (DNA, RNA) tiếp xúc với mesosome làm cho mối liên quan chặt chẽ giữa các chức năng chuyển hoá, tổng hợp vật chất di truyền

của nhân bào tương và màng tế bào [12, 14, 16, 31 , 32]

1.4 Các phương pháp chẩn đoán vi khuẩn lao và bệnh lao:

Các phương pháp chẩn đoán lao phổi gồm: lâm sàng, X quang, chẩn đoán vi sinh, phản ứng Mantoux và BCG, nội soi, mô bệnh học, tế bào học, các xét nghiệm máu và dịch màng phổi Tùy điều kiện và hoàn cảnh mà áp dụng tổng hợp các biện pháp chẩn đoán Trong đề tài này chỉ đề cập đến các phương pháp chủ yếu sau đây:

1.4.1 Kỹ thuật soi kính trực tiếp

Bệnh phẩm thường là đờm, ngoài ra còn các bệnh phẩm khác như: dịch phế quản, dịch màng phổi, dịch màng não, dịch não tuỷ, Bệnh phẩm được nhuộm bằng phương pháp Zielh-Neelsen hoặc thuốc nhuộm huỳnh quang uramin Dùng NaOH làm đờm lỏng ra, quay li tâm lấy cặn, tập trung vi khuẩn để nhuộm soi Đây

là kỹ thuật đơn giản, nhanh có kết quả, song độ nhạy thấp (từ 25-50%) và không định danh được Có ngưỡng phát hiện vi khuẩn ≥103

vi khuẩn/ml Tuy nhiên, hiện nay phương pháp này vẫn đang được sử dụng rộng rãi trong nước cũng như ở nhiều nước trên thế giới bởi dễ thực hiện, trong điều kiện đơn giản, giá thành rẻ, cho kết quả nhanh Phát hiện được nguồn lây lao chính và giúp theo dõi kết quả điều trị Đối với các thể lao ít vi khuẩn như lao ngoài phổi thì phương pháp này ít có tác dụng [12, 13, 16]

1.4.2 Kỹ thuật nuôi cấy

Vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường Lowenstein-Jensen (Ogawa Mark),

chúng mọc thành các khuẩn lạc hình súp-lơ, mầu trắng ngà Sau 1-2 tháng có khi

lâu hơn mới xác định được kết quả chính xác Phương pháp này có độ nhậy và độ

đặc hiệu cao hơn so với phương pháp soi kính trực tiếp (độ nhậy đạt trên 70% đối

với lao phổi, độ đặc hiệu là 100%), đồng thời phân loại được vi khuẩn lao và cho

phép làm kháng sinh đồ Nhưng phương pháp này đòi hỏi thời gian, giá thành của

phương pháp khá cao không phù hợp với khả năng kinh tế của đa số bệnh nhân nghi

lao [13, 22, 25]

1.4.3 Kỹ thuật PCR

Đây là một trong những kỹ thuật có độ nhậy và độ đặc hiệu cao nhất Kỹ

thuật dựa trên nguyên tắc nhân các đoạn axit nucleic đặc biệt của vi khuẩn lao

M tuberculosis có trong bệnh phẩm bằng cách sử dụng các đoạn mồi

oligonucleotide đặc hiệu PCR là phương pháp rất quan trọng trong chẩn đoán, xác

định tác nhân gây bệnh lao phổi AFB âm tính và lao ngoài phổi, đặc biệt là lao

màng não Mặc dù kỹ thuật này có độ nhậy cao (có thể phát hiện 10-12

g DNA/ml) nên tỷ lệ dương tính giả cũng rất cao Hơn nữa giá thành kỹ thuật cao và đòi hỏi

phương tiện, trang thiết bị hiện đại nên khó có thể ứng dụng phổ cập trong điều kiện

các nước đang phát triển như ở nước ta [1, 19, 23]

1.4.4 Kỹ thuật RFLP

Sử dụng các enzyme cắt endonuclease để tạo một loạt các đoạn DNA nhỏ có

độ dài khác nhau Người ta có thể xác định được toàn bộ DNA của vi khuẩn với kỹ

thuật phân tích các đoạn cắt đa dạng (RFLP) Kỹ thuật này với tính đặc hiệu và độ

nhạy cao, có giá trị trong nghiên cứu dịch tễ song chưa có ý nghĩa trong đánh giá và

chẩn đoán [12, 31, 35]

