nghiên cứu nuôi cấy in vitro cây sâm ngọc linh (panax vietnamensis ha et grushv

Xuất phát từ những vấn đề trên, chúng tôi đã chọn đề tài “Nghiên cứu nuôi cấy in vitro cây sâm Ngọc Linh Panax vietnamensis Ha et Grushv.” nhằm góp phần xác định môi trường nuôi cấy thíc

MỞ ĐẦU

Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) là cây

thuốc có giá trị dược liệu và giá trị kinh tế cao, được biết đến trên thế giới với

tên gọi Vietnamese ginseng, ngoài ra còn có các tên khác như: sâm Việt Nam,

sâm Khu V, Thuốc giấu, sâm Đốt trúc, Rợm con Sâm Ngọc Linh phân bố ởvùng núi Ngọc Linh thuộc 2 tỉnh Kon Tum và Quảng Nam, còn có ởLangbian-Lâm Đồng Đặc biệt, Việt Nam là nơi phân bố sâm Ngọc Linh duynhất trên toàn thế giới Điều đáng tự hào là ở sâm Ngọc Linh có thành phầnginsenosid được đánh giá vào loại nhiều nhất so với các loài khác của chi

Panax trên thế giới Ở phần thân rễ chứa các hợp chất saponin (hơn 50 loại),

polyacetylen (7 loại), acid béo, acid amine, các hợp chất sterol, đường tự do,các vi lượng,… Thân và lá cũng có chứa nhiều loại saponin và vi lượng,…được dùng làm thuốc bổ, chữa viêm họng, huyết áp thấp, xuất huyết dạ dày,chống stress,… Sâm Ngọc Linh có thể chế biến thành dạng bột, dạng viên,dạng sâm nước để uống Ngoài ra, sâm Ngọc Linh được đồng bào dân tộc Xê-đăng sử dụng như một vị thuốc trị bá bệnh, tăng lực, chống mệt mỏi,… [4, 6,7]

Dựa trên nhiều bằng chứng nghiên cứu khoa học đã chứng minh loàisâm này có giá trị cao về mặt dược liệu, các nhà khoa học đã xếp sâm Ngọc

Linh vào nhóm sâm quý của thế giới cùng với nhân sâm Triều Tiên (Panax ginseng C.A Meyer), sâm Mỹ (Panax quinquefolium L.) và sâm Tam thất (Panax notoginseng (Burk.) F H Chen) [7].

Hiện nay, mặc dầu nhà nước đã có chủ trương bảo vệ nguồn cây thuốcquý này nhưng nguồn sâm tự nhiên vẫn bị khai thác lén lút, trái phép mộtcách nghiêm trọng, có thể dẫn đến cạn kiệt nguồn sâm tự nhiên Vì vậy, cần

có nhiều nghiên cứu, sản xuất, cũng như đánh giá chuẩn xác về giá trị y học

và giá trị kinh tế của sâm Ngọc Linh Trong các hướng nghiên cứu, hướngnuôi cấy mô hứa hẹn sẽ đưa cây sâm Ngọc Linh phát triển cả về số lượng lẫnchất lượng, đáp ứng đủ nhu cầu của thị trường và mang lại hiệu quả kinh tếcao

Nhân giống hữu tính cây sâm Ngọc Linh bằng cách gieo hạt thôngthường cho tỷ lệ hạt nảy mầm thấp khoảng 30-40% [5], còn nếu nhân giống

vô tính bằng cách cắt đầu mầm của cây sâm sau khi thu hoạch giâm xuốngđất, cho tỷ lệ sống cao (95%) nhưng cây con chỉ mọc vào tháng 2 đến tháng 4

dù trồng bất kỳ ở thời điểm nào trong năm và mỗi đầu mầm chỉ phát triển

thành một cây con [7] Vì vậy, nghiên cứu nhân giống vô tính in vitro cây sâm

Ngọc Linh hết sức cần thiết, nhằm mục đích tạo nguồn cây giống dồi dào đápứng kịp thời cho nhu cầu mở rộng nguồn sâm nguyên liệu

Xuất phát từ những vấn đề trên, chúng tôi đã chọn đề tài “Nghiên cứu

nuôi cấy in vitro cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)”

nhằm góp phần xác định môi trường nuôi cấy thích hợp cho nhân giống vô

tính in vitro của loài sâm này.

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 KHÁI NIỆM VÀ SƠ LƯỢC LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN NUÔI CẤY

MÔ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT

1.1.1 Khái niệm

Hai khái niệm, tính tạo hình và tính toàn năng quyết định sự hiểu biếttrong nuôi cấy mô và tế bào thực vật và sự tái sinh cây Nhiều quá trình phứctạp xảy ra trong các giai đoạn sinh trưởng và phát triển của cây trồng liênquan đến sự thích ứng với điều kiện của môi trường nuôi cấy [41]

Tính tạo hình có thể thay đổi quá trình trao đổi chất, tăng trưởng, vàphát triển theo hướng tốt nhất khi thực vật được nuôi cấy trong môi trườngphù hợp Đặc biệt là khả năng có thể bắt đầu phân chia tế bào từ bất cứ loại

mô nào của cây để tái sinh các bộ phận hoặc trải qua các con đường phát triểnkhác nhau khi có điều kiện kích thích sinh trưởng hợp lý Khi tế bào thực vật

và các mô được nuôi cấy trong ống nghiệm thường thể hiện tính tạo hình rấtcao, một loại mô hoặc cơ quan có thể được hình thành từ một dạng mô khác

và có thể được tái sinh cây hoàn chỉnh [13, 41]

Theo Haberlandt (1902), tất cả các tế bào của một cơ thể đa bào đềumang toàn bộ lượng thông tin di truyền của cơ thể đó và khi gặp điều kiệnthích hợp, mỗi tế bào đều có khả năng tái sinh và phát triển thành một cá thểhoàn chỉnh Tức là, mỗi tế bào riêng rẽ của một cơ thể đa bào đều chứa đầy

đủ toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết của cả sinh vật đó và nếu gặpđiều kiện thích hợp thì mỗi tế bào có thể phát triển thành một cơ thể sinh vật

hoàn chỉnh Sự duy trì tiềm năng di truyền này được gọi là tính toàn năng.Thực tế trong nuôi cấy tế bào và tái sinh ở thực vật cung cấp bằng chứngthuyết phục nhất cho tính toàn năng Nhưng việc xác định điều kiện nuôi cấy

và chất kích thích sinh trưởng có thể rất khó khăn để nhận thấy tính toàn năng

ở thực vật, mà quá trình này chủ yếu dựa vào kinh nghiệm [3, 14, 41]

Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật cho phép tái sinh chồi hoặc cơquan từ các mô như lá, thân, hoa, rễ, củ hoặc đỉnh sinh trưởng Trước kiangười ta dùng phương pháp này để nghiên cứu các đặc tính cơ bản của tế bàonhư sự phân chia, đặc tính di truyền và ảnh hưởng của các hóa chất đối với tếbào và mô trong quá trình nuôi cấy [3, 41]

Nuôi cấy mô và tế bào thực vật là sự duy trì và nuôi dưỡng mô, tế bào,

cơ quan hay cây hoàn chỉnh của thực vật trong điều kiện in vitro Kỹ thuật

nuôi cấy mô dùng cho cả mục đích nhân giống và cải thiện di truyền như sảnxuất sinh khối các sản phẩm hóa sinh, bệnh học thực vật, duy trì và bảo quảnnguồn gen quý,… Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật là một trongnhững thành công sớm nhất và đã được ứng dụng rộng rãi nhất của công nghệ

sinh học Việc ứng dụng nhân giống vô tính in vitro đã thành công nhiều ở rất

nhiều loài thực vật mà trước đây các phương thức nhân giống truyền thốnggặp rất nhiều khó khăn [3, 14]

1.1.2 Sơ lược lịch sử phát triển của nuôi cấy mô và tế bào thực vật

Lịch sử phát triển của nuôi cấy mô và tế bào thực vật có thể chia làm 3giai đoạn như sau:

1) Giai đoạn khởi đầu từ năm 1902 – 1933, Gottlibe Haberlandt (1902),đưa ra giả thuyết về “tính toàn năng của tế bào thực vật” Tuy nhiên, ông đã

không thành công với các tế bào mô mềm, biểu bì do chúng không thể phânchia được.

