giám sát hoạt động và đánh giá hiệu quả của chế phẩm trợ sinh từ streptomyces sp. a1 đến chất lượng môi trường nước ao nuôi tôm tại phú lộc - thừa thiên huế

Theo Maeda vàNagami 1989, việc sử dụng các loại vi khuẩn trợ sinh không những đã ức chế được sự phát triển của Vibrio spp., giúp duy trì môi trường ao nuôi tôm tốt hơn, mà còn tạo điều k

MỞ ĐẦU

 Lý do chọn đề tài

Tỉnh Thừa Thiên Huế (TT Huế), với 126 km đường bờ biển, có diện tíchvùng đầm phá chiếm 34 % diện tích toàn tỉnh Trong đó, hệ Tam Giang - Cầu Haivới diện tích 22,000 ha được xem là hệ đầm phá lớn nhất Đông Nam Á [22] Hệsinh thái nước mặn, nước lợ đặc thù ở đây đã tạo điều kiện thuận lợi cho việc pháttriển nghề nuôi trồng thủy sản (NTTS) ở tỉnh TT Huế đặc biệt là nghề nuôi tôm.Tuy nhiên từ năm 2002 đến nay, việc phát triển các đầm, hồ, ao nuôi tôm một cách

ồ ạt, tùy tiện, không theo quy hoạch và thiếu khoa học đã khiến cho môi trường bị ônhiễm nghiêm trọng Dịch bệnh tôm thường xuyên xảy ra gây thiệt hại nghiêmtrọng về kinh tế - xã hội và gây suy thoái hệ sinh thái vùng đầm phá Hậu quả làchính nghề nuôi tôm làm cho nhiều gia đình lao đao, nhiều hộ tái nghèo, làm tăng

số hộ nghèo trên toàn tỉnh [19]

Với thực tế đó, việc sử dụng các chế phẩm trợ sinh ngày càng trở nên phổbiến trong nuôi tôm không chỉ nhằm mục đích phòng bệnh và cải thiện dinh dưỡng

mà còn vì nhu cầu ngày càng cao về nuôi tôm thân thiện với môi trường Ở Châu Á

đã có nhiều nghiên cứu sử dụng các probiotic trong nuôi tôm Theo Maeda vàNagami (1989), việc sử dụng các loại vi khuẩn trợ sinh không những đã ức chế

được sự phát triển của Vibrio spp., giúp duy trì môi trường ao nuôi tôm tốt hơn, mà

còn tạo điều kiện thuận lợi cho sự sinh trưởng của ấu trùng tôm [72] Ở TrungQuốc, nghiên cứu men vi sinh trong nuôi thủy sản được tập trung vào vi khuẩnquang hợp Qiao Zhenguo và cs (1992) nghiên cứu 3 chủng vi khuẩn quang hợp sử

dụng cho nuôi tôm thẻ Trung Quốc (Penaeus chinensis) dùng cải thiện chất lượng

môi trường nước [88] Cui Jingjin và cs (1997) đã báo cáo về việc sử dụng các vi

khuẩn quang hợp Rhodomonas sp trong sản xuất tôm giống Penaeus chinensis Các

kết quả đạt được cho thấy chất lượng nước trong ao nuôi được bổ sung vi khuẩn đãđược cải thiện đáng kể, ô nhiễm trên vỏ của ấu trùng đã được giảm xuống, thời gianbiến thái của ấu trùng là một ngày hoặc thậm chí sớm hơn [46] Theo Graslund và cs.(2003) thì 86 % người nuôi tôm ở Thái Lan sử dụng probiotic để cải thiện chất lượngnước và bùn đáy ao nuôi [39]

Ở nước ta, đa số các chế phẩm được sử dụng có nguồn gốc nhập ngoại vàphần lớn các chế phẩm này chưa được công bố về xuất xứ nguồn gốc Vì vậy,chúng có thể là nguy cơ lan truyền các vi sinh vật (VSV) độc hại, VSV biến đổi genlàm mất an toàn sinh học Ngoài ra, các tác động có lợi của việc sử dụng các chếphẩm trong nuôi tôm vẫn còn gây tranh cãi bởi hiệu quả là chưa rõ ràng Vì vậyviệc tạo ra các chế phẩm sinh học bản địa là việc làm cấp thiết

Trên thực tế chúng tôi đã phân lập được một chủng xạ khuẩn bản địa,

Streptomyces sp A1, với các đặc tính trợ sinh được mong muốn từ trầm tích ao nuôi

tôm ở tỉnh TT Huế [81] Trong nghiên cứu này, chúng tôi đặt vấn đề “Giám sát

hoạt động và đánh giá hiệu quả của chế phẩm trợ sinh từ Streptomyces sp A1

đến chất lượng môi trường nước ao nuôi tôm tại Phú Lộc - Thừa Thiên Huế” nhằm tạo cơ sở khoa học và thực tiễn cho việc sử dụng chế phẩm trợ sinh từ các vi

sinh vật bản địa, góp phần nâng cao năng suất, hạn chế sử dụng kháng sinh và hóachất trong ao nuôi tôm, tạo ra các sản phẩm tôm “sạch” bảo đảm an toàn vệ sinhthực phẩm, hướng đến một sự phát triển bền vững cho ngành nuôi trồng thủy sảncủa tỉnh TT Huế

 Mục đích nghiên cứu

 Giám sát được hoạt động và đánh giá được hiệu quả của việc sử dụng

chế phẩm trợ sinh từ Streptomyces sp A1 đến chất lượng môi trường nước ao nuôi

tôm tại Phú Lộc - TT Huế

 Tạo điều kiện thuận lợi cho việc sản xuất, sử dụng chế phẩm sinh họcsẵn có tại địa phương với hiệu quả cao trong việc khống chế dịch bệnh trên tôm,góp phần đảm bảo sự phát triển bền vững nghề NTTS của tỉnh TT Huế nói riêng và

cả nước nói chung

 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

 Đối tượng nghiên cứu

- Chủng xạ khuẩn Streptomyces sp A1 có khả năng trợ sinh trong nuôi tôm

được nhóm chúng tôi phân lập và đặc tính hóa trước đây [81] Mẫu hiện đang đượclưu giữ ở trạng thái đông khô tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học -Khoa Sinh học - Trường Đại học Khoa học Huế

- Mẫu nước và mẫu trầm tích các ao nuôi tôm ở Phú Lộc - TTHuế

 Phạm vi nghiên cứu

- Các ao nuôi tôm ở Phú Lộc- tỉnh TT Huế.

 Phương pháp nghiên cứu

 Nhân sinh khối chủng xạ khuẩn Streptomyces sp A1 trên máy lắc (Jeiotech

SI-600R, Korea) và nhân giống cấp 2 trong hệ lên men 10 L (Infors Labfors

HT, Switzerland)

 Các thông số chất lượng nước như nhiệt độ, độ dẫn điện, độ đục, độ mặn,

pH, DO và TDS được đo tại hiện trường bằng máy đo HORIBA U-52 (Mỹ)

 Tổng chất rắn (TSS) được xác định theo phương pháp khối lượng

 BOD5 được xác định bằng đo DO trước và sau khi ủ 5 ngày ở 20  1oC

 COD được xác định theo phương pháp hồi lưu kín-đo quang

 Phosphate (PO4)3-; nitrite (NO2-) được xác định theo phương pháp đo quang

 Nitrate (NO3) được xác định theo phương pháp khử bằng cadmium (Cd) và

đo quang

 Ammonium (NH4/NH3) được xác định theo phương pháp đo quang sử dụngthuốc thử OPP

 Tổng Coliform được xác định bằng kỹ thuật nhiều ống MPN

 Giám sát hoạt động của chế phẩm bằng kỹ thuật đếm trên đĩa và DGGE

 Xác định mật độ sống của Streptomyces sp A1 bằng phương pháp đếm trên

môi trường SCA

 Kiểm tra hoạt tính đối kháng với Vibrio harveyi V7 của chế phẩm từ Streptomyces sp A1 bằng phương pháp thạch đĩa 2 lớp.

 Ý nghĩa khoa học của đề tài

 Sản xuất một chế phẩm trợ sinh cho nuôi tôm từ một chủng xạ khuẩn bản

địa, Streptomyces sp A1, được phân lập ngay tại ao nuôi tôm ở tỉnh TT Huế với

những đặc tính trợ sinh mong muốn

 Giám sát hoạt động của chế phẩm trợ sinh khi được sử dụng vào môitrường ao nuôi tôm bằng cả hai phương pháp: truyền thống và phân tử

 Làm cơ sở khoa học cho các nghiên cứu liên quan

 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

 Tạo điều kiện thuận lợi cho việc sản xuất chế phẩm sinh học tại địaphương nhằm khống chế dịch bệnh trên tôm, góp phần đảm bảo sự phát triển bềnvững nghề NTTS của tỉnh TT Huế nói riêng và cả nước nói chung.

 Cấu trúc của luận văn

Luận văn gồm phần mở đầu và 3 chương

Chương 1: Giới thiệu khái quát về tình hình nuôi tôm và dịch bệnh ở Việt

Nam và các vùng nuôi tôm ven đầm phá của tỉnh TT Huế, đồng thời đề cập đếnprobiotic và tình hình nghiên cứu, ứng dụng probiotic trong nuôi tôm

Chương 2: Nêu các phương pháp nghiên cứu được sử dụng.

Chương 3: Trình bày những kết quả đã đạt được trong quá trình nghiên cứu

trong đó có sự so sánh với các công trình nghiên cứu liên quan khác, đồng thời nêulên các kết luận rút ra từ những kết quả đã đạt được và kiến nghị cho hướng pháttriển của đề tài

Chương 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TỔNG QUAN VỀ NUÔI TÔM Ở VIỆT NAM NÓI CHUNG VÀ VÙNG VEN ĐẦM PHÁ TỈNH THỪA THIÊN HUẾ NÓI RIÊNG

1.1.1 Tổng quan về nuôi tôm ở Việt Nam

Nghề nuôi tôm Việt Nam thực sự phát triển từ sau năm 1987 và nuôi tômthương phẩm phát triển mạnh vào những năm đầu thập kỷ 90 của thế kỷ trước [6]

Sự bùng nổ của nghề nuôi tôm thương phẩm được đánh dấu vào năm 2000, khiChính phủ ban hành Nghị quyết 09, cho phép chuyển đổi một phần diện tích trồnglúa, làm muối năng suất thấp, đất hoang hoá sang NTTS Chỉ trong vòng một nămsau đó, đã có 235,000 ha gồm 232,000 ha ruộng lúa, 1,900 ha ruộng muối và 1,200

ha diện tích đất hoang hoá ngập mặn được chuyển đổi thành ao nuôi tôm Theo sốliệu của Tổng cục Thống kê Việt Nam, ngành tôm nuôi đã phát triển rất mạnh tronggiai đoạn từ năm 2000 cho đến nay Diện tích mặt nước nuôi tôm nước mặn, lợ năm

2005 đã đạt đến 616,9 ngàn ha, tăng 1,9 lần so với năm 2000 [15] Phần lớn diệntích nuôi tôm ở Việt Nam tập trung ở đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL), rải rácdọc các cửa sông, kênh, rạch ven biển miền Trung, đồng bằng sông Hồng và sôngThái Bình ở miền Bắc [6]

Song song với việc mở rộng diện tích, sản lượng tôm nuôi cũng tăng mạnh từnhững năm 90 và đặc biệt là từ sau năm 2000 (Bảng 1.1), Việt Nam đã trở thànhmột trong 5 nước có sản lượng tôm nuôi cao nhất trên thế giới Các loài tôm nuôi

chính ở Việt Nam gồm tôm sú (Penaeus monodon), tôm he mùa (Penaeus merguiensis), tôm nương (P orientalis), tôm đất/rảo (Metapenaeus ensis), trong đó

tôm sú là loài nuôi chủ đạo, đóng góp sản lượng cao nhất (Bảng 1.2 và 1.3)

Bảng 1.1 Sản lượng tôm nuôi ở Việt Nam

(Nguồn: Báo cáo của Bộ Thuỷ sản từ 1990-2003)

