nghiên cứu biến động một số chỉ tiêu hóa sinhcủa cây nha đam dưới tác động của mannitol trong điều kiện nuôi cấy in vitro

Ảnh hưởng của mannitol đến các chỉ tiêu hóa sinh của lá cây nha đam in vitro nuôi cấy trên môi trường có bổ sung mannitol ở các nồng độ khác nhau.. DANH MỤC BẢNGBảng 3.1 Ảnh hưởng của n

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRONG ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY IN VITRO

CHUYÊN NGÀNH: SINH HỌC THỰC NGHIỆM

MÃ SỐ : 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS HOÀNG THỊ KIM HỒNG

Huế, 2012

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi.Các số liệu, kết quả trình bày trong đề tài là trung thực, khách

quan và nghiêm túc Những tài liệu tham khảo có nguồn gốc rõ

ràng Nếu có gì sai sót tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm

Tác giả luận văn

HUỲNH THỊ HỒNG TRANG

Trong suốt thời gian học cũng như làm luận văn em nhận được rất nhiều sự quan tâm giúp đỡ của các thầy cô giáo trong khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học, Đại học Huế Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý giá đó

Đặc biệt, em xin gởi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến TS.Hoàng Thị Kim Hồng, PGS.TS Nguyễn Hoàng Lộc đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo em trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Em xin gởi lời cảm ơn đến các anh chị tại phòng thí nghiệm Công nghệ gen

và phòng Miễn dịch, Viện Tài nguyên, Môi trường và Công nghệ sinh học, Đại học Huế đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn đến những người thân trong gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ trong suốt thời gian học tập cho đến khi hoàn thành luận văn

Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn!

Huế, tháng 9 năm 2012

Tác giả luận văn

Huỳnh Thị Hồng Trang

MỤC LỤC

Trang

Trang phụ bìa

Lời cam đoan

Lời cảm ơn

Mục lục

Danh mục viết tắt

Danh mục bảng

Danh mục hình

Danh mục đồ thị

MỞ ĐẦU 1

Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu chung về thực vật CAM 3

1.1.1 Thực vật CAM 3

1.1.2 Cơ chế chuyển hóa acid malic trong quá trình quang hợp của thực vật CAM 5

1.2 Giới thiệu chung về cây nha đam 7

1.2.1 Lịch sử phát hiện cây nha đam 7

1.2.2 Đặc điểm sinh học của cây nha đam 8

1.2.3 Thành phần hóa học cây nha đam 9

1.3 Nhân giống in vitro 9

1.3.1 Thuật ngữ nhân giống in vitro 9

1.3.2 Lược sử phát triển của nhân giống in vitro 10

1.3.3 Nhân nhanh cây con in vitro 14

1.4 Đặc tính chịu hạn của thực vật 15

1.4.1 Cơ sở sinh lý, hóa sinh và sinh học phân tử của tính chịu hạn của thực vật 15

1.4.2 Ảnh hưởng của mannitol lên nuôi cấy mô tế bào thực vật 17

1.5 Tổng quan về một số thành phần hóa sinh 18

1.5.1 Tổng quan về tinh bột 18

1.5.2 Tổng quan về acid oxaloacetic (OAA) 19

1.5.3 Tổng quan về acid pyruvic 20

1.5.4 Tổng quan về mannitol 20

1.6 Tổng quan về protein và kỹ thuật điện di SDS-PAGE 21

1.6.1 Khái quát về protein 21

1.6.2 Giới thiệu về kỹ thuật điện di 22

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Đối tượng nghiên cứu 24

2.2 Phương pháp nghiên cứu 24

2.2.1 Kỹ thuật nuôi cấy in vitro 24

2.2.1.1 Kiểm tra môi trường tối ưu 24

2.2.1.2 Kỹ thuật nhân nhanh từ cây tái sinh 25

2.2.1.3 Xử lý stress nước cho cây con in vitro và thu mẫu 25

2.2.2 Xác định tốc độ sinh trưởng tương đối 26

2.2.3 Xác định hàm lượng nước bằng phương pháp sấy khô mẫu 26

2.2.4 Xác định cường độ quang hợp bằng máy đo cường độ quang hợp Ciras-2 Portable hệ thống quang hợp của hãng Licor - Mỹ 26

2.2.5 Xác định hàm lượng tinh bột theo phương pháp của Coombs và cs (1987) 26

2.2.6 Xác định hàm lượng đường khử theo phương pháp dinitro salixylic acid 26

2.2.7 Xác định hàm lượng OAA và pyruvate bằng phương pháp đo mật độ quang học ở bước sóng 340 nm 26

2.2.8 Xác định hoạt tính enzyme 27

2.2.9 Xác định hàm lượng protein và chạy điện di SDS - PAGE 27

2.2.10 Xử lý kết quả thí nghiệm 28

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 29

3.1 Tạo nguồn nguyên liệu ban đầu 29

3.1.1 Khả năng nhân chồi của đoạn thân tách từ cây nha đam in vitro 29

3.1.2 Khả năng nhân chồi của đỉnh sinh trưởng tách từ cây nha đam in vitro 29

3.1.3 Nhân nhanh cây nha đam in vitro lên môi trường tối ưu và cấy chuyển lên môi trường bổ sung mannitol ở các nồng độ khác nhau 31

3.2 Ảnh hưởng của mannitol ở các nồng độ khác nhau lên khả năng sinh trưởng

và các chỉ tiêu sinh lý, hóa sinh của cây nha đam in vitro 32

3.2.1 Ảnh hưởng của mannitol lên khả năng sinh trưởng của cây nha đam in vitro 32 3.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ mannitol đến tốc độ sinh trưởng tương đối cây nha đam trong điều kiện in vitro 34

3.2.3 Ảnh hưởng của mannitol đến các chỉ tiêu sinh lý của cây nha đam in vitro 35

3.2.3.1 Biến động pH của dịch lá nha đam in vitro nuôi cấy trên môi trường có bổ sung các nồng độ mannitol khác nhau 35

3.2.3.2 Cường độ quang hợp ở lá của cây nha đam in vitro sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường có bổ sung mannitol ở các nồng độ khác nhau 37

3.3 Ảnh hưởng của mannitol đến các chỉ tiêu hóa sinh của lá cây nha đam in vitro nuôi cấy trên môi trường có bổ sung mannitol ở các nồng độ khác nhau 38 3.3.1 Hàm lượng nước trong lá cây nha đam in vitro cấy chuyển lên môi trường có bổ sung mannitol ở các nồng độ khác nhau 38

3.3.2 Hàm lượng protein 39

3.3.3 Hàm lượng đường khử và hàm lượng tinh bột 40

3.3.4 Hàm lượng pyruvate và OAA 42

3.3.5 Hoạt độ enzyme 44

3.6 Kết quả chạy điện di SDS-PAGE 46

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48

4.1 Kết luận 48

4.2 Kiến nghị 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC

SDS - PAGE : sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gel

electrophoresis

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1

Ảnh hưởng của nồng độ mannitol đến tốc độ sinh trưởng

tương đối của cây nha đam trong điều kiện in vitro 34

Bảng 3.2

Biến động pH của dịch lá cây nha đam in vitro sau 4 tuần

nuôi cấy trên môi trường có bổ sung mannitol ở các nồng

độ khác nhau

36

Bảng 3.3

Cường độ quang hợp của lá cây nha đam in vitro nuôi cấy

trên môi trường có bổ sung mannitol ở các nồng độ khác nhau

37

Bảng 3.4

Hàm lượng chất khô và protein trong lá nha đam được nuôi cấy trên môi trường bổ sung các nồng độ mannitol khác nhau