2) Giai đoạn thứ hai từ năm 1934 – 1965, phát hiện ra các hormonesinh trưởng đầu tiên và xây dựng được các môi trường cơ bản

3) Giai đoạn ba từ 1965 – 1978 – đến nay, phát hiện ra các kĩ thuật nuôicấy mô có ý nghĩa như tạo cây đơn bội, nuôi cấy tế bào trần, kết hợp nuôi cấy

mô tế bào với kỹ thuật gen,…

Từ năm 1898, Gottlibe Haberlandt đã tiến hành nuôi cấy tế bào ởnhiều loài thực vật nhưng không thành công Đến năm 1902, ông đưa raphương pháp nuôi cấy tế bào thực vật để chứng minh cho tính toàn năng của

tế bào và cho rằng mỗi tế bào bất kỳ của sinh vật nào cũng đều mang toàn bộlượng thông tin di truyền của cơ thể đó và có khả năng phát triển thành cơ thểhoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi [3] Kotte và Robbins (1922) đã thànhcông khi nuôi cấy rễ cây ngô Fritz Went (1926) đã tìm ra chất kích thích sinhtrưởng (KTST) đầu tiên là 3-indoleacetic acid (IAA), đã giúp cho việc nuôicấy mô thực vật có nhiều thuận lợi hơn Cũng trong thời gian này, hàng hoạtvitamin nhóm B cũng được phát hiện như: thiamin (vitamin B1), pyridoxin(vitamin B6), nicotinic (vitamin B3),… có vai trò lớn thúc đẩy sinh trưởngtrong nuôi cấy [19]

Năm 1939, Philip R White đã nuôi cấy liên tục cây cà rốt và câythuốc lá trong ống nghiệm, Folke Skoog phát hiện ra đặc tính mới và quantrọng của các KTST nhóm auxin, Skoog và Murashige phát triển môi trườngdinh dưỡng chuẩn Murashige-Skoog (MS) được ứng dụng rộng rãi trong nuôicấy mô và tế bào thực vật, Gautheret và Nobecourt đã duy trì được sự sinh

trưởng của callus cà rốt (Daucus carota) trong một thời gian dài Năm 1946,

Ball đã tái sinh cây hoàn chỉnh từ nuôi cấy mô phân sinh chồi cà rốt, Morel

và Martin tạo được cây Thược dược (Dahlia) sạch virus từ nuôi cấy mô phân

sinh chồi của cây bị nhiễm [19] Năm 1955, Miller và cs đã tìm ra cấu trúc vàsinh tổng hợp kinetin (KIN), là một cytokinin trong nuôi cấy mô thực vật[10] Skoog và Miller (1957) khám phá vai trò của tỷ lệ nồng độauxin/cytokinin trong nuôi cấy mô thực vật Cooking (1960) đã tạo ra sốlượng lớn tế bào trần ở những thực vật khác nhau nhờ sử dụng enzyme phângiải thành tế bào [12]

Năm 1966, Guha và cs đã nuôi cấy thể đơn bội từ bao phấn củacây cà độc dược thành công [12] Bourgin và Nitsch (1967) tạo cây đơn bộithành công ở cây thuốc lá [10]

Với sự ra đời của enzyme giới hạn vào đầu những năm 1970,nuôi cấy mô bắt đầu hướng tới một lĩnh vực nghiên cứu công nghệ thực vậtmới Các tế bào toàn năng của thực vật có thể được thay đổi bằng cách chèncác gen ngoại lai đặc trưng để tạo ra cây trồng biến đổi gen [48]

Trong vòng 30 năm trở lại đây, kỹ thuật nhân giống in vitro đã

tạo nên cuộc cách mạng lớn trong nhân giống thực vật và hướng tới mục tiêu

áp dụng kỹ thuật này để sản xuất cây giống thương mại Kỹ thuật nhân giống

in vitro đã trở thành một phương pháp nhân giống chuẩn và phổ biến đối với

nhiều loại cây trồng như: cây công nghiệp, cây lâm nghiệp, cây cảnh, câydược liệu, cây ăn trái và rau xanh Hiện nay, kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bàothực vật kết hợp với các kỹ thuật gen được ứng dụng rộng rãi trong nôngnghiệp, lâm nghiệp, y học,… để nhân giống, chọn dòng, lai xa nhiều loài thựcvật, chuyển gen vào cây trồng, sản xuất giống cây trồng, cung cấp nguồndược liệu,…

1.2 NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY TRỒNG

1.2.1 Môi trường nuôi cấy in vitro

Trong nuôi cấy in vitro, tất cả các nhu cầu của các tế bào thực vật, cả

chất hóa học và tác dụng của nó phải đáp ứng được trong bình nuôi cấy: môitrường phát triển và môi trường bên ngoài (ánh sáng, nhiệt độ,…) Môi trườngphát triển cần cung cấp đầy đủ các các ion khoáng chất cần thiết cho sự tăngtrưởng và phát triển Trong nhiều trường hợp cũng phải cung cấp bổ sungthêm chất hữu cơ như amino acid và vitamin Trong các điều kiện nuôi cấykhông quang hợp thì cũng yêu cầu bổ sung một nguồn carbon cố định ở dạngđường (thường là sucrose) Một thành phần quan trọng khác cũng phải đượccung cấp đó là nước, chính là dung môi của các quá trình sinh học Các yếu tốvật lý như pH, nhiệt độ, môi trường khí, ánh sáng (chất lượng, thời gian), và

áp lực thẩm thấu cũng phải được duy trì trong giới hạn [3, 14, 41]

Trong môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật, thành phần phụ giaquan trọng nhất quyết định kết quả nuôi cấy là các chất điều khiển sinhtrưởng Có bốn nhóm chất điều hòa sinh trưởng chung đó là auxin, cytokinin,gibberellin và abscisic acid, những chất này có vai trò quan trọng trong nuôicấy mô Tỷ lệ của các chất điều hòa sinh trưởng cần cho sự tạo rễ và chồi rấtkhác nhau, và mô là nơi dường như liên quan trực tiếp với lượng chất điềuhòa sinh trưởng được tổng hợp nội sinh ở các tế bào của mẫu nuôi cấy [3, 30,

31, 32, 33]

Cơ sở cho việc xây dựng các môi trường nuôi cấy là xem xét các thànhphần cần cho sự sinh trưởng và phát triển của cây Thành phần môi trườngnuôi cấy tế bào và mô thực vật thay đổi tùy theo loài và bộ phận nuôi cấy Đốivới cùng một mẫu cấy nhưng tùy theo mục đích thí nghiệm thì thành phần

môi trường cũng sẽ thay đổi tùy theo giai đoạn phân hóa của mẫu cấy [3, 14,41]

1.2.1.1 Các thành phần của môi trường nuôi cấy

* Các nguyên tố đa lượng

Trong môi trường nuôi cấy cung cấp các nguyên tố đa lượng cần thiếtcho sự tăng trưởng và phát triển của thực vật Các nguyên tố đa lượng gồm:nitrogen, phosphore, potassium, magnesium, calcium, sulphur Những nguyên

tố này thường chiếm 0,1% trọng lượng khô của thực vật [3, 41]

* Các nguyên tố vi lượng

Các nguyên tố vi lượng cần thiết với hàm lượng rất thấp cho thực vậtsinh trưởng, phát triển và nhiều vai trò sinh lý khác Các nguyên tố vi lượngthường bao gồm: manganese, iodine, copper, cobalt, boron, molybdenum,iron và zinc [3, 11, 14, 41]

* Hữu cơ bổ sung

Hai loại vitamin là thiamine (vitamin B1) và myo-Inositol (được xem là

một loại vitamin B), được cho là cần thiết cho nuôi cấy in vitro tế bào thực

vật và các amino acid thường sử dụng nhất là arginine, asparagin, asparticacid, alanine, glutamic acid, glutamine và proline [3, 41]