Miền Bắc 127 1,114 1,897 2,693 2,114 4,382 9,215

Nam Trung bộ 495 589 4,135 6,993 17,153 23,727 20,890Đông Nam bộ 242 542 1,570 3,652 990 3,153 4,359Tây Nam bộ 14,741 30,333 47,121 44,307 81,875 127,899 153,122

Cộng 15,605 32,746 55,593 58,996 103,845 162,713 193,973

Bảng 1.2 Diện tích và sản lượng tôm nuôi ở Việt Nam 2009

(Nguồn: NN&PTNT, 2009)

Tôm sú Tôm thẻ chân

đó mặt hàng tôm chiếm 39 % [110]

Tuy vậy, nghề nuôi tôm ở Việt Nam đang phải đối mặt với nhiều thách thức,ảnh hưởng đến tính bền vững của ngành Đó là các tác động kinh tế, xã hội, môitrường của ngành nuôi tôm và gần đây là các vấn đề về rào cản chất lượng sản phẩm

và tranh chấp thương mại giữa các nước xuất khẩu và nhập khẩu Nuôi tôm ở ViệtNam chủ yếu vẫn do các nông hộ thực hiện ở quy mô sản xuất nhỏ Chuỗi thịtrường từ khâu sản xuất đến khâu chế biến và tiêu thụ chưa được thiết lập chặt chẽ,làm cho nghề nuôi tôm mang tính nhỏ lẻ và manh mún, kém hiệu quả, rủi ro cao,chất lượng không ổn định dẫn đến giảm khả năng cạnh tranh với các nước khác

trong khu vực Hơn nữa, việc chuyển đổi quá nhanh một diện tích lớn ruộng lúa,ruộng muối năng suất thấp và đất hoang hoá ven biển sang nuôi tôm kéo theo mộtloạt các vấn đề bất cập về cung ứng vốn đầu tư, giống, kỹ thuật công nghệ, quản lýmôi trường, kiểm soát dịch bệnh, quy hoạch và phát triển cơ sở hạ tầng Ngoài ra,

sự phát triển nhanh chóng của nghề nuôi tôm đã và đang đặt ra những vấn đề môitrường bức xúc trước mắt và lâu dài như suy thoái rừng ngập mặn, mất cân bằngsinh thái, ô nhiễm môi trường và sự phát triển của dịch bệnh [6]; [17]; [28]

Theo ước tính của Bộ Thuỷ sản (1996), nạn dịch bệnh tôm ở các tỉnh đồngbằng sông Cửu Long trong các năm 1994-1995 đã ảnh hướng tới 85,000 ha và gâythiệt hại 294 tỷ đồng Và trong các năm 2001, 2002 dịch bệnh tôm tiếp tục đe doạ

và gây ảnh hưởng lớn ở khu vực ĐBSCL Năm 2003, cả nước có 546,757 ha nuôitôm nước lợ thương phẩm, trong đó diện tích có tôm nuôi bị bệnh và chết là 30,083

ha Riêng các tỉnh ven biển từ Đà Nẵng đến Kiên Giang có tới 29,200 ha tôm nuôi

bị chết nhiều, chiếm 97,06 % diện tích có tôm bị chết trong cả nước Năm 2008,dịch bệnh xảy ra ở hầu hết các tỉnh trọng điểm nuôi tôm như Kiên Giang, Cà Mau,Sóc Trăng, Bến Tre và Trà Vinh Diện tích bị dịch bệnh ở các tỉnh vùng Bắc Bộ ướctính khoảng 18 nghìn ha [6] Trong năm 2011, Tổng cục Thủy sản (Bộ NN&PTNT)cho biết ngành nuôi tôm ở các tỉnh ĐBSCL đã mất trắng khoảng 60,000 ha vì dịchbệnh Bước sang vụ nuôi tôm mới, nhưng chỉ trong 2 tháng đầu năm 2012, đã cómột số vùng nuôi tôm bị chết với tỷ lệ 30-70 % diện tích Và tính đến hết tháng6/2012, cả nước đã thả giống gần 615 nghìn ha tôm, tuy nhiên, đến nay gần 40nghìn ha tôm đã chết, chủ yếu là tôm nuôi bán thâm canh và thâm canh Các tỉnhthiệt hại lớn là Trà Vinh, Sóc Trăng, Kiên Giang, Bạc Liêu, Long An, các tỉnh NamTrung Bộ…[111]

Hạn chế lớn nhất về công nghệ là ngành nuôi tôm ở Việt Nam nói riêng vàtrên thế giới nói chung chưa chủ động được khâu sản xuất giống, chưa cung cấp đủgiống, con giống chất lượng thấp và chưa kiểm soát được dịch bệnh trong sản xuất

và lưu thông giống, nuôi với mật độ cao, không tuân theo lịch thời vụ, không tuântheo quy trình kỹ thuật, nguồn nước bơm vào một số nơi bị ô nhiễm Một số bệnhnguy hiểm thường gặp ở tôm là bệnh vi rút đốm trắng-WSSV, bệnh đầu vàng-YHD,bệnh Parvovirus ở gan tụy tôm-HPV, bệnh do Penaeus Monodon Baculovirus-

MBV, bệnh do ký sinh trùng, do môi trường và dinh dưỡng, bệnh do vi khuẩn

Vibrio, vi khuẩn dạng sợi, bệnh do nấm…[29]

1.1.2 Tổng quan về nuôi tôm vùng ven đầm phá tỉnh TT Huế

TT Huế có hệ đầm phá Tam Giang- Cầu Hai lớn nhất Đông Nam Á, nằm trảidài trên 70 km thuộc địa bàn của 5 huyện (Phong Điền, Quảng Điền, Hương Trà,Phú Lộc và Phú Vang) với diện tích mặt nước khoảng 22,600 ha, có nguồn lợi thủysản dồi dào và đa dạng sinh học cao [2] Hệ đầm phá Tam Giang-Cầu Hai nhậnnước ngọt từ hầu hết các sông lớn trong khu vực (sông Hương, Bồ, Ô Lâu, ĐạiGiang và Truồi), đồng thời thông với biển qua hai cửa Thuận An và Tư Hiền Khuvực đầm phá chịu ảnh hưởng của chế độ bán nhật triều Hệ thống đầm phá TamGiang - Cầu Hai đóng một vai trò rất quan trọng trong quá trình điều hòa dòngchảy, ngăn chặn sự xâm nhập mặn, ngoài ra nó còn được khai thác phục vụ giaothông thủy, đánh bắt và NTTS Nhìn chung, môi trường nước lợ của đầm phá đã tạođiều kiện thuận lợi cho sự phân bố và phát triển đa dạng của các sinh vật thủy sinh,mang lại một nguồn lợi thủy sản đáng kể cho cộng đồng 300.000 cư dân sinh sốngven bờ [62]

Từ năm 1994, tỉnh TT Huế đã xác định NTTS như một ngành kinh tế mũinhọn của vùng [83] Phát triển NTTS, đặc biệt là hoạt động nuôi tôm đã mang lạidiện mạo mới cho vùng đầm phá Từ các cơ chế, chính sách thông thoáng của Nhànước và chính quyền địa phương, người dân TT Huế đã phát triển NTTS một cách ồ

ạt trên các vùng đất ven đầm phá, diện tích nuôi tôm tăng đột biến từ 1,800 ha năm

1999 lên đến 3,200 ha năm 2001 (Sở Thủy sản TT Huế, 2002) Diện tích NTTS củatỉnh hiện nay là 5,800 ha, trong đó diện tích ao nuôi tôm nước lợ và nước mặn là3,900 ha, nuôi tôm nước ngọt là 1,900 ha, diện tích nuôi trong năm 2011 ước tínhđạt 5,910 ha [111] Về sản lượng tôm, năm 2007 ước tính đạt 7,800 tấn trong đótôm sú đạt 3,360 tấn Ngành thuỷ sản đóng vai trò kinh tế-xã hội quan trọng đối vớitỉnh TT Huế với tổng doanh thu xuất khẩu năm 2005 lên đến 6 triệu USD, chiếm0,23 % của tổng kim ngạch toàn quốc (2,65 tỉ USD)

Tuy nhiên việc quản lý và sử dụng tài nguyên đầm phá chưa hợp lý và sự pháttriển NTTS thiếu quy hoạch đã làm môi trường nước bị ô nhiễm, tôm bị dịch bệnh,nuôi tôm bị mất mùa, thua lỗ trong những năm gần đây Tình hình dịch bệnh trên tôm

diễn ra và lây lan trên diện rộng làm ảnh hưởng đến kinh tế-xã hội và ô nhiễm nghiêmtrọng môi trường đầm phá (Bảng 1.4) Theo Báo cáo của Sở Thủy sản TT Huế năm

2007, ước tính có 1.052,98 ha ao nuôi tôm bị nhiễm bệnh (chiếm 36,91%), năm 2010,889,7 ha ao nuôi tôm đã mất trắng do dịch bệnh Từ chỗ xuất khẩu thủy sản đạt 27 triệuUSD vào năm 2002 thì đến năm 2003 chỉ còn 5 triệu USD, năm 2004 còn 3 triệu USD[112] Mãi đến năm 2009, kim ngạch xuất khẩu thủy sản của tỉnh mới tăng lên được6,3 triệu USD và chỉ chiếm 5% tổng kim ngạch toàn tỉnh [22]; [34]

Bảng 1.4 Diện tích nuôi tôm đến năm 2007 ở các huyện thuộc tỉnh TT Huế

Trong số những dịch bệnh thủy sản thì bệnh do vi khuẩn gây nên chiếm một

tỷ lệ lớn Sự phát triển nhanh chóng của các vi khuẩn gây bệnh cơ hội là nguyênnhân chủ yếu của tỷ lệ tử vong cao ở tôm trong môi trường nước ao nuôi giàu chất

hữu cơ Trong đó, Vibrio spp mà phổ biến là Vibrio alginolyticus, V anguillarum,

V harveyi và V parahaemolyticus được xem là nhân tố chính [29]; [50]; [61].

Thông thường, việc bổ sung các loại thuốc kháng sinh và hóa chất với nồng

độ hợp lý vẫn là giải pháp được chọn lựa cho mục đích kiểm soát dịch bệnh do

Vibrio spp trong nuôi tôm Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh và hóa chất không

đúng quy cách và liều lượng thường mang lại hiệu quả thấp Ngoài ra phương phápnày cũng có một số nhược điểm như tạo ra các dòng vi khuẩn kháng nhiều loạikháng sinh rất nguy hiểm có thể gây suy thoái môi trường [38]; [68]; [86]; [92];[98], và sự tồn dư các loại kháng sinh cũng như hóa chất trong động vật thủy sản,làm giảm đáng kể sức cạnh tranh về mặt kinh tế đối với các sản phẩm xuất khẩu

Vì vậy, việc tạo ra các chế phẩm sinh học từ các vi sinh vật bản địa phù hợpvới điều kiện khí hậu của Việt Nam, độ an toàn sinh học cao và giá thành rẻ thật sự

là một vấn đề cấp thiết, đảm bảo cho sự phát triển bền vững của ngành nuôi trồng,chế biến và xuất khẩu thủy sản Việt Nam

1.2 PROBIOTIC VÀ TRIỂN VỌNG CỦA VIỆC SỬ DỤNG PROBIOTIC TRONG NUÔI TÔM

1.2.1 Khái niệm về probiotic

Probiotic theo tiếng Hy Lạp có nghĩa là “dành cho cuộc sống” và đã có nhiềuđịnh nghĩa cho thuật ngữ này từ các tác giả khác nhau Lily và Stillwell (1965) đãdùng thuật ngữ này để mô tả những chất được tiết ra bởi một loại vi sinh vật (VSV)nào đó mà có thể kích thích sự phát triển của sinh vật khác [69] Parker (1974) lạicho rằng probiotic là những vi sinh vật (VSV) như vi khuẩn hay nấm men mà có thểthêm vào thực phẩm giúp cân bằng quần thể VSV trong ruột của sinh vật chủ [85].Theo Fuller (1989), probiotic là những VSV được sử dụng làm thức ăn bổ sung gây

ra những ảnh hưởng hữu ích lên vật chủ bằng cách ổn định hệ VSV đường ruột[55] Năm 1992, Havenaar đã mở rộng định nghĩa về probiotic: Probiotic được địnhnghĩa như là sự nuôi cấy riêng lẻ hay hỗn hợp các VSV sống mà có ảnh hưởng cólợi cho sinh vật chủ bằng cách cải thiện những đặc tính của VSV bản địa Trên cơ

sở những nghiên cứu gần đây, Salminen và cs (1999) cho rằng probiotic là các chếphẩm hay các thành phần có nguồn gốc từ tế bào VSV có tác động có lợi lên vậtchủ [90] Theo tổ chức Lương Nông Liên Hiệp Quốc/Tổ chức Y tế Thế giới (FAO/WHO, 2001): “Probiotic là các VSV sống khi được đưa một lượng cần thiết vào cơthể sẽ đem lại hiệu quả có lợi cho cơ thể vật chủ” [51] Một cách tổng quát, theoPhạm Thị Tuyết Ngân (2007): “Probiotic là hỗn hợp bổ sung mang bản chất của cácVSV sống tác động có lợi đối với vật chủ nhờ cải thiện hệ vi sinh liên kết với vậtchủ hoặc sống tự do trong môi trường, nó giúp cải thiện việc sử dụng thức ăn hoặctăng cường giá trị dinh dưỡng của thức ăn, ngoài ra probiotic còn giúp tăng khảnăng đề kháng của vật chủ đối với mầm bệnh hoặc nhờ vào sự cải thiện chất lượngcủa môi trường sống” [18]