1.4.5 Phương pháp ELISA

Xác định kháng nguyên của vi khuẩn gây bệnh, phương pháp này sử dụng

kháng thể đơn dòng đặc hiệu với M tuberculosis trong xác định nguyên nhân gây

bệnh lao Phương pháp này cho kết quả nhanh hơn (3 giờ), kỹ thuật và phương tiện

không đòi hỏi cao lắm Độ nhạy và độ đặc hiệu khá cao đối với bệnh nhân lao phổi,

với bệnh lao ngoài phổi phương pháp này vẫn còn hạn chế [12, 19, 24]

1.4.6 Miễn dịch tế bào

Trong chẩn đoán hiện nay phản ứng Mantoux vẫn được sử dụng hầu hết trong các cơ sở chẩn đoán bệnh lao như một trong các dấu hiệu Đây là kỹ thuật

tiêm trong da với một lượng kháng nguyên đặc hiệu của M tuberculosis để phát

hiện phản ứng quá mẫn muộn ở đối tượng nghi lao Thông thường kháng nguyên được sử dụng là kháng nguyên protein tinh khiết (PPD) Do vacxin BCG có thể kích thích một tỉ lệ dương tính nhất định với PPD nên kết quả phản ứng Mantoux chưa đạt được độ đặc hiệu cần thiết [20]

1.4.7 Miễn dịch dịch thể

Các kỹ thuật huyết thanh bắt đầu được sử dụng trong chẩn đoán lao từ sau khi R.Koch tìm ra và mô tả trực khuẩn lao Kỹ thuật huyết thanh có thể là phương pháp chẩn đoán nhanh, đơn giản có thể áp dụng trong các nước phát triển cũng như các nước đang phát triển Ở bệnh nhân AFB âm tính cũng như AFB dương tính, ở trẻ em bị lao cũng như người lớn bị lao, kháng thể dịch thể kháng lao đều ở mức độ cao Đặc biệt có thể sử dụng phương pháp này đối với các đối tượng bệnh nhân lao

bị thiếu hụt miễn dịch và có đáp ứng miễn dịch yếu hoặc âm tính với thử nghiệm Mantoux như bệnh nhân HIV dương tính

Trên thế giới, đã có nhiều nỗ lực nghiên cứu phát triển các kỹ thuật huyết thanh, cho đến nay vẫn chưa có kỹ thuật nào được đưa ra để sử dụng thường xuyên cho chẩn đoán lao Một trong những yếu tố gây khó khăn trong phát triển kỹ thuật huyết thanh vẫn là chất lượng kháng nguyên, và có thể do môi trường ngoại cảnh có chứa nhiều loại vi khuẩn Mycobacteria khác và chúng có khả năng gây phản ứng chéo cao [20]

Trong những năm gần đây nhiều nhóm nghiên cứu đã sử dụng các kỹ thuật miễn dịch khác như: kỹ thuật huỳnh quang (IFT), kỹ thuật miễn dịch phóng xạ, kỹ thuật ngưng kết hạt latex,… để xác định nguyên nhân gây bệnh lao Song các nhóm

nghiên cứu với mục đích phát hiện kháng nguyên M tuberculosis trực tiếp trong

bệnh phẩm đến nay vẫn gặp khó khăn trong khâu xử lý mẫu Do vậy kỹ thuật còn có

1.5.1 Nguyên lý của kỹ thuật PCR

Phản ứng chuỗi polymerase là một kỹ thuật đơn giản, cho phép khuếch đại in

vitro một trình tự DNA lên hàng triệu lần trong vài giờ Phản ứng chuỗi PCR được

thực hiện khi có DNA mẫu, 2 đoạn mồi (mỗi đoạn mồi dài 18-30 bazơ), Taq

polymerase (enzyme chịu nhiệt được tách từ vi khuẩn Thermus aquaticus), bốn loại

deoxyribonucleotide triphosphate (dATP, dTTP, dGTP, dCTP), dung dịch đệm và ion Mg2+ Phản ứng chuỗi PCR được thực hiện trên thiết bị nhân DNA máy PCR [18, 29]