* Nguồn carbon

Nguồn carbon được sử dụng gồm: sucrose, glucose, maltose, galactose

và sorbitol Nhưng sucrose được sử dụng phổ biến nhất do nó dễ tìm, giá rẽ,

dễ hấp thu và tương đối ổn định Các nguồn carbon khác cũng có thể được sửdụng nếu nó thật sự tối ưu hơn so với sucrose [3, 11, 41]

* Các tác nhân làm rắn môi trường

Khi nuôi cấy in vitro tế bào thực vật trên môi trường rắn, các gel tạo

một giá đỡ cho mô sinh trưởng trong điều kiện tĩnh Agar là một loạipolysaccharide thu được từ một số loài tảo, chúng có ưu điểm hơn các tácnhân tạo gel Gelatin ở nồng độ cao (10%) cũng có hiệu quả tạo gel nhưng bịhạn chế sử dụng vì nó nóng chảy ở nhiệt độ thấp (25 oC) Các hợp chất khác

đã được thử nghiệm thành công bao gồm methacel, alginate, phytagel và rite [3, 41]

gel-Tóm lại, các thành phần này là những nhu cầu hóa chất cơ bản của môitrường nuôi cấy tế bào thực vật Tuy nhiên, tùy vào các điều kiện của mô hìnhthí nghiệm mà chúng ta có thể thiết kế một môi trường tối ưu cho sự sinhtrưởng và phát triển trong nuôi cấy tế bào thực vật

1.2.1.2 Điều chỉnh sự phát triển của thực vật và nuôi cấy mô

Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật là các thành phần quan trọngquyết định hướng phát triển của các tế bào thực vật Các chất điều hòa sinhtrưởng thực vật được sử dụng nhất thường là các hormone tự nhiên của thựcvật hoặc các chất điều hòa sinh trưởng được tổng hợp

Trong nuôi cấy tế bào thực vật các nhóm chất điều hòa sinh trưởngđược sử dụng gồm:

* Auxin

Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng rộng rãi trongnuôi cấy mô thực vật Trong đó, IAA là auxin tự nhiên có trong mô thực vật,còn NAA, IBA, 2,4-D là các auxin nhân tạo, thường các auxin nhân tạo cóhoạt tính mạnh hơn

Tên viết tắt / Tên Tên hóa học

2,4-D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid

2,4,5-T 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid

Dicamba 2-methoxy-3 ,6-dichlorobenzoic acid

MCPA 2-Methyl-4-chlorophenoxyacetic acid

NOA 2-Naphthyloxyacetic acid

Picloram 4-amino-2,5,6-trichloropicolinic acid

Auxin có ở các bộ phận của cây như mô phân sinh đỉnh, các bộ phậnnon của cây (auxin nội sinh) Khi sử dụng auxin trong nuôi cấy cần lưu ý đếnđặc điểm của đối tượng cần nghiên cứu, đặc tính của auxin (ngoại sinh) đểxác định khoảng nồng độ và loại auxin cần thiết.

Auxin có khả năng thúc đẩy sự phân chia tế bào và phát triển của tếbào, tạo và nhân nhanh callus, tạo phôi soma (2,4-D), kích thích sự phân hoácủa các mô dẫn, kích thích tạo chồi bất định (khi auxin ở nồng độ thấp) [3, 11,

31, 41]

* Cytokinin

Các cytokinin là dẫn xuất của adenine Các cytokinin được sử dụngthường xuyên nhất là BAP, zeatin và 2-iP là các cytokinin tự nhiên, còn BA

và KIN là các cytokinin nhân tạo

Tên viết tắt / Tên Tên hóa học

Zeatin 4-Hydroxy-3-methyl-trans-2-butenylaminopurine

Cytokinin có khả năng kích thích phân chia tế bào, tạo và nhân callus,kích thích phát sinh chồi trong nuôi cấy mô, tạo chồi bất định (khi ở nồng độcao), ức chế sự hình thành rễ [3, 11, 41, 32]

* Gibberelin

Gibberellin được tạo ra trong đỉnh rễ, chồi, lá non, hạt Đóng vai tròquan trọng đối với nhiều quá trình sinh lý như: sinh lý ngủ nghỉ của hạt vàchồi, sinh lý phát triển của hoa, làm tăng sinh trưởng chiều dài của thực vật,

Người ta đã phát hiện được trên 60 loại thuộc nhóm gibberellic acid(GA), nhưng chỉ có một vài loại GA là được sử dụng trong các môi trườngnuôi cấy mô thực vật và GA3 là phổ biến nhất [3, 11, 41, 33]

* Abscisic acid

Abscisic acid là một chất điều hòa sinh trưởng thực vật tự nhiên đượctạo ra trực tiếp từ acid mevalonic hoặc do sự phân giải carotenoid Chúngđược tạo ra trong lá, quả, đỉnh rễ, hạt

Abscisic acid có khả năng ức chế phân chia tế bào, gây ra sự ngủ nghỉcủa chồi, làm chậm sự nảy mầm của hạt và sự ra hoa, đóng khí khổng, tăngcường khả năng chống chịu của tế bào thực vật đối với điều kiện ngoại cảnhbất lợi [3, 11, 30, 41]

Vào những năm 1950, chất điều hòa sinh trưởng thực vật bắt đầu được

mô tả và sử dụng trong nuôi cấy tế bào thực vật Tuy nhiên, có một số khókhăn do sự khác biệt lớn trong đáp ứng giữa các loài, giống và thậm chí cảcây trồng trong các điều kiện khác nhau Auxin và cytokinin được sử dụngrộng rãi nhất trong nhóm các chất điều hòa sinh trưởng trong nuôi cấy môthực vật Tỷ lệ auxin/cytokinin rất quan trọng đối với sự phát sinh hình tháitrong các hệ thống nuôi cấy Trong môi trường nuôi cấy cho phát sinh phôi(embryogenesis), tạo callus hoặc tạo rễ, cần sử dụng tỷ lệ auxin/cytokinin cao

Ở trường hợp tạo chồi và chồi nách, cần sử dụng tỷ lệ auxin/cytokinin thấp [3,

30, 31, 32, 41]

1.2.2 Một số phương thức nhân giống in vitro

Phương thức nhân giống vô tính in vitro là một bước tiến bộ vượt

bậc của khoa học kỹ thuật trong công tác nhân giống cây trồng, nó đã có thểthay thế cho phương thức nhân giống cổ điển (gieo hạt, giâm cành, giâm chồi,chiết, ghép, tách dòng,… ) và giải quyết những khó khăn mà phương pháp cổđiển không thể vượt qua

1.2.2.1 Nhân giống in vitro từ các cấu trúc sinh dưỡng

* Nhân giống in vitro thông qua nuôi cấy mô phân sinh đỉnh

Các bộ phận nhỏ nhất của đỉnh chồi hay đỉnh sinh trưởng làm mẫu vậtnuôi cấy, bao gồm mô phân sinh đỉnh và các mầm lá non Nhưng rất khóthành công khi nuôi cấy các mô phân sinh đỉnh riêng rẽ có kích thước nhỏ vàchỉ được ứng dụng với mục đích tạo cây trồng sạch bệnh Nên trong nhân

giống in vitro người ta thường nuôi cấy cả đỉnh chồi hoặc đỉnh sinh trưởng [3,

11, 41]

Nếu độ lớn của chồi nuôi cấy tăng thì tỷ lệ sống và tính ổn định về mặt

di truyền của chồi tăng và ngược lại Nhưng chồi nuôi cấy càng lớn thì khảnăng mang mầm bệnh càng cao, chồi nuôi cấy càng nhỏ thì khả năng mangmầm bệnh càng thấp Do đó, phải kết hợp hài hòa được các yếu tố trên để tìm

ra phương thức lấy mẫu tối ưu [3]

Nếu mẫu được nuôi cấy trên môi trường thích hợp, từ mộtđỉnh sinh trưởng, mẫu sẽ phát triển thành một chồi hay nhiều chồi Chồi tiếptục phát triển vươn thân, ra lá và rễ để trở thành một cây hoàn chỉnh Xét vềnguồn gốc của các cây đó có ba khả năng: 1) Cây phát triển từ chồi đỉnh; 2)Cây phát triển từ chồi nách phá ngủ; 3) Cây phát triển từ chồi mới phát sinh[3, 11]