Thông thường, các chủng VSV có thể sử dụng làm probiotic đã được phânlập từ VSV bản địa và ngoại sinh của các loài động vật thủy sản Các loại vi khuẩn

Gram (-), kỵ khí tùy nghi như Vibrio và Pseudomonas tạo thành hệ VSV bản địa

chiếm ưu thế của một loạt các loài cá biển Ngược với các loài cá nước mặn, hệVSV bản địa của các loài cá nước ngọt có xu hướng bao gồm các loài thuộc giống

Aeromonas, Plesiomonas, thuộc họ Enterobacteriaceae, và các vi khuẩn kỵ khí bắt buộc như Bacteroides, Fusubacterium và Eubacterium Vi khuẩn sản sinh acid lactic mà phổ biến ở các loài động vật có vú hoặc ruột gia cầm (Bifidobacterium ở người, Lactobacillus ở động vật gặm nhấm, lợn và gia cầm, Enterococcus ở động

vật ăn thịt) được xem là loài chiếm ưu thế đứng thứ hai ở cá và đại diện chủ yếu bởi

Carnobacterium [40].

1.2.2 Cơ chế tác động của probiotic trong NTTS

1.2.2.1 Sản xuất các chất ức chế

Vi khuẩn được sử dụng làm probiotic thường tiết ra nhiều loại hợp chất hóahọc gây ức chế đối với cả vi khuẩn G (+) và G (-) Những chất này có thể kể đếnnhư: bacteriocin, siderophore, lysozyme, protease, hydrogen peroxide, Vi khuẩnsinh acid lactic cho thấy cũng sản xuất các hợp chất như bacteriocin mà có tác dụng

ức chế đối với nhiều loại VSV khác [74]

1.2.2.2 Cạnh tranh vị trí bám dính

VSV probiotic cạnh tranh về vị trí bám dính và thức ăn trên bề mặt biểu môruột và cuối cùng ngăn chặn sự nhân lên của nhóm vi khuẩn gây bệnh Khả năng

bám dính và sinh trưởng trong điều kiện in vitro trên/trong biểu mô ruột hay lớp

màng nhầy bên ngoài thành ruột đã được thử nghiệm đối với một số tác nhân gây

bệnh cho cá như Vibrio anguillarum và Aeromonas hydrophila [74].

1.2.2.3 Cạnh tranh chất dinh dưỡng

VSV hữu ích sử dụng chất dinh dưỡng mà nếu không sẽ được tiêu thụ bởi các loại

vi khuẩn gây bệnh Cạnh tranh chất dinh dưỡng đóng vai trò quan trọng trong hệ VSVđường ruột hoặc môi trường xung quanh của đối tượng thủy sản được nuôi Do đó, ứngdụng thành công nguyên tắc cạnh tranh này trong tự nhiên không phải là điều đơn giản vàđiều này vẫn còn là thách thức đối với các nhà sinh thái học VSV [74]

1.2.2.4 Nguồn cung cấp chất dinh dưỡng và các enzyme tham gia vào quá trình tiêu hóa

Các nhà khoa học đã chứng tỏ được rằng vi sinh vật probiotic tác động có lợicho quá trình tiêu hóa của động vật thủy sản Ở cá, người ta nhận thấy rằng

Bacteriodes và Clostridium sp cũng góp phần vào nguồn dinh dưỡng cho vật chủ, đặc biệt là cung cấp các acid béo và vitamin Các vi khuẩn khác như Agrobacterium

sp., Pseudomonas sp., Brevibacterium sp., Microbacterium sp., và Staphylococus

sp cũng đóng góp vào quá trình hấp thu chất dinh dưỡng ở cá hồi Bắc cực

(Salvelinus alpinus L.) Ngoài ra, một số vi khuẩn cũng tham gia vào quá trình tiêu

hóa của động vật hai mảnh vỏ bằng cách sản xuất ra các enzyme ngoại bào nhưprotease, lipase cũng như cung cấp nhiều yếu tố tăng trưởng cần thiết khác Cácnghiên cứu tương tự cũng được thực hiện đối với quần thể VSV ở tôm trưởng thành

(Penaeus chinensis), cho thấy có sự bổ sung các enzyme thiết yếu cho tiêu hóa và

tổng hợp các chất tương tự như ở động vật VSV có thể cung cấp nguồn vitamin hayamino acid cho bộ máy tiêu hóa của vật chủ [74]

1.2.2.5 Tăng cường đáp ứng miễn dịch

Hệ thống đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu có thể được kích thích bởiprobiotic Các nhà khoa học đã chứng minh được rằng nếu bổ sung bằng cách uống

vi khuẩn Clostridium butyricum cho cá hồi cầu vồng (Oncorhynchus mykiss) sẽ

giúp tăng cường sức đề kháng của cá đối với phẩy khuẩn bằng cách tăng cường hoạtđộng thực bào của bạch cầu Rengpipat và cs (2000) nhận thấy khi sử dụng

Bacillus sp (chủng S11) giúp giảm tỷ lệ tôm nhiễm bệnh do khả năng kích hoạt các

tế bào cũng như các đáp ứng miễn dịch dịch thể Balcazar (2003) cho rằng bổ sung

hỗn hợp vi khuẩn (Bacillus và Vibrio sp.) có ảnh hưởng tích cực đến sự sinh trưởng

và tỷ lệ sống của ấu trùng tôm chân trắng cũng như khả năng chống chịu với các tác

nhân gây bệnh Vibrio harveyi và bệnh đốm trắng do virus gây nên Hiệu quả bảo vệ

này có được là do tăng cường hoạt động thực bào và hoạt tính kháng khuẩn, dẫn đếnkích thích hệ thống miễn dịch Ngoài ra, Nikoskelainen và cs (2003) đã sử dụng vi

khuẩn sinh lactic Lactobacillus rhamnosus (chủng ATCC 53103) với mật độ 105CFU/g thức ăn, nhận thấy gia tăng khả năng hô hấp ở cá hồi cầu vồng

(Oncorhynchus mykiss) [74].

1.2.2.6 Cải thiện chất lượng nước

Probiotic cũng góp phần cải thiện chất lượng nước trong NTTS Điều này là

do các vi khuẩn hữu ích trong probiotic có khả năng tham gia vào chu trình tuầnhoàn hợp chất hữu cơ trong ao nuôi [74]

Cải thiện chất lượng nước cho thấy liên quan đặc biệt với vi khuẩn Bacillus sp.

Nguyên nhân cơ bản là do vi khuẩn Gram (+) có khả năng chuyển hóa chất hữu cơ

triệt để thành CO2 hiệu quả hơn vi khuẩn G (-) Trong chu trình trao đổi chất,duy trìmật độ vi khuẩn Gram (+) trong ao nuôi sẽ hạn chế được sự tích lũy vật chất hữu cơtrong ao trong suốt quá trình nuôi Theo Dalmin và cs (2001), việc sử dụng

Bacillus sp được cho là giúp cải thiện chất lượng nước, tỷ lệ sống và tốc độ tăng trưởng của ấu trùng tôm sú (Penaeus monodon) cũng như ức chế phẩy khuẩn gây

bệnh [47]; [40]

1.2.2.7 Tương tác với thực vật nổi (thực vật thủy sinh)

Vi khuẩn probiotic có khả năng đáng kể trong việc tiêu diệt một số loài tảo,đặc biệt là tảo gây ra hiện tượng thủy triều đỏ Những dòng vi khuẩn đối kháng vớitảo có thể là không được mong muốn trong kỹ thuật ương ấu trùng bằng nước xanh,tuy nhiên sẽ có lợi khi tảo phát triển quá mức trong ao nuôi [74]

1.2.2.8 Hoạt tính kháng virus

Một số vi khuẩn sử dụng như là probiotic có tác dụng kháng virus Mặc dù cơchế chính xác của hoạt tính này vẫn chưa được biết rõ, các nghiên cứu trong phòngthí nghiệm chỉ ra rằng virus bị bất hoạt bởi các chất có hoạt tính sinh học chiết xuất

từ tảo biển và các nhân tố ngoại bào của vi khuẩn Các nghiên cứu gần đây cho thấy

Pseudomonas sp., Vibrio sp., Aeromonas sp và nhóm Coryneform phân lập từ các

trại sản xuất giống cá hồi có hoạt tính kháng virus gây bệnh hoại tử ( Infectioushematopoietic necrosis virus- IHNV) với hiệu quả hơn 50 % Girones và cs (1989)

đã tìm thấy một loại vi khuẩn biển thuộc giống Moraxella có khả năng đối kháng

đặc hiệu với poliovirus [58] Direkbusarakom và cs (1998) đã phân lập được hai

chủng vi khuẩn Vibrio spp Nica 1030 và Nica 1031 từ một trại sản xuất giống tôm

sú Các dòng phân lập được cũng thể hiện hoạt tính kháng IHNV và virus

Oncorhynchus masou (OMV) [49]

1.2.3 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng probiotic trong nuôi tôm

1.2.3.1 Tình hình sử dụng và hiệu quả của probiotic trong nuôi tôm trên thế giới

Vào những năm cuối của thập kỷ 80, những công bố đầu tiên về kiểm soátsinh học trong NTTS đã được công nhận và từ đó nhiều nghiên cứu về vấn đề nàykhông ngừng phát triển Tuy vậy, cho đến nay, nghiên cứu về sử dụng probiotictrong NTTS vẫn còn đang ở trong giai đoạn mới mẻ và có nhiều vấn đề cần phải

đầu tư Những dòng vi khuẩn cơ bản như Vibrio, Pseudomonas, Bacillus và

Lactobacillus đã được kiểm chứng và được xem như như những dòng vi sinh hữu

ích trên các đối tượng tôm, cua, nhuyễn thể và cá [59]

Maeda và Nagami (1989) báo cáo về việc sử dụng chế phẩm trợ sinh đã làm

suy giảm mật độ vi khuẩn Vibrio trong ao nuôi do sự cạnh tranh sinh học giữa nhóm

vi khuẩn có lợi và nhóm gây bệnh, tạo điều kiện thuận lợi cho sự sinh trưởng của ấutrùng tôm, cua [72]

Trong một công trình nghiên cứu khác, Maeda và Liao (1992) đã sử dụngchủng vi khuẩn PM-4 phân lập từ đất bổ sung vào môi trường ương, nhận thấy có

ảnh hưởng tốt đối với tỷ lệ sống của ấu trùng tôm sú (Penaeus monodon), do chúng

khoảng 10% mẫu có mặt vi khuẩn này [59]

Jiravanichpaisal và Chuaychuwong (1997) sử dụng Lactobacillus sp trong nuôi tôm sú để hạn chế bệnh gây ra bởi nhóm Vibrio và bệnh đốm trắng Các tác giả

đã xác định được hoạt động ức chế của Lactobacillus sp trên nhóm Vibrio, E coli

và Staphylococcus sp [65]

Rengpipat và Rukpratanporn (1998) cho rằng Bacillus S11 là vi khuẩn hữu ích

có thể bổ sung vào dung dịch giàu hóa Artemia trước khi cho ấu trùng tôm sú ăn.