1.5.2 Thành phần phản ứng

Enzyme

Enzyme Taq polymerase là enzyme chịu nhiệt, được tách từ vi khuẩn suối

nước nóng Thermus aquaticus Hoạt tính của enzyme Taq giảm 50% sau 150 phút ở

nhiệt 92,50C; sau 40 phút ở nhiệt độ 950

C và sau 5-6 phút ở nhiệt độ 970C Nếu nhiệt độ tăng lên tới 950C trong 20 giây để biến tính DNA kép thành sợi đơn thì hoạt tính enzyme Taq còn lại 65% sau 50 chu kì phản ứng

DNA khuôn (template)

DNA khuôn là vật liệu khởi đầu cho phản ứng PCR nên đòi hỏi có độ tinh sạch cao DNA khuôn có thể là sợi đơn hoặc sợi đôi của chuỗi DNA được biết trước trình tự ở hai đầu để thiết kế mồi Thông thường, nồng độ của DNA khuôn được đưa vào phản ứng PCR khoảng 10-500ng

Đoạn mồi (primer)

Các đoạn mồi thực chất là các oligonucleotide dài khoảng 4-10 bazơ (đối với mồi ngẫu nhiên) hoặc khoảng 12-24 bazơ (đối với mồi đặc trưng) Nồng độ mồi thích hợp để tiến hành phản ứng PCR là từ 0,1-0,5μM Lượng mồi đưa vào phản ứng PCR phải phù hợp với lượng DNA cần tổng hợp (thường 106 phân tử DNA cần 108 phân tử mồi)

Các nucleotide (dNTPs)

dNTPs là hỗn hợp của bốn loại deoxyribonucleotide (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) làm nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp DNA Tuỳ thuộc vào mục đích nghiên cứu, các nhà khoa học còn có thể sử dụng một số nucleotide đã được thay đổi như gắn thêm biotin hoặc digoxygenein, Nồng độ phản ứng của các dNTP thường dùng vào khoảng 200mM mỗi loại, tuy nhiên ở nồng độ dNTP thấp (10-100mM) Taq DNA polymerase hoạt động chính xác hơn

Mỗi một chu kì PCR gồm 3 giai đoạn cơ bản có nhiệt độ khác nhau:

(1) Giai đoạn tách chuỗi DNA: DNA bị biến tính từ dạng sợi kép thành dạng sợi đơn ờ nhiệt độ 94-950C trong khoảng thời gian rất ngắn (khoảng 1-1,5 phút)

(2) Giai đoạn gắn mồi: Nhiệt độ phản ứng được hạ thấp xuống 40- 650

C cho phép hai đoạn mồi gắn vào DNA mẫu ở vị trí tương đồng theo nguyên tắc bổ sung (A -

T, G - C) ở hai đầu DNA cần nhân

(3) Giai đoạn kéo dài: ở nhiệt độ 720C, DNA Taq polymerase hoạt động kéo dài đoạn DNA từ đoạn mồi và hai đoạn DNA mới được tổng hợp theo nguyên tắc bổ sung từ hai đầu đoạn DNA khuôn ban đầu [18, 29, 40]

1.5.3 Ứng dụng của kỹ thuật PCR trong y học

Bằng kỹ thuật PCR, từ một lượng khuôn DNA rất nhỏ như: một giọt máu, một sợi tóc hay một tế bào,… người ta có thể khuếch đại chính xác, trật tự một lượng lớn lên đến hàng triệu bản nhằm phục vụ cho các quá trình khảo sát trong

phản ứng Trong công nghệ sinh học, PCR được sử dụng trong việc lập bản đồ gene, phát hiện gene, dòng hoá gene, giải mã trình tự DNA,…