* Nhân giống in vitro thông qua nuôi cấy chồi bất định

Theo phương thức này, đỉnh chồi bất định có thể phát triển trực tiếptrên mẫu hoặc gián tiếp thông qua callus từ sẹo trên bề mặt vết cắt của mẫu(đoạn thân, mảnh lá, cuống lá, hoa, nhánh củ, đoạn mầm) Chồi bất định

có thể phát triển gián tiếp thoáng qua giai đoạn hình thành callus từ các chồi

in vitro Các chồi sau đó phát triển từ ngoại vi mô callus và không có liên kết

với các mô có mạch dẫn của mẫu ban đầu Tại các tế bào nhu mô nằm ở trongbiểu bì hoặc ngay phía dưới bề mặt của thân, chồi bất định sẽ phát sinh trựctiếp [3, 8, 11]

1.2.2.2 Nhân giống in vitro thông qua giai đoạn callus

Cây hoàn chỉnh nếu được tái sinh trực tiếp từ mẫu vật nuôi cấy in vitro ban đầu thì nhanh chóng thu được cây và khá đồng nhất về mặt di

truyền Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp mô nuôi cấy không tái sinh cây

ngay mà phát triển thành khối callus Callus là một khối tế bào phát triển vô

tổ chức, hình thành do sự phản phân hóa của các tế bào đã phân hóa Tế bàocallus khi cấy chuyển nhiều lần sẽ không ổn định về mặt di truyền Để tránhtình trạng đó nhất thiết phải sử dụng loại callus vừa phát sinh, tức là callus sơcấp để tái sinh cây thì hy vọng sẽ thu được cây tái sinh đồng nhất [3, 41]

1.2.2.3 Nhân giống in vitro thông qua phát sinh phôi vô tính

Ở một số loài, sự phát sinh phôi vô tính hình thành trực tiếp từ nhữngphôi bất định nằm trong phôi tâm Phôi vô tính rất giống phôi hữu tính ởhình thái, quá trình phát triển và sinh lý, nhưng do không phải là sản phẩmcủa sự thụ tinh giữa giao tử đực và giao tử cái, mà nó có nguồn gốc từ phôisoma, vì vậy không có quá trình tái tổ hợp di truyền, các phôi vô tính giốnghệt với các tế bào soma đã sinh ra chúng về bản chất di truyền [3, 41]

Từ phôi vô tính có thể sản xuất hạt nhân tạo bằng cách bọc nótrong một hạt polymer như: agar, agarose, alginate… Trong cấu trúc lưới củacác hạt đó, nước, chất dinh dưỡng và chất sinh trưởng được cung cấp thay chonội nhũ, giúp cho phôi vô tính có thể nảy mầm trở thành cây hoàn chỉnh [3,

12, 11]

1.3 TỔNG QUAN MỘT SỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG

IN VITRO CÂY SÂM

1.3.1 Một số kết quả nghiên cứu nuôi cấy in vitro chi Panax

Sâm là cây thuốc có giá trị dược liệu và giá trị kinh tế cao, có nhiều chi,

họ khác nhau nhưng chủ yếu là các loại thuộc chi Panax Hiện nay, các nhà

khoa học trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu thành công trongviệc chứng minh giá trị về tác dụng của nó trong y học cũng như việc ứng

dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào nhằm khai thác mọi tiềm năng vốn

có trong loại dược liệu quí này [1, 4, 7, 9]

Năm 1993, Sarita và cs đã tiến hành nghiên cứu nhân nhanh phôi soma

bất định ở cây nhân sâm (Panax ginseng C A Meyer), thấy rằng phôi soma

và phôi phát sinh từ callus được hình thành từ phôi hợp tử non Phôi somađược nhân nhanh từ các phôi ngẫu nhiên có sự sinh trưởng và phát triển phụthuộc vào hormone sinh trưởng trong môi trường Trong đó, nhóm auxin được

sử dụng gồm 2,4-D, NAA, IAA ở nồng độ 1,0 mg/l đã làm tăng nhanh sốlượng phôi soma nuôi cấy ở lần thứ hai và thứ ba từ phôi soma ban đầu Cònnhóm cytokinin (KIN, BA) làm ức chế phôi bất định Sau đó, phôi soma đượctăng trưởng và tái sinh thành cây con thông qua hai giai đoạn, đầu tiên là kéodài chồi trên môi trường MS có bổ sung 1,0 mg/l KIN, tiếp theo là tạo rễ trênmôi trường MS bổ sung 1,0 mg/l KIN và 1,0 mg/l GA3 [42]

Shoyama và cs (1996) đã tiến hành vi nhân giống cây sâm Tam thất

(Panax notoginseng) phát sinh từ phôi soma và phân tích RAPD của cây con

tái sinh Phôi soma phát sinh từ callus bắt nguồn từ nụ hoa non của sâm Tamthất trong 18 tuần nuôi cấy trên môi trường ½ MS có bổ sung GA và BA Cácmôi trường tối ưu nhất cho sự hình thành rễ là môi trường MS có bổ sungNAA DNA tổng số được chiết xuất từ lá của cây con tái sinh của cây sâmTam thất Phân tích RAPD sử dụng 21 đoạn mồi ngẫu nhiên, nhóm nghiêncứu đã thấy được tính đồng nhất về di truyền của cây sâm Tam thất Các sảnphẩm khuếch đại là đơn hình cho tất cả các cây con được tái sinh bằng cáchtạo phôi, cho thấy phôi soma có thể được sử dụng cho vi nhân giống vô tínhcủa loài cây này [44]

Yong và Woong (1997) đã nghiên cứu sự tăng cường hình thành phôisoma đơn bằng cách tiền xử lý co nguyên sinh (pre-plasmolyse) từ lá mầmcây Nhân sâm đã nuôi cấy Các tác giả cho biết, nuôi cấy mô lá mầm của phôihữu tính cây nhân sâm trên môi trường MS không có chất điều hòa sinhtrưởng đã tạo trực tiếp phôi soma Phôi soma chỉ được hình thành gần vết cắtcủa lá mầm Những phôi đa và/hoặc phôi đơn được hình thành với tần số khácnhau tùy theo mức độ trưởng thành của phôi được sử dụng khi cấy Nhưngkhi cấy phôi hữu tính đã được tiền xử lý co nguyên sinh bằng sucrose 1,0 Mtrong 24 giờ, thì tần số hình thành phôi đơn đã tăng cao ở bất kỳ mức độtrưởng thành nào của lá mầm [51].

Năm 1998, Yong và cs đã tái sinh cây nhân sâm thông qua sự hìnhthành chồi bất định từ mô lá mầm Ở đây, mô lá mầm của sâm Triều Tiênhình thành phôi soma trực tiếp trên môi trường không có chất điều hòa sinhtrưởng và kết quả có 89% mô cấy đã hình thành phôi soma Cytokinin ức chếmạnh quá trình hình thành phôi soma nhưng kích thích sự hình thành chồi bấtđịnh trực tiếp Trong đó, BAP có hiệu quả hơn kinetin cho sự hình thành chồibất định Khi kết hợp auxin (IBA 0,05 mg/l) với cytokinin (BAP 5 mg/l) sẽlàm tăng cường sự hình thành chồi bất định, với tần số cao nhất là 40% Chồibất định được hình thành chủ yếu ở phần bên trong, còn phôi soma được hìnhthành gần vết cắt của lá mầm Chồi phát triển từ chồi bất định sau khi cấychuyển lên môi trường MS có bổ sung GA3 (10 mg/l) Rễ được hình thành từcác chồi khi cấy trên môi trường ½ MS có bổ sung auxin (IAA) Sau đó, câyhoàn chỉnh được đem trồng trong nhà kính với tỉ lệ sống là 36% [50]

Jianyong và cs (1999) đã nuôi cấy tế bào Nhân sâm (từ rễ của Panax ginseng C A Meyer ) trên môi trường bổ sung carbohydrate khác nhau bao

gồm sucrose, glucose, fructose, ở nồng độ 10-110 g/l Sucrose là nguồn cung

cấp carbon tốt hơn các monosaccharide khác cho sự phát triển của tế bào nhânsâm và nồng độ tối ưu là từ 30 đến 50 g/l Sự gia tăng nồng độ ban đầu trongphạm vi này làm tăng mật độ tế bào tối đa và chỉ số tăng trưởng đáng kể,trong khi đó nồng độ cao hơn lại ức chế sự phát triển của tế bào Sự cung cấpnguồn sucrose và một số thành phần khác của môi trường khi mô phát triểnlàm tăng chỉ số tăng trưởng hơn 60-70% và năng suất sinh khối hơn 50%[26].