Kết quả tôm ít bệnh hơn và phát triển nhanh hơn, đạt tỉ lệ sống 13% khi gây nhiễm

với V harveyi, trong khi kết quả đối chứng chỉ đạt 4% [89].

Scholz (1999) đã cho biết các loại chế phẩm chứa Saccharomyces cerevisiae

và Phaffia rhodozyma có khả năng nâng cao sức đề kháng chống các bệnh do Vibrio gây ra trên tôm Ngoài ra, màng tế bào của các chủng VSV này chứa một

nguồn giàu các chất glucan và mannan giúp kích thích hệ miễn dịch Hơn nữa, dochứa hàm lượng cao và phong phú các vitamin và khoáng chất trong thành phần tế

bào, các VSV đã góp phần nâng cao chức năng hệ miễn dịch của động vật nuôi[91]

Prabhu và cs (1999) đã nhận thấy những kết quả có lợi của việc sử dụng mộtchế phẩm trợ sinh thương mại trong các ao nuôi tôm ở Ấn Độ Tuy nhiên, chế phẩmsinh học chỉ được ứng dụng trong bốn lần khác nhau (việc lựa chọn số lần này đãkhông được giải thích rõ ràng) Bên cạnh đó, các dữ liệu về thông số chất lượngnước đã được thu thập và phân tích để thấy được sự khác biệt giữa các giá trị

“trước” và “sau” trong mỗi ao trong mỗi ứng dụng hơn là thấy được một phân tíchtổng thể giữa các ao được xử lý và ao đối chứng [87]

Sonnenholzer và Boyd (2000) đã đánh giá tác động của chế phẩm trợ sinh đến

tỷ lệ phân hủy chất hữu cơ ở đáy ao sau khi thu hoạch và chất lượng nước thải ranhằm đề xuất hướng khắc phục việc cần thiết phải loại bỏ bùn đáy sau khi nuôi Tuynhiên, một lần nữa, việc đánh giá chỉ được giới hạn trong phạm vi từ 7 đến 9 ngày

và phương pháp chỉ quan tâm đến việc giảm lượng bùn đáy mà không quan tâm đếnviệc cải thiện chất lượng nước Căn cứ vào thực trạng môi trường NTTS tại vùngnuôi tôm, cả hai yếu tố này cần phải được đồng thời nghiên cứu [93]

Matias và cs (2002) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các sản phẩm VSV thươngmại đến chất lượng nước trong các ao nuôi tôm nhiệt đới Việc bổ sung các sảnphẩm VSV thương mại vào các ao nuôi tôm đã không mang lại kết quả trong việccải thiện đáng kể chất lượng nước so với đối chứng Tuy nhiên, chất lượng nước làkhá tốt hơn trong giai đoạn đầu của quá trình nuôi và sản xuất tôm cao hơn ở một số

ao đã chỉ ra rằng một số sản phẩm VSV có tiềm năng để tăng cường môi trường aonuôi và sản lượng tôm [75]

Wang và cs (2005) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các chế phẩm trợ sinhthương mại đến chất lượng nước trong các ao nuôi tôm và kết quả đã cho thấy rằngcác chế phẩm có thể làm giảm đáng kể nồng độ nitrogen và phosphorus trong nước

ao nuôi so với đối chứng [101]

Yanbo Wang và cs (2006) đã khảo sát tác dụng của các chế phẩm trợ sinh đếntrầm tích của ao nuôi tôm trong suốt 117 ngày của quá trình nuôi Kết quả đã cho thấychế phẩm trợ sinh có thể làm giảm sự tích lũy các chất dinh dưỡng (nitrogen, phosphate

và lưu huỳnh) và cải thiện thành phần của các quần thể vi khuẩn trong trầm tích aonuôi, và do đó, cung cấp một môi trường trầm tích tốt cho việc nuôi tôm [104]

Lakshmanan R và P Soundarapandian (2008) đã đánh giá hiệu quả của các

chế phẩm sinh học thương mại đến việc nuôi tôm sú Penaeus monodon (Fabricius)

ở quy mô lớn Kết quả đã cho thấy các chế phẩm này đã đóng một vai trò quantrọng trong tỉ lệ sống sót, phát triển và kháng bệnh của tôm bằng cách bảo đảm cácthông số chất lượng nước tốt trong suốt thời gian nuôi [71]

Xu-xia Zhou và cs (2009) đã nghiên cứu tác dụng của chế phẩm trợ sinh đến

ấu trùng tôm dựa trên chất lượng nước, tỷ lệ sống sót và hoạt động enzyme tiêu hóa.Kết quả cho thấy việc bổ sung chế phẩm trợ sinh ở một nồng độ nhất định có thểlàm tăng đáng kể tỷ lệ sống sót và hoạt động của một số enzyme tiêu hóa của ấutrùng tôm [99]

1.2.3.2 Tình hình sử dụng và hiệu quả của probiotic trong nuôi tôm ở Việt Nam

Ở Việt Nam, hiện có khoảng 150 thương hiệu chế phẩm sinh học đang đượcbán với các tên thương mại như Power Pack, Envi Bacillus, Bio Waste… Các sảnphẩm này chủ yếu là có nguồn gốc từ nước ngoài, một số có nguồn gốc xuất xứkhông rõ ràng [37]

Trong những năm gần đây Bộ Thủy sản (2002a, 2002b) đã cho phép lưu hành

sử dụng nhiều chế phẩm vi sinh và nhiều nơi đã làm quen với việc sử dụng các chếphẩm vi sinh này và có kết quả khá tốt Tuy nhiên, cần có một sự đánh giá toàn diện

về hiệu quả kinh tế và phương pháp sử dụng

Đặng Thị Hoàng Oanh và cs (2000) đã nghiên cứu tác dụng của men vi sinhBio-dream lên các yếu tố vô sinh và hữu sinh trong ương nuôi ấu trùng tôm càngxanh với liều lượng 1g/m3 (theo hướng dẫn của nhà sản xuất) và nhịp sử dụng khácnhau Tác giả cho biết với nghiệm thức không sử dụng, sử dụng hàng ngày và sửdụng 10 ngày 1 lần thì nghiệm thức sử dụng hàng ngày là tốt nhất Kết quả thử

nghiệm ấu trùng chuyển sang tôm bột ở ngày thứ 18, mật số vi khuẩn Vibrio tổng

cũng thấp và các yếu tố môi trường cũng luôn giữ được ổn định Điều này cho thấyhiệu quả tích cực của men vi sinh trong sản xuất giống tôm càng xanh [48]

Theo Võ Thị Thứ và cs (2004), thử nghiệm men vi sinh Biochie để xử lýnước nuôi tôm sú giống và tôm thịt tại Đồ Sơn, Hải Phòng và Hà Nội cho kết quả

khá tốt thông qua môi trường được cải thiện, đặc biệt rất có hiệu quả đối với nuôitôm giống như giảm chu kỳ thay nước và giảm mùi hôi Tác dụng của chế phẩm lên

sự tăng trưởng rất khả quan là tôm phát triển đồng đều, tăng tỉ lệ sống và tăngtrưởng nhanh [32]

Võ Thị Hạnh (Viện Sinh học nhiệt đới) đã phối trộn các chế phẩm VSV sống

và enzyme tiêu hóa để sản xuất thành công chế phẩm probiotic BIO I và BIO II

Chế phẩm BIOII gồm các nhóm VSV Lactobacillus, Bacillus và Sacharomyces

phối hợp với các enzym α-amylase và protease dùng trong xử lý môi trường nướcnuôi tôm, cá và chế phẩm BIOI dùng trong chăn nuôi Chế phẩm BIO II có tácdụng: phân hủy những thức ăn thừa và các khí thải ở đáy ao, ổn định pH và màunước ao, kìm hãm sự tăng trưởng của các VSV gây bệnh cho tôm, cá như các vi

khuẩn Vibrio spp., tăng năng suất nuôi trồng [12] KS Phạm Minh Văn, Giám đốc

Công ty cổ phần kỹ thuật nuôi trồng thủy sản Khánh Long (TP.HCM) nhận xét:

“Sau 6 tháng thử nghiệm BIO II tại các ao tôm sú ở Tiền Giang, Sóc Trăng và NinhThuận với diện tích thử nghiệm lớn kết quả cho thấy độ pH nước ổn định, màu nướctrong ao xanh, tôm sú không nhiễm bệnh, năng suất thu hoạch tôm tăng”

Ở Sóc Trăng, mô hình nuôi tôm sú bằng chế phẩm vi sinh ES-01 và BS-01 củaTrung tâm nghiên cứu ứng dụng sinh học phục vụ NTTS đã góp phần đưa năng suấttôm nuôi nhiều trang trại đạt tới 12 tấn/ha/vụ Nhiều hộ nuôi tôm có xử lý chế phẩm visinh cho thấy môi trường nước luôn ổn định, tôm phát triển nhanh khắc phục đượcnhiều khó khăn về thời tiết, môi trường, chi phí đầu tư, dịch bệnh, tăng năng suất [109]

Ở Cà Mau, việc áp dụng mô hình nuôi tôm bằng chế phẩm EM.ZEO bước đầumang lại hiệu quả khả quan, giữ cho môi trường của ao luôn sạch, tôm khoẻ mạnh

mà hoàn toàn không sử dụng các loại hoá chất độc hại, kháng sinh Trong suốt quátrình nuôi, tôm phát triển tốt và không bị nhiễm bệnh [108]

Nghiên cứu của Nguyễn Thanh Phương (2007), sử dụng kết hợp 3 loại men visinh Ecomarine, Bio-dream, BZT trong ương nuôi ấu trùng tôm càng xanh theo môhình nước xanh cải tiến, cho thấy các yếu tố môi trường phù hợp cho sự phát triển

của ấu trùng, men vi sinh góp phần hạn chế số lượng vi khuẩn Vibrio spp trong môi

trường bể ương, với tỷ lệ sống của ương ấu trùng tôm càng xanh khá cao, dao động

từ 59,1-76,6 % [25]

Riêng ở TT Huế, theo điều tra của Lê Thị Nam Thuận và cs (2007), việc sử dụngchế phẩm sinh học trong nuôi tôm còn rất hạn chế Chỉ có 10 loại chế phẩm sinh họcđược sử dụng, trong đó có tới 90% chế phẩm có nguồn gốc nước ngoài Hiện nay, chếphẩm sinh học Bokashi trầu của Trường Đại học Nông Lâm Huế đã được người dânnuôi tôm địa phương xác nhận có hiệu quả bước đầu Nhưng các VSV được sử dụng cónguồn gốc từ chế phẩm EM của Nhật Bản Đa phần các loại chế phẩm sinh học chỉđược sử dụng trong các ao nuôi quy mô lớn hay ở các Trung tâm thuộc Sở Thủy sản.Nguyên nhân của tình trạng này là giá thành của các chế phẩm sinh học còn quá cao sovới mức thu nhập của người dân [37] Vì vậy, việc tìm ra những VSV bản địa có khảnăng trợ sinh cao cho nuôi tôm là một vấn đề cấp thiết, góp phần quan trọng tronghướng phát triển bền vững nghề nuôi tôm của tỉnh TT Huế.