PCR được ứng dụng rất rộng rãi trong y học: trong chẩn đoán bệnh ung thư (tìm HPV trong ung thư cổ tử cung, phát hiện gene APC trong ung thư đại tràng, gene BRCA 1 - BRCA 2 trong ung thư vú, gene TPMT trong bệnh bạch cầu trẻ em, gene IgH và TCRy trong u lympho không Hodgkin, gene Rb-105 trong u nguyên bào lưới, gene NF-1,2 trong u xơ thần kinh,…), nghiên cứu về hệ kháng nguyên bạch cầu người (HLA, human lymphocyte antigene),…

Trong Vi sinh học, PCR là một phương tiện hữu dụng để phát hiện các tác nhân vi sinh vật gây bệnh trong các trường hợp:

* Tác nhân không thể nuôi cấy thường quy: như các virus (viêm gan B, viêm gan C, Dengue virus, HIV, Herpes, CMV, EBV, HPV, virus SARS, H5N1,…), các

vi khuẩn (Chlamydia, Legionella, Mycoplasma, Treponema pallidum,…)

* Tác nhân nuôi cấy thường quy cho kết quả chậm: M tuberculosis

* Tác nhân nuôi cấy thất bại vì có mặt rất ít trong bệnh phẩm, đã bị điều trị kháng sinh trước đó (ví dụ: Lao thất bại nuôi cấy, viêm màng não mủ mất đầu,…)

PCR cũng được dùng để xác định độc tố của vi sinh vật: Tiểu đơn vị A của

độc tố ruột không chịu nhiệt của Escherichia coli, và gần đây, các gene eltA và elfB của E coli sinh độc tố ruột (enterotoxigeneic Escherichia coli, ETEC); vt1 và vt2 của E coli gây chảy máu đường ruột (enterohaemorrhagic Escherichia coli; EHEC); eaeA và bfpA của E coli gây bệnh đường ruột (enteropathogeneic

Escherichia coli; EPEC); ial của E coli xâm nhập đường ruột (enteroinvasive Escherichia coli; EIEC) và Shigella đã được khuyếch đại bằng PCR nhằm chẩn

đoán phân biệt giữa các loại Escherichia coli gây tiêu chảy [17, 23, 24, 30, 34, 35]

PCR khuếch đại các gene nói trên đã thay thế hoặc bổ sung cho các thử nghiệm kinh điển có độ nhậy và độ đặc hiệu kém hơn hoặc là thay thế cho các kỹ thuật phức tạp hơn

Độc tố ruột của vi khuẩn tả (CT - cholera toxin) đóng vai trò chủ đạo trong

cơ chế gây bệnh của chúng PCR đã được dùng khuếch đại đoạn gene mã hoá cho

CT; nhờ đó, có thể phân biệt một cách chắc chắn Vibrio cholerae gây bệnh tả thực

sự với các Vibrio cholerae khác, thuộc các nhóm huyết thanh không gây bệnh tả (trước đây gọi là các Vibrio không ngưng kết; nonagglutination, NAG) Clostridium

difficile cũng được định loại thông qua xác định các loại độc tố riêng biệt của chúng

bằng PCR

PCR còn được dùng để nghiên cứu về tính kháng thuốc của vi khuẩn Ví dụ,

khảo sát gene pbp1a và 2a của Streptococcus pneumoniae bằng kỹ thuật

PCR-SSCP, kỹ thuật PCR phát hiện đột biến kháng Rifamicin ở gene rpoB, phát hiện kháng INH do thiếu gene catalase (gene Kat G) của vi khuẩn lao, [36]

Trong lĩnh vực ký sinh trùng, kỹ thuật PCR được dùng trong chẩn đoán lỵ

amíp, Leishmania, Echinococcus, Microsporidia, Giardia, Cryptosporidium,

Toxoplasma gondii,…

1.5.4 Sự đa dạng trong quy trình kỹ thuật và trình tự nucleotide đặc hiệu

đƣợc sử dụng để phát hiện vi khuẩn lao M tuberculosis

Cho tới nay hầu hết các phòng thí nghiệm trên thế giới khi sử dụng phương pháp PCR trong chẩn đoán bệnh lao đều phát triển các thường quy riêng Đoạn khuôn mẫu được sử dụng nhiều nhất là đoạn trình tự axit nucleic nằm trên gen nhảy