39

Bảng 3.5

Hàm lượng đường khử và hàm lượng tinh bột trong lá cây

nha đam in vitro khi nuôi cấy trên môi trường có bổ sung

mannitol ở các nồng độ khác nhau

41

Bảng 3.6

Hàm lượng pyruvate và OAA trong lá nha đam in vitro

khi nuôi cấy trên môi trường có bổ sung mannitol ở các nồng độ khác nhau

42

Bảng 3.7

Hoạt độ enzyme MDH, PEPC và ME trong dịch chiết lá

nha đam in vitro trên môi trường có bổ sung mannitol ở

các nồng độ khác nhau

44

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 3.1 Cụm chồi thu được từ đoạn thân tách từ cây nha đam in vitro 29

Hình 3.2 Cụm chồi thu được từ đỉnh sinh trưởng tách từ cây nha

Hình 3.3 Chồi đơn tách từ cụm chồi nha đam in vitro mới cấy chuyển 31

Hình 3.4 Chồi đơn tách từ cụm chồi nha đam in vitro sau cấy

Hình 3.5

Mẫu nha đam in vitro xử límannitol :a,b,c,d,e,f,g tương

ứng với nồng độ mannitol: 1, 3, 6, 9, 12,15, 18% cấy chuyển sau 4 tuần

33

Hình 3.6 Quá trình tích lũy và chuyển hóa acid malic trong nhóm

Hình 3.7

Phổ điện di protein hòa tan tổng số của lá cây nha đam in

vitro trên môi trường bổ sung mannitol ở các nồng độ

khác nhau

46

DANH MỤC ĐỒ THỊ

Đồ thị 3.1 Hàm lượng protein trong lá cây nha đam in vitro nuôi cấy trên

môi trường có bổ sung mannitol ở các nồng độ khác nhau 40

Đồ thị 3.2 Hàm lượng pyruvate của cây nha đam in vitro khi nuôi cấy

trên các môi trường có bổ sung hàm lượng mannitol khác nhau 43

Đồ thị 3.3 Hàm lượng OAA của cây nha đam in vitro khi nuôi cấy trên

các môi trường có bổ sung hàm lượng mannitol khác nhau 44

MỞ ĐẦU

Thực vật có mạch lá được chia thành 3 nhóm chính: C3, C4, CAM (Crassualacean acid metabolism) Trong số đó, thực vật CAM chiếm khoảng 6 – 7%, được phân thành 5 lớp, 33 họ, 328 giống, 16.000 loài khác nhau Thực vật CAM có nhiều giá trị kinh tế khác nhau, một số thuộc nhóm hoa cây cảnh như phong lan, hoa quỳnh đỏ, quỳnh trắng, xương rồng…, một số thuộc nhóm cây dược liệu như cây thuốc bỏng, nha đam, dứa dại…, một số thuộc nhóm cây ăn trái như dứa, thanh long… [26]

Khác với các loài thực vật C3 và C4, các loài thực vật CAM thường có khả năng đóng khí khổng vào ban ngày, do vậy hạn chế được sự mất nước qua lá, đồng thời vào ban đêm, khí khổng của chúng thường mở ra để hấp thụ CO2 và tích lũy lượng CO2 này trong acid malic Quá trình chuyển hóa acid malic vào ban ngày sẽ tạo ra sản phẩm hữu cơ là pyruvate hoặc acid oxaloacetic (OAA) đồng thời thải ra

CO2 Lượng CO2 này sẽ được bào quan lục lạp ở trong cây sử dụng, phối hợp với nước và ánh sáng để tiến hành quá trình quang hợp [31] Căn cứ vào sản phẩm tạo thành trong quá trình chuyển hóa acid malic mà người ta chia thực vật CAM ra thành 2 nhóm chính: nhóm malate enzyme (ME – CAM) xúc tác chuyển hóa acid malic thành pyruvate và nhóm phosphoenolpyruvate carboxykinase (PCK – CAM) xúc tác chuyển hóa acid malic thành OAA

Trong số các loài thực vật CAM, cây nha đam (Aloe vera Linne)( A vera)

được xếp vào nhóm PCK – CAM và được xem như một loại thần dược với những công dụng, dược tính hữu ích Nhiều nghiên cứu của các nhà khoa học đã cho thấy cây nha đam có rất nhiều tác dụng như trị vết thương, ngăn ngừa và chữa bệnh, làm thức uống, dưỡng da, dầu gội…Chất gel chiết rút từ cây nha đam được dùng nhiều trong các ngành công nghệ dược phẩm, hóa mỹ phẩm, tạo ra các sản phẩm kem dưỡng da từ nha đam Nha đam là loại cây không chỉ có tác dụng làm đẹp mà còn được sử dụng vào mục đích trị bệnh và được ghi nhận có tác dụng tốt trong những

bệnh lý như: đái tháo đường, vảy nến, tăng cholesterol máu, bỏng, tổn thương da do tia xạ sau điều trị ung thư, giúp nhanh lành vết thương…[14]

Một số nghiên cứu gần đây đã xây dựng hoàn chỉnh quy trình nhân nhanh giống cây nha đam bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào Quy trình nuôi cấy này cho

phép tạo ra một lượng lớn cây nha đam in vitro làm nguồn vật liệu khởi đầu trong

việc nghiên cứu khả năng chịu hạn của cây trong điều kiện nhân tạo

Trong kỹ thuật nuôi cấy mô, người ta thường dùng mannitol để gây hạn sinh lý

trong cây in vitro Mannitol thường gây mất nước trong cây, khối nguyên sinh chất của

tế bào sẽ bị tách dần ra khỏi màng tế bào và co cụm lại, dẫn đến hiện tượng co nguyên sinh Mức độ co nguyên sinh trong cây nhiều hay ít phụ thuộc vào nồng độ xử lý mannitol Dưới tác động của mannitol, cây sẽ mất đi lượng nước tự do nhưng chúng vẫn có thể sử dụng được lượng nước liên kết không chặt và nước nội bào để duy trì sự sống Tuy nhiên, khi tất cả các dạng nước này trong cây đều bị mất đi thì cây bị thiếu nước trầm trọng, dẫn đến sự ngừng trệ các hoạt động trao đổi chất trong cây và gây ảnh hưởng lớn đến sự sống của cây Một số trường hợp nghiên cứu gần đây cho thấy, trong trường hợp mất nước nghiêm trọng, một số loại cây có khả năng chuyển hướng trao đổi chất để tăng cường tính thích nghi nhằm duy trì sự sống

Để hiểu rõ hơn đặc tính này trong nhóm thực vật CAM, chúng tôi chọn đề tài

“Nghiên cứu biến động một số chỉ tiêu hóa sinh của cây nha đam dưới tác động

của mannitol trong điều kiện nuôi cấy in vitro”

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về thực vật CAM

Công trình nghiên cứu phân loại về thực vật CAM đã được Dittrich và cộng

sự (cs) công bố trên tạp chí quốc tế lần đầu tiên vào năm 1973 [23] Trong đó, ông cho rằng acid malic và cơ chế tích lũy hoặc chuyển hóa của chúng theo thời gian ngày, đêm là một trong những yếu tố chính đóng vai trò hết sức quan trọng trong quang hợp và hô hấp của thực vật CAM

Xu hướng thế giới hiện nay, sau khi đã tập trung khai thác và sử dụng triệt để tiềm năng kinh tế của các nhóm thực vật C3 và C4, nhiều nhà nghiên cứu chuyên sâu chuyển hướng tập trung nghiên cứu về thực vật CAM, họ đã khai thác và đưa vào sử dụng tiềm năng kinh tế của nhóm thực vật này nhằm phục vụ nhu cầu của con người Hiện nay, nhiều nghiên cứu về thực vật CAM tập trung vào hai hướng chính: sử dụng chúng để trồng trên các vùng đất hoang, có thời tiết khắc nghiệt để cải tạo đất, tăng diện tích đất trồng trọt, một hướng khác là thay đổi điều kiện sống

để cải tạo một số loại thực vật CAM làm thức ăn cho người và gia súc [26]