Trước thực trạng này, với nỗ lực tìm ra giải pháp khắc phục dịch bệnh trên tôm ở

TT Huế, Ngô Thị Tường Châu và Nguyễn Thị Ngọc Thanh (2007) đã tiến hành phânlập và tuyển chọn các chủng VSV có khả năng phân giải chất hữu cơ cao từ nước thảinuôi tôm ở TT Huế, từ đó đi sâu nghiên cứu khả năng phân giải protein của các chủng

vi khuẩn được tuyển chọn [8] Ngoài ra, Ngô Thị Tường Châu và cs (2010a) đã tiếnhành khảo sát chất lượng nước và các quần thể vi khuẩn trong ao nuôi tôm ở Quảng

An, Quảng Điền, Thừa Thiên Huế [9] Cũng theo hướng đó, Ngo Thi Tuong Chau và

cs (2010a và 2010b) đã phân lập và đặc tính hóa vi khuẩn thuộc giống Vibrio phân lập

từ tôm bệnh trong các ao nuôi của tỉnh TT Huế [80]; [81]; [82]

1.3 XẠ KHUẨN VÀ KHẢ NĂNG TRỢ SINH TRONG NUÔI TÔM

1.3.1 Giới thiệu chung về xạ khuẩn

1.3.1.1 Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên

Sự tồn tại của xạ khuẩn được thừa nhận và biết đến hơn một trăm năm nay.Ban đầu, xạ khuẩn được xem là một nhóm VSV với nhiều đặc điểm tương đồng với

cả vi khuẩn (prokaryote) và nấm mốc (eukaryote) Tuy nhiên việc xác định đượcthành phần hóa học và cấu trúc của xạ khuẩn từ những năm 1950 đã xác nhận xạ

khuẩn là prokaryote Ngày nay, xạ khuẩn được xếp vào bộ Actinomycetales theo hệ thống phân loại của Bergey hoặc Actinomycetes theo hệ thống phân loại của

Kracinhicop, là vi khuẩn Gram (+) có khả năng hình thành hệ sợi phân nhánh, cóthành phần G+C trong DNA trên 55 % [30]

Xạ khuẩn phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên, chủ yếu chúng có trong đất vàđóng vai trò rất quan trọng trong sự hình thành mùn và tham gia vào chu trình tuầnhoàn vật chất trong tự nhiên Theo Waksman (1961) thì trong một gam đất cókhoảng 29.000-2.400.000 mầm xạ khuẩn, chiếm 9-45 % tổng số VSV [10]

Xạ khuẩn cũng có thể được phân lập từ nước ngọt nhưng mật độ hiện diện

thấp Các giống phổ biến là Actinoplanes, Micromonospora, Nocardia, Rhodococcus, Streptomyces và Thermoactinomyces Nhiều giống xạ khuẩn đã được phân lập từ nước biển và trầm tích biển bao gồm Streptomyces, Micromonospora, Mocrobispora, Nocardia, Thermoactinomyces và Coryneforms Streptomycetes

chiếm ưu thế ở khu vực nước nông ở biển Thái Bình Dương và biển Atlantic, trong

khi Micromonosporae và Nocardioforms chiếm ưu thế ở trầm tích biển sâu Xạ

khuẩn cũng hiện diện ở dạng cộng sinh trong hệ đường ruột các động vật trong đất,giữ vai trò quan trọng trong quá trình tiêu hóa ở mối [30]

1.3.1.2 Đặc điểm hình thái và sự hình thành bào tử của xạ khuẩn

* Khuẩn lạc

Đặc điểm nổi bật của xạ khuẩn là có hệ sợi phát triển, phân nhánh mạnh vàkhông có vách ngăn (chỉ trừ cuống bào tử khi hình thành bào tử) Đường kính hệ sợicủa xạ khuẩn khoảng từ 0,1-0,5 µm

Khuẩn lạc của xạ khuẩn thường chắc, xù xì có dạng da, dạng vôi, dạngnhung tơ hay dạng màng dẻo Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc khác nhau: đỏ, dacam, vàng, nâu, xám, trắng…tuỳ thuộc vào loài và điều kiện ngoại cảnh Kích thước

và hình dạng của khuẩn lạc có thể thay đổi tuỳ loài và tuỳ vào điều kiện nuôi cấynhư thành phần môi trường, nhiệt độ, độ ẩm…Đường kính mỗi khuẩn lạc chỉ chừng0,5-2 mm nhưng cũng có khuẩn lạc đạt tới đường kính 1cm hoặc lớn hơn

* Khuẩn ty

Trên môi trường đặc, hệ sợi của xạ khuẩn phát triển thành 2 loại: một loạicắm sâu vào môi trường gọi là hệ sợi cơ chất (khuẩn ty cơ chất) làm nhiệm vụ hấpthu chất dinh dưỡng Một loại phát triển trên bề mặt thạch gọi là hệ sợi khí sinh(khuẩn ty khí sinh) với chức năng chủ yếu là sinh sản [10]

* Sự hình thành bào tử của xạ khuẩn

Xạ khuẩn sinh sản sinh dưỡng bằng bào tử Bào tử được hình thành trên cácnhánh phân hóa từ khuẩn ty khí sinh được gọi là cuống sinh bào tử Cuống sinh bào

tử ở các loài xạ khuẩn có kích thước và hình dạng khác nhau Có loài dài tới

100-200 nm, có loài chỉ khoảng 20-30 nm Có loài cấu trúc theo hình lượn sóng, có loài

lò xo hay xoắn ốc Sắp xếp của cuống sinh bào tử cũng khác nhau Chúng có thể sắpxếp theo kiểu mọc đơn, mọc đôi, mọc vòng hoặc từng chùm Đặc điểm hình dạngcủa cuống sinh bào tử là một tiêu chuẩn phân loại xạ khuẩn [26]

1.3.2 Xạ khuẩn thuộc giống Streptomyces

Giống Streptomyces là một giống xạ khuẩn bậc cao được Wakman và

Henrici đặt tên năm 1943 Đây là giống có số lượng loài được mô tả lớn nhất Cácđại diện cho giống này có hệ sợ khí sinh và hệ sợi cơ chất phát triển phân nhánh.Đường kính sợi xạ khuẩn khoảng 1-10 µm, khuẩn lạc thường không lớn có đườngkính khoảng 1-5 mm Khuẩn lạc chắc, dạng da mọc đâm sâu vào cơ chất Bề mặtkhuẩn lạc thường được phủ bởi khuẩn ty khí sinh dạng nhung, dày hơn cơ chất, đôikhi có tính kỵ nước

Xạ khuẩn giống Streptomyces sinh sản vô tính bằng bào tử Trên đầu sợi khí

sinh hình thành cuống sinh bào tử và chuỗi bào tử Cuống sinh bào tử có nhữnghình dạng khác nhau tùy loài: thẳng, lượn sóng, xoắn, có móc, vòng Bào tử đượchình thành trên cuống sinh bào tử bằng hai phương pháp phân đoạn và cắt khúc.Bào tử xạ khuẩn có hình bầu dục, hình lăng trụ, hình cầu với đường kính khoảng1,5 µm Màng bào tử có thể nhẵn, gai, khối u, nếp nhăn tùy thuộc vào loài xạkhuẩn và môi trường nuôi cấy Màu sắc của khuẩn lạc và hệ sợi khí sinh cũng rất

khác nhau tùy theo nhóm Streptomyces, màu sắc này cũng có thể biến đổi khi nuôi

cấy trên môi trường khác nhau

Các loài xạ khuẩn thuộc giống Streptomyces có cấu tạo giống vi khuẩn Gram

(+), hiếu khí, dị dưỡng các chất hữu cơ Chúng có thể thủy phân nhiều hợp chất caophân tử như chitin, lignocellulose, latex,…và do đó đóng vai trò quan trọng trongquá trình khoáng hóa và sự hình thành mùn Xạ khuẩn chi này có khả năng tạo

thành số lượng lớn các chất kháng sinh ức chế vi khuẩn, nấm sợi, các tế bào ungthư, virus và nguyên sinh động vật [26]; [79].

1.3.3 Xạ khuẩn và khả năng sản sinh các hợp chất thứ cấp

Xạ khuẩn được các nhà khoa học cũng như các nhà vi sinh công nghiệp quantâm do khả năng sản sinh các hợp chất thứ cấp hữu ích cho con người, đặc biệt làcác kháng sinh Trong số 8.000 chất kháng sinh hiện biết trên thế giới, có trên 80%

là có nguồn gốc từ xạ khuẩn Giống Streptomyces chiếm hơn hai phần ba nguồn các

kháng sinh tự nhiên đã phát hiện được Các hợp chất kháng sinh khác nhau của xạkhuẩn đã được nghiên cứu đặc điểm gồm aminoglycoside, chloramphenicol,anthracycline, glycopeptide, β-lactam, macrolides, nucleoside, peptide, polyene,polyester, polyketide, actinomycin và tetracycline Các hợp chất này được sử dụngthành công làm thuốc diệt cỏ, thuốc chống ung thư, các chất điều hòa miễn dịch vàchất chống ký sinh trùng [27]

Xạ khuẩn sản sinh một lượng lớn kháng sinh với những cấu trúc hóa học đadạng Tuy nhiên, không phải tất cả các chủng xạ khuẩn đều sinh kháng sinh và vaitrò của kháng sinh trong chu trình sống của xạ khuẩn cũng chưa được hiểu rõ.Kháng sinh là sản phẩm cuối cùng của quá trình chuyển hóa, được tích lũy bêntrong tế bào hay được phóng thích ra ngoài môi trường Các chủng xạ khuẩn thuộccùng một loài có thể sản sinh các loại kháng sinh khác nhau; mặt khác, các chủngthuộc các loài khác nhau có thể sản sinh cùng loại kháng sinh Có nhiều quan điểmkhác nhau về khả năng hình thành chất kháng sinh (CKS) Một số tác giả cho rằng

sự hình thành CKS là do cơ chế giúp cho VSV tồn tại trong môi trường tự nhiên Sốkhác cho rằng, sự hình thành CKS là do sự cạnh tranh trong môi trường dinh dưỡng.Hầu hết các tác giả cho rằng kháng sinh là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp được hìnhthành vào cuối pha lũy thừa, đầu pha cân bằng của chu kỳ sinh trưởng [10]; [30]

Ngoài ra, xạ khuẩn cũng sản sinh nhiều loại enzyme ngoại bào như amylase,protease và lipase, góp phần quan trọng trong vòng tuần hoàn chuyển hóa các hợpchất hữu cơ nhằm cải thiện chất lượng nước trong các ao nuôi tôm, tạo điều kiệnthuận lợi cho tôm sinh trưởng nhanh và hạn chế dịch bệnh xảy ra

Hơn nữa, một số loài xạ khuẩn biển có khả năng tổng hợp các hợp chấtsiderophore để thu hút sắt vốn rất ít trong nước biển Đặc điểm này giúp xạ khuẩnchiếm ưu thế trong cuộc cạnh tranh sắt với các VSV gây bệnh [18].

1.3.4 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng xạ khuẩn trong nuôi tôm

Surajit và cs (2006) cho biết xạ khuẩn phân bố rộng rãi trong đại dương vàcác hệ sinh thái nước mặn Xạ khuẩn có khả năng chịu nhiệt, chịu hạn do có thể tồntại lâu trong môi trường nhờ khả năng hình thành bào tử Đây là một đặc điểm quantrọng góp phần đảm bảo sự thành công khi áp dụng xạ khuẩn vào mục đích trợ sinhtrong NTTS nói chung và nuôi tôm nước lợ nói riêng [96]

Xạ khuẩn biển đặc biệt là giống Streptomyces thường tồn tại rất phổ biến

trong môi trường nước biển, được xem là VSV có tiềm năng trợ sinh cao Nghiêncứu sử dụng xạ khuẩn biển là một hướng mới, trong đó sử dụng xạ khuẩn biển làmprobiotic trong nuôi tôm mới chỉ có những công bố bước đầu và có rất ít báo cáo đềcập đến việc ứng dụng xạ khuẩn làm probiotic trong NTTS

You và cs (2005) đã phân lập và đặc tính hóa 94 chủng xạ khuẩn đối kháng

với vi khuẩn gây bệnh Vibrio spp từ trầm tích ven biển, trong đó 87,2 % thuộc giống Streptomyces và các chủng còn lại thuộc Micromonospora spp 50 %, các chủng xạ khuẩn này đã thể hiện hoạt tính đối kháng với các chủng Vibrio spp gây bệnh Kết quả này đã cho thấy Streptomyces là một nguồn tác nhân kiểm soát sinh

học có tiềm năng lớn trong NTTS [105]

Sau đó, Surajit và cs (2006) đã báo cáo một nghiên cứu sơ bộ về việc sử

dụng Streptomyces vào sự sinh trưởng, phát triển của tôm sú Kết quả đã cải thiện

được chất lượng môi trường nước, ngăn chặn dịch bệnh, tăng năng suất trong nuôitôm sú [96]

Kumar và cs (2006) đã chiết xuất các sản phẩm đối kháng từ xạ khuẩn biển

và kết hợp vào thức ăn để quan sát ảnh hưởng của chúng trong điều kiện tự nhiênđến virus gây bệnh đốm trắng ở tôm sú [70]