IS6110 IS6110 chỉ có mặt trong nhóm M tuberculosis và các Mycobacteria khác thuộc nhóm lao điển hình, và thường có độ lặp lại cao trong hệ gen của M

tuberculosis, do vậy là một trình tự lý tưởng để đóng vai trò là đoạn DNA đích

Ngoài ra một số trình tự khác cũng được sử dụng để phát hiện vi khuẩn lao như

IS986, P36 (đây là các gen nhảy có đặc điểm tương tự như IS6110), 16S rRNA, các

gen mã hóa cho protein 65kDa và 38 kDa,… [1, 11, 12, 37, 42]

Ngoài sự khác nhau về trình tự axit nucleic đích, phương pháp tách chiết DNA, số chu kỳ nhân gen và các phương pháp phát hiện sản phẩm sao chép của PCR cũng khác nhau ở mỗi phòng thí nghiệm Kỹ thuật điện di trên gel agarose hoặc lai ghép với các đoạn mồi đặc hiệu có đánh dấu phóng xạ hoặc sử dụng các đoạn mồi đánh dấu với chất không phóng xạ là các kỹ thuật phổ biến để phát hiện sản phẩm sao chép

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là 67 bệnh nhân nghi mắc lao phổi và 34 bệnh nhân tràn dịch màng phổi nghi do lao đến khám tại Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Thái Nguyên từ tháng 6 năm 2010 đến tháng 2 năm 2011

Trong nghiên cứu này mẫu bệnh phẩm sử dụng cho chẩn đoán phát hiện vi

khuẩn lao M tuberculosis là những mẫu đờm được lấy từ bệnh nhân nghi mắc lao

phổi và dịch chọc dò màng phổi của những bệnh nhân bị tràn dịch màng phổi nghi

do lao

2.2 Dụng cụ và thiết bị xét nghiệm

Các dụng cụ, máy móc, thiết bị cần thiết trong Phòng xét nghiệm tế bào và Phòng nuôi cấy của Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Thái Nguyên; Phòng xét nghiệm

Vi sinh và Sinh học phân tử Trường Đại học Y - Dược Thái Nguyên

- Ống thủy tinh, pipet các loại, đèn cồn, eppendorf…

- Máy PCR (Eppendorf, Đức); Máy điện di (BioRad, USA); Máy ly tâm (Eppendorf, Đức); Lò vi sóng (Sharp); Tủ ấm, tủ sấy (Jeio-Tech); Máy lắc ngang; Water bath (Loip) Máy phân tích và chụp ảnh gel ( Gel DocTM XR, Bio-Rad, USA), Bộ điện di ngang (BioRad, USA); Tủ an toàn sinh học cấp II (ESCO, Singapore)

2.3 Hóa chất xét nghiệm

* Hóa chất nhuộm Ziehl-Neelsen:

Dung dịch Fuchsin Carbol 0,3%; Dung dịch cồn tảy HCI 3% ; Dung dịcMethylene blue 0,3%

* Hóa chất và môi trường nuôi cấy phân lập vi khuẩn lao:

Dung dịch khử tạp (Dung dịch NaOH 4%); Môi trường nuôi cấy Ogawa Mark

* Hóa chất thuần nhất và xử lý mẫu đờm (iVASputaPre Kit, Cty Việt Á):

Pha các dung dịch sử dụng cho 10 mẫu (Bảo quản ở 2-8 0

C)

Dung dịch SP4 (50ml): 250mg SP3 (5 ống) trong 50ml dung dịch SP1 Dung dịch SP5 (50ml): 5ml dung dịch SP2 trong 45ml nước cất vô trùng

Chuẩn bị vừa đủ cho mỗi lần dùng

* Hóa chất tách chiết DNA (iVApDNA Extraction Kit, Cty Việt Á):

Dung dịch pED1 (Dung dịch 1); Dung dịch pEX2 (Dung dịch 2)

Dung dịch pEX3 (Dung dịch 3); Dung dịch EX4 (Dung dịch 4)

Dung dịch ED5 (Dung dịch 5)

* Dung dịch chạy điện di:

2.4 Quy trình nghiên cứu

Hình 2.1 Quy trình nghiên cứu