Riêng nước ta, khi đề cập đến thực vật CAM, các nhà nghiên cứu chủ yếu chú trọng đến giá trị hoa cây cảnh của nhóm phong lan và xương rồng, các tiềm năng có giá trị kinh tế khác của thực vật CAM vẫn chưa được khai thác, có thể thấy rằng nghiên cứu chuyên sâu về thực vật CAM thực sự vẫn là một khoảng trống rất lớn, chưa được chú trọng đến ở nước ta Thực tế cho thấy, chưa có một số liệu điều tra, thống kê nào được công bố về số lượng các loài và chủng loại của thực vật

CAM trên lãnh thổ nước ta Hơn nữa, các nghiên cứu chuyên sâu về cơ chế chuyển hĩa, trao đổi chất đặc trưng của thực vật CAM vẫn chưa được thực hiện Vì thế, chúng ta thiếu hẳn cơ sở khoa học cho việc tìm kiếm, cải tạo một số lồi thực vật CAM theo hướng vừa cĩ giá trị kinh tế vừa cĩ khả năng thích nghi tốt để trồng trên các vùng đất hoang phế, cĩ điều kiện sống khắc nghiệt, nhằm giữ đất và cải tạo đất

để khai thác và sử dụng chúng phục vụ nhu cầu đời sống của con người là một việc làm cần thiế ý nghĩa lớn trong tương lai [26]

Hiện nay, khí hậu tồn cầu đang ngày càng nĩng lên và theo dự đốn, nhiệt

độ trái đất sẽ ấm lên trung bình từ 2 – 40C trong thế kỷ tới (IPCC, 2007), dẫn đến tình trạng khan hiếm nước Việt Nam là nước nằm trong khu vực nhiệt đới giĩ mùa

Vì vậy, hạn là yếu tố thường xuyên tác động gây ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển của cây trồng, ảnh hưởng xấu đến năng suất và phẩm chất của chúng [12] Trong điều kiện cực kì khơ hạn, thực vật CAM cĩ thể đĩng khí khổng một thời gian dài để ngăn chặn sự mất nước và lặp lại chu trình CO2 bên trong tế bào Do đĩ, chúng sẽ khơng cĩ bất cứ một sự sinh trưởng nào nhưng cĩ thể duy trì sự sống cho

tế bào Thực vật CAM được tìm thấy trước đây chủ yếu là ở sa mạc hay những vùng khí hậu khơ hạn với các dạng sống như: biểu sinh, leo hay thẳng đứng Nhưng những nghiên cứu gần đây cho rằng một số thực vật CAM cũng sống trong nước

Cĩ nhiều tài liệu khác nhau về thực vật CAM sống thủy sinh như Isoëtes và một số

thực vật 1 lá mầm và 2 lá mầm Keeley khẳng định: "Thực vật CAM thủy sinh sống

ở những nơi mà quang hợp cĩ khả năng bị hạn chế bởi carbon" [30] Thực vật CAM sống thủy sinh khơng cĩ liên quan với sự mất nước, đúng hơn là cĩ liên quan tới hàm lượng khí CO2 Các dạng sống cĩ thể thay đổi trong chu trình sống Ví dụ như cây dạng sống bán biểu sinh sẽ sống như dạng thẳng và trở thành dạng đứng tự do khi chúng giết chết tế bào chủ Các họ thực vật CAM sống dạng đứng tự do như: Cactaceae, Euphorbiaceae, Didieraceae, Agavaceae Cĩ một số thực vật thực hiện

cả quang hợp C3 và CAM hay C4 và CAM

Ở nước ta cĩ rất ít nghiên cứu được tiến hành trên thực vật CAM Một số nghiên cứu hiện nay về thực vật CAM hầu như chỉ tập trung chủ yếu vào hướng hoa cây cảnh

(phong lan, xương rồng), nghiên cứu cải biến để tăng năng suất (dứa, nha đam) nhưng lại không khai thác được đặc trưng cơ bản của CAM trong các đối tượng này [26]

1.1.2 Cơ chế chuyển hóa acid malic trong quá trình quang hợp của thực vật CAM

Ở một số loài thực vật CAM, quá trình chuyển hóa acid malic để tạo thành OAA hay pyruvate và giải phóng ra CO2 là quá trình trao đổi chất rất quan trọng trong giai đoạn III (hình 1.1) của chu trình quang hợp

Hình 1.1.Các giai đoạn (phase) của chu trình quang hợp [17]

Căn cứ vào sản phẩm tạo thành trong quá trình chuyển hóa acid malic mà người ta chia thực vật CAM ra thành 2 nhóm chính: malic enzyme (ME) – CAM và phosphoenolpyruvate (PCK) – CAM [23] Các loại thực vật thuộc nhóm ME – CAM thường chứa một lượng lớn ME tham gia xúc tác cho quá trình chuyển hóa acid malic tạo ra pyruvate và CO2 Ngược lại, các loại thực vật thuộc nhóm PCK – CAM thường chứa một lượng lớn enzyme phosphoenolpyruvate carboxykinase (PCK) tham gia xúc tác cho quá trình chuyển hóa acid malic để tạo thành OAA và

CO2, sau đó OAA lại tiếp tục chuyển đổi sang phosphoenolpyruvate (PEP) [22]…Tuy nhiên, dưới tác động thay đổi của yếu tố môi trường (đặc biệt trong điều kiện khô hạn) mà trong quang hợp, một số loài thực vật CAM có khả năng thay đổi

cơ chế chuyển hóa acid malic tạo thành OAA hoặc pyruvate để tăng khả năng sống sót và thích nghi với sự biến đổi của môi trường

Mỗi nhóm ME – CAM hay PCK – CAM được chia thành 2 nhóm nhỏ: nhóm tạo thành tinh bột và nhóm tạo thành đường glucose bên ngoài lục lạp dựa trên nguồn carbonhydrate chính đã sử dụng trong chu trình hàng ngày của chúng Bên cạnh đó có 1 số loài thực vật CAM trung gian có đặc tính của cả 2 nhóm ME – CAM và PCK – CAM, phụ thuộc vào điều kiện môi trường

Mỗi loài thực vật CAM sở hữu một cơ chế chuyển hóa riêng biệt

Hình 1.2 Sơ đồ chuyển hóa acid malic ở hai nhóm thực vật CAM

- Chuyển hóa acid malic tế bào chất và chức năng sinh lý của chúng ở các

loài thực vật CAM

Ở các loài thực vật CAM, acid malic tạo thành vào ban đêm và tích lũy trong không bào của các tế bào quang hợp, phụ thuộc vào mỗi loài thực vật CAM khác nhau Acid malic được chuyển hóa tạo thành pyruvate và CO2 hoặc OAA và CO2vào ban ngày ME và malate dehydrogenase (MDH) đóng vai trò quan trọng trong chuyển hóa acid malic ở tế bào chất của các loài thực vật CAM [26]

Hình1.3 Sơ đồ chuyển hóa acid malic [48]

Mặc dù ME, MDH cùng được định vị trong tế bào chất của A.vera nhưng hoạt tính ME trong tế bào chất thấp hơn nhiều so với hoạt tính MDH Ở A vera,

acid malic được oxy hóa bởi MDH tạo OAA và sau đó OAA chuyển đổi thành PEP

và CO2, CO2 tiếp tục đi vào chu trình Calvin Những chuyển hóa của acid malic trong tế bào chất giúp cho các loài thực vật CAM thích nghi và sống sót được dưới điều kiện khô hạn [26]

1.2 Giới thiệu chung về cây nha đam

1.2.1 Lịch sử phát hiện cây nha đam

Cây nha đam là loại cây thảo mộc đã có từ thời thượng cổ [6] Khoảng 5.000 năm trước công nguyên, nhiều dân tộc Ả Rập ở vùng Trung Đông đã biết sử dụng cây nha đam để phục vụ cho cuộc sống của mình Rồi từ vùng Trung Đông cây nha

đam di thực sang nhiều quốc gia khác như: Ấn Độ, Trung Quốc, Malaysia, Mexico, CuBa Lịch sử tồn tại và phát triển cây nha đam trên khắp thế giới gắn liền với sự hiểu biết ngày càng phong phú về các lĩnh vực: sinh học, dược lý