Claire và cs (2000) nghiên cứu vai trò của polyamine và các con đường

trao đổi chất trong phôi soma của nhân sâm (Panax ginseng) trong nuôi cấy

lỏng Khả năng tạo phôi từ callus trong nuôi cấy lỏng là một quá trình gồm bathử nghiệm: nuôi cấy huyền phù tế bào có bổ sung một hỗn hợpauxin/cytokinin, chỉ bổ sung auxin và chỉ bổ sung cytokinin Kết quả cho thấykhi kết hợp các polyamine hoặc tiền chất của nó (arginine và ornithine) vàomôi trường tái sinh để cảm ứng thì số lượng phôi tăng lên đến 4 lần [17]

Claire và cs (2002) đã xác định vai trò ảnh hưởng tốt của các auxinkhác nhau và các polyamine ở những giai đoạn hình thành và phát triển phôi

soma của nhân sâm trong nuôi cấy in vitro Nhóm nghiên cứu nhận định việc

sản xuất cây con khả thi thông qua sự phát sinh phôi của nhân sâm cần có môitrường nuôi cấy khác nhau tương ứng ở các giai đoạn phát triển kế tiếp Cácảnh hưởng của auxin và polyamine đã được thử nghiệm ở các thí nghiệm khácnhau Nhân nhanh callus từ rễ gốc phôi trên môi trường tối ưu ½ MS bổ sung

3-(benzo [b] selenyl) acetic acid (BSAA) và KIN; Các polyamine ngoại sinh

sử dụng ở giai đoạn này sẽ có hại như gây ra hóa nâu callus, làm giảm khảnăng khởi đầu tạo phôi và xu hướng tăng sự thủy tinh hóa Sử dụng BSAA làauxin thuận lợi nhất ở giai đoạn khởi đầu và nó được tăng cường hoạt độngkhi có sự hiện diện của các polyamine, mà spermidine là hiệu quả nhất Các

auxin cần thiết hiệu quả nhất ở giai đoạn tái sinh phôi đó là BSAA vàseleniated 2,4-D (2,4-D-Se) Spermidine có ảnh hưởng cao đến sự phát triểnđồng thời cả chồi và rễ [18].

Năm 2002, Marta và cs đã xác định vai trò đặc trưng của spermidinetrong giai đoạn khởi đầu phát sinh phôi soma ở nhân sâm Sự phát sinh phôisoma của sâm Triều tiên đã được bắt đầu từ khối huyền phù của callus trongmôi trường ½ MS có bổ sung auxin tổng hợp là BSAA Nhóm nghiên cứuthấy rằng khi bổ sung thêm spermidine vào môi trường ban đầu này, đã tăngđáng kể số lượng phôi soma [37]

Jung và cs (2005) nghiên cứu sự tăng trưởng và sản xuất saponin của rễnhân sâm trong các môi trường nuôi cấy, đánh giá theo giá trị pH, nồng độnitơ, sucrose và phosphate khác nhau Độ pH của môi trường không có tácđộng tăng trưởng rễ đáng kể, nhưng ảnh hưởng rõ ràng đến hàm lượngsaponin Hàm lượng saponin thu được tối đa là 0,26% ở pH 6,0 Nồng độ tối

ưu tăng trưởng rễ và sản xuất saponin là 30 g/l sucrose, 382,7 mg/l nitơ và40,4 mg/l phosphate [27]

Sijun và cs (2005) đã xây dựng quy trình sản xuất cây giống sâm bắc

Mỹ (Panax quinquefolium L.) hiệu quả cao thông qua phát sinh phôi soma từ

mẫu cấy lá mầm Nhóm tác giả đã tiền xử lý mẫu lá mầm bằng sucrose 1,0 M

ở 4oC, kết quả đã cải thiện chất lượng phôi và tần số phát sinh phôi Tần sốphát sinh phôi thứ cấp ở mô có nguồn gốc từ phôi soma được nuôi cấy trênmôi trường MS bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D và 1,0 mg/l NAA đạt 90% Nhữngphôi soma có thể phát triển xa hơn đến trưởng thành trên môi trường SH bổsung 1% than hoạt tính và một nửa chúng có thể nảy mầm Khoảng 85% phôi

đã nảy mầm có thể chuyển thành cây với hệ thống rễ cái phát triển tốt trên

môi trường ½ MS với 0,5% than hoạt tính Tỷ lệ sống của cây con khi đượctrồng trong phòng nuôi và bên ngoài môi trường lần lượt là 95,6% và 93,7%.[45].

Xiang và cs (2007) thực hiện tái sinh cây thông qua phát sinh phôi

soma trực tiếp ở cây sâm Nhật Bản (Panax japonicus) Phôi soma trực tiếp

thu được từ các phôi hữu tính trên môi trường MS có bổ sung 4,4 M 2,4-D.Sau đó, phôi soma thứ cấp được nuôi cấy lặp đi lặp lại Việc tạo phôi somathứ cấp được tăng cường bằng cách tiền xử lý co nguyên sinh (1,0 Mmannitol trong 10 giờ) Tần số hình thành phôi soma lần thứ hai từ các đoạn

lá mầm đã giảm xuống, nhưng số lượng phôi soma trên mỗi mẫu cấy lại tănglên rất nhiều Khi có tiền xử lý co nguyên sinh sẽ làm chậm quá trình pháttriển và thích ứng môi trường mới của phôi ở giai đoạn lá mầm Nếu khôngtiền xử lý co nguyên sinh thì phôi lá mầm được tạo thành sau 8 tuần nuôi cấy.Tất cả lá mầm của phôi soma đã được tiền xử lý đều phát triển trên môitrường MS bổ sung 5 M GA3, nhưng trên môi trường đối chứng không cóhormone chỉ có 15,3% mẫu phát triển Sau 2 tháng nuôi trên môi trường ½

WPM (Woody Plant Medium), cây con đã ra hoa một cách tự nhiên Trong bao phấn của hoa in vitro, sự phát sinh vi bào tử (microsporogenesis) xảy ra

bình thường với số lượng hạt phấn thấp [49]

Năm 2008, Thành và cs đã nhân nhanh rễ bất định của nhân sâm Triềutiên trên môi trường MS cơ bản, kết quả thu được sự hình thành và phát triểncủa callus thích hợp nhất là 2,4-D, còn IBA là thích hợp cho sự hình thành vàtăng trưởng của rễ bất định Số rễ được hình thành trên môi trường bổ sungIBA nhiều hơn so với NAA Nồng độ sucrose ban đầu đã ảnh hưởng đến sựtăng trưởng sinh khối tế bào và sản phẩm saponin, kết quả cho thấy nồng độ

sucrose 50 g/l là tối ưu nhất cho sự sinh trưởng của rễ bất định với khối lượngkhô (KLK) là 1,62 ± 0,19 g [9]

1.3.2 Một số nghiên cứu nuôi cấy in vitro sâm Ngọc Linh

Năm 1968, Vũ Đức Minh đã tìm thấy cây thuốc này tại vùng núi NgọcLinh và đặt tên là sâm Khu 5 Năm 1973, đoàn điều tra cây thuốc của Ban

Dân y Khu 5 đã phát hiện một loài Panax mọc hoang thành quần thể trên

vùng núi Ngọc Linh về phía triền núi Kon Tum và đặt tên là sâm Đốt trúc với

tên khoa học là Panax articulatus Năm 1976, công trình nghiên cứu sơ bộ

của Nguyễn Thới Nhâm tại Ba lan cho thấy thành phần saponin của sâm NgọcLinh khá giống nhân sâm Vào năm 1985, tên khoa học của sâm Ngọc Linh

được xác định là Panax vietnamensis Ha et Grushv., thuộc họ nhân sâm (Araliaceae), loài sâm thứ 20 được tìm thấy trên thế giới [4, 7].