You và cs (2007) cũng đã báo cáo rằng xạ khuẩn là một loại VSV có tiềm

năng đối kháng chống Vibrio spp và đề nghị sử dụng xạ khuẩn biển để chống lại các bệnh gây ra bởi Vibrio spp [106]

1.4 TỔNG QUAN VỀ KỸ THUẬT DGGE

1.4.1 Nguyên tắc

Điện di trên gel biến thiên nồng độ chất biến tính (DGGE) là một kỹ thuậtphân tử nhằm phân tách các sản phẩm PCR sợi đôi có kích thước tương đồng vớinhau nhưng khác nhau về trình tự của nucleotide cấu thành Kỹ thuật này dựa trênnguyên tắc cơ bản đó là sự bắt cặp bổ sung của các base trên phân tử DNA:adenine-thymine liên kết với nhau bằng hai liên kết hydro và guanine-cytosine thìliên kết mạnh hơn với ba liên kết hydrogen Kỹ thuật này cũng dựa trên khả năngchuyển động khác nhau trên gel polyacrylamide giữa DNA sợi đôi và DNA bị biếntính một phần [52]; [53]; [54] Sự nóng chảy của DNA sợi đôi (dsDNA) trong quátrình điện di xảy ra do nồng độ ngày càng tăng các tác nhân gây biến tính DNA(phổ biến là urea và formamide) Khi dsDNA bị biến tính, tinh linh động của phân

tử chậm hơn đáng kể so với các phân tử DNA xoắn kép [76] Tuy rằng tốc độ dịchchuyển khác nhau của phân tử DNA trong gel biến thiên nồng độ chất biến tínhđược cho là liên quan đến hàm lượng GC, nhưng thực tế có thể phức tạp hơn nhiều.Fischer và Lerman (1980) cho rằng phân tử dsDNA dịch chuyển trong gel gradientbiến tính cho đến điểm nóng chảy ổn định của nó [53] Do đó, sự thay đổi trình tựnucleotide trong vùng nóng chảy ảnh hưởng đáng kể đến khả năng di của toàn thểphân tử DNA đó Hơn nữa, một trình tự dài giàu GC có thể được gắn vào với mộttrong số các mồi cho phản ứng PCR [78] Trình tự dài khoảng 40-60 cặp base nàyđược gọi là “kẹp GC” và gắn tại vị trí 5’ của mồi xuôi và cũng được khuếch đại lêncùng với các bản sao trong suốt phản ứng PCR PCR với “kẹp GC” sẽ giúp tạo racác sản phẩm có 1 đầu có nhiệt độ biến tính rất cao Sản phẩm PCR chạy qua gel do

đó sẽ chỉ biến tính một phần Kẹp GC có tác dụng ngăn cản sự biến tính hoàn toàn

của sản phẩm PCR, giữ cho chúng vẫn ở dạng sợi đôi Các đoạn DNA có dạng hìnhchữ “Y” sẽ bị giữ lại tại vị trí mà chúng bắt đầu bị biến tính ở trên gel [60]; [64].

Muyzer và cs (1993) là những người tiên phong trong việc ứng dụng DGGEvào lĩnh vực sinh thái VSV Trong nghiên cứu này, ông đã mô tả đặc điểm của mộtquần thể VSV phức tạp bằng phản ứng PCR-DGGE dựa trên các gen của ribosome(rRNA) Kỹ thuật DGGE sử dụng các gen 16S rRNA vì chúng hiện diện trong bộgen của tất cả các vi sinh vật, đây là một cấu trúc bảo tồn cao, và có sự kết hợp xen

kẽ giữa các cấu trúc bảo tồn cao và vùng biến động cao Việc thiết kế mồi cho phảnứng PCR chủ yếu dựa trên các vùng bảo tồn, trong khi các vùng biến động cung cấptrình tự tiến hóa cho việc phân tích phát sinh loài và cho sự phân tách bởi DGGE.Đầu tiên, Muyzer và cs (1993) tiến hành khuếch đại vùng biến động thứ 3 (V3) củatiểu đơn vị nhỏ gen mã hóa rRNA 16S vi khuẩn từ vị trí 341 đến 534 (dựa theo trình

tự E coli) DNA tổng số được tách chiết từ mẫu môi trường được khuếch đại bằng

PCR với mồi đặc hiệu cho hầu hết gen 16S rRNA của vi khuẩn Sản phẩm khuếchđại sau đó được sử dụng cho phân tích DGGE, kết quả cho thấy các băng của vikhuẩn tại chỗ chiếm ưu thế [60] Khuếch đại PCR vùng V3 và V5 của gen 16SrRNA trong các nghiên cứu sau này đều sử dụng các mồi được thiết kế bởi Muyzer

và cs (1993, 1998) [60]; [77] là hai trong số những cặp mồi được sử dụng phổ biếncho phân tích quần thể VSV [100]; [107]

1.4.2 Ưu và nhược điểm của kỹ thuật DGGE

DGGE vẫn tiếp tục đóng góp như một công cụ quan trọng trong các thí nghiệmphân tích và thăm dò quần thể VSV bên cạnh sự phát triển ngày một nhanh chóng vàhiệu quả của các kỹ thuật phân tích trình tự Muyzer và cs (1993) đã chỉ ra rằng

“DGGE cung cấp hình ảnh trực tiếp các thành phần của mẫu tổ hợp trong các phươngpháp định tính và bán định lượng, và thứ hai nữa là ít tốn thời gian cũng như ít khókhăn hơn việc phân tích trình tự” Ưu điểm trước hết của kỹ thuật DGGE đó là có thểtiến hành nhiều mẫu cùng một lúc một cách nhanh chóng và khá kinh tế Về nguyêntắc, một ngày chúng ta có thể chiết xuất DNA của các mẫu tổ hợp, PCR, chạy gel quađêm và đọc kết quả điện di DGGE vào ngày sau đó Nhiều mẫu có thể được phân tích

đồng thời do dó cho phép theo dõi sự biến động trong quần thể VSV theo không gian

và thời gian [60]; [63] Hơn nữa, kết quả thu được dễ dàng cho ta có cái nhìn tổng quan

về các loài chiếm ưu thế trong một hệ sinh thái [66] DGGE đã và đang được phát triểnhoàn thiện hơn trở thành một kỹ thuật phân tử có độ tin cậy cũng như chính xác cao đểđánh giá đa dạng và sự biến động của các quần thể VSV [77]

Về nhược điểm, một trong những hạn chế của kỹ thuật DGGE đó là trình tựcác băng thu được trên gel tương ứng với những đoạn DNA có kích thước nhỏ (từ200-600 bp) Điều này hạn chế số lượng thông tin về trình tự nucleotide giúp choviệc nghiên cứu hệ thống phát sinh chủng loại cũng như kém hữu ích cho việc thiết

kế các mẫu dò trong kỹ thuật lai phân tử Nhược điểm thứ hai đó là người ta ướctính rằng chỉ các VSV có mặt trên 1-2 % sau phản ứng khuếch đại PCR mới có thểtạo thành các băng trên gel DGGE Ngoài ra, các đoạn DNA của các trình tự khácnhau có thể có đặc tính di động trên gel polyacrylamide tương tự nhau Vì vậy, mộtbăng có thể không hoàn toàn là đại diện cho một loài và 1 loài vi khuẩn cũng có thểcho ra nhiều băng vì nhiều gen 16S rRNA có trình tự khác nhau [63]

1.4.3 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng kỹ thuật DGGE

Kỹ thuật DGGE được sử dụng cho nhiều mục đích trong lĩnh vực sinh thái

VSV Ứng dụng đầu tiên và phổ biến nhất là phát hiện và so sánh mức độ đa dạngcủa quần thể VSV trong các môi trường khác nhau Ngoài ra, các nhà khoa họccũng ứng dụng kỹ thuật này để phân tích sự biến động trong cấu trúc quần thể VSVtheo thời gian [97]

Muyzer và cs (1993) đã sử dụng kỹ thuật DGGE để nghiên cứu đa dạng ditruyền quần thể VSV trong môi trường Qua nghiên cứu này, các tác giả đã tìm rachủng vi khuẩn khử sulfate kị khí mà không phát triển khi nuôi trong điều kiện hiếukhí Năm 1994, Muyzer cùng với De Wall đã tiếp tục nghiên cứu và cải tiến kỹthuật này, hai ông đã cắt các băng DNA sau điện di DGGE ra khỏi gel và đem điphân tích trình tự [21] Từ đó, kỹ thuật DGGE ngày càng hoàn thiện hơn và trởthành một quy trình chuẩn để nghiên cứu đa dạng VSV

Zhang và cs (2009) đã nghiên cứu cấu trúc quần thể vi khuẩn và mối quan

hệ giữa các biến động của môi trường đến quần thể này trong các mẫu trầm tích thuđược từ các hệ sinh thái rừng ngập mặn nhiệt đới ở Tam Á thuộc đảo Hải Nam,Trung Quốc Dữ liệu về quần thể vi khuẩn ở nơi đây được tạo ra nhờ nuôi cấy,PCR-DGGE và kết quả thống kê cho thấy sự đa dạng trong thành phần loài ở cácđịa điểm và thời gian thu mẫu khác nhau Người ta cũng nhận thấy nồng độ carbonhữu cơ trong mẫu trầm tích ảnh hưởng đáng kể đến sự biến động trong thành phầncác loài ưu thế Kết quả giải trình tự 17 băng dại diện sau DGGE và so sánh trênBLAST đã xác định các loài vi khuẩn chiếm ưu thế với các nhóm phân loại khác

nhau, có thể kể đến như Proteobacteria, Bacteroidetes, Gemmatimonadetes, Actinobacteria và Firmicutes [103].

Yamamoto và cs (2009) đã đánh giá sự biến động của hệ VSV trong suốtquá trình ủ phân động vật (composting) từ 3 nguồn khác nhau (nguồn A, B, C) bằng

kỹ thuật PCR-DGGE Kết quả nghiên cứu cho thấy có sự thay đổi trong cấu trúcquần thể vi khuẩn trong quá trình composting Mẫu phân từ nguồn A có sự biếnđộng nhỏ thành phần loài VSV, và ở mẫu B chỉ cho thấy có sự biến đổi khi có sựgia tăng nhiệt độ Trong khi đó, các mẫu từ nguồn C có sự đa dạng trong quần thể vikhuẩn theo các khoảng nhiệt độ khác nhau Trong pha đầu tiên của quá trình

composting, chiếm ưu thế hơn cả là các loài Bacteroidetes; trong giai đoạn ưa nhiệt, một số vi khuẩn thuộc nhóm Firmicutes có xu hướng gia tăng, và ở giai đoạn cuối cùng quần thể vi khuẩn bao gồm Bacteroidetes, Firmicutes và Proteobacteria [84].