Đến nay, sau nhiều năm nghiên cứu, các nhà khoa học đã chứng minh được rằng: cây nha đam có nguồn gốc từ Bắc Phi và Trung Đông, từ rất lâu nó được loài người sử dụng để làm thuốc Vào thế kỷ XIII, nhà khoa học người Ý là Macro Polo (1254 – 1323) đã thực hiện chuyến đi nghiên cứu thực vật cận nhiệt đới Châu Á Đến Trung Quốc, Macro Polo đã giới thiệu cho người dân bản xứ 1 loại cây thảo dược (sau này gọi là nha đam hoặc lô hội), từ Trung Quốc cây nha đam được di thực sang Việt Nam

Cây nha đam là loại cây bụi như xương rồng, còn được gọi bằng một số tên

khác như: tượng đảm, long tu, du thông, lưỡi hổ, hổ thiết… thuộc chi Aloe, họ huệ tây (Liliaceae) [4] Trong khoảng 180 loài thuộc chi Aloe thì chỉ có 4 loài được sử

dụng để làm thuốc bổ dưỡng và chữa bệnh, một số loài có độc tố Hai loài được chú

ý nhiều nhất là A Ferox và A vera Linne

Theo sách “Cây cỏ Việt Nam” của Phạm Hoàng Hộ thì chi Aloe ở nước ta chỉ có 1 loài là A.vera L Sinensis Berger tức là cây nha đam lá nhỏ [6], [7]

1.2.2 Đặc điểm sinh học của cây nha đam

Theo Võ Văn Chi (1991), Đỗ Thanh Hội (1997) thì cây nha đam là loại cây dạng thân cỏ, mập, màu xanh lục nhạt, thân ngắn [3], [8]

Cây nha đam trưởng thành có lá mập, dài 30 – 50 cm, rộng 5 – 10 cm, dày 1 – 2 cm

Lá nha đam gồm 2 phần: phần vỏ ngoài là lớp vỏ xanh, khi cắt ngang chảy ra nhựa màu vàng có mùi hắc, để khô chuyển thành màu đen, phần trong là phần thịt mọng nước dạng gel

Cụm hoa của cây cao khoảng 1m, mọc thành chùm, hoa to đều có màu vàng lục nhạt Quả nang hình trứng màu xanh, chứa nhiều hạt Nếu rạch một đường giữa

là nha đam tươi rồi dùng thìa nạo ở giữa lá nha đam quan sát sẽ thấy có một chất gel trong suốt

1.2.3 Thành phần hóa học cây nha đam

Phân tích các thành phần lấy từ lá nha đam, các nhà nghiên cứu tìm thấy các chất sau [14]:

1 Hợp chất anthraquinon: đây là thành phần có tác dụng chữa bệnh của

nha đam bao gồm:

o Aloe emodin (chất này không có trong dịch tươi nha đam) Trong nhựa

khô, Aloe emodin chiếm 0,05 – 0,5% chất này tan trong ete, cloroform, benzen

o Barbaloin: chiếm 15 – 30% thành phần nhựa của nha đam Chất này sẽ tan dần khi để ngoài không khí và ánh sáng, tan trong nước, cồn, aceton, rất ít trong benzen và cloroform

o Aloinosit A, Aloinosit B, Anthranol

o Glycozit, Aloezin, Aloenin

2 Chất nhựa: este của acid cinnamic

3 Chất hữu cơ: monosaccharit, polysacarit, xenluloza, mannoza,

L-rhamnoza…

4 Các vitamin: gồm B1, B2, B6 và acid folic

5 Cácenzyme: oxydase, lipase, amilase, catalase, allnilase…

6 Các nguyên tố khoáng vi lượng: zinc, potasodium, mangesium,

manganese,calcium…

1.3 Nhân giống in vitro

1.3.1 Thuật ngữ nhân giống in vitro

Nhân giống in vitro hay còn gọi là vi nhân giống được sử dụng đặc biệt cho việc

ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, tạo dòng cây sạch bệnh, làm nguồn nguyên liệu cho chọn lọc… bắt đầu bằng nhiều bộ phận khác nhau có kích thước nhỏ, sinh trưởng ở điều kiện vô trùng trong các bình nuôi cấy Trong thực tế, các

nhà vi nhân giống dùng thuật ngữ nhân giống in vitro và nuôi cấy mô thay đổi cho

nhau để chỉ mọi phương thức nhân giống thực vật trong điều kiện vô trùng Thuật ngữ

đồng nghĩa là nuôi cấy in vitro Nhân giống in vitro và nuôi cấy mô bắt đầu bằng các

mảnh nhỏ của thực vật, sạch vi sinh vật, và được nuôi cấy vô trùng [2]

1.3.2 Lược sử phát triển của nhân giống in vitro:

Bắt đầu từ năm 1938, hai nhà sinh học người Đức là Matthias Jacob Schleiden (nhà thực vật học) và Theodor Schwann (nhà động vật học) mới chính thức đề xướng học thuyết cơ bản của sinh học gọi là Học thuyết tế bào Học thuyết

tế bào khẳng định: mỗi cơ thể động, thực vật đều bao gồm những thể tồn tại hoàn toàn độc lập, riêng lẻ và tách biệt, đó chính là tế bào [1]

Năm 1883, Wilhelm Roux lần đầu tiên lý giải về phân bào giảm nhiễm ở cơ

quan sinh dục Từ một tế bào thực vật nuôi cấy in vitro có thể tái sinh thành một cơ

thể sống hoàn chỉnh Khả năng này của tế bào thực vật được gọi là tính toàn năng Năm 1902, Haberlandt là người đầu tiên đề xuất phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào Ông làm thí nghiệm với tế bào khí khổng và đã không thành công, do ông đã chọn cây một lá mầm là đối tượng rất khó nuôi cấy, hơn nữa ông đã dùng các tế bào đã mất hết khả năng tái sinh Một nguyên nhân khác của sự thất bại là do vào thời kỳ đó, những hiểu biết khoa học về nhu cầu dinh dưỡng của mô thực vật còn rất hạn chế nên Haberlandt đã không tìm ra được môi trường dinh dưỡng tối thích cho sự phân chia tế bào

Đến năm 1922, Robins và học trò của Haberlandt là Kotte đã tiến hành nuôi cấy đỉnh sinh trưởng của rễ một cây hòa thảo trong môi trường lỏng, có sự hiện diện của muối khoáng và glucose, đầu rễ sinh trưởng khá mạnh và tạo nên một hệ rễ nhỏ

có cả rễ phụ Sau đó, hệ rễ này sinh trưởng chậm dần và ngừng lại, mặc dù đã chuyển sang môi trường mới [1]

Năm 1934, Kogl lần đầu tiên xác định được vai trò của IAA, một hormone thực vật đầu tiên thuộc nhóm auxin có khả năng kích thích sự tăng trưởng và phân chia tế bào Năm 1939, ba nhà khoa học Gautheret, Nobecourt và White đã đồng thời nuôi cấy mô sẹo thành công trong thời gian dài từ mô tượng tầng (cambium) ở

cà rốt và thuốc lá, mô sẹo có khả năng sinh trưởng liên tục

Năm 1934 White đã nuôi cấy thành công đầu rễ cà chua (Lycopersicum

esculentum) trong môi trường lỏng có bổ sung muối khoáng, glucose và dịch chiết

nấm men trong một thời gian dài Ba năm sau, ông thay thế dịch chiết nấm men bằng hỗn hợp các vitamine nhóm B là thiamine (B1), pyridoxine (B6) và acid nicotinic (B3), và ông thấy rằng việc thay thế này hoàn toàn phù hợp Từ đó việc nuôi cấy đầu rễ trong thời gian vô hạn đã được tiến hành ở nhiều cây khác nhau.