Năm 2007, Thanh và cs đã nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôicấy đến sự tăng trưởng sinh khối và sự tích lũy sản phẩm ginsenoside trongnuối cấy tế bào lỏng của sâm Ngọc Linh Kết quả cả môi trường MS đầy đủ

và ½ MS đều làm tăng sinh khối và tăng sản xuất ginsenoside, thu được 9,8 g/

l và 6,81 mg/l KLK Khi tăng nồng độ sucrose từ 20 đến 50 g/l thì KLK cũngtăng từ 5,4 g/l lên đến 10,3 g/l, nhưng khi tăng nồng độ sucrose cao hơn 60 g/

l thì dẫn đến sự kìm hãm tăng trưởng tế bào, khi nồng độ 70 g/l sucrose thìdẫn đến giảm sinh khối và giảm tích lũy ginsenoside [46]

Luong và cs (2009) nghiên cứu về ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy

đến sự hình thành callus và sinh khối tế bào ở Panax vietnamesis, cho thấy

trong bốn loại môi trường được sử dụng (MS, White, Gamborg và Nitch), môitrường MS cho thấy kết quả tốt nhất, tỷ lệ hình thành callus thành công vàkhối lượng tế bào hình thành được 30% và tương ứng với 62,93 ± 3,63 mg

KLK Ở môi trường Nitch cho kết quả thấp nhất, tỷ lệ hình thành callus vàsinh khối tế bào tương ứng là 15% và 27,10 ± 2,24 mg KLK Kết quả chothấy rằng môi trường MS là thích hợp nhất cho sự hình thành callus và sản

xuất sinh khối tế bào ở Panax vietnamesis [34].

Năm 2009, Nguyễn Thành Sum và cs đã khảo sát môi trường thích hợptạo rễ bất định và nhân sinh khối sâm Ngọc Linh Sử dụng mẫu có kích thước1,0×1,0×0,25 cm cấy trên môi trường MS có bổ sung 30 g/l sucrose, 8,0 g/lagar và 2,4-D với các nồng độ khác nhau Thực nghiệm cho thấy, môi trườngchứa 3 mg/l 2,4-D đã cho kết quả hình thành mô sẹo và rễ bất định tốt nhấtsau 2 tháng nuôi cấy Những đoạn cắt 1,0 cm của những mẫu rễ bất định nàysau đó được chuyển sang môi trường MS, White và Gamborg (B5) có bổ sung

30 g/l sucrose, 8,0 g/l agar, và IBA hoặc NAA với các nồng độ khác nhau.Nghiên cứu cho thấy môi trường White có bổ sung NAA đã đạt được kết quảtăng sinh khối rất khả quan Trong môi trường White bổ sung 3,0 mg/l NAA,thích hợp cho sự phát triển rễ bất định ở sâm Ngọc Linh [8]

Dương Tấn Nhựt và cs (2010), nhân giống vô tính sâm Ngọc Linh vàtrồng thử nghiệm ở giai đoạn vườn ươm Callus được cảm ứng từ củ sâmNgọc Linh được cắt thành lát mỏng và cấy lên môi trường MS bổ sung 1,0mg/l 2,4-D và 0,2 mg/l TDZ (thiadizurol), trong điều kiện chiếu sáng 16giờ/ngày Môi trường tốt nhất cho tỷ lệ tăng sinh khối callus là môi trường

MS bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D kết hợp 0,2 mg/l TDZ Số chồi tái sinh từ callusđạt cao nhất trên môi trường SH (Schenk và Hilderbrandt – 1972) bổ sung 1,0mg/l BA, 1,0 mg/l NAA và 2 g/l than hoạt tính Trong giai đoạn tăng trưởngchồi, môi trường ½ MS được bổ sung 1,0 mg/l BA và 0,5 mg/l NAA, 50 g/lsucrose, 2,0 g/l than hoạt tính và được đặt trong điều kiện ánh sáng đèn LED70% đỏ và 30% xanh là tốt nhất Sau 6 tháng trồng ngoài khu vực vườn ươm

cho thấy tốc độ sinh trưởng nhanh hơn so với cây sâm Ngọc Linh gieo bằng

hạt với tỷ lệ sống sót của 1000 cây sâm in vitro là 87% [6].

Nguyễn Thị Liễu và cs (2011) đã nghiên cứu khả năng tạo rễ bất địnhcủa sâm Ngọc Linh, mẫu cấy được thu thập từ củ sâm tươi có kích thước1,0×1,0×0,25 cm trên môi trường MS có bổ sung 50 g/l sucrose, 8,0 g/l agar,1,0 mg/l 2,4-D cho kết quả hình thành callus và rễ bất định tốt nhất sau 2tháng nuôi cấy Rễ bất định được cắt 1,0 cm và cấy chuyển lên môi trườngGamborg (B5) được bổ sung 50 g/l sucrose, 8,0 g/l agar, 5,0 mg/l IBA, kếtquả hình thành và phát triển rễ bất định cũng như sự tăng sinh khối rất tốt Từkết quả ban đầu này đã mở ra một hướng nghiên cứu mới là tạo sinh khối rễsâm Ngọc Linh trong thời gian ngắn, số lượng nhiều, chủ động nguồn nguyênliệu để cung cấp cho ngành dược, giảm dần số lượng nhập khẩu, tiết kiệmđược nguồn vốn và giảm giá thành sản phẩm [5]

Năm 2011, Nhut và cs đã tạo rễ và vi nhân giống sâm Ngọc Linh từ lá

có nguồn gốc nuôi cấy từ callus Các phương pháp cảm ứng lá có nguồn gốc

từ callus, nhân nhanh callus, cảm ứng chồi bất định và tái sinh cây sâm NgọcLinh đã được kiểm tra Trong nghiên cứu này, callus được hình thành trên cảhai môi trường có riêng rẽ 2,4-D hoặc kết hợp với TDZ Callus cảm ứng cótần số cao nhất thu được trên môi trường MS bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D và 0,2mg/l TDZ Môi trường nhân nhanh callus tốt nhất là môi trường SH có bổsung 0,2 mg/l TDZ và 1,0 mg/l 2,4-D Số lượng chồi có nguồn gốc từ callusthu được cao nhất (8,2 chồi) trên môi trường SH vừa bổ sung 50 g/l sucrosekết hợp với 2,0 mg/l BA Tạo rễ từ chồi bất định tốt nhất trên môi trường SH

có bổ sung 1,0 mg/l NAA Cây con đã được di thực thành công với tỷ lệ sống85% và chiều dài rễ tăng đáng kể sau hai tháng trồng trên núi Ngọc Linh [38]

1.3.3 Khái quát về sâm Ngọc Linh

1.3.3.1 Đặc điểm hình thái

Sâm Ngọc Linh là cây thân thảo, sống lâu năm, có chiều cao từ 0,4-0,8

m Thân rễ (củ) nạc gồm nhiều đốt, phân nhánh, nằm ngang, đường kính 2,5 cm, phần đầu có nhiều vết sẹo do thân khí sinh tàn lụi hàng năm Thân rễcòn mang nhiều rễ phụ, ở cây hoang dại, thân rễ là phần phát triển mạnh nhấtchứa chất dự trữ và hoạt chất Hình dạng rất thay đổi, rễ củ ở cây sâm hoangdại rất phát triển có dạng con quay, hình trụ, có màu vàng nhạt mang nhiều rễcon với những vàm ngang Lá kép chân vịt, gồm 2-3 lá mọc vòng; lá chétthuôn, dài 10-14 cm, rộng 3,0-5,0 cm; gốc nhọn, đầu vuốt nhọn; mép khíarăng cưa; cuống lá chét dưới 1 cm Hoa mọc ở ngọn, cụm hoa thường gồm 1tán, cá biệt có tán phụ, cuống cụm hoa dài 15-30 cm Hoa nhỏ, màu trắng ngà,cuống hoa 1,0-1,5 cm; đài 5, hợp ở gốc, hình tam giác rộng; nhị 5, chỉ nhịmảnh; bầu 2 ô, cá biệt 1 ô, đầu nhụy chẻ đôi Quả hình cầu hoặc hình cầu hơidẹt, đường kính 0,6-1,0 cm, khi chín màu đỏ, có chấm đen Mỗi quả có 1-2hạt, gần tròn, đường kính 2,0-3,0 mm, màu trắng xám Đối với sâm trồng, rễ