Ye và cs (2011) đã đánh giá sự biến động theo thời gian của quần thể vikhuẩn cyanobacteria trong mẫu nước và trầm tích của hồ Taihu, ở tỉnh Hồ Châu,Trung Quốc bằng kỹ thuật DGGE và real-time PCR Kết quả cho thấy sự đa dạng

khá thấp trong các mẫu nước thu nhận được và 2 loài chiếm ưu thế là Microcystis

và Synechococcus Vào mùa nở hoa nước (tháng 6-9), số lượng của Synechococcus trong mẫu thường cao hơn nhiều so với Microcystis và tỉ lệ này là ngược lại trong

tháng 12 Tương tự, đối với mẫu trầm tích, sự biến động của các loài cyanobacterialớn nhất ghi nhận được từ các mẫu trầm tích ở độ sâu 20-25 cm [102]

Vũ Nguyên Thành và Lê Đức Mạnh (2006) tiến hành đánh giá hệ VSV trongbùn kỵ khí của hệ thống xử lý nước thải UASB bằng kỹ thuật DGGE Phần lớnVSV trong bể UASB là những loài kỵ khí, tham gia vào mối tương tác cộng sinhphức tạp và khó có thể phân lập được trên môi trường dinh dưỡng Các tác giả đãkết hợp giữa kỹ thuật DGGE cùng với phân tích trình tự để xác định thành phần hệVSV chủ yếu trong bùn kỵ khí của hệ thống xử lý nước thải nhà máy Sữa Hà Nội.Nhóm VSV kỵ khí trong bùn cấu thành từ các loài sinh acid, hydrogen và methane.Kết quả phân tích cho thấy có hai loài sinh methane được phát hiện, đó là hai loài vi

khuẩn cổ Methanomethylovorans hollandica và Methanothrix soehngenii M soehngenii là loài chủ đạo khi quá trình xử lý kỵ khí đã ổn định và có thể được sử

dụng làm loài VSV chỉ thị của hệ thống [31]

Trong một nghiên cứu khác, Lê Đức Mạnh và cs (2006) cũng đã sử dụng kỹthuật DGGE để đánh giá động học hệ sinh thái bùn kỵ khí của hệ thống xử lý nướcthải của nhà máy sản xuất bia Kết quả phân tích DGGE sản phẩm khuếch đại 16SrDNA cho vi khuẩn và cổ khuẩn trong bùn hoạt tính của hệ thống xử lý nước thảibia rất đa dạng Đánh giá sơ bộ cho thấy có đến vài chục loài VSV trong hệ sinhthái Sau đó, nhóm tác giả đã tiến hành cắt một số băng đại diện, khuếch đại lầnnữa, tinh sạch và giải trình tự DNA để xác định loài Kết quả cho thấy một trong

những VSV phổ biến và quan trọng là các loài thuộc chi Veillonella VSV sinh

methane xuất hiện trong giai đoạn sau với số lượng tăng dần, nhưng giảm dần sự đadạng Như vậy, kỹ thuật DGGE kết hợp với giải trình tự, phân tích dữ liệu và quansát dựa trên hình thái có thể giúp ích cho việc đánh giá thực trạng của hệ sinh thái[20]

Nguyễn Bá Hữu và cs (2007) đã xác định cấu trúc tập đoàn vi khuẩn khử

chlor Dehalococcoides trong mẫu bùn hồ khu vực nhiễm dioxin tại sân bay Đà

Nẵng bằng kỹ thuật PCR-DGGE Kết quả nghiên cứu cho thấy nhóm vi khuẩn nàyhiện diện ở tất cả các mẫu bùn từ các hồ bị ô nhiễm được nghiên cứu [12] Năm

2008, nhóm nghiên cứu lại tiếp tục đánh giá đa dạng vi khuẩn trong các hồ nhiễmdioxin ở trên cũng bằng kỹ thuật DGGE Kết quả của nghiên cứu này đã giúp ích

trong việc đưa ra phương pháp xử lý ô nhiễm chất độc dioxin ở miền trung ViệtNam bằng con đường phân hủy sinh học [14]

Phạm Thị Tuyết Ngân và cs (2008) đã nghiên cứu ảnh hưởng của việc bổsung dầu thực vật lên sự đa dạng quần thể VSV trong bể lọc sinh học bằng kỹ thuậtDGGE để Mục đích của nghiên cứu này nhằm tìm hiểu ảnh hưởng của dầu thực vậtlên quá trình nitrate hóa và phản nitrate hóa trong hai hệ thống lọc tuần hoàn nướcmặn và nước lợ [23]

Nguyễn Thị Tuyền và cs (2009) đã sử dụng kỹ thuật RFLP và PCR-DGGE

để đánh giá đa dạng vi khuẩn khử nitrate trong một số môi trường sinh thái ở ViệtNam và tìm ra các chủng đại diện cho nhóm vi khuẩn này Đầu tiên, tác giả đã tiến

hành RFLP gen 16S rDNA sử dụng hai enzyme HaeIII và MspI Sau đó phân tích

thành phần loài trong quần thể VSV bằng điện di biến tính và PCR trực tiếp từ cácbăng cắt ra từ gel DGGE, tinh sạch các băng này để đọc trình tự tìm ra các chủng vikhuẩn đại diện [35]

Thái Mạnh Hùng và cs (2011) đã nghiên cứu động học của quá trình tạobiogas và quần thể methanogen trong bể lên men kỵ khí ở nhiệt độ cao xử lý kếthợp bùn thải và rác hữu cơ Nhóm tác giả đã sử dụng PCR-DGGE gen 16S rRNAvới cặp mồi đặc hiệu đối với cổ khuẩn 0348aF và 0691R Sau khi tiến hành PCR vàđiện di trên gel biến tính, các băng chính được cắt, thôi gel trong nước, khuếch đại,tinh sạch, phân tích trình tự Trình tự gen thu được sau đó được đem phân tích và sosánh với trình tự 16S rRNA của các loài có liên quan hiện đã công bố trên DatabaseDDBJ/EMBL/GenBank nhờ công cụ BLAST [11]

Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

- Chủng xạ khuẩn Streptomyces sp A1 có khả năng trợ sinh trong nuôi tôm

được được nhóm chúng tôi phân lập và đặc tính hóa trước đây [81] Mẫu hiện đangđược lưu giữ ở trạng thái đông khô tại phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ Sinhhọc, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Huế

- Mẫu nước và mẫu trầm tích các ao nuôi tôm ở Phú Lộc – TTHuế

Hình 2.1 Hình thái khuẩn lạc Streptomyces sp A1 trên môi trường

thạch-casein-tinh bột.

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Nhân sinh khối chủng xạ khuẩn Streptomyces sp A1

2.2.1.1 Nhân giống cấp 1 trong các bình ở điều kiện lắc

- Chủng xạ khuẩn Streptomyces sp A1 được nuôi cấy trên môi trường

thạch-tinh bột-casein (SCA) Sinh khối được hòa trong dung dịch nước muối sinh lý (0,85

% NaCl) đến một mật độ thích hợp và được sử dụng để làm dịch cấy

- Nhân giống chủng xạ khuẩn trong các bình tam giác chứa 150 mL môitrường tinh bột-casein dịch thể (SCB); điều chỉnh pH môi trường đến 8,0

- Cấy dịch cấy vào môi trường với thể tích sao cho mật độ cuối cùng đạt 108

tế bào/mL

- Nuôi cấy các bình tam giác trên máy lắc ổn nhiệt (Jeiotech SI-600R, Korea)

ở 30 oC, 150 vòng/phút

2.2.1.2 Nhân giống cấp 2

- Chuẩn bị 5 L môi trường tinh bột-casein dịch thể (SCB) đã được tối ưu hóa[1] và cho vào bình lên men 10 L (Infors Labfors HT, Switzerland), khử trùng môitrường ở 121 oC/15 phút, để nguội

- Với tỷ lệ tiếp giống là 1:10 (v/v) từ giống cấp 1, giống xạ khuẩn được nhântrong bình lên men với các thông số vận hành như sau: pH 8,0, nhiệt độ 30 oC, tốc

độ khuấy 150 vòng/phút

Hình 2.2 Hệ lên men 10 L (Infors Labfors HT, Switzerland )

2.2.1.3 Tạo chế phẩm xạ khuẩn dạng thô

Sau 3 ngày nhân giống theo các phương pháp nêu trên, tiến hành thu sinhkhối xạ khuẩn bằng cách lọc chân không Sinh khối thu được sau đó được xử lýbằng cách đặt vào tủ ấm 35 oC trong 6 h nhằm loại bớt nước và bảo quản ở 4 oC

2.2.2 Bố trí thí nghiệm

Tôm sú (Penaeus monodon) được nuôi tại các ao ở hồ cao triều, khu vực 4,

thị trấn Phú Lộc, huyện Phú Lộc, tỉnh Thừa Thiên Huế (tọa độ: 16o16’20.39’’N &

107o52’29.77’’E) theo kinh nghiệm của các hộ nuôi tôm tại địa phương

Thí nghiệm của chúng tôi được chia làm 2 lần khảo sát riêng biệt tương ứngvới 2 vụ tôm khác nhau: vụ 1 kéo dài từ 23/02 đến 17/05/2012 bao gồm 7 đợt thumẫu; vụ 2 từ 28/06 đến 06/09/2012 tương ứng với 6 đợt thu mẫu

Hình 2.3 Hình ảnh ao nuôi thí nghiệm (trái) và ao nuôi đối chứng (phải)

tại thị trấn Phú Lộc, huyện Phú Lộc, tỉnh TT Huế.

Ở vụ 1, ấu trùng tôm sú (PL) 9 ngày tuổi được cung cấp bởi các trại giốngtrên địa bàn Đà Nẵng được thả vào các ao nuôi diện tích 1000 m2 với mật độ thảnuôi là 30 con/m2 Tôm được cho ăn thức ăn thương mại với khối lượng bằng 1%trọng lượng cơ thể, chia làm ba lần mỗi ngày Các ao nuôi không có sự trao đổinước liên tục với bên ngoài mà chỉ thêm nước vào khi mực nước trong ao hạ thấp

Ở ao thí nghiệm (TN), chế phẩm trợ sinh từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp A1

được bổ sung trực tiếp vào nước nuôi với mật độ 105 CFU/L định kỳ 2 tuần/lần (tính

từ thời điểm bổ sung chế phẩm) và ao đối chứng (ĐC) không bổ sung chế phẩm.Ngoài ra, còn có một ao so sánh (SS) được bổ sung chế phẩm thương mại

Ở vụ 2, thí nghiệm cũng được bố trí như trên nhưng chỉ tiến hành bổ sung

chế phẩm từ xạ khuẩn Streptomyces sp A1 khi ấu trùng tôm sú được ương sau 1

tháng tuổi Do điều kiện thí nghiệm không cho phép nên chỉ khảo sát được trên một

ao TN và một ao ĐC không bổ sung chế phẩm Ở ao TN, chế phẩm từ xạ khuẩn

Streptomyces sp A1 được bổ sung trực tiếp vào nước nuôi với mật độ 105 CFU/L,định kỳ 10 ngày/lần (tính từ thời điểm bổ sung chế phẩm)

2.2.3 Thu mẫu và xử lý mẫu

Mẫu nước được lấy định kỳ 2 tuần/lần (tính từ thời điểm bổ sung chế phẩm)theo phương pháp tổ hợp các điểm ngẫu nhiên ở độ sâu 20 cm so với mặt nước aonuôi và được bảo quản lạnh trong các chai nhựa sạch Đối với mẫu trầm tích thì tiếnhành thu mẫu ở độ sâu 0-10 cm ở tầng bề mặt của nền đáy ao nuôi Một số thông sốchất lượng nước được đo tại hiện trường, các thông số còn lại được phân tích trongphòng thí nghiệm

2.2.4 Phân tích chất lượng nước môi trường ao nuôi tôm

2.2.4.1 Các thông số đo tại hiện trường

Các thông số nhiệt độ, độ dẫn điện, độ đục, độ mặn, pH, oxygen hòa tan (DO) vàtổng chất rắn hòa tan (TDS) được đo tại hiện trường bằng máy Horiba U-52 (Japan)

2.2.4.2 Tổng lượng chất rắn (TSS) xác định theo phương pháp khối lượng [40]

 Nguyên tắc

Lọc mẫu (đồng nhất) qua giấy lọc tiêu chuẩn đã cân trước và sấy khô phầnnằm lại trên giấy lọc ở 103-105 oC Phần gia tăng khối lượng so với giấy lọc là chấtrắn lơ lửng (TSS)

- Lặp lại “sấy-làm nguội-cân’ cho đến khi thay đổi khối lượng không quá 4%

so với lượng cân lần trước Cuối cùng ta có kết quả m1.