Sau khi Went và Thimann phát hiện chất kích thích sinh trưởng thực vật đầu tiên, axit β-indolacetic (IAA) và kết tinh được chất này, Gautherets xác nhận tác dụng kích thích sinh trưởng mô sẹo của IAA và 3 nhóm vitamin do White đề nghị Năm 1939, cùng với Nobescourt, Gautherets đã thành công trong việc duy trì sự

tăng trưởng của mô sẹo cà rốt (Daucus carota) trên môi trường có agar trong thời

gian vô hạn bằng cách cấy chuyền đều đặn 6 tuần một lần

Năm 1941, Overbeck ở Mỹ đã chứng minh được khả năng kích thích sự sinh

trưởng phôi ở cây Datura thuộc họ Cà (Solanaceae) của nước dừa trong quá trình

nuôi cấy Steward (1948) xác nhận tác dụng kích thích sinh trưởng của nước dừa lên callus cà rốt Trong thời gian này, nhiều chất điều hòa sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm auxin đã được nghiên cứu và tổng hợp hóa học thành công Nhiều tác giả nhận thấy cùng với nước dừa, 2,4-dichlorophenoxy aceticacid (2,4-D) và α-napthaleneacetic acid (NAA) đã giúp tạo mô sẹo, gây phân chia tế bào thành công ở nhiều đối tượng thực vật trước đó rất khó nuôi cấy

Năm 1949, Limmasets và Cornuet đã phát hiện rằng virus phân bố không đồng nhất trên cây và thường không thấy có virus ở vùng đỉnh sinh trưởng Năm

1952, Morel và Martin đã tạo ra cây sạch bệnh virus của 6 giống khoai tây từ nuôi

cấy đỉnh sinh trưởng Ngày nay, kỹ thuật này với một số cải tiến đã trở thành

phương pháp loại trừ bệnh virus được dùng rộng rãi đối với nhiều loài cây trồng khác nhau Năm 1952, Morel và Martin lần đầu tiên thực hiện vi ghép in vitro thành

công Kỹ thuật vi ghép sau đó đã được ứng dụng rộng rãi trong tạo nguồn giống

sạch bệnh virus và tương tự virus ở nhiều cây trồng nhân giống bằng phương pháp

vô tính khác nhau, đặc biệt là tạo giống cây ăn quả sạch bệnh

Năm 1954, Miller và Skoog trong khi nuôi cấy mô lõi cây thuốc lá đã đã phát minh cấu trúc và sinh tổng hợp của kinetin - một cytokinin đóng vai trò quan trọng

trong phân bào và phân hoá chồi ở mô nuôi cấy Sau này, người ta đã chứng minh rằng sự phân bào ở thực vật trong tự nhiên cũng do các chất hóa học tương tự như kinetin điều khiển và xếp chung các chất đó vào nhóm có tên gọi là cytokinin Chất cytokinin đầu tiên được tách từ thực vật bậc cao là zeatin lấy từ mầm ngô

Việc phát hiện ra vai trò của IAA, NAA, 2,4-D và kinetin cùng với việc phát hiện vai trò của vitamin và nước dừa có ý nghĩa rất quan trọng trong lịch sử nuôi cấy mô và tế bào thực vật Chính việc phát hiện này làm cơ sở cho sự phát triển tiếp theo của lĩnh vực khoa học này

Đến năm 1957, Skoog và Miller đã khám phá vai trò của tỷ lệ nồng độ các chất auxin: cytokinin trong môi trường đối với sự phát sinh cơ quan (rễ hoặc chồi) Khi tỷ lệ auxin/ cytokinin (ví dụ: nồng độ IAA/kinetin) nhỏ hơn 1 và càng nhỏ, mô

có xu hướng tạo chồi Ngược lại khi nồng độ IAA/ nồng độ kinetin lớn hơn 1 và càng lớn, mô có xu hướng tạo rễ Tỷ lệ nồng độ auxin và cytokinin thích hợp sẽ kích thích phân hoá cả chồi và rễ, tạo cây hoàn chỉnh Hiện tượng này được xác nhận trên nhiều cây khác nhau và đóng góp rất lớn vào điều khiển sinh trưởng, phát triển và phát sinh cơ quan của mô, tế bào trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật

Từ năm 1954 - 1959, kỹ thuật tách và nuôi tế bào đơn được phát triển Muller, Haberlandt và Riker đã tách các tế bào của mô sẹo thành một huyền phù các

tế bào đơn bằng cách nuôi trên máy lắc Nickell (1956) nuôi liên tục được một

huyền phù tế bào đơn cây đậu (Phaseolus vulgaris) Reinert và Steward (1958) tạo

được phôi và cây cà rốt hoàn chỉnh từ tế bào đơn nuôi cấy trong dung dịch Melchers và Beckman (1959) đã nuôi liên tục các tế bào đơn trong bình có dung tích khá lớn bằng cách sục khí liên tục và thỉnh thoảng thu hoạch tế bào, thêm dung dịch dinh dưỡng mới Kỹ thuật nuôi cấy tế bào đơn đã phát triển cao độ với các thiết

bị tinh vi phức tạp do Street và cs đề nghị

Năm 1960, Morel đã thực hiện bước ngoặt cách mạng trong sử dụng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng trong nhân nhanh các loại địa lan Cymbidium, mở đầu công nghiệp vi nhân giống thực vật

Cũng vào năm 1960, Cooking ở Đại học Notthingham (Anh) lần đầu tiên sử dụng enzyme cellulase để phân huỷ vách cellulose của tế bào thực vật và thu được các tế bào chỉ có màng nguyên sinh chất bao quanh, được gọi là tế bào trần (protoplast) Cũng trong thời gian này, Bergman công bố có thể dùng phương pháp lọc đơn giản để thu được một huyền phù không có các tế bào kết cụm mà gồm hầu hết là các tế bào đơn Cùng với kỹ thuật nuôi tế bào của Bergman, nhiều tác giả đã thành công trong việc tạo được cây hoàn chỉnh từ một tế bào, chứng minh tính toàn thể của tế bào thực vật

Năm 1964 - 1966, Guha và Maheshwari đã thu được cây đơn bội bằng cách

nuôi cấy bao phấn của cây cà độc dược (Datura inoxia) và chứng minh được rằng

cây đơn bội này xuất hiện từ hạt phấn đơn bội Sau đó một năm, Bourgin và Nitsch

đã nuôi thành công cây thuốc lá (Nicotiana tabacum) đơn bội từ bao phấn tới lúc ra

hoa Cho đến nay, người ta đã thành công trong nuôi cấy bao phấn của nhiều loài khác nhau (lúa, ngô, cải, tiêu, ) và đã góp phần to lớn vào việc tăng thêm vào kiến thức về di truyền học thực vật và thực tiễn chọn giống

Năm 1970, Takebe, Labib và Melchers đã sử dụng kỹ thuật tế bào của Bergman để nuôi cấy protoplast của cây thuốc lá và tái sinh được cây hoàn chỉnh Đến nay, người ta đã thành công ở nhiều loài khác như các cây ăn quả, lấy sợi, các loài cây lấy gỗ và thậm chí các loài ngũ cốc (pennisetum, lúa và lúa mì) Trong quá trình nghiên cứu, người ta nhận thấy các protoplast có khả năng dung hợp với nhau trong các điều kiện nhất định và hấp thu các phân tử lớn hoặc thậm chí các bào quan

từ bên ngoài Do đó, các nhà nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật hy vọng rất lớn là có thể sử dụng protoplast trong công tác chọn giống thực vật

Từ năm 1980 đến nay là giai đoạn thành công của lĩnh vực công nghệ gen thực vật Chỉ trong một thời gian ngắn, hàng loạt các phương pháp đưa gen ngoại lai vào tế bào thực vật đã được công bố như phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn

Agrobacterium, kỹ thuật dung hợp bằng điện (electroporation), kỹ thuật vi tiêm

(microinjection), sử dụng sóng siêu âm (ultrasonic gene transfer), sử dụng súng bắn gen (gene gun) đang được các phòng thí nghiệm trên thế giới sử dụng và đạt được

nhiều kết quả mong muốn Sau khi đưa gen ngoại lai vào tế bào, người ta sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật để nuôi cấy tế bào được chuyển nạp, sau đó tái sinh lại thành cây hoàn chỉnh mang những đặc tính sinh học mới Các cây chuyển gen

đó ra hoa, kết hạt bình thường và được coi như một giống cây trồng mới

Từ năm 1996 - 2000, một hướng ứng dụng khác của nuôi cấy mô và tế bào thực vật là sản xuất protein ngoại lai bằng cách sử dụng huyền phù tế bào thực vật như một phương tiện cho sản xuất kháng thể tái tổ hợp (recombinant antibodies) và các đoạn kháng thể (antibody fragments) (Lacount và cs., 1997; Liu và cs., 1999), các enzyme như β-glucuronidase (Kurata và cs., 1998), invertase (Molles và cs., 1999), phosphomonoesterase (Ilieva và cs., 1996) và các protein có giá trị chữa bệnh như interleukin 2 (IL-2) và interleukin 4 (IL-4) của người (Magnuson và cs., 1997), Ricin (Sehnke và cs., 1999), α1-antitrypsin người, GM-CSF người (James và cs., 2000)

Năm 2004, Kunet và cs đã nghiên cứu ứng dụng công nghệ chíp DNA vào trong ngành nuôi cấy mô và tế bào thực vật để phân tích sự sai khác DNA trong quá trình nuôi cấy, đặc biệt là trong nuôi cấy callus, nuôi cấy phát sinh phôi

Năm 2005, Wayne R Curtis đã ứng dụng nguyên lý trao đổi khí, cải thiện điều kiện môi trường để thiết kế bioreactor trong vi nhân giống cây trồng

Giai đoạn này kích thích tạo cơ quan phụ hoặc các cấu trúc khác mà từ đó cây hoàn chỉnh có thể phát sinh Những khả năng tạo cây đó là:

- Phát triển chồi nách

- Tạo phôi vô tính

- Tạo đỉnh sinh trưởng

- Tạo rễ

Trong giai đoạn này cần nghiên cứu các tác nhân kích thích sự phân hóa cơ quan, đặc biệt là chồi như:

+ Bổ sung tổ hợp các chất kích thích sinh trưởng mới Tăng tỷ lệ auxin/cytokinin

sẽ kích thích mô nuôi cấy tạo rễ và ngược lại sẽ kích thích phát sinh chồi

+ Tăng thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày, tối thiểu 1.000 lux Trong thực tế nghiên cứu, người ta nhận thấy khó tách biệt ảnh hưởng của chu kỳ chiếu sáng khỏi ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng Ánh sáng tím là thành phần quan trọng kích thích phân hóa mạnh Ánh sáng đỏ có ảnh hưởng giống cytokinin, nó tạo nên sự tích lũy cytokinin trong mô một số loài, chính lượng cytokinin này góp phần kích thích

quá trình phát sinh cơ quan và tạo chồi từ những mô nuôi cấy in vitro

+ Bảo đảm chế độ nhiệt trong khoảng 20 – 300C Trong trường hợp những loài có nguồn gốc nhiệt đới, nhiệt độ nuôi cấy thích hợp vào khoảng 32 – 350C Ngược lại, đối với những loài hoa ở vùng ôn đới nhiệt độ thích hợp cho quá trình tạo cụm chồi phải < 300C

Mục tiêu của giai đoạn này là nhân nhanh với số lượng lớn tạo điều kiện cho việc tiến hành thí nghiệm sau này khi xử lý mannitol gây stress nước

1.4 Đặc tính chịu hạn của thực vật

1.4.1 Cơ sở sinh lý, hóa sinh và sinh học phân tử của tính chịu hạn của thực vật

Khả năng của thực vật ngăn ngừa tổn thương khi bị ảnh hưởng của các yếu

tố bất lợi đó là tính chống chịu [15]

Trong tự nhiên, hạn hán là hiện tượng thường xuyên xảy ra và liên quan trực tiếp đến vấn đề nước trong cây Kramer (1983) cho rằng, những tác động của môi trường xung quanh đủ để gây nên mất nước ở thực vật đó là hạn [33] Khi hạn là yếu

tố bất lợi với thực vật sẽ gây ra các mức độ thiệt hại khác nhau Để chống lại sự mất nước do nguyên nhân từ các tác động bên ngoài, ở thực vật có 3 cơ chế sinh lý chủ yếu được thảo luận, đó là cơ chế trốn hạn, cơ chế tránh hạn và cơ chế chịu hạn [15]

Thực vật có thể hoàn thành chu kỳ sống sớm hơn trước khi sự thiếu nước nghiêm trọng trong đất và trong cây xảy ra Kiểu chịu mất nước này gọi là trốn hạn Muốn trốn được hạn, cây phải có sức sinh trưởng và phát triển mạnh, có thể ra hoa

và tạo quả sớm để thời điểm thiếu nước không ảnh hưởng đến chu kỳ sống của cây Nhóm cây trốn hạn thường là cây sống ở vùng sa mạc, cây có thời gian sinh trưởng ngắn Chu trình sống của chúng thường hoàn thành trước mùa khô hạn tới

Để tránh hạn, thực vật có thể giữ nước trong tế bào hoặc giảm sự thoát nước

ra ngoài cơ thể Trong đó, phương thức tránh hạn chủ yếu của thực vật là hạn chế sự mất nước như: thay đổi độ mở của khí khổng, giảm diện tích lá, nhanh chóng bù lại

sự thiếu hụt nước thông qua những biến đổi về hình thái Định hướng sự phát triển của lá theo hướng giảm sự hấp thụ bức xạ, tăng cường sự hấp thụ nước theo hướng phát triển sâu và rộng của bộ rễ [15]

Duy trì áp suất thẩm thấu nội bào có tác dụng bảo vệ hoặc duy trì sức sống,

độ đàn hồi của tế bào ngay cả khi bị mất nước cực đoan, đó là khả năng chịu hạn Trong điều kiện hạn hán, áp suất thẩm thấu của tế bào được điều chỉnh tăng lên giúp cho tế bào có thể duy trì lượng nước Tuy nhiên, ở cùng một thời điểm bị hạn, thực vật sử dụng nhiều hơn một cơ chế để chống hạn

Tìm hiểu bản chất hóa sinh và sinh học phân tử của tính chịu hạn đang là mối quan tâm của nhiều nghiên cứu Nghiên cứu tính chống chịu hạn và cấu trúc tế bào người ta nhận thấy, hàng loạt những biến đổi sâu sắc xảy ra ở nhiều cấp độ trong các giai đoạn khác nhau và liên quan đến hoạt động của các gen Nghiên cứu của Bray (1993) [18] về những sản phẩm của gen tham gia bảo vệ tế bào khi tế bào bị thiếu nước được tiếp cận theo hướng:

- Hoạt động của nhóm gen tạo sản phẩm bảo vệ tế bào:

+ Sản phẩm của gen là các chất môi giới phân tử, tham gia vào quá trình tạo cấu trúc không gian đúng cho các phân tử protein được tạo thành trong tế bào, hay tạo cấu trúc đúng cho những phân tử protein được tạo thành trong tế bào, hay tạo cấu trúc đúng cho những phân tử protein bị biến tính trong điều kiện cực đoan

+ Các sản phẩm của gen tham gia đào thải những chất bị biến tính, những chất có khả năng gây độc cho tế bào khi tế bào gặp tác động của điều kiện bất lợi

- Hoạt động của nhóm gen tham gia điều chỉnh áp suất thẩm thấu trong tế bào: Các chất điều hòa áp suất thẩm thấu có vai trò khác nhau trong việc giữ và lấy nước vào tế bào Đó là việc điều chỉnh các kênh ion trên màng tế bào Sản phẩm của gen thay thế vị trí nước nơi xảy ra các phản ứng hóa sinh, hoặc tương tác với lipid, protein màng tế bào, ngăn chặn sự phá hủy màng tế bào và ngăn chặn sự phá hủy của các