1,5-củ rất phát triển, tăng trưởng hàng năm rất rõ rệt, chúng có ba dạng chính:dạng củ cà rốt, dạng con quay và dạng bó củ (là dạng rất phổ biến) Sâm NgọcLinh trồng thường cao đến 1 m, mang nhiều lá kép có khi đến 7 lá chét to hơnbình thường [2, 4, 7]

1.3.3.2 Vùng phân bố

Loài sâm này phát triển tự nhiên ở vùng núi Ngọc Linh thuộc hai tỉnhKon Tum và Quảng Nam, ngoài ra còn có ở núi Langbian thuộc tỉnh LâmĐồng Việt Nam là nơi phân bố duy nhất của sâm Ngọc Linh trên toàn thế

giới [2, 4, 7]

1.3.3.3.Đặc điểm sinh thái học

Cây sâm Ngọc Linh đặc biệt ưa ẩm và ưa bóng, thường mọc rải ráchoặc thành đám nhỏ dưới tán rừng kín thường xanh ẩm; độ cao 1900-2300 m

so với mực nước biển Nhiệt độ trung bình của vùng có sâm mọc tự nhiên từ15-18oC, độ ẩm 90%, lượng mưa khoàng 3000 mm/năm; đất nhiều mùn, giàudinh dưỡng Hàng năm, phần thân mang lá tàn lụi vào tháng 11; đến tháng 3năm sau mọc lên thân mới, ra hoa vào tháng 4-5, quả chín vào tháng 9,10.Sâm được tái sinh tự nhiên từ hạt hoặc từ phần đầu mầm thân rễ [2, 4, 7]

1.3.3.4 Thành phần hóa học

Hợp chất saponin được xem là thành phần hoạt chất chủ yếu của sâm

Ngọc Linh cũng như của các loài sâm khác trên thế giới Các saponin

dammaran được xem là hoạt chất quyết định cho các tác dụng sinh học [20]

Về mặt hoá học, thân rễ và rễ củ sâm Ngọc Linh đã phân lập được 52loại saponin, trong đó có 26 loại saponin thường thấy ở sâm Triều Tiên, sâm

Mỹ, sâm Nhật Bản, đại diện chính là Ginsenoside-Rb1, Ginsenosid-Rg1,Ginsenosid-Rd và 26 loại saponin mới phát hiện trong sâm Ngọc Linh, đạidiện chính là: majonosid-R1, majonosid-R2 Đặc biệt majonosid-R2 chiếm50% hàm lượng saponin toàn phần của sâm Ngọc Linh Trong lá và cuống lá

đã phân lập được 19 saponin dammaran, trong đó 8 saponin có cấu trúc mới.Ngoài thành phần saponin, trong sâm Ngọc Linh đã xác định có 17 loại acidamin, 20 chất khoáng vi lượng và 0,1% hàm lượng tinh dầu [4, 7, 20, 25]

Bộ phận nằm dưới mặt đất của cây sâm Ngọc Linh trồng có khuynhhướng phát triển thành một rễ củ thay vì một thân rễ như ở cây mọc hoangdại Từ bộ phận này của cây sâm Ngọc Linh trồng tại Trại Dược liệu Trà

Linh, tỉnh Quảng Nam, các nhà khoa học đã chiết xuất, phân lập và xác địnhcấu trúc của 5 loại saponin damaran gồm ginsenosid-Rb1, ginsenosid-Rd,ginsenosid-Rg1, vina-ginsenosid-R11 và majonosid-R2 Các kết quả nghiêncứu cho thấy sâm Ngọc Linh trồng chứa thành phần saponin tương tự cây sâmmọc hoang trong tự nhiên (hàm lượng saponin thô trong sâm trồng là 19,7%,gần tương đương với sâm thiên nhiên 21,3%) [7, 25]

1.3.3.5 Tác dụng dược lý

Các công trình nghiên cứu dược lý và lâm sàng cho thấy sâm NgọcLinh có những tác dụng rất giống nhân sâm như: cải thiện tình trạng suynhược của cơ thể chống mệt mỏi, làm gia tăng sự vận động tự nhiên, trí thôngminh và sự nhanh nhẹn khéo léo, kháng viêm, giảm đau, phục hồi khí huyết,chống oxy hóa Ngoài ra, nó còn có tác động kháng khuẩn đáng kể đối với các

loài Streptococci gây bệnh và có tác dụng tốt với chứng viêm họng Gần đây,

các thử nghiệm dược lý cho thấy majonosid-R2 là saponin chủ yếu của sâmNgọc Linh, có tác dụng chống stress và là một chất xúc tác quan trọng chốngung thư (anti-cancer promoting agent) [2, 4, 6]

1.3.3.6 Sự cần thiết phát triển nguồn sâm Ngọc Linh

Sâm Ngọc Linh đã được các nhà khoa học chứng minh có giá trị dượcliệu cao, được xếp vào nhóm sâm quý của thế giới Hiện nay, người ta có xuhướng quay trở về với cây thuốc và thuốc có nguồn gốc thiên nhiên, và sâmNgọc Linh là một dược liệu quý có giá trị kinh tế cao, nên cũng chính là đốitượng bị khai thác triệt để vì mục đích thương mại, đã dẫn đến cạn kiệt nguồnsâm tự nhiên Để giải quyết vấn đề này đòi hỏi phải có giải pháp toàn diện vềquản lý, bảo vệ, bảo tồn, quy hoạch vùng sâm nguyên liệu, cần thiết ứng dụngnhững kỹ thuật mới trong sản xuất để nâng cao giá trị thương mại, xây dựng

thương hiệu sâm Ngọc Linh trên thị trường thế giới Trong đó, kỹ thuật nhân

giống in vitro cho hệ số nhân giống cao, nên đây là giải pháp cần thiết góp

phần phát triển đáp ứng kịp thời nguồn sâm nguyên liệu trong công tác nhângiống để mở rộng diện tích sâm trồng và sản xuất sản phẩm sâm Ngọc Linh

Hình 1 Cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)

a Cây sâm Ngọc Linh mọc tự nhiên; b Cây sâm Ngọc Linh trong vườn trồng;

c Mẫu sâm Ngọc Linh tự nhiên được thu thập tại vùng núi Ngọc Linh.

1, 2, 3, 4, 5 Cây sâm Ngọc Linh có độ tuổi tương ứng: 3 tháng và 1, 2, 3, 5 năm

tuổi

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu của chúng tôi là sâm Ngọc Linh, đây là loài sâmchỉ phân bố ở Việt Nam, được xếp đầu bảng trong “Sách đỏ Việt Nam”, cógiá trị về mặt dược liệu cao, được xếp vào nhóm sâm quý trên thế giới

Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) thuộc:

Họ (familia): Araliaceae

Phân họ (subfamilia): Aralioideae

Chi (genus): Panax

2.2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Nguyên liệu

Nguyên liệu nuôi cấy ban đầu là đỉnh sinh trưởng, thân củ, cuống lá củacây sâm Ngọc Linh tự nhiên 5 năm tuổi Mẫu được thu tại vùng núi NgọcLinh, huyện Nam Trà My, tỉnh Quảng Nam

2.2.2 Môi trường nuôi cấy

Mẫu được cấy lên các môi trường ½ MS, MS, SH, White có bổsung 30 g/l sucrose, agar 8 g/l và các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhómauxin và cytokinin với nồng độ khác nhau tùy theo mục đích của từng thínghiệm Môi trường nuôi cấy được khử trùng ở nhiệt độ 120˚C trong 20 phút,

áp suất 1 atm

2.2.3 Điều kiện thí nghiệm

- Nhiệt độ phòng nuôi cấy: 25 ± 2oC

Cắt mẫu với kích thước 5-6 cm để dễ dàng cho bước khử trùng mẫu vàrửa lại bằng nước cất vô trùng 5 lần trước khi chuyển mẫu vào tủ cấy vôtrùng.