 Tính toán: Tổng lượng chất rắn theo công thức:

TSS (mg/L) = m1 – m 0 x 100

V

2.2.4.3 Xác định nhu cầu oxy sinh hóa BOD 5 (Ultimate BOD Test) [40]

 Nguyên tắc

Ủ mẫu ở nhiệt độ 20  1 oC trong thời gian 5 ngày, ở chỗ tối, trong bìnhhoàn toàn đầy và nút kín Xác định DO trước và sau khi ủ Từ đó tính ra lượngoxygen tiêu tốn (theo mg) cho 1 L mẫu, tức BOD5 Tùy vào đặc điểm mẫu nước mà

ta có thể pha loãng và cấy thêm VSV cho mẫu hoặc không

 Tính toán: BOD5 (mg/L)= DO2 – DO1

2.2.4.4 Xác định nhu cầu oxy hóa học COD: Phương pháp oxy hóa bởi K 2 Cr 2 O 7 [40].

 Nguyên tắc:

Khi phân hủy mẫu, ion dichromate (Cr2O72-) oxy hóa chất hữu cơ và bị khử

về chromic (Cr3+), cả 2 dạng Cr này đều hấp thụ ánh sáng trong vùng khả kiến Ởvùng 400 nm, ion dichromate (màu vàng) hấp thụ mạnh, ion chromium (màu xanh)hấp thụ rất yếu Ion chromium hấp thụ mạnh ở vùng 600 nm trong khi iondichromate không hấp thụ

Với mẫu COD cao (100-900 mg/L) đo độ hấp thụ quang dung dịch sau phânhủy ở 600 nm (đo Cr3+ gia tăng) Với mẫu có COD thấp đo độ hấp thụ quang dungdịch sau phân hủy ở 420 nm (đo Cr2O72- giảm)

2,5 mL dung dịch chuẩn/mẫu (trong ống nghiệm 20 mL)

Thêm 1,5 mL dung dịch phân hủy

Thêm cẩn thận 3,5 mL H2SO4/Ag+ (cho chảy dọc thành ống nghiệm)

Vặn chặt nắp, đảo vài lần để trộn

Cho vào bộ đun (đã gia nhiệt trước 150oC) và đun trong 2 h

Làm nguội từ từ đến nhiệt độ phòng

Đo độ hấp thụ quang ở 420 nm (*)

 Quy trình phân tích

 Tính toán

Lập đường chuẩn và tính giá trị phosphorus trong mẫu từ đường chuẩn

2.2.4.6 Xác định nitrite (N-NO 2 - ): Phương pháp so màu (Colorimetry)[40]

 Nguyên tắc

Nitrite được xác định qua sự tạo thành hợp chất màu azo tím đỏ ở pH 2,0-2,5 bằngphản ứng ghép azo của sulfanilamide được diazo hóa với N-(1-naphthyl)-ethylenediaminedihydrochloride (NED dihydrochloride) Đo độ hấp thụ quang ở 543 nm

Trong vòng 10-30 phút đo độ hấp thụ quang ở 880 nm (*)

Thêm 4 mL thuốc thử hiện màu, khuấy trộn đều

25 mL mẫu/dd chuẩn (trong ống nghiệm hay cốc 50 mL)

Xuất hiện màu đỏ

Thêm 1 giọt chỉ thị phenolphtalein

Không

Có

20 mL dung dịch chuẩn/mẫu (trong ống nghiệm 20 mL)

Thêm 1 mL dung dịch tạo màu, trộn đều

Chờ 15- 20 phút, đo độ hấp thụ quang ở 543 nm

2.2.4.7 Xác định nitrate (N-NO 3 - ): Phương pháp khử Cd [40]

- Chuẩn bị dung dịch trung gian và dung dịch chuẩn

-2.2.4.8 Xác định ammonium (N-NH 4 - ): Phương pháp OPP [67]

 Nguyên tắc- Trong môi trường kiềm, ammonia phản ứng với hypochlorite vàphenol, xúc tác bởi sodium nitroprusside tạo hợp chất indophenol màu xanh sẫm

Đo hấp thụ quang ở 670 nm Khoảng xác định đến 0,6 mg N-NH4 /L

- Phương pháp tương tự phương pháp chuẩn phenate, nhưng thay phenol

bằng o-phenylphenol (dạng tinh thể dễ cân và ít độc hơn phenol).

 Quy trình phân tích

Cho chảy qua cột khử, thu đầu ra với tốc độ 7-10 mL/phút Bỏ 25 mL đầu

tiên, thu phần còn lại vào bình chứa ban đầu

Trong vòng 15 phút sau khi khử, lấy 20 mL vào ống nghiệm, thêm 1 mL

thuốc thử tạo màu, trộn đều

Trong vòng 10 phút - 2 h, đo quang ở 543 nm

25 mL dung dịch chuẩn/mẫu + 75 mL dung dịch NH

Sau 2 - 5 phút, thêm 0,4 mL R4, trộn đều

Đun trong nồi cách thủy ở 40oC/15 phút

Đo hấp thụ quang ở 670 nm

 Quy trình phân tích: gồm 3 khâu

- Khâu phỏng đoán (presumptive test): cho lần lượt 10 mL, 1 mL và 0,1 mLmẫu nước đã pha loãng vào các ống nghiệm chứa Lauryl sulphate broth (10 ốngnghiệm có nồng độ định sẵn và 5 ống có nồng độ gấp hai lần định sẵn) Nuôi cấy ở

35 oC trong 48 h, ghi nhận các ống dương tính (có sinh khí, làm đục môi trường)

- Khâu xác nhận (confirmed test): chuyển một vòng que cấy lớp váng phíatrên từ ống dương tính có độ pha loãng mẫu lớn nhất ở khâu phỏng đoán sang cácống chứa brilliant green lactose bile broth Nuôi cấy ở 35 oC trong 48 h, ghi nhậncác ống dương tính

- Khâu hoàn tất (completed test): mẫu từ ống dương tính ở khâu xác nhậnđược ria trên môi trường EMB agar Sau 18-24 h nuôi cấy ở 35 oC, quan sát hìnhthái khuẩn lạc Nếu thấy khuẩn lạc nhỏ và có chấm đen ở trung tâm khuẩn lạc hoặc

có ánh kim thì tiến hành nhuộm Gram Nếu kết quả được ghi nhận là G (-), hình que

và không sinh bào tử thì khâu này là dương tính

 Tính toán

Từ các ống dương tính ở khâu phỏng đoán tiến hành tra bảng Mc Crady(MPN), nhân với hệ số pha loãng tương ứng để có kết quả về chỉ số MPN/100 mLcủa coliform tổng số.

2.2.4.10 Phương pháp đánh giá chất lượng nước

Đánh giá chất lượng nước các ao nghiên cứu dựa vào Quy chuẩn kỹ thuậtquốc gia về chất lượng nước biển ven bờ QCVN10:2008/BTNMT, Tiêu chuẩn ViệtNam về chất lượng nước biển ven bờ TCVN 5943-1995 (cột áp dụng cho nuôi trồngthủy sản) và Tiêu chuẩn Chất lượng nước cho mục đích nuôi tôm sú của Bộ Thủysản 28 TCN 171-2001 (phụ lục) Ngoài ra, một số thông số chất lượng nước đượcđánh giá dựa vào kinh nghiệm thực tế trong quá trình nuôi tôm

2.2.5 Giám sát hoạt động của chế phẩm trợ sinh từ Streptomyces sp A1

2.2.5.1 Giám sát hoạt động của chế phẩm trợ sinh từ Streptomyces sp A1 bằng phương pháp truyền thống

Mẫu nước ao thí nghiệm từ đợt thu mẫu thứ 2 của mỗi vụ được sử dụng để

tái phân lập chủng xạ khuẩn Streptomyces sp A1 Kiểm tra sự hiện diện của chúng

trên môi trường thạch đĩa SCA

2.2.5.2 Giám sát hoạt động của chế phẩm trợ sinh từ Streptomyces sp A1 bằng phương pháp phân tử DGGE

 Tách chiết DNA

DNA tổng số của vi sinh vật có trong mẫu trầm tích của các ao nghiên cứuđược tách bằng PowerSoil®DNA Isolation Kit (MoBio Laboratories, Inc.) theohướng dẫn của nhà sản xuất

Sau khi tách chiết, DNA được khuyến cáo là bảo quản ở -20 oC đến -80 oCnhằm ngăn chặn sự biến tính để sử dụng cho các thí nghiệm PCR và điện di saunày

 Khuếch đại vùng V3 của gen 16 S rDNA

Sau khi tách chiết DNA tổng số, vùng V3 của gen 16S rDNA vi khuẩn (177bp) được khuếch đại bằng PCR với mồi 341F có gắn thêm trình tự giàu GC (40 bp)tại đầu 5’ và mồi 518R Trình tự như sau:

341F: 5'-CCTACGGGAGGCAGCAG-3'

518R: 5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'Những mồi này đặc hiệu cho vi khuẩn và sản phẩm PCR được sử dụng đểđánh giá đa dạng tập đoàn vi khuẩn trong các mẫu nghiên cứu Nhiệt độ gắn mồitrong phản ứng khuếch đại PCR khoảng 65 oC.

Sản phẩm của phản ứng PCR được điện di trên gel agarose 1,5 % ở 100 V/30phút, sau đó được nhuộm với Ethidium bromide và quan sát dưới ánh sáng tửngoại

 Điện di DGGE

Kỹ thuật DGGE được tiến hành thực hiện trên thiết bị DcodeTM UniversalMutation Detection System (Bio-rad, USA) với kích thước bản gel 16 cm × 16 cm.Nồng độ của gel là 10 % polyacrylamide với thang biến tính từ 30-60 % urea.Ammonium persulphate (APS) được thêm đến nồng độ cuối cùng là 0,09 % (w/v)

và nồng độ TEMED 0,1 % (v/v) trong gel Gel được để cho polymer hóa trongkhoảng 60 phút

Tổng số 20 µl sản phẩm PCR được trộn với loading dye và load mẫu vàogiếng Mẫu được đặt vào buồng điện di chứa khoảng 7 L dung dịch đệm 1xTAE vàcho chạy hệ thống ở 60 oC trong 17,5 h, hiệu điện thế sử dụng 130 V

Sau khi điện di được hoàn thành, tắt nguồn điện của hệ thống và lấy gel ra.Đặt gel vào trong một đĩa đựng 250 mL đệm và 25 µl dung dịch 10 mg/ml ethidiumbromide (50 µg/ml) Nhuộm trong 5-15 phút Sau khi nhuộm, cẩn thận chuyển gelvào trong một đĩa chứa 250 mL đệm nhằm loại bỏ thuốc nhuộm trong 5-20 phút.Cuối cùng, đặt gel trên một UV transilluminator và chụp ảnh

2.2.6 Tạo chế phẩm trợ sinh dạng bột từ Streptomyces sp A1 với chất mang là

bột talcum

Các bước tiến hành cụ thể như sau:

- Nhân giống chủng xạ khuẩn theo phương pháp như đã nêu ở mục 2.2.1 vàbảo quản ở 4 oC để sử dụng làm chế phẩm

- Khử trùng 5 g bột talcum [Mg3(SiO3)3(Si(O))(OH)2] chứa trong các chai kín

ở 121 °C/15 phút

- Để nguội, trộn sinh khối xạ khuẩn vào chất mang theo các mật độ khácnhau (109 và 1010 CFU/g)

- Chế phẩm gồm chất mang và sinh khối xạ khuẩn được bảo quản ở các nhiệt

độ khác nhau: 10, 25, 30, 35 oC

2.2.7 Thăm dò điều kiện bảo quản của chế phẩm

Điều kiện thích hợp cho việc bảo quản chế phẩm gồm sinh khối xạ khuẩn

Streptomyces sp A1 và bột talcum trong trường hợp này được xác định dựa vào mật

độ sống của xạ khuẩn và hoạt tính đối kháng của nó với Vibrio harveyi V7 theo

định kỳ 7 ngày/lần

2.2.7.1 Kiểm tra mật độ sống của Streptomyces sp A1

Cân 1 g chế phẩm và pha loãng mẫu thành nhiều độ pha loãng bậc 10 liêntiếp Chọn 1-2 độ pha loãng và cấy trải lên các đĩa petri chứa môi trường SCA vàđếm số khuẩn lạc xạ khuẩn hình thành sau 3 ngày nuôi cấy ở 35 oC

Mật độ tế bào trong mẫu ban đầu được tính theo công thức sau:

A =

Trong đó:

A: số tế bào/g hay mL

N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn

ni: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i

V: thể tích dịch mẫu (mL) cấy vào trong mỗi đĩa

fi: độ pha loãng tương ứng

2.2.7.2 Kiểm tra hoạt tính đối kháng với Vibrio harveyi V7 của chế phẩm từ Streptomyces sp A1

Hoạt tính đối kháng với Vibrio harveyi V7 của chế phẩm trợ sinh từ Streptomyces sp A1 được xác định bằng phương pháp đĩa thạch hai lớp, tiến hành

như sau:

- Cấy vạch xạ khuẩn lên các đĩa petri chứa môi trường SCA từ các khuẩn lạc

riêng biệt thu được ở mục 2.2.7.1 đã trình bày ở trên Bao gói các đĩa và nuôi ở tủ