1.4.2 Ảnh hưởng của mannitol lên nuôi cấy mô tế bào thực vật

Sự thiếu hụt nước trong môi trường là một yếu tố quan trọng nhất gây hạn chế đến năng suất cây trồng Vì vậy, việc giúp cây trồng giữ được nước và đánh giá khả năng chịu hạn của cây trồng cũng như phát triển những loại cây trồng mới có khả năng chịu hạn đang trở nên cấp bách Kỹ thuật nuôi cấy mô đã được ứng dụng trong nghiên cứu gây hạn sinh lý ở thực vật và được xem như một con đường mang lại kết quả nhanh chóng hơn so với các phương pháp thông thường, đặc biệt là nghiên cứu cây bị stress muối và stress nước Do trong điều kiện nuôi cấy mô các thông số vật lý và dinh dưỡng được kiểm soát chặt chẽ, mà điều này rất khó để thực hiện trong môi trường truyền thống Ngoài ra, sự tương tác giữa các bộ phận của cây và môi trường có thể được kiểm soát và loại bỏ và sự tăng trưởng và phát triển của các mô có thể được theo dõi một cách dễ dàng [2]

Trong việc nghiên cứu các dòng chịu hạn, người ta thường sử dụng mannitol như là một tác nhân gây stress môi trường Mannitol là một loại đường được tạo thành ở một số giống cây như sản phẩm chính của quá trình quang hợp, một số cây trồng có thể chuyển hóa được nó Tuy nhiên, việc hấp thụ mannitol rất chậm, vì vậy, mannitol làm tăng áp lực nội tại của môi trường Theo một số tác giả, trong trường hợp này, tế bào phải có một cơ chế nào đó nhằm tăng áp lực nội tại để có thể tồn tại trong môi trường có mannitol Chính cơ chế này đã kích thích tế bào tổng hợp ABA nội sinh và kìm hãm sự sinh trưởng của tế bào, giúp cho cây chịu sự mất nước lớn hơn bình thường Nhưng khả năng kích thích tổng hợp ABA chỉ xảy ra ở một nồng độ mannitol thích hợp, vượt qua giới hạn này, mannitol làm cho tế bào bị mất nước sinh lý và có thể chết Tương tự proline và các loại đường, ABA là một chất gây ức chế ở thực vật nhưng có vai trò quan trọng giúp cho cây trồng chống lại các điều kiện bất lợi của môi trường như nhiệt độ thấp, hạn, nồng độ muối cao…Có khá nhiều nghiên cứu tập trung tìm hiểu cơ chế của tính chống chịu hạn, trong đó có nhiều nghiên cứu đề cập đến vai trò của ABA [2]

1.5 Tổng quan về một số thành phần hóa sinh

1.5.1 Tổng quan về tinh bột

Tinh bột có công thức hóa học là (C6H10O5)n Đây là một polysacarit carbohydrate chứa hỗn hợp amylose và amylopectin, tỷ lệ phần trăm amylose và amylopectin thay đổi tùy thuộc vào từng loại tinh bột, tỷ lệ này thường dao động từ 20:80 đến 30:70 Tinh bột có nguồn gốc từ các loại cây khác nhau có tính chất vật lí

và thành phần hóa học khác nhau Chúng đều là các polymercarbohydrat phức tạp của glucose (công thức phân tử là C6H12O6) Tinh bột được thực vật tạo ra trong tự nhiên trong các quả, củ, ngũ cốc Tinh bột, cùng với protein và chất béo là một thành phần quan trọng bậc nhất trong chế độ dinh dưỡng của loài người cũng như nhiều loài động vật khác Ngoài sử dụng làm thực phẩm ra, tinh bột còn được dùng trong công nghiệp sản xuất giấy, rượu, băng bó xương Tinh bột được tách ra từ hạt như ngô và lúa mì, từ rễ và củ như sắn, khoai tây, dong là những loại tinh bột chính dùng trong công nghiệp

Tinh bột được cấu tạo bởi 2 thành phần chính là amylose (20 – 30%) và amylopectin (70 – 80%) cả hai đều là polymer của α – D – glucose

Amylose:

Trong amylose, các gốc glucose được gắn vào nhau nhờ liên kết α (1 → 4)

và tạo ra chuỗi phân tử dài Mỗi phân tử có từ 500 đến 20.000 gốc glucose tùy thuộc vào nguồn tinh bột

Khi tách tinh bột cũng như phân đoạn tinh bột thường có mặt O2 của không khí, do đó sẽ khử trùng hợp phân tử amylose Amylose “nguyên thủy” có mức độ trùng hợp không phải hàng trăm mà là hàng ngàn Có 2 loại amylose:

- Amylose có mức độ trùng hợp tương đối thấp (khoảng 2.000) thường không có cấu trúc bất thường và bị phân ly hoàn toàn bởi β – amylase

- Amylose có mức độ trùng hợp lớn (hơn 6.000), có cấu trúc án ngữ đối với

β – amylase nên chỉ bị phân giải đến 60%

Amylopectin:

Phân tử amylopectin, các phân tử gắn với nhau không chỉ nhờ liên kết α(1 → 4)

mà còn nhờ liên kết α (1 → 6) tạo ra cấu trúc mạch nhánh trong amylopectin Phân tử amylopectin chỉ có một đầu khử duy nhất

Phân tử amylopectin có cấu tạo những chùm nho trong đó xen kẽ hai loại vùng: vùng một có cấu tạo chặt, sắp xếp có trật tự và có độ tinh thể do đó khó bị thủy phân, vùng hai sắp xếp kém trật tự có nhiều điểm phân nhánh và không có tinh thể nên dễ dàng bị thủy phân

Hình 1.4 Cấu trúc amylose và amylopectin

1.5.2 Tổng quan về acid oxaloacetic (OAA)

Acid oxaloacetic là hợp chất hữu cơ có công thức C4H4O5(HOOC – (C=O) –(CH2) – COOH) Chúng thuộc loại acid carboxylic tan trong nước Về cấu trúc, OAA có liên quan đến acid malic, acid fumaric, thành phần của chu trình Crebs, trong phản ứng đòi hỏi NAD+ và là chất cần thiết để hình thành acid citric trong phản ứng có sự tham gia của pyruvate và coenzyme A [52]

Acid dicarboxylic 4 carbon này là một chất trung gian của chu trình Crebs và gluconeogenesis OAA được hình thành sau quá trình oxy hóa L – malate, xúc tác bởi malate dehydrogenase, và phản ứng với acetyl CoA để hình thành citrate, xúc tác bởi citrate dehydrogenase

OAA còn được hình thành từ phản ứng carboxyl hóa PEP được xúc tác bởi PEPC Quá trình này xảy ra ở tế bào mesophyll của thực vật, sau đó chúng bị khử thành acid malic OAA có cấu tạo đặc biệt ổn định Vì vậy mà 2 đồng phân có nhiệt

độ nóng chảy khác nhau (1520

C cis, 1840C trans) OAA cũng là một chất có khả năng ức chế phức hợp II trong chuỗi hô hấp

1.5.3 Tổng quan về acid pyruvic

Acid pyruvic (CH3COCOOH) là một acid hữu cơ, một α – keto acid đơn giản nhất Anion carboxylate (COO-) của acid pyruvic (CH3COCOO-), pyruvate, là một hợp chất hữu cơ quan trọng trong hóa sinh, một điểm giao có tính chất then chốt ở một số con đường trao đổi chất Pyruvate được tạo thành từ glucose qua chu trình đường phân và có biến đổi trở lại carbohydrate nhờ chu trình glucogenesis hoặc acid béo thông qua acetyl CoA – đầu vào chính cho một loạt chuỗi phản ứng của chu trình Crebs.Trong chu trình acid citric, pyruvate cung cấp năng lượng cho tế bào sống khi có mặt O2 hoặc lên men tạo ra lactate khi thiếu O2. Trong chu trình đường phân, PEP được biến đổi thành pyruvate nhờ xúc tác của pyruvate kinase Đây là phản ứng giải phóng nhiều năng lượng và không thuận nghịch Đồng thời,

nó sử dụng 2 enzyme là pyruvate carboxylase và PCK xúc tác cho sự chuyển đổi ngược pyruvate thành PEP Ở thực vật, pyruvate được hình thành trong phản ứng decarboxyl hóa acid malic dưới tác dụng của malate decarboxylase