Trong tủ cấy, mẫu được khử trùng sơ bộ bằng cồn 70% trong 45 giây,sau đó tiếp tục khử trùng mẫu bằng dung dịch HgCl2 0,1% từ 5-15 phút và rửalại bằng nước cất vô trùng 5-7 lần trước khi cấy vào môi trường nuôi cấy banđầu Khả năng khử trùng mẫu được đánh giá thông qua tỷ lệ mẫu chết, mẫunhiễm và mẫu sống không nhiễm sau 4 tuần nuôi cấy

2.2.5 Nuôi cấy ban đầu

Đỉnh sinh trưởng (kích thước 0,5 cm), cuống lá, thân củ (cắt lát mỏngkích thước 1,0-1,5 mm) được cấy lên môi trường dinh dưỡng cơ bản MS có 8g/l agar, 30 g/l sucrose và bổ sung riêng lẻ chất KTST 2,4-D (1,0-3,0 mg/l),kết hợp giữa 2,4-D (1,0-2,0 mg/l) với KIN (1,0-2,0 mg/l) và 2,4-D (1,0 mg/l)với TDZ (0,1-0,3 mg/l) để thăm dò khả năng tái sinh chồi của mẫu sau 8 tuầnnuôi cấy

2.2.6 Nhân nhanh callus

Mô callus thu thập từ kết quả nuôi cấy ban đầu(0,5×0,5 cm), được cấy trên môi trường MS có bổ sung kết hợp 2,4-D (1,0-2,0 mg/l) và TDZ (0,1-0,3 mg/l) để nhân nhanh callus nhằm cung cấp đủ mẫunghiên cứu cho các giai đoạn tiếp theo Số liệu được thu thập sau 8 tuần nuôicấy

2.2.7 Tạo phôi soma từ callus

Mô callus (0,5×0,5 cm) được cấy lên 4 loại môi trường MS, ½ MS, SH,

và White Trong đó, cả MS và SH có 30 g/l sucrose, 8 g/l agar, cả ½ MS vàWhite có 50 g/l sucrose, 8 g/l agar bổ sung phối hợp các chất KTST 2,4-D,KIN và BA, NAA ở các nồng độ khác nhau để thăm dò khả năng tạo phôi Sốliệu được thu thập sau 8 tuần nuôi cấy

2.2.8 Tạo chồi

Cụm phôi soma (1,0×1,0 cm) được cấy lên môi trường SH có 30 g/lsucrose, 8 g/l agar và môi trường ½ MS có 50 g/l sucrose, 8 g/l agar bổ sungkết hợp các chất KTST BAP (0,5-1,5 mg/l) và NAA (0,1-1,5 mg/l) để thăm

dò khả năng tái sinh chồi sau 8 tuần nuôi cấy

2.2.9 Tạo rễ

Chồi in vitro thu được từ các thí nghiệm trên, được cấy lên môi trường

MS, ½ MS, SH có 30 g/l sucrose, 8 g/l agar, White có 10-50 g/l sucrose, 8 g/lagar và bổ sung riêng lẻ (1,0-3,0 mg/l) 2,4-D hoặc NAA để thăm dò khả nănghình thành và phát triển của rễ sau 8 tuần nuôi cấy

2.2.10 Xử lý thống kê

Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi thínghiệm được lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp quan sát ít nhất 15 mẫu Kết quả thínghiệm được xử lý để thu giá trị trung bình và phân tích Duncan's test bằngphần mềm SPSS 16.0 với mức xác suất có ý nghĩa p<0,05

Hình 2 Sơ đồ thí nghiệm

Cây sâm Ngọc Linh tự nhiên

Khử trùng

Nuôi cấy ban đầu

Nhân nhanh callus

Tạo phôi soma

Đỉnh sinh trưởng, thân củ và cuống lá

Callus

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 TẠO NGUỒN NGUYÊN LIỆU KHỞI ĐẦU

3.1.1 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng

Mẫu cấy, các mảnh mô thực vật, dùng để nuôi cấy thường là nguồnnhiễm chính vì có rất nhiều vi sinh vật bám trên bề mặt, trong các rãnh nhỏhoặc giữa các lớp vảy chồi, mầm chồi, Đối với một số loài thực vật đượcbao phủ bên ngoài bởi một lớp sáp dày hoặc có lông tơ thì càng khó khử trùng

vì đây là nơi cư ngụ của rất nhiều vi sinh vật Để giải quyết những vấn đề này,người ta thường rửa mô cấy với xà phòng để loại bỏ bụi đất và gia tăng sựtiếp xúc bề mặt của mô cấy với các chất khử trùng, tăng cường hiệu quả khửtrùng của các chất khử trùng Sau khi khử trùng, mẫu cấy được rửa sạch bằngnước cất vô trùng 3-5 lần [11, 12]

Hiện nay các hóa chất khử trùng thường được dùng phổ biến như:calcium hypochlorite, sodium hypochlorite, nước bromine, H2O2, HgCl2.Trong đó, HgCl2 được đánh giá là có hiệu quả diệt khuẩn khá và thường được

sử dụng ở nồng độ 0,1% Khi sử dụng ở nồng độ cao hơn 0,1 % thì dung dịchHgCl2 có tác dụng diệt khuẩn cao nhưng lại gây độc cho mẫu cấy và thườnglàm mẫu cấy chết hay không tái sinh [11, 41]

Xác định thời gian khử trùng mẫu cấy ban đầu để đánh giá khả năngkhử trùng thích hợp cho tỉ lệ nhiễm và chết thấp nhất mà mẫu cấy vẫn có khảnăng tăng trưởng và phát triển nhằm cung cấp đủ nguồn mẫu thực hiện các thínghiệm tiếp theo

Tạo rễ

Cây in vitro

Mẫu cây sâm Ngọc Linh sau khi được thu thập, được đem rửa với xàphòng loãng 3 lần, sau đó rửa sạch dưới vòi nước chảy trong khoảng 2 giờ.Tiếp theo, mẫu được cắt với kích thước 5-6 cm để dễ dàng cho bước khửtrùng mẫu Sau đó, rửa lại bằng nước cất vô trùng 5 lần trước khi chuyển mẫuvào tủ cấy vô trùng Trong tủ cấy, mẫu được khử trùng sơ bộ bằng cồn 70%trong 45 giây và tiếp tục khử trùng mẫu bằng dung dịch HgCl2 0,1% từ 5-15phút, sau đó mẫu được rửa lại bằng nước cất vô trùng 5-7 lần trước khi cấyvào môi trường nuôi cấy ban đầu

Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1%đến khả năng vô trùng mẫu cấy sau 4 tuần theo dõi, được trình bày ở bảng3.1

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch HgCl 2 0,1% đến

khả năng vô trùng mẫu cấy

Thời gian

(phút)

Tổng số mẫu cấy

Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)

Tỷ lệ mẫu chết (%)

Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (%)

Qua kết quả trình bày ở bảng 3.1 cho thấy, khử trùng bằng dung dịchHgCl2 0,1% trong thời gian ngắn (5 phút) thì khả năng vô trùng mẫu thấp, tỷ

lệ nhiễm mẫu cao (56,32%) Tuy nhiên, khi tăng thời gian khử trùng từ 5-15phút, tỷ lệ mẫu nhiễm giảm dần nhưng tỷ mẫu chết tăng Trên biểu đồ 3.1.cho thấy, khử trùng mẫu trong thời gian 7 phút cho tỷ lệ mẫu sống khôngnhiễm đạt cao nhất (87,07%)

Biểu đồ 3.1 So sánh ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch HgCl 2

0,1% đến khả năng vô trùng mẫu