- Về tính chất vật lý: acid pyruvic là một chất lỏng sánh, không màu, mùi tương tự như acid acetic Chúng có thể hòa tan trong nước theo bất cứ tỷ lệ nào, nhiệt độ nóng chảy 11,80C, nhiệt đô sôi 1850C

1.5.4 Tổng quan về mannitol

Mannitol là một đường rượu 6 carbon có dạng tinh thể màu trắng, vị ngọt, dễ hòa tan trong nước, công thức hóa học C6H8(OH)6

Hình 1.5 Cấu tạo phân tử mannitol Mannitol được tách chiết đầu tiên từ dịch tiết của hoa tần bì Ở thực vật, nó được sử dụng để gây áp lực thẩm thấu Mannitol được chuyển hóa từ đường bởi sự khử, với khối lượng phân tử 182,17 g/mol, tỷ trọng 1,52 g/ml Dung dịch nước của mannitol có tính acid nhẹ và đôi khi nhiều dung dịch được xử lý để pH thấp hơn Mannitol nóng chảy ở nhiệt độ 165 – 1690C và sôi ở nhiệt độ 2950C [51]

1.6 Tổng quan về protein và kỹ thuật điện di SDS-PAGE

1.6.1 Khái quát về protein

Các phân tử protein được cấu tạo nên nhờ các chuỗi polypeptide Chúng là

cơ sở của sự đa dạng về cấu trúc và chức năng của tất cả các sinh vật Chúng có cấu trúc phức tạp hơn rất nhiều so với carbonhydrate, lipid và cả nucleic acid Các protein có cấu trúc không gian 3 chiều phức tạp khi ở dạng tự nhiên và ở dạng này mới có hoạt tính sinh học Các protein chính là công cụ phân tử hiện thực hóa thông tin di truyền chứa trên nucleic acid [4]

Phân tử protein là các polymer được cấu tạo nên từ những đơn vị cấu trúc là amino acid, có 20 loại amino acid khác nhau Các amino acid nối với nhau bằng các liên kết peptide tạo thành các mạch polypeptide Các phân tử protein thường có nhiều hơn một mạch polypeptide Cấu trúc của protein phụ thuộc trực tiếp vào cấu trúc của DNA hay nói cách khác là phụ thuộc vào số lượng, thành phần cũng như trình tự sắp xếp của các nucleotide Chính cấu trúc của DNA sẽ quy định số lượng trình tự sắp xếp của các amino acid của phân tử protein từ đó quy định luôn chức năng của các phân tử protein này

1.6.2 Giới thiệu về kỹ thuật điện di

- Polyacrylamide gel

Điện di trên polyacrylamide gel được Weintraub sử dụng lần đầu tiên năm 1959 [44] Hợp chất cơ bản được sử dụng trong gel là acrylamide, đây là một monomer có cấu trúc phân tử là CH2=CH-CO-NH2 Khi có mặt các gốc tự do được cung cấp

bởiammonium persulfatevà ổn định bởi N,N,N’,N; - tetramethylethylenediamine, phản

ứng chuỗi được bắt đầu trong đó có các acrylamide monomer được polymer hóa thành một chuỗi dài Khi bisacrulamide (N,N’ – methylenebisacrylamide) được bổ sung trong phản ứng polymer hóa, các chuỗi sẽ liên kết chéo tạo thành dạng gel Độ xốp của gel được xác định bởi chiều dài của chuỗi và mức độ liên kết chéo [4]

Polyacrylamide gel có hai thành phần chính là stacking gel nằm phía trên và separating gel nằm phía dưới Stacking gel có nồng độ polyacrylamide thấp, thường

là 5% Mục đích của stacking gel tập trung lại các phân tử protein trên đường separating gel trước khi được phân tách theo khối lượng phân tử Do gel có nồng độ polyacrylamide thấp nên các mắt lưới của gel cũng ít đi, vì vậy các phân tử protein

di chuyển qua nó một cách dễ dàng Separating gel có nồng độ polyacrylamide cao hơn stacking gel rất nhiều, thường nằm trong khoảng 10 – 15% Mục đích của separating gel là để phân tách đoạn protein có khối lượng phân tử khác nhau Do separating gel có nồng độ polyacrylamide cao nên các mắt lưới trong đó cũng dày hơn Vì vậy, các phân tử protein di chuyển qua nó cũng khó khăn hơn nhiều [4]

Khi các phân tử protein di chuyển qua stacking gel gặp separating gel có nồng độ cao hơn, chúng sẽ tập trung lại trên bề mặt separating gel, do đó nồng độ của chúng sẽ tăng lên nhiều lần Ở đó, các phân tử protein do đã được biến tính có khối lượng phân tử thấp, cấu trúc không gian đơn giản dễ dàng đi qua được các mắt lưới Kết quả là các phân tử protein được phân tách thành các đoạn khác nhau

Trong quá trình chạy điện di một chiều các phân tử protein sẽ dịch chuyển giữa các mắt lưới polyacrylamide gel để di chuyển sang điện cực trái dấu Sự phân tách này xảy ra nhờ điện tích của protein trái dấu ở pH cho trước, kích thước của

protein và sự cản trở của chúng trong quá trình dịch chuyển trong điện trường Vì vậy, nếu các đặc điểm này bù trừ lẫn nhau thì protein khác điện tích và kích thước nhưng cũng có thể di chuyển cùng tốc độ như nhau trong gel Để đơn giản hóa sự phân tách hỗn hợp protein mà chỉ phụ thuộc vào kích thước của chuỗi polypeptide, người ta tiến hành biến tính protein bằng thuốc tẩy sodium dodecyl sulfate (SDS) SDS liên kết rất chặt với protein làm cấu trúc ba chiều của protein bị biến tính trở thành các chuỗi polypeptide gắn đầy SDS trên đó Trung bình, một amino acid sẽ liên kết với hai phân tử SDS và SDS sẽ tạo điện tích âm cho hạt SDS – polypeptide Ngoài ra, SDS còn làm giảm mức độ khác nhau của các phân tử bằng cách phá vỡ các liên kết hydrogen, kìm hãm các phản ứng kị nước nội phân tử, phá vỡ cấu trúc bậc hai và bậc bốn của phân tử protein [4]

Nhờ vào cấu trúc dạng mạng lưới của polyacrylamide gel mà các protein có khối lượng phân tử khác nhau (hay cấu trúc không gian phức tạp khác nhau) lần lượt di chuyển qua lớp gel với tốc độ khác nhau Tốc độ dịch chuyển của các phân

tử này phụ thuộc vào khối lượng của chúng, các phân tử có khối lượng bé dịch chuyển nhanh hơn và ngược lại Kết quả cuối cùng các phân tử có khối lượng bằng nhau sẽ tập hợp thành 1 băng trên gel

Sau khi tiến hành nhuộm các băng protein trên polyacrylamide gel và rửa sạch thuốc nhuộm Dựa vào vị trí và độ đậm nhạt của các băng protein (cùng với các băng protein chuẩn), ta có thể định tính thành phần các loại protein cùng với sự thay đổi hàm lượng của chúng Kỹ thuật điện di SDS chủ yếu để xác định sự xuất hiện của các protein mới trong mẫu nghiên cứu Ngoài tác dụng phân tách các băng protein có khối lượng phân tử khác nhau, polyacrylamide gel còn được ứng dụng để phân tách các đoạn DNA có kích thước bé (<200bp)